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标题: 【求助】请高手帮忙看看细胞是不是支原体污染？ [打印本页]

作者: 北风那个吹 时间: 2013-1-4 12:08 标题: 【求助】请高手帮忙看看细胞是不是支原体污染？

这段时间培养细胞胞内核外出现明显黑色小颗粒，培养基中也有，高倍镜下观察发现培养基中颗粒多做类似布朗运动的扭动，胞内核外颗粒则运动不明显。细胞状态欠佳，但生长速度不受影响，培养基也未曾浑浊，怀疑支原体污染。做荧光染色（DAPI核染），荧光显微镜下观察细胞表面可见明显蓝色小亮点，细胞间和核表面也有少许。
请各位大虾帮忙看看是不是支原体污染，有没有什么好的处理方案，谢谢！
另外，想请问下DAPI应该只染DNA，为什么我的染色核外还有一圈浅蓝色类似胞质的结构？如果不是胞质着色，那又是什么？

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作者: 北风那个吹 时间: 2013-1-4 12:09

图2，这张左上方胞内可见明显蓝色小亮点（颜色深度等同胞核染色），左下方和右上方主要集中在细胞表面

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作者: 北风那个吹 时间: 2013-1-4 12:09

图3

附：每张图片对应一种细胞

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作者: 北风那个吹 时间: 2013-1-4 12:10

图4，图片下方蓝色小亮点主要集中在细胞表面，散在分布；图片中间偏上方细胞间隙有2-3个散在蓝色小亮点

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作者: 北风那个吹 时间: 2013-1-4 12:10

图5，蓝色小亮点主要集中在图片左边细胞

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作者: 北风那个吹 时间: 2013-1-4 12:10

图6，蓝色小亮点集中在图片中间细胞表面

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作者: 北风那个吹 时间: 2013-1-4 12:11

图7，图片下方拉得老长的丝状结构是什么？

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作者: 北风那个吹 时间: 2013-1-4 12:11

图8，图片左边黑色背景下散在的蓝色小亮点

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作者: 北风那个吹 时间: 2013-1-4 12:12

图9，蓝色小亮点集中在图片左边细胞表面，下方细胞间隙也可见

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作者: 北风那个吹 时间: 2013-1-4 12:12

图10，黑色背景下散在明显蓝色小亮点

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作者: abc816 时间: 2013-1-4 12:13

相关疾病：
感染
拉丝可能是细胞接近死亡或状态不好时的凋谢产物，如果细胞大面积脱落，可能是细胞传代过多状态不好所致，也可能是长时间不换液或密度过大所致，但加上染色中出现的结果看来，细胞更像是感染了霉菌，以前我也出现过这种情况，是霉菌感染的结果。

作者: 北风那个吹 时间: 2013-1-4 12:13

我觉得不是霉菌污染，细胞培养至出现明显黑色颗粒到现在基本有一个月了，细胞生长速度完全没受影响，只是状态不佳，也没在培养基中看到纵横交错的菌丝，若是霉菌污染，细胞现在早该死掉了。

作者: duoduo 时间: 2013-1-4 12:14

好像是支原体污染
具体请看这个web site
cuturl('http://www.bioon.com/experiment/faq/80858.shtml')
不过最终确定，你需要买一个支原体检测试剂盒，我们实验室以前用过一个，好像还不错，就是做个PCR就好了，也有一些防治支原体的药有得卖，我记得精美就有，可以试试。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14514

作者: 北风那个吹 时间: 2013-1-4 12:14

恩，我这两天在做PCR检测，结果若也是阳性，基本肯定了。

不知对于支原体消除大家有什么比较有效的建议，象BM-Cyclin、Plasmocin如何？我用过环丙10ug/ml，效果不佳。

另外，抗生素能彻底消除支原体吗？

作者: xue258 时间: 2013-1-4 12:15

我的细胞目前也出现类似的黑色小颗粒，请问楼主你说的黑色小颗粒在低倍镜（40倍）能看的见吗？我培养基的黑色小颗粒在40倍就能看到，200倍观察发现做布郎运动，细胞内部也有（主要在核周围），基本上不影响细胞生长。但是传代或刺激（例如转染）的时候会出现很多。
我有以下观点跟楼主商榷：
1.支原体在光学显微镜下看不到吧，40倍光镜能看到支原体吗？
2.细胞内部也有，在细胞死亡的时候（例如转染，传代等刺激）培养基里黑色小颗粒会多一点出现。我怀疑是细胞裂解产生的颗粒。

作者: bs4665 时间: 2013-1-4 12:15

按理讲支原体是不可见的，所以通常都是染DNA后在荧光显微镜下观察细胞核外是否有荧光。当然，如果要确定，最好还是用检测试剂盒看看。
小黑点我也不知道是什么东西，我曾经观察到在用胰酶消化细胞的时候，有细胞破裂，细胞内释放出很多小黑点样的东西。但是奇怪的是我用防治支原体的药处理一段时间后，细胞明显变得“干净”很多，细胞内和细胞外的小黑点都明显降低了。
但是这些小黑点是什么呢？

作者: bs4665 时间: 2013-1-4 12:16

通常不推荐使用抗生素，因为容易产生抗药性，然后你的细胞做的实验结果就会被质疑。

作者: 北风那个吹 时间: 2013-1-4 12:16

按照常理，支原体在光镜下是不能被观察到的，我的细胞现在低倍镜下能看到小黑点，高倍镜下能观察到黑店的布朗运动，荧光染色在细胞表面及细胞间可见荧光小点，PCR检测培养上清做膜板阴性，想抽提DNA试试。

作者: 北风那个吹 时间: 2013-1-4 12:17

用了抗生素（环丙）没见明显改善，不用细胞结果也会收到质疑，既然如此还是用吧，顺便可以进一步确定是否是支原体污染

作者: zsxan1990 时间: 2013-1-4 12:18

我认为仅凭DAPI染色不能确定是支原体污染,你换液时多用PBS(或者培养基)冲几遍,我的细胞传代的时候会出现黑色小颗粒,但过夜PBS冲洗换液后就基本上没有了，也没长起来.

作者: 北风那个吹 时间: 2013-1-4 12:18

再传一张照片供大家看看，帮忙顶顶！

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14515

作者: 北风那个吹 时间: 2013-1-4 12:19

我觉得这张很典型，大虾帮忙分析一下

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14516

作者: dongdongqiang 时间: 2013-1-4 12:19

支原体的问题是比较复杂，通常没有经验的人很难判断。
我建议你看看我上面给的链接以及那个网页内部的链接，那里面有不少有用的知识可供大家一起研究，学习和探讨。至于确定支原体污染，我觉得PCR的方法还是比较可信的，你要不放心，可以再做几次，同时一定做好正、负对照。
感觉你的DAPI染色的细胞还是蛮像是支原体污染。“若有支原体污染，在Vero细胞核外与细胞表面会出现蓝色萤光小点或是丝状点。其形状一致，与细胞残片染成之不规则点状物不同。”这个是那个网站上的原话。

作者: sunnyB 时间: 2013-1-4 12:20

我用过Plasmocin 来杀支原体，细胞传的尽量稀，用25μg/ml的浓度处理2周，情况会有明显的好转，但是完全杀灭很难，还需要挑单克隆，得到没有污染的细胞，但是从你的图片看，不怎么象支原体污染，可能是你DAPI浓度太高，产生的非特异的细胞质着色。

作者: xingyi08 时间: 2013-1-4 12:21

我也遇到这种情况，我们这的老专家说这是血清中的黑胶虫，不太好去掉

作者: H2O 时间: 2013-1-4 12:21

QUOTE:

原帖由 xingyi08 于 2013-1-4 12:21 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我也遇到这种情况，我们这的老专家说这是血清中的黑胶虫，不太好去掉

一年以前，我们实验室的细胞也出现这种情况，一直没有办法根除，上网检索的结果基本确定为黑胶虫。最后几乎所有的细胞都被污染，很是痛心...
楼主可在园子里，以“黑胶虫”为关键词检索参考。
另外还有如下的情况供参考：
1）血清浓度很低，甚至无血清时，平板很快就被铺满，甚至出现絮状的东东，细胞玩完；
2）消化细胞时，用低浓度的胰酶可以在细胞未脱落时洗掉一部分，换液频繁一点时，可以遏制一定程度不能除掉；
3）建议楼主仔细排查实验的每一环节，特别是配制培养基的用水等细节，因为我们后来从上海、北京引来的细胞在换用我们的培养基传代几次之后也出现类似情况；
4）刚开始用过一段时间的大扶康注射液（用量记不太清了，不好意思），有点儿效果但不是很理想；
5）个人感觉，夏天，可能是空气湿度太大的原因，细胞的状态普遍不是很好，容易出现问题。
关注此帖，祝楼主好运。有好消息，别忘了及时分享：）

作者: 生物迷 时间: 2013-1-4 12:21

有可能是支原体污染,也有可能是血清里的微生物影响
你可以换一批血清试试!

作者: 北风那个吹 时间: 2013-1-4 12:22

现在大家意见主要分两种：支原体或者“黑胶虫”，我倾向前者，目前黑胶虫没有确切的定义，检测和处理方式，我只能先按支原体处理，安排检测和治疗同步进行：
PCR检测支原体，尽可能抽提DNA作为膜板；
定购了BM-Cyclin和Plasmocin，到货后准备分别加药做对照

大家还有什么好的建议，请与我分享，谢啦！

作者: 8s5g 时间: 2013-1-4 12:22

支原体很小，肉眼看不到的，检测支原体污染，可以用支原体检测试剂盒，我们实验室就有自己研发的这种试剂盒，我们自己都用的，每次冻存细胞之前都会检测一下，也对外销售，有需要可以联系我哦，我可不是做广告啊，偶是研三的学生。
如果污染了，可以用专门灭支源体的东东加进培养液杀，不过需要一段时间才能完全消灭，不过因为我没污染过，亲自没用过，不过我看实验室有人再用，好像一个月左右就可以了。不过据说灭过支原体的细胞今后也很容易复发的……

作者: 北风那个吹 时间: 2013-1-4 12:23

QUOTE:

原帖由 8s5g 于 2013-1-4 12:22 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

支原体很小，肉眼看不到的，检测支原体污染，可以用支原体检测试剂盒，我们实验室就有自己研发的这种试剂盒，我们自己都用的，每次冻存细胞之前都会检测一下，也对外销售，有需要可以联系我哦，我可不是做广告啊，偶是研三的学生。
如果 ...

你们实验室用的是什么试剂盒？

作者: 987789 时间: 2013-1-4 12:24

有可能是黑胶虫污染，40倍荧光显微镜下可见它们到处游动，不是呈布朗运动，现在的血清里多少都会有黑胶虫污染，无法清除；有可能是支原体污染，建议用双抗与卡那霉素或四环素高倍剂量联用，但要根除很难。

作者: kuohao17 时间: 2013-1-4 12:25

首先声明我做细胞应该算是老手。
细胞生长不好的原因很多——
1：细胞欺负生手，也就是，消化、吹打操作还有有一定影响的。当然，从上述帖子主人叙述看，贴主不应该是生手，因此，细胞生长不太好可以排除操作问题；
2：细胞生长不好与培养基直接相关，培养基中影响最为严重的就是牛血清。不知道贴主的牛血清是什么牌子？
3：支原体污染也是重要原因。但是正如上面朋友讲的，支原体在普通光学显微镜下是读不到的。我曾经检测过支原体污染，用的是牛心浸出液，即：将牛心去结缔组织，剁碎，浸煮，过滤，然后加琼脂成半固体。将细胞培养液做穿刺接种，有支原体者，围绕穿刺管道，会长出云雾状菌落。
4：细菌污染：有个别情况，细菌生长非常缓慢，似乎不太使细胞培养液体混浊，这个情况我遇到过多次；
5：环境：细胞生长不好的时候，千万记住要观察培养箱的二氧化碳的含量和温度。尤其温度，一定要看温度计，而不是看他数字显示。二氧化碳的含量可以从你培养细胞的颜色上观察，如果细胞还很稀疏液体就很黄了，多是因为二氧化碳的含量过高。当然，要同时观察多瓶细胞，而不是一瓶。
6：还有，消化液不合适也影响
7：还曾经遇到洗液配制不合适.
我们实验室的网站：百度搜索“贰拾面体”，进入后点击首页就到

作者: 大尾巴 时间: 2013-1-4 12:25

我倾向于黑胶虫污染

作者: bling 时间: 2013-1-4 12:26

从以上提供的DAPI染色来看，支原体污染不典型，不太像．特别是胞外的染色，倒是像细胞碎片．有试剂盒看看吧．＜个人意见，仅供参考＞

作者: wood533 时间: 2013-1-4 12:27

首先觉得这个问题应该广泛讨论，我想很多做细胞实验的人都可能遇到过这种情况，一直以来也没有一个确定的说法，细胞培养虽然说操作简单，但涉及到方方面面，对很多培养细胞的老手来讲这也是个棘手的问题，楼主这个问题很好，体现了对科研的认真态度，图片讲解的很细致。
我曾经也遇过这种情况，较同意贰拾面体的观点。
惭愧至今我也没弄明白是怎么回事，但记得当初我用的是两性霉素和青链霉素，是对付支原体的，效果不错，之后的细胞背景趋好。我也曾怀疑是黑胶虫，但未找到合适的证明根据。
以上是个人的一点体会，望有高人指点！

作者: 黄花菜 时间: 2013-1-4 12:27

你们用的是什么试剂盒啊，是什么价格的呢？我是研二的学生，现在正在养细胞做生物学检测，是个新手吧，看见这个帖子很好，关注！问过师兄貌似不是支源体污染，另外个人认为两性霉素和青链霉素对支原体效果不是很理想，起码我们这里是．

作者: wood533 时间: 2013-1-4 12:28

我的细胞也是这样，培养液不变黄，细胞生长基本不受限制。我师姐也说是所谓的黑焦虫，与细胞共生，这主要与血清有关，微孔过滤器也除不掉，只能尽早结束试验了

作者: greenbee 时间: 2013-1-4 12:28

你用的血清是经透析处理的吧?

作者: 北风那个吹 时间: 2013-1-4 12:29

1. 我们用PAA的FBS和dFBS；
2. 基本排除细菌污染，因为这种现象持续至今已有1个多月，若是细菌应该早就爆发，之前在园内看到一些帖子提到类似现象可能是洋葱伯克霍尔德菌污染，我不了解这种细菌的生物特性，不知大家意见如何？
3. 我们的培养箱半个月前检测过一次，显示温度和二氧化碳显示和实际相符，所有可以排除由培养箱导致的细胞生长不良；
4. 有人提出是血清问题，但我撤掉血清后黑色小颗粒现象反倒加重，在某种程度上说明血清对其有抑制作用，所以我不完全同意是单纯的血清问题

作者: okhaha 时间: 2013-1-4 12:29

我们实验室在几个月前也碰到这个情况，当时我们三个培养箱的细胞全部有这个现象，H33258染色比你这个还明显，拉丝和小点非常多。我采取了两个步骤，现在基本没问题了。
1。换血清。我非常怀疑PAA的血清质量（标准血清，特级的好像没事）。我们实验室之前一直用的Hyclone的血清，换成PAA血清数月后出现这个情况，我还听到一些其它实验室用这个血清也出问题。

2。Plasmocin处理（Invivogen公司)。换血清后细胞状态有所好转，但经常反复。细胞间彻底消毒，常用好要的细胞统统扔掉，非常珍贵的不能扔的细胞用Plasmocin治疗，其它新要的细胞用预防剂量预防。效果明显，现在已经恢复正常了。

不过有一点，治疗过的细胞生长状态非常好，也没有杂质，但染色核外仍有信号，不知道为什么。

这是我的切身经验，希望对你有用。

作者: 北风那个吹 时间: 2013-1-4 12:30

请问你使用Plasmocin治疗的具体方案是什么？我这边已经使用过这个药，25ug/ml连用3周，似乎没什么效果。

作者: bling 时间: 2013-1-4 12:31

没有效果？就是按说明书上的用量正常培养，见效非常快。你可以适当加大点浓度。
另外我建议你换掉PAA的血清，我严重怀疑它。

作者: vcve 时间: 2013-1-4 12:31

请问你使用Plasmocin治疗的具体方案是什么？我这边已经使用过这个药，25ug/ml连用3周，似乎没什么效果。

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根据你提供的图来看根本不是支原体污染，Plasmocin当然没有效果了，我认为是你染色的问题，背景太高。

作者: 33号 时间: 2013-1-4 12:32

这些讨厌的黑东西我也碰过，开始以为是细菌污染，于培养液里加了双抗：青霉素和链霉素，没用。不过现在天气凉了，好像又没了。

作者: nut6694 时间: 2013-1-4 12:32

你们实验室用的是什么试剂盒？

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这是我导师实验室开发的试剂盒，你可以看看，不是广告哦
cuturl('http://www.hdbiosciences.com/ChnMycoplasma.htm')

作者: greenbee 时间: 2013-1-4 12:32

我觉得你的是支原体污染，从荧光染色结果来看，结果很符合，做一下分子学鉴定就可以知道的

作者: hold住 时间: 2013-1-4 12:33

是不是支原体，取培养基做个PCR或者买个支原体检测的kit就好了。

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