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标题: 【讨论帖】流式细胞仪的应用交流,贴出你的经验 [打印本页]

作者: 算盘阿星 时间: 2013-1-13 16:43 标题: 【讨论帖】流式细胞仪的应用交流,贴出你的经验

各位朋友,近来接触了流式细胞仪,碰到了很多同学在做这方面的实验,说实话,国内大多数的实验的应用都还是很简单的,但是不少人走了很多弯路,浪费了很大的人力,物力,财力.最后还要挨老板的批,开此贴,希望能对实验人员有益.说出我的经验,提出你的问题,,,,,,,,,我们在路上!

作者: @STAR@ 时间: 2013-1-13 16:43

流式细胞怎么检测某种表位阳性细胞在所有细胞中的纯度？

作者: 算盘阿星 时间: 2013-1-13 16:43

你所提的这个问题是流式目前应用最多的实验,前提条件:
1)某种表位阳性细胞有合适的荧光标记抗体.
2)所有的细胞这个概念比较模糊,在流式分析中,可以精确到某个亚群/某系/收集的所有细胞等多种说法,这个数据可以通过设门很容易得到.

不知道这个答复你是否能理解?

作者: 算盘阿星 时间: 2013-1-13 16:44

<一>用流式细胞仪分析未知浓度溶液中细胞数量的方法

取二份正常人的外周血,A份WBC计数在4*10~9个/L,B份WBC计数在10*10~9个/L,此数据可以用三分类或五分类血细胞分析仪器分析得到.每份上述血样取50ul加入流式管中,加入450ul溶血素,混匀,室温避光放置10min.上机器.未知样品C取50ul加入流式管中,加入450ul溶血素/PBS(提取细胞),混匀,室温避光放置10min.上机器分析:
原始细胞浓度分析细胞速度(相同取样体积,相同添加体积,相同上样速度)
A 4*10^9 L M
B 10*10^9 L N
C ??? H

???=Y=10^9[10+6(X-N) /(N-M)],代入H=X，即可计算出未知浓度溶液中细胞的数量。

这个方法很简单,能够计算细胞的大概浓度,有助于我们进行下一步的确定细胞和抗体的用量.

当然,计数细胞的浓度还有其他办法,常见的有牛鲍氏计数盘等.

作者: glass 时间: 2013-1-13 16:44

我用流式细胞仪做细胞周期，想问一下，为什么我做出的图上看不到G2峰呢？
这可能是什么原因呢？
还有就是G1峰的CV值偏大，>8% 大概在9.6%，如何才能改进呢？
谢谢

作者: 算盘阿星 时间: 2013-1-13 16:44

首先解决第一个问题：
1）G1峰的CV值偏大，>8% 大概在9.6%
流式分析细胞周期的要求是G1期的CV小于8%，CV过大，分析的结果基本就不可靠了.在评估你实验样本的CV的时候，你应该要求仪器的实验人员用微球（仪器厂商提供）或者细胞周期检测试剂中的鸡红细胞等检测仪器的CV值，一般要求在3%以内才可以接受然后进行实验样品的检测。如果这个过程评估没有问题，再考虑样品的是否存在问题并且再去想问题解决它。

2)G2M期看不到的问题比较复杂，首先要能检测到G0G1期细胞的峰，G2M期的出现和你的细胞状态有关，非常有可能你所检测的样本不存在这个周期的细胞，这与你的细胞选择，细胞处理过程，刺激过程等有关。

作者: www.1 时间: 2013-1-13 16:45

体外校正和体内校正，怎么做

作者: 算盘阿星 时间: 2013-1-13 16:45

体外校正和体内校正，怎么做

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你所说的这个校正是什么意思，能解释下吗

作者: 算盘阿星 时间: 2013-1-13 16:46

体外校正和体内校正，怎么做

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你所说的这个校正是什么意思，能解释下吗

作者: fox_79 时间: 2013-1-13 16:46

流式细胞术检测RAW 264.7细胞表面TLR4受体表达变化情况

各位老师我准备用TLR4的一抗和荧光素二抗来标记胞膜表面受体然后用流式细胞术测得的荧光强度或带荧光的细胞个数来判定胞膜TLR4受体表达量改变情况但由于巨噬细胞吞噬能力很强我必须在保证包膜表面蛋白标记的同时尽量避免非特异性吞噬产生胞内TLR4标记干扰（疑问：流式细胞术能否测的胞内的荧光物质？）由于之前没有做过相关的实验请各位老师能提供比较详细一点的操作步骤介绍
同时我还看到文献中有以一抗同源IgG 作为对照的这个对照是什么目的？

作者: jkobn 时间: 2013-1-13 16:47

校正包括体内和体外校正通过校正曲线校准曲线是通过含有活化形式非酷类钙离子指示剂的钙离子缓冲液得到的EDTA-Ca2+缓冲液是最常用的用于校准的钙指示剂.可是我们老师觉得这种方法并不准确

作者: 04906 时间: 2013-1-13 16:47

流式细胞术检测RAW 264.7细胞表面TLR4受体表达变化情况

各位老师我准备用TLR4的一抗和荧光素二抗来标记胞膜表面受体然后用流式细胞术测得的荧光强度或带荧光的细胞个数来判定胞膜TLR4受体表达量改变情况但由于巨噬细胞吞噬能力很强我必须在保证包膜表面蛋白标记的同时尽量避免非特异性吞噬产生胞内TLR4标记干扰（疑问：流式细胞术能否测的胞内的荧光物质？）由于之前没有做过相关的实验请各位老师能提供比较详细一点的操作步骤介绍
同时我还看到文献中有以一抗同源IgG 作为对照的这个对照是什么目的？

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胞内有荧光的话，也会被检测到的。
巨噬细胞吞噬，是在37度条件下进行的，你试验如果不需要37度孵育的话，那就全程冰上操作，这样会尽量减少巨噬细胞吞噬。
还有，能用已经标记好荧光的TLR4抗体么，应该是有的，这样会好点，直标比间标好点，如果能的话。

作者: 04906 时间: 2013-1-13 16:48

流式细胞术检测RAW 264.7细胞表面TLR4受体表达变化情况

各位老师我准备用TLR4的一抗和荧光素二抗来标记胞膜表面受体然后用流式细胞术测得的荧光强度或带荧光的细胞个数来判定胞膜TLR4受体表达量改变情况但由于巨噬细胞吞噬能力很强我必须在保证包膜表面蛋白标记的同时尽量避免非特异性吞噬产生胞内TLR4标记干扰（疑问：流式细胞术能否测的胞内的荧光物质？）由于之前没有做过相关的实验请各位老师能提供比较详细一点的操作步骤介绍
同时我还看到文献中有以一抗同源IgG 作为对照的这个对照是什么目的？

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补充一下，同源IgG 对照，就是比如，你用鼠抗人TLR4抗体，那么你就用个非特异性的鼠IgG做同源对照。目的就是看有多少鼠IgG非特异性结合到巨噬细胞上并被染色。这个就是你的实验背景值了

作者: standbyme 时间: 2013-1-13 16:48

流式做了很长时间，但是似乎一直没有想要的结果，不知道是不是做的有问题，请各位达人帮忙看看图吧
图1:24h空白对照
图2:24h最大剂量药物
图3:72h空白对照
图4:72h最大剂量
问题1：为什么72h的凋亡比24h反而更少了呢？48h的图我没有截取，凋亡也比24h少。
问题2：为什么24h时细胞阻滞在G1期，而48h和72h却又阻滞在了S期，而我目前看到文献上都是阻滞在G1期。我在做第一次流式的时候3天的都阻滞在S期，这是第二次的。
问题3：为什么debris还有负数呢？

请各位达人指点，做流式的老师每次都让自己回去分析看能不能用，我看了一本流式的书，但是分析这个还是挺困难的！

作者: 算盘阿星 时间: 2013-1-13 16:48

我看了你这个检测的结果图片,要想评估还真是比较困难.

作者: 算盘阿星 时间: 2013-1-13 16:49

流式细胞术检测RAW 264.7细胞表面TLR4受体表达变化情况

各位老师我准备用TLR4的一抗和荧光素二抗来标记胞膜表面受体然后用流式细胞术测得的荧光强度或带荧光的细胞个数来判定胞膜TLR4受体表达量改变情况但由于吞噬能力很强我必须在保证包膜表面蛋白标记的同时尽量避免非特异性吞噬产生胞内TLR4标记干扰（疑问：流式细胞术能否测的胞内的荧光物质？）由于之前没有做过相关的实验请各位老师能提供比较详细一点的操作步骤介绍
同时我还看到文献中有以一抗同源IgG 作为对照的这个对照是什么目的？

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首先:流式细胞仪是肯定可以检测胞内的荧光物质的,现在流式细胞仪所能覆盖的检测范围已经很广泛了,包括细胞表面抗原、胞内抗原、细胞分泌物以及游离的蛋白质等。

抗吞噬作用可以用以一抗同源IgG 作为对照，目的就是为了做为空白对照，检测吞噬所带来基础本底值。

作者: catone 时间: 2013-1-19 22:01

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