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标题: 【分享帖】Transwell侵袭实验总结 [打印本页]

作者: DONT 时间: 2012-12-26 09:32 标题: 【分享帖】Transwell侵袭实验总结

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第一节概念
这里想明确两个概念，一个是Transwell，另一个是肿瘤细胞侵袭模型。
1．Transwell
关于Transwell这个词该如何解释，查了很多资料也未见准确的注解，我觉得可以这么理解吧，trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。
更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。
Fig1

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作者: DONT 时间: 2012-12-26 09:33

但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0µm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。
下图是一个Transwell装置的纵切面
Fig2

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作者: DONT 时间: 2012-12-26 09:33

将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。
我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。
Fig3

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作者: DONT 时间: 2012-12-26 09:34

应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
下面参考guxuefeng战友和cosmosci战友的帖子具体来谈谈孔径的选择，当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验：
(1).共培养体系：
小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0µm以下孔径。常用0.4、3.0µm。我们实验室用的是0.4µm。
Fig4

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作者: DONT 时间: 2012-12-26 09:34

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将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。
(2).趋化性实验
可用5.0、8.0、12.0µm膜，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。
①细胞B对细胞A的趋化作用：将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。
②趋化因子对细胞的趋化作用：将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。
(3).肿瘤细胞迁移实验
常用8.0、12.0µm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。
(4).肿瘤细胞侵袭实验
常用8.0、12.0µm膜，原理与肿瘤细胞迁移实验类似。
Fig5

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作者: DONT 时间: 2012-12-26 09:36

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上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，但与肿瘤细胞迁移实验不同的是，聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶，用以模仿体内细胞外基质，细胞欲进入下室，先要分泌基质金属蛋白酶（MMPs）将基质胶降解，方可通过聚碳酸酯膜。计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的侵袭能力。
下面这个链接是我关于侵袭研究方面的一个比较形象的解释。
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=7453397&sty=3&keywords=transwell')

以上是Transwell的一些常见的应用。

作者: DONT 时间: 2012-12-26 09:36

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2．肿瘤细胞侵袭模型
用于研究肿瘤细胞侵袭能力的肿瘤细胞侵袭模型有如下几种（引自司徒镇强《细胞培养》）：
2．1 体内癌细胞侵袭模型
2．1．1 皮下移植侵袭模型
2．1．2 肌肉内移植侵袭模型
2．1．3 腹腔内移植侵袭模型
2．1．4 小鼠肾包膜下移植侵袭模型
2．1．5 鼠睾丸包膜下移植侵袭模型
2．1．6 小鼠耳廓皮下移植侵袭模型
2．1．7 鼠爪垫皮下移植侵袭模型
2．1．8 视网内界膜侵袭模型
2．2 体外癌细胞侵袭模型
2．2．1 体外静止器官培养法
2．2．1．1 半固体培养基单细胞器官培养法
2．2．1．2 液体培养基单细胞器官培养法
2．2．2 半体外半体内器官培养法
2．2．3 单层细胞器官培养法
2．2．4 瘤细胞球体器官培养法
2．2．4．1 静止球体器官培养法
2．2．4．2 旋转摇动球体器官培养法
2．2．5 单层细胞侵袭实验模型
2．2．6 Transwell侵袭小室测定法

可见，Transwell与侵袭实验之间并不能划等号，Transwell有多种应用，侵袭实验也有多种方法。所谓Transwell侵袭实验，其实是指将Transwell这一技术应用于肿瘤细胞侵袭研究的一种实验。由于其简单易行、重复性好，因而得到了越来越广泛的应用，但不能认为研究肿瘤侵袭只有Transwell一种方法。

作者: DONT 时间: 2012-12-26 09:37

第二节 Transwell侵袭实验
我的课题涉及Transwell侵袭实验和Transwell迁移实验，其他方面的Transwell应用我不太清楚，因此这里主要谈谈Transwell侵袭实验。
1．实验用品：
Fig6

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作者: DONT 时间: 2012-12-26 09:38

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① Transwell小室：
多种厂家可提供，论坛里常用的是Costar、Corning、BD生产的小室，我们实验室用的是Chemicon公司的ECM550系列，另有Boyden chamber、Millipore公司的millicell和雕弓满月射天狼战友介绍的Thincert。
这些厂家提供的小室，有的已铺好基质胶，买来就可以用，很方便，但也比较贵，我们实验室用的Chemicon公司的ECM550系列是已经铺好胶的，质量很好，但是非常贵，24孔板配套的小室，每个价格约130元，不推荐给大家。BD也有已包被好的，价格不清楚。Coster和Corning公司生产的小室，是论坛里比较常用的，好像是要自己铺胶，但据说每个小室成本只有40左右，应该比较适合中国国情。
下面是一些战友提供的价格，具体建议大家联系代理商咨询。linanping1979战友提供的价格：coster的24孔板的transwell的价格是456元RMB,8µm，用于肿瘤的侵袭实验。iceyxy战友提供的价格：Millipore的8µm的50个1760RMB,0.4µm的2000多,是一次性的。梅林战友提供的BD价格： 240RMB一块（6.5um,24孔,12instert），好像是没胶的。liguofan说国产的boyden30块一个。jjyy提供的价格是：corning cat No.3422. 6.5mm transwell with 8.0um prore polycarbonate membrane insert, Qty 48,950人民币不到。平均每个20元不到。
Transwell小室按照公司的要求，都是一次性使用的。不过其实洗洗泡泡还是可以重复用的。我用的Chemicon公司的ECM554，用完后擦去基质胶，再用胰酶和75%酒精泡，可以把膜洗得很干净，用前用紫外里外都照30min。sword01战友提供的处理方法：用棉签轻轻擦去胶和反面细胞，清水冲洗，超声清洗，低挡，30min，清水3×5min，蒸馏水3×5min，室温凉干，用前紫外线小室正面3h，反面6h，微波，低火10min×2。
因为我买的是铺好胶的，所以没买Matrigel，二次利用的小室只用来做不需要铺胶的迁移实验。以前的Chemicon ECM550系列，膜很结实，擦不坏，可以反复用很多次，但现在的膜已经改用一种很薄很脆的材料，一般只能重复用一次，真黑啊！很多战友说Costar和Corning也是可以重复用的，大家可以试试。
victoh战友对Millipore公司的millicell有比较详细的讲解，链接如下： cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/2082166_1.html')
本人没见过，有兴趣的可以自己研究一下。
另外，根据论坛战友提供的信息，osmonic公司有专用的膜出售，鼎国生物代理。Transwell小室用过后，可把原来的膜切下，贴上osmonic公司的膜，这样又可以用了，不过我没用过，有兴趣的可以试试。maojianwen战友的使用方法： trasnwell小室做一次后，将原来的膜去掉，重新泡酸，泡酒精，使用前照紫外，然后用女士用指甲油（注意用无色较稀的）将osmonic公司的膜贴上，剪掉多余的边缘。再照紫外。
② 上层培养液：
上层培养液采用无血清培养基，为维持渗透压，需加入0.05%-0.2% BSA。
③ 细胞：
值得注意的是，有侵袭能力的细胞才可用于Transwell侵袭实验。建议实验前先用酶谱法检测MMPs的表达，特别是MMP-2的表达。如果不清楚细胞MMPs的表达情况，就盲目进行Transwell侵袭实验，可能会造成不必要的浪费，一次Transwell侵袭实验花钱少则数百，多则数千，并不是笔小数目，还是小心为妙。
另外，为了让实验结果更明显，可先撤血清让细胞饥饿12－24h，再进行实验。
④ 基质胶：
常用的是人工重构基底膜材料Matrigel，主要成分为层黏连蛋白和Ⅳ型胶原，生产厂家有BD、美国Collaborative Rsearch公司等。CaoY战友的帖这么说的：Matrigel是BD公司生产的，是一种细胞外基质，4度时是液体，在37度会逐渐凝固成胶状，不可逆。同样的东西在sigma叫ECM。zhangyong1036战友提供的价格：BD公司的matrigel 1500左右。
如果购买的小室是已经铺好基质胶的，那么Matrigel就不需要购买了。

作者: DONT 时间: 2012-12-26 09:38

⑤ 下层培养液：
下层常用含5%－10% FBS的培养基，具体浓度根据细胞侵袭力而定，侵袭力弱的细胞可适当提高FBS浓度。下层也可用趋化因子，有战友将纤维粘连蛋白加入下层培养液作为趋化因子，但个人认为，FBS仍是最合适的。
⑥ 细胞培养板：
常用于Transwell侵袭实验的细胞培养板有6孔板、12孔板、24孔板等，以24孔最常用。细胞培养板没什么特殊要求，普通的细胞培养板就可以。但要注意，细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套。
⑦ 此外，膜的下室面可涂上纤维粘连蛋白(fibronectin，FN，Sigma有售)，这样做的目的是使穿过膜的细胞更好地附着在膜上，也可用胶原（collagen）或明胶（gelatin）。很多战友认为这不是必须的，而且我也是不涂的，细胞照样贴壁很好。如果贴壁不好的话可以试试看。linanping1979战友认为，如果培养时间很长（>24h），细胞还是会掉到下室里面去，所以有条件的话，最好还是在膜下层涂上FN。
另外，值得一提的是，膜下层涂上FN还有一定的趋化作用。
nn255战友提供的价格： sigma的fibronectin，价格在1500左右。

作者: DONT 时间: 2012-12-26 09:38

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2．步骤
2．1 Transwell小室制备
2．1．1 无基质胶Transwell小室制备
① 包被基底膜：
用50mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃风干。如果需要在下室面铺FN的话，可将200ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。用胶原（collagen）的话，一般配成0.5mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。
② 水化基底膜：
吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37℃，30min。
另有tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9ug/ul) 60-80µl (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37℃ 30min使Matrigel聚合成凝胶。

2．1．2 有基质胶的Transwell小室制备
Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300µl预温的无血清培养基，室温下静置15－30min，使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。

2．2 制备细胞悬液
① 制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。
② 消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1－10×105，个人认为不要超过5×105。
具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。
个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。

2．3 接种细胞
① 取细胞悬液100－200µl加入Transwell小室，不同公司的、不同大小的Transwell小室对细胞悬液量有不同要求，请参考说明书。24孔板小室一般200µl。
② 24孔板下室一般加入500µl含FBS或趋化因子的培养基，不同的培养板加的量有不同要求，具体请参考说明书。这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。
③ 培养细胞：常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。
以我的课题为例，我使用的药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力，还对细胞增殖有明显抑制。我选择的药物浓度是用MTT筛选出的72h的IC50。用这个浓度处理细胞，24h内对细胞增殖并无明显抑制，但24h后，抑制作用就开始出现了。所以，用这个浓度来做Transwell，处理时间也必须限定在24h内，否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡，使处理组细胞数目少于对照组，那么就难以肯定穿过膜的细胞比对照组少，究竟是由于侵袭被抑制引起，还是处理后细胞数目本身就比对照组少而引起的了。
时间过长不可以，同样，过短也不行，因为细胞内会有一定量的MMPs储存，短时间内可能侵袭能力不会有太大改变。同时从药物被吸收进去，进而发挥作用，影响MMPs表达，到最后释放到培养基中，还需要一个过程。时间点的选择可尽量长点，也可选择多个时间点研究时间依赖效应，但前提是这个时间范围内细胞数目不能有明显变化。
另外，我看到细胞在小室内的形态不是正常培养贴壁的形态，而是圆形的，仍是悬浮时的形态，不过会聚集成团，所以看到细胞不正常贴壁也不要紧张，是正常现象
在培养过程中，膜下会逐渐有少量小气泡产生，这是正常现象，可不予处理，但我遇到过培养一段时间后，膜下出现了大气泡，幸亏及时发现，否则后果将非常严重。因此，个人建议，最好接种细胞后1－2h把培养板从培养箱里拿出来看看，确信没有大气泡产生。

作者: DONT 时间: 2012-12-26 09:45

2．4 结果统计
检测穿过的细胞数有两种方法：
2．4．1 直接计数法
2．4．1．1 “贴壁”细胞计数
这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去。如下图：
Fig7

[ 本帖最后由 DONT 于 2012-12-26 09:55 编辑 ]

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作者: DONT 时间: 2012-12-26 10:01

通过给细胞染色，可在镜下计数细胞
① 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞
② 染色：常用的染色方法有结晶紫染色、台肦蓝染色、Giemsa染色、苏木精染色、伊红染色等。
个人推荐采用0.1%结晶紫染色，这种方法有如下优势：(1). 不需要固定细胞，直接染色即可。(2). 配制简单方便。(3). 染色后可以用33%醋酸脱色，将结晶紫完全洗脱下来，洗脱液可在酶标仪上570nm 测其OD值，间接反映细胞数。个人认为这是结晶紫染色最大的优势所在。因为，虽然经过准确的细胞计数，往往穿过膜的细胞数仍难以准确控制，可能某一批实验穿过的细胞会特别多，以致细胞成堆，这种情况下就难以计数了，这种情况下就可以用醋酸脱色后用酶标仪检测。使用结晶紫染色要注意，染色前要将膜风干，否则可能会染不上。
③ 细胞计数：我们使用的是Leica DC 300F正置显微镜进行观察和拍照，把Transwell小室反过来底朝上就可清楚看到小室底膜上下室侧附着的细胞。也有不少人用手术刀将膜切下后染色，再贴在玻片上，滴二甲苯，再盖上盖玻片，就可以长期保存，但是这样做小室就成了一次性的了，未免有点浪费。
取若干个视野计数细胞个数。论坛里一般采用3－5个视野，也有人用10个，都是随机选取，个人认为这样选择的视野带有很大的偶然性，也会掺进人为影响，特别是计数视野较少的时候。我选取16个视野，不是随机选择，而是有固定的位置。我们使用的显微镜所看到的视野的直径刚好是Chemicon公司的ECM550系列小室底面膜的直径的1/4。
Fig8

[ 本帖最后由 DONT 于 2012-12-26 10:03 编辑 ]

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作者: DONT 时间: 2012-12-26 10:03

如图，蓝色部分表示膜的大小，白色圆形表示视野的大小，绿色方形则表示拍照时所能拍下的视野的中心部分。这样，每个小室都拍摄如下图的16个视野进行计数，这样得到结果是比较客观和准确的。
Fig9

图片附件: 95265890.jpg (2012-12-26 10:03, 6.68 KB) / 该附件被下载次数 20
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14434

作者: DONT 时间: 2012-12-26 10:03

不同厂家不同型号的小室，膜的面积不尽相同，但个人认为，拍照时还是应当选取固定的位置，并选择尽可能多的视野。

作者: DONT 时间: 2012-12-26 10:04

2．4．1．2 “非贴壁”细胞计数
由于某些细胞自身的原因或某些膜的关系，有时细胞在穿过膜后不能附着在膜上，而是掉进下室。如下图：
Fig10

图片附件: 23663996.jpg (2012-12-26 10:04, 5.52 KB) / 该附件被下载次数 14
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14435

作者: DONT 时间: 2012-12-26 10:04

这种情况我没有遇到过，根据论坛里提供的经验，可以收集下层培养液，用流式细胞仪计数细胞量，也可用细胞计数的方法直接在镜下计数，个人认为MTT应该也是可以用的，有兴趣的可以试试看。

作者: DONT 时间: 2012-12-26 10:05

2．4．1 间接计数法
间接计数法主要用于穿过细胞过多，而无法通过计数获得准确的细胞数所采用的方法，与常用的MTT实验是同样的原理。
2．4．1．1 MTT法
① 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞
② 24孔板中加入500µl含0.5mg/ml MTT的完全培养基，将小室置于其中，使膜浸没在培养基中，37℃ 4h后取出。
③ 24孔板中加入500µl DMSO，将小室置于其中，使膜浸没在DMSO中，振荡10min，使甲臜充分溶解。取出小室，24孔板于酶标仪上测OD值。
2．4．1．1 荧光试剂检测
这类方法一般是与Transwell小室一起出售的，其原理与MTT法类似，是用一种荧光染料染细胞，再将细胞裂解，检测荧光值。Chemicon的ECM554即属于这类。
2．4．1．1 结晶紫检测
上文已说过，这里不再赘述，原理与MTT法也是类似的。但结晶紫染色还有个优点，就是染色和脱色的过程并不影响膜上细胞，在脱色后还可重新染色。

作者: DONT 时间: 2012-12-26 10:06

这里附上我实验中的一些图：
Fig11

图片附件: 45517021.jpg (2012-12-26 10:06, 12.91 KB) / 该附件被下载次数 25
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14436

作者: DONT 时间: 2012-12-26 10:08

上面是用Nikon SMZ1000显微镜配套的数码相机直接对膜下室侧进行拍摄得到的照片，左图是对照组，中间是1/3 72h IC50的浓度处理组，右图是72h IC50的浓度处理组，接种细胞后同时加入药物，培养24h，结晶紫染色。随着药物浓度增加，穿过的细胞减少，侵袭力明显受到抑制。

作者: DONT 时间: 2012-12-26 10:08

这是用正置显微镜拍摄的图，结晶紫染色，进行细胞计数。
Fig12

图片附件: 53403812.jpg (2012-12-26 10:08, 7.92 KB) / 该附件被下载次数 12
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14437

作者: DONT 时间: 2012-12-26 10:09

相关疾病：
肿瘤
第三节 Transwell的其他应用的实验步骤
1．Transwell肿瘤细胞迁移实验
过程与Transwell侵袭实验基本一致，不同的只是不需要铺Matrigel。个人认为，由于没有基质胶的阻挡，细胞穿过膜的速度较侵袭实验明显加快，所以细胞量要更大。我做侵袭实验的细胞密度是1×105，而迁移实验的密度是1×106。另外，下层培养液的FBS浓度也可适当下调，我做侵袭实验的浓度是5%，迁移实验的浓度是2.5%。

2．cathywxy战友的Transwell上皮细胞培养步骤
做了一段时间的原代细胞培养，把经验拿出来跟大家分享一下吧，请有关战友共同探讨：
(1). 将雄性wistar大鼠麻醉，开胸，将气管取出，置于4℃含0.1％胰蛋白酶XIV (Sigma)，100 U/ml青霉素和100ug/ml链霉素（Gibco-BRL）、无Ca 2＋、Mg2＋，无血清的MEM。
(2). 用无菌的细胞刮棒刮气管内壁，将所得溶液离心后得到游离细胞。
(3). 离心后立即用新鲜的上述MEM溶液（含10％胎牛血清）清洗3次，以中和胰蛋白酶，再用含5％胎牛血清、100U/ml 青霉素和100 ug/ml 链霉素的LHC-8 medium (Biofluids)冲洗一次。
(4). 冲洗过后，将得到的细胞悬液用台盼兰测定活力，若存活率大于90％，则将细胞以106/cm2密度接种于可通透的多聚碳滤膜上（12 mm SNAPWELL, Costar），以37°C 5％CO2-95% 空气含5% 胎牛血清(Gibco-BRL) and 100 U/ml 青霉素and 100ug/ml 链霉素的LHC-8 medium孵育6~10天。
(5). 孵育后，经测定跨上皮电阻在1000~2000Ω之间，即可用于电生理试验。
显微镜下气管上皮细胞形细胞呈铺路石状，圆形核位于中央，生长时常彼此紧密连接成单层细胞片
链接： cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/3750799_1.html')

3. metastasis战友的Transwell B16细胞的体外迁移实验
我以前用 costar的Transwell做过B16细胞的体外迁移实验，具体是这么做的：首先把Transwell倒置，在Transwell的PVPF膜（0.8 um）的下表面涂一层fibronectin(10 ug/ml，50ul),37度2小时，PBS洗一遍后，放入预先每孔加有600ul的培养基（含10%血清）的24孔板内，后在Transwell的内室加入细胞（100ul,用含0.1%血清的培养基稀释好自己所需密度），放入培养箱，12-18小时后，取出Transwell，用棉签擦去PVPF膜靠近内室那一面的细胞，另一面的细胞用甲醛室温固定30分钟，结晶紫染色20分钟，用清水洗3遍以上，后在显微镜下观察细胞，记数。
链接： cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=2681611&sty=3&keywords=Transwell')

4．mci战友的内皮细胞HMEC-1迁移实验
1%明胶处理的transwell经无血清的MCDB131培液于培养箱中平衡1小时后，上室加入100µl用serum-free MCDB131稀释的5*104/孔的HMEC及不同浓度的药物，下室加入0.6ml serum-free的MCDB131培液及20%FCS刺激迁移,同时设置相应阴性及阳性对照，置于CO2培养箱中作用8小时，然后弃去孔中培液，用90%酒精常温固定30分钟，0.1%结晶紫常温染色10分钟，清水漂净，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，显微镜(Olympus, DP50, Japan).下观察并拍照，最后用10%乙酸100µl/孔抽提10分钟，于600nm处测定OD值。抑制率计算公式为：抑制率（%）=[(OD值给药组-OD值无刺激阴性对照)/（OD值不加药阳性对照- OD值无刺激阴性对照)] ×100%.
链接： cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=850667&sty=3&keywords=Transwell')

作者: DONT 时间: 2012-12-26 14:59

相关疾病：
肿瘤感染

guxuefeng战友的Transwell应用指南：
1. 混合培养 0.4、3.0µm 细胞/细胞、细胞/物质相互作用、基质与上皮、细胞/基质的相互作用、肿瘤多相性。
2. 趋化性 3.0、5.0、8.0、12.0µm 血液有形成分的趋化性、噬细胞、巨噬细胞的迁移。
3. 药物的转移 0.4、3.0µm 受体定位、药物反应极性、药物作用于血管渗透性、药物通过上皮、内皮细胞、脑血管上皮细胞。
4. Endocytosis 0.4、3.0µm 膜同期、细胞因子、激素、抗体、毒素的受体－配体反应、蛋白质更新。
5. 体外受精 0.4、0.3µm 卵泡粒膜细胞培养、内分泌和旁分泌对卵泡粒膜的影响。
6. 转移与入侵 0.4、8.0、12.0µm
7. 微生物发病 0.4、3.0µm 病毒细菌、寄生虫、吸附宿主血细胞、入侵穿透上皮屏障、微生物受体及其药物作用。
8. 极性 0.4、3.0µm 离子通道、蛋白、酶、酯类、受体的极性、极性发生与维持、紧密连接的合成与集合。
9. 组织模型重建 0.4、3.0µm 伤口愈合、血管发生、上皮再生、感染。
10. 转移/渗透性研究 0.4、3.0µm 大分子、离子、水、小分子、如：激素、生长因子。
原文链接：
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=1397812&sty=3&keywords=transwell')

作者: DONT 时间: 2012-12-26 14:59

transwell膜和孔径的选择:
TRANDSWELL透过性支持物可提供三种膜材料 C\PET\胶原包被的PTFE.(膜的特性见附件)
a、PET膜TRANWELL透明嵌入式的特点是带有在显微镜下呈透明的膜。这些膜经过处，可以让细胞更好的贴附和生长。TRANSWELL透明嵌入式使细胞在相差显微镜下更易观察，可以估计细胞的生长状态和单细胞层的形成。
b、聚碳酯TRANWELL嵌入膜提供0.1-12µm的多种孔径。绝大多数经过处理，使得细胞更易贴附。
c、TRANSWELL-COL嵌入膜带有湿润时透明的，胶原包被的PTFE膜，使得细胞更易贴附和伸展，同时在培养的过程中可以观察。TRANSWELL-COL含有牛胎盘中提取的等摩尔数混合I型和III型胶原，不同于传统包被技术会形成密封的膜层，特殊的技术稳定性的胶原包裹住滤膜的每一根纤维，从而保持了膜的多孔性。
选择孔径：
在实验中使用TRANSWELL透过性支持物时选择合适的孔径也是十分重要的，
附件2有推荐透过性支持物的常规应用和推荐使用的孔径，最小孔径的TRANSWELL膜（0.1µm）主要应用于药物转动研究。细胞侵袭、趋化性和运动性研究通常采用3.0um或以上的孔径的TRANSWELL膜。细胞从膜的孔中迁徙通过的能力与选用的细胞系与培养条件有关，同时也与孔径相关，小于3.0µm孔径条件下，细胞不会迁徙通过，对于一些要求严格的实验，建议在实验中选择一系列孔径作为对照来确定哪种尺寸最适合于你的细胞培养与特殊应用（当然这个建议成本是很高的，呵呵）。还有一个方法就是参照已经发表的文献的推荐，若需要更多的使用与应用信息，可以到corning的网站技术信息部分的TRANSWELL查阅参考。
原文链接：
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=5116572&sty=3&keywords=Transwell')

作者: DONT 时间: 2012-12-26 15:00

protocol
具体步骤：
（1）基质胶准备：将冻存于－80度冰箱的BD matrigel 4度过夜（24h），变成液态；
（2）取300ul无血清培养基，加入60ul（或50ug/每室）Matrigel ，混匀，（ 4℃操作，最好在冰浴上），加入上室各100ul（3个室）；放入37℃培养箱中，孵育4-5h（>5h）；此间经常观察，当出现“白色层”时，说明已经变为固态。
注释：无血清培养基和基质胶按1：5稀释，每孔加50ul，在37℃培养箱中1-2h。
（3）消化细胞，无血清培养基洗3次，计数，配成细胞悬液；
（4）用无血清培养基洗 Matrigel洗1次；每孔加入100ul细胞悬液；
（5）下腔室中加入500ul含有20％FBS条件培养基；
（6） 37℃培养箱中，孵育20-24h；
（7）取出transwell用PBS洗2遍， 5%戊二醛固定，4℃；
（8）加入结晶紫（0.1%）染色或Giemsa染色（5－10min），室温0.5h，PBS洗2遍，用棉球擦去上表面细胞，显微镜下观察。
链接：
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/5918815')

作者: DONT 时间: 2012-12-26 15:00

Matrigel invasion assays
Overview
Matirgel is considered as basement membrane and generated from EHS sarcoma. Matrigel contains not only basement membrane components (collagens, laminin, and proteoglycans)but also matrix degrading enzymes/their inhibitors and growth factors. Invasion of tumor cells into Matrigel has been used to characterize involvement of ECM receptors and matrix degrading enzymes which play roles in tumor progression.
Material
- Matrigel (Becton-dickinson)
- 24-transwell (Coster)
- Fibronectin(Sigma)
- Diff-Quick staining solution (Fischer Scientific)
Procedure
1. Thaw Matrigel at 4C overnight.
2. Dilute Matrigel (5mg/ml to 1 mg/ml) in serum free-cold cell culture media (RPMI1640, EMEM, DMEM, etc).
3. Put 100 ul of the diluted matrigel into upper chamber of 24-well transwell
4. Incubate the transwell at 37C at least 4 to 5 h for gelling.
5. Harvest cells from tissue culture flasks by Trypsin/EDTA.
6. Wash the cells 3 times with culture media (RPMI1640, EMEM, DMEM etc)containing 1 % FBS.
7. Resuspend the cells in media containing 1% FBS at a density of 10^6 cells/ml.
8. Gently wash gelled matrigel with warmed serum free-culture media.
9. Put 100 ul of the cell suspension onto the matrigel.
10. lower chamber of the transwell is filled with 600 ul of culture media containing 5 ug/ml fibronectin, as an adhesive subtrate.
11. Incubate at 37C for 20 to 24 h.
12. Remove transwells from 24-well plates and stained with Diff-Quick solution.
13. Scrape off noninvaded cells on the top of the transwell with a cotton swab.
14. Count invaded cells under a light microscope.

Troubleshooting
- Need to check batch of matrigel.
- Matrigel tends to form gel very quickly at room temerature, therefore, pipets and tips using in steps 2 and 3 have to be chilled at -20C prior to experiements.
- In our experience, matrigel would not make gel under a concentration of 1 mg/ml.
- If cell make aggregation during invasion assays, reduce the density of cell suspension (at step 7).
- Invasion assays can be performed for 36 to 40h.

Reference
Knutson, JR., Iida, J., Fields, GB, and McCarthy, JB.
Molecular Biology of the Cell, 7: 383-396, 1996.
链接： cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=850832&sty=3&keywords=Transwell')

作者: DONT 时间: 2012-12-26 15:07

Thincert做侵袭实验的步骤
下面奉上用Thincert做侵袭实验的步骤（摘自《A quantitative cell migration assay using ThinCert™ cell culture inserts》，大家如需要，可用google搜之）：
1. Prepare cell cultures according to standard cell culture procedures
2. Starve cells overnight in serum-free medium with 0.2 % BSA
3. Harvest cells and wash them twice in PBS
4. Resuspend cells in serum-free medium with 0.2 % BSA to an appropriate final cell concentration (e.g. 106/ml)
5. Place 24 well ThinCertTM cell culture inserts in the wells of a CELLSTAR® 24 well cell culture plate
6. Add 600 µl culture medium with or without chemoattractant to each well of the cell culture plate
7. Add 200 µl cell suspension to each cell culture insert
8. Incubate the cell culture plate for 3-24 h in a cell culture incubator at 37°C and 5 % CO2
9. Remove the cell culture medium from each well of the cell culture plate and replace it by 450 µl serum-free culture medium with 8 µM Calcein-AM
10. Incubate for 45 min in a cell culture incubator at 37°C and 5 % CO2
11. Remove the culture medium from the cell culture inserts
12. Transfer the cell culture inserts into a freshly prepared 24 well cell culture plate containing 500 µl prewarmed Trypsin-EDTA per well
13. Incubate for 10 min in a cell culture incubator at 37°C and 5 % CO2, agitate the plate from time to time
14. Discard the cell culture inserts and transfer 200 µl of the Trypsin-EDTA solution (now containing the migratory cells) from each well into a black flat bottom 96 well plate
15. Read fluorescence in a fluorescence plate reader at an excitation wavelength of 485 nm and an emission wavelength of 520 nm
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=7459761&sty=3&keywords=Thincert')

作者: DONT 时间: 2012-12-26 15:07

下面这些帖子也很有价值，就不一一复制过来了，大家自己去看看

cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=5872538&sty=3&keywords=transwell')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=41&id=2932571&sty=3&keywords=transwell')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/4530205_0.html')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=7148557&sty=1&tpg=1&age=0')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/7453397')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/6922815')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/6927598')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/4330371_0.html')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=2875154&sty=3&keywords=transwell')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=2681611&sty=3&keywords=transwell')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=68&id=4823507&sty=3&keywords=transwell')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/2882062_0.html')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=3655749&sty=3&keywords=transwell')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/3643925_0.html')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=2783181&sty=3&keywords=transwell')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=4314590&sty=3&keywords=transwell')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=4409970&sty=3&keywords=transwell')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=41&id=1647043&sty=3&keywords=transwell')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=6417462&sty=3&keywords=transwell')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/4528099_0.html')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=6320167&sty=3&keywords=transwell')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=1846597&sty=3&keywords=transwell')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/3015023_0.html')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=7501496&sty=1&tpg=2&age=0')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=6030643&sty=3&keywords=transwell')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=7427307&sty=3')

另外推荐两本书：韩锐主编的《抗癌药物研究与实验技术》和司徒镇强《细胞培养》，都有相关讲解。

作者: mamamiya 时间: 2012-12-26 15:08

请问有没有知道 BD公司的Matrigel保质期有多长时间？(-20度保存）说明书上只说stable for a minimum of 3 months from day of shipment when stored at -20℃.我有-20℃存放两年的Matrigel(师姐留下来的）现在还能用吗？

作者: moonlight45 时间: 2012-12-26 15:09

关心中，也有过期半年左右的Matrigel，不知道还能不能用，希望有经验的战友解答一下！

作者: flower-201 时间: 2012-12-26 15:11

使用结晶紫染色要注意，染色前要将膜风干，否则可能会染不上

能不能请教一下，怎样风干，是自然晾干还是烘干

作者: flower-201 时间: 2012-12-26 15:15

我做迁移试验，结晶紫染色。染色后我在显微镜下可以看到成片的细胞但是就是没被染色
做了两次都出现这种情况，请大家帮忙分析一下吧

作者: caihong 时间: 2012-12-26 15:16

我现在做平滑肌细胞的迁移实验,已经失败好多次了,非常着急.有些问题我想请教一下大家,我用的是CORNING的8uM的transwell,我接种的细胞5*10(4)个/well,迁移时间是24小时.这时隐约可以看见迁移到膜底部的细胞,但看不清楚. 我不知道怎么观察迁移了的细胞,有人说染色后把上室取下来,翻转过来就可以看了,但是我翻转过来后怎么也看不清那层膜,小室有一定高度,翻转后就与显微镜的光源距离很远,怎么调都没法看清楚膜,更看不清楚细胞了,我把膜剪下来铺在培养皿上在显微镜下看,一个细胞都没有找到,下室的培养液中也没有细胞,急死我了,请大家帮帮忙,指点一下,好吗?谢谢了

作者: lxh031 时间: 2012-12-26 15:18

相关疾病：
肿瘤
细胞要染色后才比较好看的，一般用结晶紫，上层的细胞可以用棉签把它擦掉。
个人感觉做几种肿瘤细胞的迁移能力的比较时，接种的细胞量和实验时间非常重要，如果细胞数太多或是培养时间太长，都会使本来有迁移能力差别的细胞之间的差别不显著甚至是没有。这个首先可以参考别人文献的细胞用量及时间，再结合自己的要求进行实验，所以刚开始时不要做太多的处理组，而要把条件摸好再说。
show几张我做的迁移实验：

图片附件: 59795647.snap.jpg (2012-12-26 15:19, 23.24 KB) / 该附件被下载次数 21
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14438

作者: lxh031 时间: 2012-12-26 15:21

我做迁移试验，结晶紫染色。染色后我在显微镜下可以看到成片的细胞但是就是没被染色
做了两次都出现这种情况，请大家帮忙分析一下吧

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是否染色时间太短？或者你根本没有看到细胞，而是膜上的那些小孔？我是这样染的，你可以参考：
结晶紫用甲醇配成0.5%的母液，使用浓度为0.1％，用PBS按1：4稀释后即为染色液。
染色方法:用PBS缓冲液洗细胞1-2次,吸尽残余的液体，加入甲醇固定20分钟,弃固定液,加入结晶紫染液,染色10-20分钟,弃染色液,用PBS冲洗干净即可！

作者: 49888 时间: 2012-12-26 15:22

请教楼主，我正在做MEC，MLg等细胞的细胞因子趋化试验，但在染色前我通过显微镜观察细胞，发现negative control中无血清小室里的细胞圆圆的，象没贴壁或是没展开一样，上面的总结中提到在做invasion试验中这个是正常的，但我做的是migration，小室膜上铺的是水化1％gelatin，请问这个是正常的吗？马上要跟老板talk了，急啊，望赐教！

作者: 49888 时间: 2012-12-26 15:22

同志们，帮忙解答一下吧，我用了好多板子了，也试过加1％，0.5 %血清试图帮助细胞贴壁伸展成梭形，但negative control的细胞迁移很明显，不能做对照了，我还没试过加BSA，听说是为了维持细胞渗透压？不太懂···
有什么方法能让细胞在上层分散的好些呢？我看了站上大家的经验，有人说小室要平衡过夜，但这是针对已有涂层的膜还是我这种自己铺gelatin的呢？还有同志说是gelatin没铺好，那东西不就直接望上挤，摇都摇不动，应该不会不均匀啊？，小室也真的很小（24 well），我晃匀后放段时间细胞还是按自己喜好一陀一陀的分布，哭都哭不出来···
请战上高手帮忙，不甚感激啊！
细胞migration一定要先在膜上拉出漂亮的梭形吗？有点子···

作者: tuuu2 时间: 2012-12-26 15:23

同志们，帮忙解答一下吧，我用了好多板子了，也试过加1％，0.5 %血清试图帮助细胞贴壁伸展成梭形，但negative control的细胞迁移很明显，不能做对照了，我还没试过加BSA，听说是为了维持细胞渗透压？不太懂···
有什么方法能让细胞在上层分散的好些呢？我看了站上大家的经验，有人说小室要平衡过夜，但这是针对已有涂层的膜还是我这种自己铺gelatin的呢？还有同志说是gelatin没铺好，那东西不就直接望上挤，摇都摇不动，应该不会不均匀啊？，小室也真的很小（24 well），我晃匀后放段时间细胞还是按自己喜好一陀一陀的分布，哭都哭不出来···
请战上高手帮忙，不甚感激啊！
细胞migration一定要先在膜上拉出漂亮的梭形吗？有点子···

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细胞密度不要太高，加入后米字形摇匀应该可以解决你的问题。

作者: loli 时间: 2012-12-26 15:24

请问有没有知道 BD公司的Matrigel保质期有多长时间？(-20度保存）说明书上只说stable for a minimum of 3 months from day of shipment when stored at -20℃.我有-20℃存放两年的Matrigel(师姐留下来的）现在还能用吗？

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情况和你差不多，用后感觉还好。

作者: moonlight45 时间: 2012-12-26 15:24

看到您整理的Transwell侵袭实验，感觉非常全面，我最近也要做这方面的实验，想请教lwjssry 战友，您说的结晶紫染色的具体步骤是什么？我看网上的步骤中都要固定，那样就不能重复应用Transwell膜了，请问您是怎么做的？非常感谢！

作者: DONT 时间: 2012-12-26 15:25

我没有固定，直接染色就可以了，不过膜要保持干燥，否则染不上

作者: fsdd817 时间: 2012-12-26 15:30

请问，侵袭实验中用的趋化因子，有没有市售的？一定要自己另外培养个NIH/3T3吗？那不是很麻烦，也费时间？

作者: kuohao17 时间: 2012-12-26 15:31

各位好，我想知道的是共培养后下室的细胞对上室细胞的影响应该怎么检测啊！

作者: kuohao17 时间: 2012-12-26 15:32

还有什么情况下才要铺基质胶啊，做共培养的时候要铺吗？

作者: redbutterfly 时间: 2012-12-26 15:35

请问楼主，我准备做wnt7a对细胞侵袭的影响，但是不知道transwell下层培养液怎么选择，看了楼主的帖子，是说用5－10％FBS就好，理解好像是说单纯检测细胞invasion，所以想请教楼主我这种情况怎么办？在线等楼主答复，急！

作者: glass 时间: 2012-12-26 15:38

研究一种贴壁细胞代谢产生的某种物质对另一种悬浮细胞的细胞毒活性的影响，需要用间接共培养体系吗？还是直接共培养就可以？

作者: 8s5g 时间: 2012-12-26 15:40

2．4．1．1 MTT法
① 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞
② 24孔板中加入500µl含0.5mg/ml MTT的完全培养基，将小室置于其中，使膜浸没在培养基中，37℃ 4h后取出。
③ 24孔板中加入500µl DMSO，将小室置于其中，使膜浸没在DMSO中，振荡10min，使甲臜充分溶解。取出小室，24孔板于酶标仪上测OD值。
擦去基质胶？细胞不是在胶这面吗，这样擦不就把细胞也擦掉了吗

作者: ha111 时间: 2012-12-26 15:42

我刚接触transwell，问2个弱弱的问题
1、上层培养液与下层培养液由中间的膜隔开，时间久了会不会混在一起啊？
2、一定要把研究的细胞放在上层吗，放在下层可以不？
谢谢你

作者: 987789 时间: 2012-12-26 15:42

谢谢大侠的总结，我准备要做趋化试验，但是我不知道transwell和boyden chamber是否为一个东西？我查阅的文献要求是用boyden chamber，
请高手指点！

作者: wood533 时间: 2012-12-26 15:45

我刚接触transwell，问2个弱弱的问题
1、上层培养液与下层培养液由中间的膜隔开，时间久了会不会混在一起啊？
2、一定要把研究的细胞放在上层吗，放在下层可以不？
谢谢你

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首先要明确你的实验目的，是做什么实验？侵袭？迁移？共培养？
会不会混在一起，关键是看你的膜上有没有胶，如果有胶是不会混起来的，但如果没胶，应该是能混起来的，不过培养液的相互扩散也是要很长时间的。
另外也要看你的实验目的，是迁移还是共培养？我做迁移，会先在上室加入细胞悬液，过一两个小时再在下室加培养液。如果是做共培养，要把上下室先分开培养，上下室细胞分别贴壁后在放到一起。
如果你是做共培养，不就是要把培养液混在一起吗？否则怎么反映一种细胞分泌的因子对另一种细胞的影响?
如果是共培养，细胞放下层应该也是可以的，如果是做侵袭迁移，当然就不能放下层了。

作者: wood533 时间: 2012-12-26 15:45

谢谢大侠的总结，我准备要做趋化试验，但是我不知道transwell和boyden chamber是否为一个东西？我查阅的文献要求是用boyden chamber，
请高手指点！

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似乎是一个东西，不过我没用过boyden chamber，你还是再多查查资料看看，可以问问试剂公司和厂商

作者: wood533 时间: 2012-12-26 15:46

2．4．1．1 MTT法
① 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞
② 24孔板中加入500µl含0.5mg/ml MTT的完全培养基，将小室置于其中，使膜浸没在培养基中，37℃ 4h后取出。
③ 24孔板中加入500µl DMSO，将小室置于其中，使膜浸没在DMSO中，振荡10min，使甲臜充分溶解。取出小室，24孔板于酶标仪上测OD值。
擦去基质胶？细胞不是在胶这面吗，这样擦不就把细胞也擦掉了吗

++++++++++++++++++++++++++++++++++++

就是要擦掉，要检测的是穿过膜的细胞

作者: wood533 时间: 2012-12-26 15:49

请问楼主，我准备做wnt7a对细胞侵袭的影响，但是不知道transwell下层培养液怎么选择，看了楼主的帖子，是说用5－10％FBS就好，理解好像是说单纯检测细胞invasion，所以想请教楼主我这种情况怎么办？在线等楼主答复，急！

+++++++++++++++++++++++++++++++

一种药？可以影响细胞的侵袭能力？

作者: H2O 时间: 2012-12-26 15:50

首先要明确你的实验目的，是做什么实验？侵袭？迁移？共培养？
会不会混在一起，关键是看你的膜上有没有胶，如果有胶是不会混起来的，但如果没胶，应该是能混起来的，不过培养液的相互扩散也是要很长时间的。
另外也要看你的实验目的，是迁移还是共培养？我做迁移，会先在上室加入细胞悬液，过一两个小时再在下室加培养液。如果是做共培养，要把上下室先分开培养，上下室细胞分别贴壁后在放到一起。
如果你是做共培养，不就是要把培养液混在一起吗？否则怎么反映一种细胞分泌的因子对另一种细胞的影响?
如果是共培养，细胞放下层应该也是可以的，如果是做侵袭迁移，当然就不能放下层了。

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谢谢大侠指点，高人
我做的是共培养，因为两种细胞用的培养基不一样，故有第一问。

作者: zsxan1990 时间: 2012-12-26 16:58

谢谢大侠！根据我查的资料，迁移试验时一般都是计数细胞，但是我也查到一篇文章说是用显微镜测定距离，不知道该怎么测距离？请高手指点！

作者: finger 时间: 2012-12-26 17:09

我也想知道怎样测量细胞迁移试验时迁移的距离，用软件还是在显微镜上直接可测？
我这有一篇文章就是测细胞迁移距离的，原文描述如下：
Cultures were fixed and the distance of cell migration away from
the edge of the fragment was analyzed. The maximum
distance of the leading edge of cells was measured in
each experiment, and the number of cells migrated from
the edge of the coverslip was counted within 50-mm
rows.
请指点。

作者: DONT 时间: 2012-12-26 17:27

这个迁移实验是用Transwell做的吗？

作者: DDD 时间: 2012-12-26 17:28

chemotaxis experiments in modified multiwell Boyden chambers (Neuroprobe, Gaithersburg, Md.) using nitrocellulose micropore filters (Sartorius, Go¨ttingen, Germany)
were performed as previously described .
After mounting of dehydrated filters to microscope slides migration depth of DC into the filter was quantified by microscopy, measuring the distance (mm) from the upper
surface of the filter to the leading front of five cells,before any cells had reached the lower surface (leading front assay) [21].
大侠，这是原文中的一部分，现在我在北京问了很多代理，买不到modified multiwell Boyden chambers ，我觉得测距离可能和modified multiwell Boyden chambers 有关，看能否帮忙知道具体怎么弄吗？那modified multiwell Boyden chambers和transwell是一个东西吗？谢谢您的帮助！

作者: is2011 时间: 2012-12-26 17:28

请教一下，结晶紫染色不固定的话怎么染啊？具体步骤是什么样？除了风干膜以外还需要注意什么吗？

作者: DONT 时间: 2012-12-26 17:29

QUOTE:

原帖由 is2011 于 2012-12-26 17:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请教一下，结晶紫染色不固定的话怎么染啊？具体步骤是什么样？除了风干膜以外还需要注意什么吗？

0.1%结晶紫染色，就是称取0.1g结晶紫，加100ml水，这是质量体积比，很简单。
染色也很简单，把膜风干了，在结晶紫里面泡半个小时就差不多了

作者: newway 时间: 2012-12-26 17:32

相关疾病：
肿瘤
非常感谢你的无私奉献！！

我打算开始做肿瘤细胞系的侵袭试验，计划用HeLa细胞，不知道这种细胞侵袭能力怎么样呢？

购买实验器材的时候，价格贵的和价格便宜的小室对实验的影响差异大吗？

看总结，感觉这个实验挺复杂的样子……如果以后的实验过程中碰到问题，可否也向您请教呢？

作者: tangxin_80 时间: 2012-12-26 17:36

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354248 BD Matrigel™ Basement Membrane Matrix High Concentration (HC), 10 ml 10 ml RUO -
354234 BD Matrigel™ Basement Membrane Matrix, 10 ml 10 ml RUO -
354230 BD Matrigel™ Basement Membrane Matrix, Growth Factor Reduced (GFR), 10 ml 10 ml RUO -
356230 BD Matrigel™ Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrigel Matrix, 5 ml 5 ml RUO -
356231 BD Matrigel™ Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrigel Matrix, Phenol Red-free, 10 ml 10 ml RUO -
354277 BD Matrigel™ hESC-qualified Matrix, 5 ml 5 ml RUO -
356234 BD Matrigel™ Matrigel Basement Membrane Matrix, 5 ml 5 ml RUO -
356235 BD Matrigel™ Matrigel Basement Membrane Matrix, 50 ml 50 ml RUO -
356237 BD Matrigel™ Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, 10 ml 10 ml RUO -
354263 BD Matrigel™ Matrix High Concentration (HC) Growth Factor Reduced 10 ml RUO -
354262 BD Matrigel™ Matrix High Concentration (HC) Phenol-Red Free 10 ml RUO -
BD公司的Matrigel有这么多种，如果用来做肿瘤细胞系细胞侵袭试验的话，用哪种呢？

作者: loli 时间: 2012-12-26 17:36

今天第一次做预实验，用的是BD公司的matrigel，是在无菌台内放4度冰袋上做的，matrigel从取出到放回—20前后也就5分钟，可1小时后我发现原来粉色的胶变黄了，请问是怎么回事，这胶还能用吗？谢谢！

作者: one 时间: 2012-12-26 17:37

请问一下0.2%的BSA是 g/ml吗？还是 g/L？

作者: qianqin1977 时间: 2012-12-26 17:38

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我打算开始做肿瘤细胞系的侵袭试验，计划用HeLa细胞，不知道这种细胞侵袭能力怎么样呢？

购买实验器材的时候，价格贵的和价格便宜的小室对实验的影响差异大吗？

看总结，感觉这个实验挺复杂的样子……如果以后的实验过程中碰到问题，可否也向您请教呢？

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计划用HeLa细胞，不知道这种细胞侵袭能力怎么样呢？可以先做个RT-PCR检测一下MMP的表达，一般来说，MMP表达高的细胞侵袭力会比较强。
不过最好还是买点Transwell来试试，必要的投资是少不了的

作者: qianqin1977 时间: 2012-12-26 17:38

请问一下0.2%的BSA是 g/ml吗？还是 g/L？

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g/ml

作者: duoduo 时间: 2012-12-26 17:39

请问：用50mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面中是用什么稀释的？谢谢！

作者: wmp1234 时间: 2012-12-26 17:40

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我想问一下，做肿瘤细胞的transwell侵袭试验最节省的要多少钱？谢谢楼主

作者: tuomu45 时间: 2012-12-26 17:40

有谁知道什么膜可以看到细胞?是看到膜上的细胞,谢谢

作者: lxh031 时间: 2012-12-26 17:40

请教各位高手有用苏木素染色的吗？膜需要干燥吗？实验前必须浸泡下transwell过夜吗？谢谢！

作者: 66小飞侠 时间: 2012-12-26 17:41

自制小室的心得：小室是重复利用的，膜是自己买的（whatman?)一百张580元，每张可以剪出4个24孔板用的膜，也就是说一块板要6张，可以做16次，先用将小室的圆大小绕小室画在纸上，剪一个膜板出来，然后再用模版剪就可以避免浪费了，以前师兄都只能剪3个，改进后就成4个了，可以省4次。然后就是把膜贴在小室上，个人建议用乙醇清洗小室，不用水，干得快。用指甲油贴上膜就好了（涂在小室口径上，不要太多，够封好就行，太多会流到膜上影响细胞闯过）。最后紫外过夜就行了。
个人觉得做小室还是挺有意思的，也有艺术感和成就感产生，是实验中休息放松的好方式。

作者: 987789 时间: 2012-12-26 17:41

你好~~
我打算做趋化实验~有问题想请教一下~

我想观察某药对细胞干预12小时后细胞趋化能力的变化~

那么，我是应该先对上室细胞干预12小时以后，再往下室加趋化因子呢？还是应该在上室加干预的同时往下室加趋化因子呢？如果是后者的话那上层的药物会不会扩散到下室去呢？

先谢谢战友啦~~

作者: 987789 时间: 2012-12-26 17:42

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有关细胞技术的热门话题——Transwell侵袭实验

应版主飘泊之邀整理此帖，在整理的过程中也学到很多知识，在此与大家分享。

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Transwell在肿瘤细胞的研究方面非常有用,但是应当注意尽量将实验做到动物,因为仅仅体外结果意义有限.

作者: hold住 时间: 2012-12-26 17:42

辛苦了很受用这个应用于细胞共培养也不错哦

作者: 98776langtao 时间: 2012-12-26 17:42

有没有比较客观的计算Transwell结果的好方法？结晶紫染色计数，总觉得不是很客观，人为因素太大

作者: 131415 时间: 2012-12-26 17:43

请问
水化基底膜的时候，要加BSA的无血清培养液，是加到上室里吗？

作者: tianmei001 时间: 2012-12-26 17:44

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我准备买corning公司的6.5mm，0.8um的Transwell，这里代理公司说要三个月，大家有没有快一点的代理公司，能告诉一下吗？我杭州的，其他地方的代理公司也可以的，谢谢大家了！

作者: xyw5 时间: 2012-12-26 17:45

为什么小室内一定要铺matrigel啊，不铺影响大吗

作者: KGZ564 时间: 2012-12-26 17:45

有没有比较客观的计算Transwell结果的好方法？结晶紫染色计数，总觉得不是很客观，人为因素太大

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用结晶紫染色计数后再加用醋酸溶液洗脱后于570nm测O.D值。我目前这么做的，感觉还不错

作者: tuuu2 时间: 2012-12-27 11:02

你好~~
我打算做趋化实验~有问题想请教一下~

我想观察某药对细胞干预12小时后细胞趋化能力的变化~

那么，我是应该先对上室细胞干预12小时以后，再往下室加趋化因子呢？还是应该在上室加干预的同时往下室加趋化因子呢？如果是后者的话那上层的药物会不会扩散到下室去呢？

先谢谢战友啦~~

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接这位战友的发言同问，既然上室那层膜允许细胞穿过到下室，那趋化因子加到上室或下室都没有什么关系了，反正溶液中的因子都可以自由穿过这层膜，同样，所谓的上室培养基和下室培养基似乎也没有区别了，因为它们因为膜的通透性而可以自由流动，那这个上、下室加趋化因子和不同培养基还有意义吗？

还有，膜的孔径如何精确选择，细胞生长在膜上，没有受趋化因子作用时不应该穿透膜而到下室，受到刺激时才变形而穿透膜到下室，那膜的孔径是否对细胞迁徙有影响，又如何界定？

作者: mickeylin 时间: 2012-12-27 11:02

你好，请问怎么样才算这个模型是否成功，需要测哪些参数，如何测量？
麻烦了，多谢多谢

作者: summerxx 时间: 2012-12-27 11:03

大家好，我想先做SiRNA，抑制目的蛋白表达，然后再做侵袭试验。现在的疑惑是转染后什么时间开始做侵袭试验比较好？有没有做过的朋友，给点经验吧。谢谢了！

作者: 8s5g 时间: 2012-12-27 11:03

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动脉粥样硬化
我做动脉粥样硬化时，淋巴细胞和巨噬细胞对平滑肌细胞的作用是不是也可以用这种技术？

作者: 66小飞侠 时间: 2012-12-27 11:05

很实用，目前有打算将血管新生的体内体外实验原理和方法研究透彻。谢谢了

作者: qhyu 时间: 2012-12-27 11:06

请问ECM554和ECM550的说明书有什么不同？会不会有细胞直接漏到下层的培养液中？

作者: utt0989 时间: 2012-12-27 11:06

lz辛苦了！很关注！我现在想做共培养的实验，关于A细胞对B细胞的影响，想请教一下依经验来说，我要把哪种细胞养在小室里比较方便检测呢？

作者: fox_79 时间: 2012-12-27 11:07

我近期准备做大鼠微血管内皮细胞的通透性研究，就是在transwell上铺单层细胞，然后室内加入FITC标记的白蛋白，观察TNF刺激后以及药物处理后单层细胞通透性的变化，准备用荧光酶标仪检测下室中的荧光强度，有文献这么做过。
我想请教下，这样的实验，应该使用什么孔径的transwell，铺什么胶比较好？我看的文献是铺的1%的明胶，难道可以不同专门的matrigel？自己铺胶有什么注意事项吗？

作者: kuaizige 时间: 2012-12-27 11:07

结晶紫染色后用醋酸洗脱后,PET膜上的细胞会被洗脱下来么??

作者: taoshengyijiu 时间: 2012-12-27 11:08

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黑色素瘤
请问下做黑色素瘤细胞侵袭试验的话用多少孔径的好呀

作者: 987789 时间: 2012-12-27 11:08

我的Matrigel只有原液凝固，而用DMEM与1640按1：2、1：4、1：8稀释后均不凝固？
问题出在什么地方？

作者: xingyi08 时间: 2012-12-27 11:09

我打算做趋化实验~有问题想请教一下~

我想观察某药对细胞干预12小时后细胞趋化能力的变化~

那么，我是应该先对上室细胞干预12小时以后，再往下室加趋化因子呢？还是应该在上室加干预的同时往下室加趋化因子呢？如果是后者的话那上层的药物会不会扩散到下室去呢？

作者: orangecake 时间: 2012-12-27 11:09

各位大侠大家上午好！我现在做的侵袭实验，我把我的实验步骤写出来，大家帮我分析一下，看存在什么问题，请大家指教，谢谢：

1.药物血清作用细胞24h以后，消化下来以10*10 4/ml铺在Transwell小室，上室100ul小室600ul 10% FBS
2.孵育24h 以后（还有的是12h).PBS 洗2遍，无水酒精固定30min,棉签小心去掉上室的细胞，风干后，苏木精染色15min，PBS冲洗2遍，1%盐酸酒精分化3-5s,PBS冲洗2遍，风干后伊红染色5min,PBS冲洗风干后显微镜下观察并照相
3.照相取5个视野，并计数取出平均值（显微镜观察时，把小室的正置于24孔板上，荧光倒置显微镜观察）
4.小室取出放到超声波里面洗涤1h,取出后紫外照射30min,继续使用。

这便是我的实验步骤了，但是染色后细胞核和细胞质都很红，分不出来，不漂亮；另外我之前只固定30min后用苏木素染色30min的时候，就是很蓝（紫）本人有点色弱，细胞核染出来了，可以分清楚，但是膜底色也很深，也不是很漂亮，所以请求大家给出宝贵意见，谢谢！！！

愿大家实验顺利进行，实验愉快！！！
Waiting for ur reply!

作者: 04906 时间: 2012-12-27 11:10

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乳腺癌
求助一个问题：我刚开始接触TRANSWELL,使用的是乳腺癌MDA-MB-231细胞系，当细胞加到上室后，细胞最终会聚集到一起，只有很少的细胞可以通过MATRIGEL到达下室，如何才能使上室的细胞均匀分布，不再聚集成团。我曾经试过减少细胞数量，米字形摇匀等，效果都不太好。
谢谢！

作者: xyw5 时间: 2012-12-27 11:10

上层培养液采用无血清培养基，为维持渗透压，需加入0.05%-0.2% BSA,加入BSA是必须的吗，刚开始做，不明白，那位大侠指点一下，谢过了

作者: greenbee 时间: 2012-12-27 11:10

最近准备做transwell, 请教各位一下：结晶紫染液如何配置浓度多少用于实验合适有无可购买到的配好的溶液烦不吝指教十分感谢

作者: greenbee 时间: 2012-12-27 11:12

最近准备做transwell, 请教各位一下：结晶紫染液如何配置浓度多少用于实验合适有无可购买到的配好的溶液烦不吝指教十分感谢

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我也很想知道!之前做这个实验,按照说明书操作,可总是染不上!

作者: star#room 时间: 2012-12-27 11:12

不同厂家不同型号的小室，膜的面积不尽相同，但个人认为，拍照时还是应当选取固定的位置，并选择尽可能多的视野。

作者: www.1 时间: 2012-12-27 11:13

我最近做侵袭实验我的Matrigel（356234 BD Matrigel™ Matrigel Basement Membrane Matrix, 5 ml 5 ml RUO - ）只有原液凝固，而用高糖DMEM按1：2、1：3稀释后均不凝固？
问题出在什么地方？

请高人指教

作者: 49888 时间: 2012-12-27 11:19

我也很想知道!之前做这个实验,按照说明书操作,可总是染不上!

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同问，另外弱问一句，如果需要将膜风干，那干掉后，细胞的形态会变吗？不会破掉吗？

作者: zzzz 时间: 2012-12-27 11:20

用结晶紫染色计数后再加用醋酸溶液洗脱后于570nm测O.D值。我目前这么做的，感觉还不错

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其实这样也未必更好，没有细胞的地方也会染上色，如果穿过的细胞量多还可以，细胞量少用这种方法就不准确了。

作者: zzzz 时间: 2012-12-27 11:20

你好~~
我打算做趋化实验~有问题想请教一下~

我想观察某药对细胞干预12小时后细胞趋化能力的变化~

那么，我是应该先对上室细胞干预12小时以后，再往下室加趋化因子呢？还是应该在上室加干预的同时往下室加趋化因子呢？如果是后者的话那上层的药物会不会扩散到下室去呢？

先谢谢战友啦~~

这个我也想知道，请指教！

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共同的疑问！之前说趋化因子扩散需要一定的时间，谁考证过这个时间是多久啊？

作者: ha111 时间: 2012-12-27 12:16

请教各位，我准备做一种药物对细胞侵袭力的抑制作用，请问怎么加入不同浓度的药，何时加药合适？

作者: jujuba 时间: 2012-12-27 12:17

首先要明确你的实验目的，是做什么实验？侵袭？迁移？共培养？
会不会混在一起，关键是看你的膜上有没有胶，如果有胶是不会混起来的，但如果没胶，应该是能混起来的，不过培养液的相互扩散也是要很长时间的。
另外也要看你的实验目的，是迁移还是共培养？我做迁移，会先在上室加入细胞悬液，过一两个小时再在下室加培养液。如果是做共培养，要把上下室先分开培养，上下室细胞分别贴壁后在放到一起。
如果你是做共培养，不就是要把培养液混在一起吗？否则怎么反映一种细胞分泌的因子对另一种细胞的影响?
如果是共培养，细胞放下层应该也是可以的，如果是做侵袭迁移，当然就不能放下层了。

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老师好！我也是准备做两种细胞的共培养，想请教：需不需要铺胶？铺胶到底是什么作用？

作者: bring 时间: 2012-12-27 12:20

BSA可以用WB中用过的吗？

作者: cj_mondy 时间: 2012-12-27 12:20

请问论坛上做过细胞侵袭试验用得细胞外基质BD Matrigel™ Basement Membrane Matirx
好像是比较经典的但价格也比较贵，1800元/5毫升，看生物在线有 matrivgel matrigel膜基质，威格拉斯生物技术（北京）有限公司的，网上评论也还可以，价格 1200元/ 5毫升，不知道有没有战友用过，这个胶怎么样，感谢大家帮助知道 ---，或者有其他公司的价格质量还可以的推荐下

作者: avi317 时间: 2012-12-27 12:27

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肿瘤
我想做肿瘤侵袭实验，药物应该放在下室还是上室，还是两个都要放呢？

作者: ha111 时间: 2012-12-27 12:27

但是问问题的人不多，回答的也不多，感觉不够精华，呵呵，希望大家共同交流实验心得，共同进步，高手们也能够多多指导我们这些菜鸟，呵呵，先说声谢谢

作者: zhenxin 时间: 2012-12-27 12:28

做贴壁细胞迁移实验时总觉得擦去上室面细胞擦不干净，周围的细胞聚集，中间没有或很少，反复擦几次上室面后，整个膜上着色细胞一个都不剩（迁移时间从8h-18h不等，一次都不成功）不知各位高手如何处理这个问题？到底如何分辨上室or下室着色？？？

作者: INK 时间: 2012-12-27 12:29

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上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，但与肿瘤细胞迁移实验不同的是，聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶，用以模仿体内细胞外基质，细胞欲进入下室，先要分泌基质金属蛋白酶（MMPs）将基质胶降解，方可通过聚碳酸酯膜。计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的侵袭能力。
下面这个链接是我关于侵袭研究方面的一个比较形象的解释。
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=7453397&sty=3&keywords=transwell')

以上是Transwell的一些常见的应用，Transwell的其他作用可参阅guxuefeng战友和cosmosci战友的帖子。

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您好，有个问题向您请教：
我最近在做细胞侵袭和迁移实验，一直没有成功（用棉花擦的时候，transwell 内侧的细胞有好多，基本都擦掉了，而外侧基本没有），想向您请教一下原因。
1 我做的是B16 细胞系，在您的论述中提到，细胞在迁移的过程中，要分泌mmps,将基质胶降解，方可通过聚碳酸酯膜,但在对B16细胞进行mmp1的PCR试验中，没有mmp1基因的表达，不知道是否是这个原因影响细胞迁移实验？
2 在加入全培养基的时候，时间有没有什么要求？我是先加入200ul 双无血清，密度 1x10 5,24孔培养皿，每孔加入1ml 全培养基。
3 甲醇固定的时候，我用的是2min,然后取出来，室温风干，风干要达到什么程度？

其实最重要的就是找不到原因，细胞几乎都没有转移过去，希望大家帮我分析一下，万分感谢！！！

作者: owanaka 时间: 2012-12-27 12:29

结晶紫染色能否把膜上的孔染色，发现有许多和孔差不多大的也染色了，不知是孔还是细胞？

作者: xue258 时间: 2012-12-27 12:30

有人做关于A549细胞侵袭实验的吗，文献上没查到，不知道这个细胞能不能用，理论上它是具有侵袭性的（MMP-2高表达）。请哪位有实际经验的帮帮忙分析一下，马上就要开始实验了，导师说阴性结果也有意义，但是我还是很担心啊。请大家帮帮忙，小妹不胜感激。

作者: 04906 时间: 2012-12-27 12:30

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头痛
楼主都消失了，怎么样各处理组计数准确呀？真是令人头痛的大问题，细胞计数板的结果误差很大，10%以上，结果很不稳定

作者: wood533 时间: 2012-12-27 12:31

一般每个孔加入多少的胶？

作者: 33号 时间: 2012-12-27 12:31

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肿瘤
请问我想做肿瘤的侵袭实验，想用BD公司的基质胶看到有好几种有BD Matrigel Matrix 、还有BD Matrigel Matrix Growth Factor Reduced ，这两种我应该选择哪种啊？

作者: newway 时间: 2012-12-27 12:31

想做细菌侵袭的transwell实验，查了很多文献，都没有什么很详细的解释，请问哪位大侠做过有关的实验，能不能给一些指点？
万分感谢！！

作者: 9900 时间: 2012-12-27 12:33

请问一下下室细胞成团怎么办啊？铺胶要注意哪些细节让胶铺得均匀？

作者: ending 时间: 2012-12-27 12:33

1、每个transwell小室加100ulDMEM, 外室500ul DMEM 使膜亲水，孵箱温育过夜；

2、同时消化细胞，用DMEM重悬细胞；

3、细胞计数（106/ml），稀释成105/ml的细胞悬液；

4、弃小室内的DMEM旧液（切勿触及底部的膜），加100ul细胞悬液，孵育2小时利于贴壁；

5、下室以500ul DMEM替换旧液，刺激1小时；

6、小室边缘标记，收集细胞，取新的24孔板，每孔各加500ul甲醇，备用；

7、棉签清理旧培养液及附着在小室膜内面的细胞，重复2次；

8、 PBS清洗小室内槽2次，棉签吸干；

9、 Transwell小室浸入甲醇，固定10min；同时去载玻片做好标记，备用；

10、上室倒置晾干后，浸入置有250ul瑞氏染液的24孔板，振荡，保证充分接触8分钟；

11、 ddH2O清洗上室两遍，漂洗膜细胞面，晾干；

12、将膜取下，细胞面朝上放置于载玻片上，指甲油封片，镜下计数。
以上为小弟的实验步骤，镜下观察未见染色细胞，求各位前辈指点~

作者: BUK 时间: 2012-12-27 12:34

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肿瘤
您好，请教您一个问题，我查BD公司的matigel有不同类型的，其中做肿瘤侵袭的是高浓度的，有必要吗？还是用标准版的？

作者: KGZ564 时间: 2012-12-27 12:35

2.1.1无基质胶Transwell小室制备

① 包被基底膜：

用50mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃风干。

② 水化基底膜：

吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37℃，30min。

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有一点我不太明白，4℃时Matrigel 不是呈溶解状态吗，在第二步水化基底膜吸出培养板中残余液体后不是把所有的胶都吸出来了吗？是不是笔误啊。

作者: wsll 时间: 2012-12-27 12:36

相关疾病：
头痛

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楼主都消失了，怎么样各处理组计数准确呀？真是令人头痛的大问题，细胞计数板的结果误差很大，10%以上，结果很不稳定

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如果对计数不是很有信心的话，可以先染色，镜下观察细胞接种的密度。然后再擦去上层细胞，观察转移过去的细胞。
细胞计数很不可靠，误差很难控制在10%一下，在考虑到消化细胞时操作问题引起的细胞状态差别，所以一般组间差异超过50%的结果才能比较确定（个人看法，欢迎同学们拍砖哈）。
现在有细胞计数仪卖，不过很出血的，蛋疼的研究生们伤不起啊！
祝好运！

作者: DDD 时间: 2012-12-27 12:38

上面是用Nikon SMZ1000显微镜配套的数码相机直接对膜下室侧进行拍摄得到的照片，左图是对照组，中间是1/3 72h IC50的浓度处理组，右图是72h IC50的浓度处理组，接种细胞后同时加入药物，培养24h，结晶紫染色。随着药物浓度增加，穿过的细胞减少，侵袭力明显受到抑制。
请问药物是加在哪一层？下面一层么？上面一层铺细胞用的是什么培液呢？是无血清的培养基么？那么下层呢？是加入FBS的同时再加入不同浓度的药物么？那么用的FBS是多少浓度的呢？

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这是做抑制实验，如果我做的是促进侵袭的实验呢？上层和下层的培养基分别用什么呢？望指点。

作者: DDD 时间: 2012-12-27 12:39

用结晶紫染色计数后再加用醋酸溶液洗脱后于570nm测O.D值。我目前这么做的，感觉还不错

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请问，使用脱色的醋酸浓度是多少呢？需要的量是多少呢？要如何脱色，控制在多少分钟？取多少量去测OD值？

作者: IAM007 时间: 2012-12-27 12:40

楼主经验丰富！我想问一个问题，就是做Transwell Migration 与Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ　－Ｉｎｖａｔｉｏｎ时拍出来的照片你怎么辨别哪个是Ｍ哪个是Ｉｎｖａｔｉｏｎ？

作者: 131415 时间: 2012-12-27 12:40

我们实验室用xCELLigence DP系统做细胞迁移和侵袭实验，非常方便，无需染色即可实时看到细胞迁移的过程。

作者: zranqi_1 时间: 2012-12-27 12:41

楼主您好，我的细胞是血液肿瘤细胞，属于悬浮细胞，我想做它的迁移力，请问：1、每个小室加多少个细胞合适？2、我观察穿过膜的细胞应该看膜上的还是下室的？非常感谢！

作者: hustwb 时间: 2012-12-27 12:41

相关疾病：
肿瘤
请问，我想看看间质细胞上清对肿瘤侵袭的影响，是把上清加上层还是下层呢，我原来是加上层的，下层加FBS，也有阳性结果，但是看大家都写加在下层，我又觉得肿瘤没必要往间质细胞跑啊，请教一下高手们，是不是有什么说法，谢谢

作者: xue258 时间: 2012-12-27 12:42

2．步骤
2．1 Transwell小室制备
2．1．1 无基质胶Transwell小室制备
① 包被基底膜：
用50mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃风干。如果需要在下室面铺FN的话，可将200ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。用胶原（collagen）的话，一般配成0.5mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。
② 水化基底膜：
吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37℃，30min。
另有tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9ug/ul) 60-80?l (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37℃ 30min使Matrigel聚合成凝胶。

2．1．2 有基质胶的Transwell小室制备
Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300?l预温的无血清培养基，室温下静置15－30min，使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。

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请教战友，Matrigel包被过的小室还算是无基底膜小室吗？这是不是矛盾诶

作者: yes4 时间: 2012-12-27 12:42

请教楼主啊，我想用3微米的小室做共培养，想研究B分泌的细胞因子对A的影响，按照实验指导，应该把A种于上室，B种于下室，但是由于上室空间有限，我所要接种的A细胞数量将为B的5倍，所以想将A种于下室，B种于上室，这样能达到效果吗？

作者: ffooll 时间: 2012-12-27 12:43

做侵袭的时候是否能有乙醇代替甲醛？

作者: tuomu45 时间: 2012-12-27 12:44

请教楼主啊，我想用3微米的小室做共培养，想研究B分泌的细胞因子对A的影响，按照实验指导，应该把A种于上室，B种于下室，但是由于上室空间有限，我所要接种的A细胞数量将为B的5倍，所以想将A种于下室，B种于上室，这样能达到效果吗？

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我也是做的和你差不多的试验，我也很疑惑，这种试验，一定要把A放在上面吗？

作者: xueyouzhang 时间: 2012-12-27 12:44

感动得泪流满面啊。。找了很久的资料都摸不清头脑，此贴关于迁移和侵袭的相关信息应有尽有哇！！！

作者: 阿司匹林 时间: 2012-12-27 12:45

请教一下用OD值如何计算细胞数啊？

作者: ero11 时间: 2012-12-27 12:45

请问大家transwell用的什么公司？多大孔径？货号多少？我用的millipore的8μm的，在显微镜下仅能看到隐隐约约的细胞轮廓，细胞迁移后用结晶紫染色结果看不到有细胞被染上，但是在皿里细胞可以被染上，所以这说明结晶紫没问题，用DAPI染transwell可以看到迁移的细胞可见，细胞也已经迁移到膜的底层了。我分析是不是因为transwell的材质不是完全透明的所以遮挡了结晶紫的颜色？应该用透明的transwell?

作者: Ao7 时间: 2012-12-27 12:46

现在我们做细胞迁移和浸润，已经不用这个方法了，我们的新方法是引进了一个比较新的技术，可实现迁移浸润的自动检测，分享几个图，欢迎大家交流

图片说明：A. 不同浓度梯度的VEGF介导的HUVEC细胞迁移。B. 不同浓度梯度的HGF介导的HUVEC细胞迁移。C和D分别是软件自动计算的VEGF和HGF诱导的时间依赖的EC50值。
该技术可实现细胞迁移浸润的实时监测，提供了大量的生物学信息，通过这个实验，我的后续实验设计得到了优化，不用再做大量的预实验了。
实验步骤也比较简单，只需将含血清的培养基加入检测板下室，然后消化细胞、细胞计数并加入到检测板的上室中。就可以进行自动检测了，非常方便。

图片附件: 34151731.snap.jpg (2012-12-27 12:46, 37.4 KB) / 该附件被下载次数 9
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