谢谢,在国外试验室,用的fisher的ECL,估计是TEMED没有完全混匀,搞的分离胶没有凝好。而且这个p53的一抗,是刚买的,周一order,周二就来了,所以效力可能太强了。说明书上推荐的一抗稀释度是1:100到1:1000,我已经用到1:1000了,那这个一抗是不是还可以再稀释一下啊。再就是连marker也显出条带来了,是一抗浓度高还是二抗浓度高的原因啊?谢谢高手回复,万分感激!作者: NBA 时间: 2013-1-19 12:19
大家好,我刚开始做western,一头雾水...看见有这么多的高手在,很是高兴!感谢大家聚集在这里,为我们这些初学者排忧解难。我有一个问题想请教各位师兄学姐,我做的目的蛋白的分子量是28kd,但是跑出条带的分子量却是52kd,这是怎么回事呢?是我的检测因子的二聚体吗?可是二聚体的分子量都是28~50kd之间啊?能排除是我一抗的问题吗?请大家试着为我分析一下,谢谢大家了!呵呵作者: NBA 时间: 2013-1-26 15:14
我想问一下,浓缩胶的tris是1.0M还是0.5M有什么区别么?
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浓缩胶的终浓度要求不同
对酸碱的缓冲能力也不同作者: NBA 时间: 2013-1-26 15:14
让楼主见笑啦。这样的结论也是在园子里和文献中学到的,也许偏驳吧!但是我的实验的确证实抗体稀释液对抗体活性有影响,在组化及W中我都对照过,当然具体机制可能不是叠氮化钠。不过任何实验都只是无穷可能中一种,我是新手,实践的可能性更少,仅供参考吧,希望有用!作者: NBA 时间: 2013-1-30 10:55
你好 我是新手 我买的是ABCOM的一抗体 但是 他没有提供做WB的适合浓度 只是提供了这样一句话 Use at a concentration of 1-2μg/ml, 两个抗体的concentration 分别为2.20mg/ml 0.5mg/ml 请问 这种情况 如何确定1抗的浓度
感激作者: NBA 时间: 2013-1-30 11:05
想请教下老师,我做的分子量是38、42、55KD的,我应该用百分之多少的分离胶啊?用10%的对结果影响大吗?另外在做的过程中,我遇到了以下一些问题想请您帮助下。首先,我蛋白跑完电泳后,做了考马氏染色,蛋白条带很清楚,于是第二天接着用这批蛋白样品做western(蛋白负20保存)。转膜条件我用的是200ma60分钟,电转仪是BIORAD的。转完后,我把膜用丽春红染色,什么都没有。转完膜的胶我考马氏染色后发现还有很多蛋白条带,我考虑是否是我时间短了,于是第二次转了100分钟,膜用丽春红染色还是什么都没有看到,转完的胶条做考马氏染色,发现仍有一根非常清楚的蛋白条带。第三次,我用了0.22的膜转75分钟,立春红染色还是什么都没有!我觉得非常疑惑,不知该怎么调整!同实验室的做42的分子量,200ma45分钟,膜经立春红染色后条带都很清楚,可是我之前也试过45分钟,胶上的marker都超清楚。这究竟是怎么回事啊?请您帮我分析下吧!电转液我也是新配的啊!作者: NBA 时间: 2013-1-30 12:43
天气高温对电泳在分离胶弥散有没有影响?
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电泳时温度高会影响条带
但是室温不会高的那个程度吧作者: NBA 时间: 2013-1-30 12:43
各位大侠,我是一新手,想请教大家一个问题。我需要提测定的指标是:磷酸甘油酸酯激酶1,为了尽量让western能得到较好的结果,从细胞当中提取蛋白时,我应该是提取总蛋白、胞浆蛋白还是核蛋白呢?有没有类似“库”这样的资源指导我们应该提取哪种蛋白?不知道表述清楚了没有,万分感谢~~~~作者: NBA 时间: 2013-1-30 13:00
各位大侠,我是一新手,想请教大家一个问题。我需要提测定的指标是:磷酸甘油酸酯激酶1,为了尽量让western能得到较好的结果,从细胞当中提取蛋白时,我应该是提取总蛋白、胞浆蛋白还是核蛋白呢?有没有类似“库”这样的资源指导我们应该提取哪种蛋白?不知道表述清楚了没有,万分感谢~~~~作者: NBA 时间: 2013-1-30 13:11
老师您好,我做了几次WB,结果都不好,我是做的FABP蛋白和beta-actin,分别是17KD和43KD,电泳条件是70V和120V,转膜两个小时,我怕转不上去,用的两张膜,转完膜marker上有清晰的彩虹条带,然后用一抗1:2000和1:500.二抗1:5000分别孵育4小时和1小时,洗膜3次,但是加了AB液后根本看不到荧光,压出的片子什么都没有,请问下是什么原因呀?谢谢。作者: NBA 时间: 2013-1-30 14:51
最近做了几次考染结果,发现蛋白条带在分离胶上部跑不开,不知道是什么原因?由于我发现现在的4%浓缩胶阻力特别大,溴芬兰条带要跑近2小时才进入分离胶,所以我怀疑可能是配胶的两种缓冲液出了问题,或是10%SDS溶液出了问题(这三种溶液是2月份配的),请帮忙分析下原因,谢谢!作者: NBA 时间: 2013-1-30 15:57
B -ACTIN跑出来过,但是这三个蛋白只做出来一次,还是80的。90,110的都没跑出来。一直在预试验摸条件,以前没做过,想请您针对我的蛋白给个好的试验条件。转移液配方甘氨酸2.9 TRIS 5.8, SDS 0.37,甲醇200ML,总体积1000.您说得加转移液中加0.1%的SDS是直接取代此处的0.37么?还是另加?
还有我的TBST用得是0.5ML的吐温加1000ML的TBS。
谢谢您给点意见。尤其是我的试验条件有没有需要改进的地方?膜选用PVDF会更好吗?封闭前需要对膜做正反标记么?作者: NBA 时间: 2013-1-30 16:12
B -ACTIN跑出来过,但是这三个蛋白只做出来一次,还是80的。90,110的都没跑出来。一直在预试验摸条件,以前没做过,想请您针对我的蛋白给个好的试验条件。转移液配方甘氨酸2.9 TRIS 5.8, SDS 0.37,甲醇200ML,总体积1000.您说得加转移液中加0.1%的SDS是直接取代此处的0.37么?还是另加?
还有我的TBST用得是0.5ML的吐温加1000ML的TBS。
谢谢您给点意见。尤其是我的试验条件有没有需要改进的地方?膜选用PVDF会更好吗?封闭前需要对膜做正反标记么?
相关疾病:
肺癌类风湿关节炎
最近准备做western blot ,在配制不连续转移缓冲液的时候需要CAPS这一试剂,但这个试剂好像很少,不大有得买,而且据说很贵。
听说可以用甘氨酸代替,如果可以用甘氨酸代替,那配制时各成分的浓度是多少?是60 mM Tris,40 mM 甘氨酸,pH 9.6吗?
请教fangweibin119老师,不胜感激!
To prepare 100 ml of each working buffer from the 5x stock solution
(final concentration 60 mM Tris,40 mM CAPS,pH 9.6):
Anode (bottom) buffer:
20 ml 5x Tris/CAPS
15 ml MeOH
65 ml water
Cathode (top) buffer:
20 ml 5x Tris/CAPS
1 ml 10% SDS
79 ml water作者: NBA 时间: 2013-1-31 14:41
请问:我转膜结果用丽春红染色,往往是膜的中间三分之一区域(约100kD至50kD)有比较清晰的条带,而上下两块区域则不多,尤其是下面的三分之一(低分子量)条带很淡。这是怎么回事? 我做脑组织,考马斯亮蓝染胶,条带很丰富;转膜后,胶也很干净。转移液是 192 m mol 甘氨酸、25 m mol Tris、10% 甲醇、0.04% SDS,130mA,7小时。目的蛋白约150KD,还可以杂出来,就是β-actin近来没杂出来或是条带很浅,为什么?作者: NBA 时间: 2013-2-5 14:46
1,FAK丰度很小
2,蛋白定量不准
3,磷酸化注意事项在蛋白提取,加入磷酸化酶抑制剂作者: NBA 时间: 2013-2-5 17:22
半干转可以用恒压吗?
半干转的恒压和恒流的区别是?
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可以用
个人习惯与长期以来的经验作者: tie8 时间: 2013-2-5 17:22
相关疾病:
心肌梗死
您好,我是用mice组织匀浆来作western的。以前用细胞来作western,同样的3-8%的Neupage胶,同样的湿转条件,同样的目的蛋白,同样的抗体,在细胞结果很好。换作组织匀浆后,电泳时,上样蛋白为40ug每well,120v,跑成波浪状,而且应该组成性表达此蛋白的wild type 只有一个器官的匀浆里有表达。内参照蛋白有的为正常的条带,有的为一圆点。不知为何电泳跑成波浪状? 困惑中,多谢!作者: NBA 时间: 2013-2-5 17:23
您好,我是用mice组织匀浆来作western的。以前用细胞来作western,同样的3-8%的Neupage胶,同样的湿转条件,同样的目的蛋白,同样的抗体,在细胞结果很好。换作组织匀浆后,电泳时,上样蛋白为40ug每well,120v,跑成波浪状,而且应该组成性表达此蛋白的wild type 只有一个器官的匀浆里有表达。内参照蛋白有的为正常的条带,有的为一圆点。不知为何电泳跑成波浪状? 困惑中,多谢!
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Neupage胶我没有跑过作者: is2011 时间: 2013-2-5 17:23
又一个问题:转膜后看不到marker?(200、130、97、62、43KDa)
以前用130mA,7小时,只能看到200、130两条带,其余的看不到,但是样品的低分子条带可见,胶很干净。猜测是时间太长了,后来缩短到4小时、3小时,丽春红染膜仍不见marker,胶挺干净,看不到marker。可能是marker的量太少,以前上10μl,但是增加到30μl(以前的3倍量)仍不见。这是怎么回事?作者: NBA 时间: 2013-2-5 17:24
Why is the actual band size different from the predicted?
Western blotting is a technique that separates proteins based on size - in general, the smaller the protein the faster it migrates through the gel. However, migration is also affected by other factors and so the actual band size observed may differ from that predicted. Common factors include...
post-translational modification - e.g. phosphorylation, glycosylation etc which increases the size of the protein
post-translation cleavage - e.g. many proteins are synthesized as pro-proteins, and then cleaved to give the active form, e.g. pro-caspases
splice variants - alternative splicing may create different sized proteins from the same gene
relative charge - the composition of amino acids (charged vs non-charged)
multimers - e.g. dimerisation of a protein. This is usually prevented in reducing conditions, although strong interactions can result in the appearance of higher bands作者: NBA 时间: 2013-2-8 12:51
在做问题western blot 时遇到难以想通的问题,希望高手解答:
目的蛋白的分子量在44KD 可是每次做下来条带到靠近于55KD的地方 没有杂带 是什么原因?
向版主求助!我W的条带总是很弥散,而且很浓,曾出现过反影。调低一抗浓度合适吗?之前怀疑是蛋白讲解,但是新抽的蛋白也是这样。但用同门的蛋白一样的电泳及转膜条件就是很漂亮的条带!蛋白的抽提方法一样的,而且我也亲自抽过同门的蛋白。我的蛋白是110k,在160的位置有修饰后的条带。弥散的条带的位置是对的。电泳:80V浓缩胶后110v分离,300ma恒流湿转2.5~3h。不知问题出在哪里?非常感谢!!!作者: NBA 时间: 2013-2-20 16:55
我做兔肌球蛋白的WB,分子量在200KD左右,一抗选的MILLIPORE的Anti-Myosin Heavy Chain,Clone,二抗选的碧云天的辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG。选择β-actin作为内参合适不?操作上具体怎么做比较好?还有没有什么需要注意的?
恳请熟悉的朋友赐教!谢谢!作者: NBA 时间: 2013-2-23 11:50
1X电泳缓冲液跑80V电泳电流很低。经常只有3-4A,而以前用0.5X的都很好。直接重新加点5X的里面就很好,一般都是25A左右。会是缓冲液的问题么?我怀疑离子浓度度不够?另外两块玻璃板中间的电泳缓冲液面经常有下降,不知道是不是没有卡好,以前未碰到过这样的问题。卡之前也检查过了。作者: NBA 时间: 2013-2-23 16:15
谢谢版主。
我用的是nc膜,请问使用时和PVDF膜有什么区别嘛?
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NC膜直接可以用,在转缓里平衡一下即可
PVDF膜需要用无水甲醇活化,活化后在转缓中平衡待用作者: NBA 时间: 2013-2-23 16:15
LZ.你好,刚开始做WESTERN,遇到的问题是这样的,提取内皮细胞的蛋白,测浓度符合WESTERN要求,上样为20vl,蛋白含量40vg,结果跑了3次了,总是marker跑得很好,考马斯亮蓝染胶没有任何条带,一直找不出原因。很急!恳请楼主帮忙分析一下!谢谢!作者: NBA 时间: 2013-2-23 16:51
楼主你好,今天我的内参加上发光液后立马就可以在PVDF膜上看到很明显的黄黑色条带,到暗室曝光时,条带的地方却是黑色的,曝光出来的条带是白色的,背景是黑色的,只有条带的轮廓,请帮我分析一下原因,昨天的结果还是好好的,一样的条件就是二抗孵育的时间由1小时延长到了2小时作者: NBA 时间: 2013-2-23 17:01
你好,我最近在跑胶时出现很奇怪的问题,就是marker中间条带会竖起来,(marker是260-10kD),在90kD以上marker很正常,但是70-30kD中间条带的地方marker就竖着,这是什么原因造成的呢?会是胶凝的不均匀造成的吗?我在配制7.5%的胶时会放在37度烘箱半小时,差不多凝了。作者: NBA 时间: 2013-3-2 10:51
现正在做WB,有一些问题难以解决,希望fangweibin119可以给我解疑释惑。我做的是小分子蛋白,分子量在37、21KD,用10%的胶跑,转膜是恒流280mA,1小时。但是在实验中发现每次转膜后,PVDF膜上Mark(师姐留下来的,德国公司)条带都不明显,蓝色条带几乎没有,红色的隐约可见,ECL发光可见目的蛋白条带影,只是条带表现为分组不明显,粗、黑或者呈圆点状不成线状,请老师指点一下,谢谢!作者: NBA 时间: 2013-3-2 12:18
非常感谢你的回答!!
我做的是TIMP2,大鼠的,SantaCruz的抗体标记的是21KD,BIOworld抗体标记在34-26之间,所以一并问了!
BIO-BAD的半干转膜仪,连接的是BIO-BAD自家的PowerPac HC Power Supply电源,设置恒压的较为方便,再请教一下,恒压转膜条件??
胶面积较小,设置恒流的话,计算出来只有20几个mA ,而电源设置选项上只有A单位,只能精确到0.01A,所以设置条件不准确!如何解决?
还有一个问题,最近是新鲜配制的丙烯酰胺,若是这个不准确的话,会有什么样的影响??
谢谢~~~作者: NBA 时间: 2013-3-2 15:44
1、转移缓冲液分湿转与半干转,两者是有区别的。你的第一个配方是半干的,第二个是时装的
2、Tween-20两者均可选作者: NBA 时间: 2013-3-2 15:48
非常感谢你的回答!!
我做的是TIMP2,大鼠的,SantaCruz的抗体标记的是21KD,BIOworld抗体标记在34-26之间,所以一并问了!
BIO-BAD的半干转膜仪,连接的是BIO-BAD自家的PowerPac HC Power Supply电源,设置恒压的较为方便,再请教一下,恒压转膜条件??
胶面积较小,设置恒流的话,计算出来只有20几个mA ,而电源设置选项上只有A单位,只能精确到0.01A,所以设置条件不准确!如何解决?
还有一个问题,最近是新鲜配制的丙烯酰胺,若是这个不准确的话,会有什么样的影响??
谢谢~~~
您好!向您请教电泳慢考虑什么原因呢?现在我们实验室电泳到底需要2.5h以上,而以前只需110分。电泳液的配方没有变,复用次数不多,而且新的时候也是慢。变得是甘氨酸是新购入的,看到颜色没有之前那么白、亮,暗暗的,不知会不会是因为甘氨酸不纯引起吗?谢谢!作者: NBA 时间: 2013-3-4 16:43
接着问:For Western blot analysis,200μg of protein was resolved on a 12% SDS polyacrylamide gel at 160V in a Mini-Protean II Cell(Bio-Rad).
睾丸样品200微克的上样量做出如下的图 说明目标蛋白的丰度是高还是低?
5ul的上样量都已经大了
这几天我在做Bax与BCl-2作者: NBA 时间: 2013-3-6 17:27
接着问:For Western blot analysis,200μg of protein was resolved on a 12% SDS polyacrylamide gel at 160V in a Mini-Protean II Cell(Bio-Rad).
睾丸样品200微克的上样量做出如下的图 说明目标蛋白的丰度是高还是低?
请问下老师。一抗、二抗孵育时间多久最好,一抗我一般都是用4°过夜的,但在室温下孵育6个小时经常没有结果。二抗有的说不超过1小时,有的说不超过2个小时,这个我也不清楚。是不是二抗浓度过高会使背景太高?我看网上说二抗浓度可以用的1:1500以上,但是我用二抗1:500基本上都没条带啦。是我显影有问题还是二抗的问题呢?谢谢老师帮我解答下,万分感谢作者: NBA 时间: 2013-3-7 11:31
您好,我请教您一个问题,我最近检测磷酸化的ATM(350KD),应该选用多大的分离胶和浓缩胶,如果带上actin内参该如何配胶。湿转的条件是什么?(我用8%分离胶和5%的浓缩胶,浓缩胶80v,进入分离胶120v直到72kd的marker跑到底大约5h,湿转0.1%sds,10%甲醇,20mA4度过夜,这个条件行吗?)作者: NBA 时间: 2013-3-7 18:32
碰到一个难题,电泳过程中蛋白跑的很慢,marke也只分开到55kd,并且在溴酚蓝处感觉胶有点厚(就是比其他地方的胶看起来厚些),在加样槽底部会看到有白色颗粒,以为是压分离胶水未吸干和胶未凌好,后来都吸干水,配好胶在室温放了50min才放入4度保存,第二天用。可结果还是一样。以前跑的很好,现在就只重配了tris。作者: NBA 时间: 2013-3-9 09:02
我有两个相差1kD的目的蛋白(假设为a,b),二抗均为抗羊,先杂a再杂b的话,b的条带很弱但是a的条带还很强,先杂b再杂a则a的条带会很弱,二抗会累积而且很难洗掉,我试着增加一抗浓度,降低二抗浓度,结果好一些但仍然不够理想。用洗膜液洗了之后,残留的抗体是没了但是蛋白好像也被洗掉了。请问版主如何解决。作者: NBA 时间: 2013-3-9 09:17
老师您好,问个非技术问题。半个月前做过一次WB,当现在想做的时候发现凝胶贮液都变成胶状凝固的了,半个月前配胶时没有大的失误,不敢肯定是不是因为一些不记得的小失误如配胶时未更换枪头,但是配胶时所用的大枪头只用在凝胶贮液,缓冲液,DW上,所以不知道怎么就会变成这样了。凝胶贮液是刚买不久的。。。。。。望老师解答,谢谢作者: NBA 时间: 2013-3-9 11:03
前辈您好:请教您两问题,我配的8%的胶,蛋白分子量为100,50-57,18kD,转膜时我把胶切成两段,以35为界,18KD的转两小时,100及50-57转三小时,恒流300mA,湿转,NC膜,不知可否?刚才转完了,瞅了一眼,因为35以下的胶条很小了,所以不好固定,变形了,歪歪扭扭的,不知道有什么更好的方法?还有一问题280KD蛋白我用的6%的胶,上述条件需要转多久,4小时可以吗?(4°)谢谢~作者: NBA 时间: 2013-3-9 14:44
老师你好,我提的蛋白做出了目的蛋白,但是今天没有做出内参(贝塔-action),丽春红染膜膜上有蛋白,重新附了二抗仍然没有显影,请问老师1.是我蛋白没提取好吗???2.我放二抗的冰箱电源线前几天遭拔了一次(可能别人无疑碰掉的),你认为我二抗(我做二抗+ECL发光剂,暗室下看得到荧光,是不是说明二抗基本上没问题???)会不会受影响???3.老师认为下一步怎么做(贝塔-action没问题,因为我前几次提的蛋白都做出来过),谢谢指教,不胜感激!作者: NBA 时间: 2013-3-9 14:48
你好,楼主,我最近做western blot β-actin内参总是不太顺利,同样一张膜上,目的条带却出的非常好,原来同样的体系下,也可以顺利的做出目的条带和内参条带,但是最近,内参出来了也缺少条带,我用10孔的胶,除去mark应该是显出来九个内参,但是每次不是最后一个孔道上没有条带,就是中间一个孔道上没有条带,不清楚是什么原因,我用的是ecl显色剂,每次都是均匀的加在膜上,静止1分钟左右才用保鲜膜包上在暗合中压片,一抗1:500,用的是santa cruz公司的,,二抗1:1000. 楼主有解决的方法吗?谢谢作者: NBA 时间: 2013-3-9 16:03
你好,楼主,我最近做western blot β-actin内参总是不太顺利,同样一张膜上,目的条带却出的非常好,原来同样的体系下,也可以顺利的做出目的条带和内参条带,但是最近,内参出来了也缺少条带,我用10孔的胶,除去mark应该是显出来九个内参,但是每次不是最后一个孔道上没有条带,就是中间一个孔道上没有条带,不清楚是什么原因,我用的是ecl显色剂,每次都是均匀的加在膜上,静止1分钟左右才用保鲜膜包上在暗合中压片,一抗1:500,用的是santa cruz公司的,,二抗1:1000. 楼主有解决的方法吗?谢谢
我的意思是,通常转膜时,装置顺序依次是负极,海绵,滤纸,胶,PVDF膜,滤纸,海绵,正极。我现在想的是可不可以用两张PVDF膜重叠在一起,用一块胶转出两张膜。条件是:稳流350mA,2.5h。目的分子68KDa,和内参GD。老师,你觉得这样做可以吗?谢谢答复!作者: NBA 时间: 2013-3-9 17:00
做了两个月的小鼠C57的肝质膜蛋白Western blot ,线粒体条带非常漂亮,但Na+k+ATPase酶(采用的半干法一个小时转膜,就是做不出来或者背景很黑(抗体1:10000或1:5000;二抗抗鼠:1:2000.实在想不出原因?请教各位高手:是不是Na+k+ATPase酶特别难做出来,怎么才能做好?怎样才能做出?有什么经验?请大家多指点啊。实验做不出,精神都崩溃了,时间就这样过去了?请大家与版主提建议啊?
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抗体是哪里的?作者: PINK 时间: 2013-3-13 16:20
老师你好,我现在想做分子量在400多KD的蛋白的含量测定,想请教一下做大分子量蛋白的条件,胶浓度,时间等。谢谢!作者: NBA 时间: 2013-3-13 16:20
TRICINE –SDS-PAGE
Tricine-SDS-PAGE胶的配方:(分离范围是5 KD--45 KD。若分离5KD以内蛋白,把AB-3换成AB-6即可,范围3KD-35KD。)
(约2.5ml)4%分离胶 10%积层胶 (约4.67ml)
ddH2O 1.486 mL 2 mL
AB-3 0.167 mL 1 mL
Gel-Buffer(3*) 0.83 mL 1 mL
甘油 — 0.67 mL
10%AP 12.5uL 25 uL
TEMED 1.3 uL 2. 5 uL
3*Gel-Buffer 配方:(100mL量)
Tris 36.4g
SDS 0.3 g
pH 8.45 with HCL
h2o make up to 100ml
难溶,可以60°C水浴促进溶解。
AB-3 (100mL量) AB-6(100mL量)
丙烯 48 g 丙烯 46.5 g
双叉丙烯酰胺 1.5 g 双叉丙烯酰胺 3 g
h2o make up to 100ml
注意:丙烯溶解后会使溶液体积增大,故只要用约80mL水溶解即可,完全溶解后再定容。通风橱内操作,注意保护自己!
外槽电泳液(+极)(Anode Buffer)10*: 500ml量
Tris 121.9g
pH 8.9 with HCL
h2o make up to 500ml
内槽电泳液(-极)(Cathode Buffer)10*:100mL体积
Tris-Base 12.11 g
Tricine 17.92 g
SDS 1g
pH 约8.250 (不用调)
h2o make up to 100ml
(般电泳槽内槽一次只要150mL液体,而外槽需要400-500mL液体。)
2*Sample Loading buffer : 5ml
甘油 1ml
B-巯基乙醇 0.5ml
0.4g SDS
0.5 M/L PH6.8 Tris 1ml
h2o make up to 5ml 加入少许溴酚蓝至红棕色
跑小分子蛋白是不错的选择。转膜一般100V,1小时就可以,膜是PVDF,0.22的。我们实验验也有30V,过夜的,说是害怕蛋白从膜上又转到滤纸上了,不知道有没有道理。但反正结果是可以用的。作者: NBA 时间: 2013-3-13 17:22
我们构建了一个定位载体,就是将基因和GFP融合,然后用烟草瞬时表达系统表达,后来用共聚焦显微镜观察,初步认为是胞间蛋白。另外,我们还构建了表达载体,带有6个HIS标签,western blot 时,我用一抗是HIS 抗体,二抗是辣根过氧化酶。western blot 的体系应该没有问题作者: mimili_901 时间: 2013-3-15 11:30
是的,看了您以前的回答,会不会是因为我把ECL吸的太干的原因,这次比往常吸的要狠一点,显完影后,打开保鲜膜后很快就变干了。还有cocktail里有磷酸酶抑制剂什么的吗?Roche公司的规格是什么啊》多少钱。最近一阵总是什么也做不出来,觉得是提取样品或许也有问题,我们用的是碧云天的裂解液,按他的提示只是加了PMSF,没有加其他的裂解液。作者: NBA 时间: 2013-3-15 12:40
我现在刚开始做WB,实验室买的是NC膜,一般来说NC膜用之前不用甲醇处理的,但是我的膜不用甲醇处理而直接浸泡与缓冲液中的话就死活转不过去,用甲醇处理后伯乐半干转系统15V定压,10分钟就转过了,因为预染marker已经转到最下层滤纸上了。请问该怎么处理作者: NBA 时间: 2013-3-15 14:36
老师你好,本人初学,现在用肺癌细胞系做一个较新的蛋白,目标蛋白在59kda,内参actin。上样量40ug和80ug都试过,分离胶浓度10%,80v浓缩胶,120v分离胶。用0.45um的pvdf膜,转印湿转200mA,90分钟,mark转的不错。奶粉封闭2h,抗缓1%BSA,一抗浓度abcam1:250(推荐1:1000~1:200)或scbt1:200(推荐1:1000~1:100),四度过夜。中杉金桥二抗1:5000,2h。每次洗膜均为tbst15min*2+tbs15min。发光液是普利莱,压30min,目标蛋白发的很不理想,浅的几乎没有的黑影,完全无法确定是不是条带,内参发的不错。请老师给点建议,不甚感激!作者: NBA 时间: 2013-3-15 15:11
我是新手 ,没有做过western,这两天在看做western的资料,我买的是GENSCRIPT ONE HOUR WESTERN KIT。但是我不知道做western前,对提蛋白的要求是什么?就是怎么准备用于做western的蛋白。我有两种蛋白,一个是胞质蛋白,一个是胞膜蛋白。提蛋白是不是用试剂盒?然后提取的蛋白还要怎么样处理才能用来做western呢?什么是调等浓度啊?蛋白质测了OD值,怎么根据OD值算呢?由于没有做过,所以很多不知道。对园子里的好多帖子也看不懂。好多试剂也不知道是干什么用的。谢谢楼主指点一下。作者: vivian4123 时间: 2013-3-15 15:31
5-50u applied to Minigel Lane (0.75-1.5mm width)and run at standard condision.(60 mA for 2 1.5mm Minigel gels ,1.4h).It is suggested that you run 5-15% acrlamide(37.5:1) minigel(1.5mm width ) at 30mA/gel 1-1.5h.这里面也没说浓缩胶和分离胶各自的电泳条件是多少,60 mA for 2 1.5mm Minigel gels ,1.4h 难道分离胶和浓缩胶都是60毫安吗?似乎是不太可能啊。后面的It is suggested that you run 5-15% acrlamide(37.5:1) minigel(1.5mm width ) at 30mA/gel 1-1.5h是指什么胶呢,30mA/gel,那是不是两块胶就还是60毫安,那这两句话是不是在表述一个意思啊。
2 关于转印,说明书上的建议是半干转,(3h 100mA for two minigel gels).100毫安转三小时是不是有点太长了?师兄们没做过这么小的蛋白的,他们平时转印的时候使用湿转。
5-50u applied to Minigel Lane (0.75-1.5mm width)and run at standard condision.(60 mA for 2 1.5mm Minigel gels ,1.4h).It is suggested that you run 5-15% acrlamide(37.5:1) minigel(1.5mm width ) at 30mA/gel 1-1.5h.这里面也没说浓缩胶和分离胶各自的电泳条件是多少,60 mA for 2 1.5mm Minigel gels ,1.4h 难道分离胶和浓缩胶都是60毫安吗?似乎是不太可能啊。后面的It is suggested that you run 5-15% acrlamide(37.5:1) minigel(1.5mm width ) at 30mA/gel 1-1.5h是指什么胶呢,30mA/gel,那是不是两块胶就还是60毫安,那这两句话是不是在表述一个意思啊。
2 关于转印,说明书上的建议是半干转,(3h 100mA for two minigel gels).100毫安转三小时是不是有点太长了?师兄们没做过这么小的蛋白的,他们平时转印的时候使用湿转。
还有目的是做的LC3B,分子量很小,才14左右,我提的细胞蛋白试了几次都没做出来,都是一片白板,转膜时间是200电流,恒流,60分钟,0.45的PVDF膜。这次换用新提的动物肾脏蛋白做的,条件也换了,用了0.22的PVDF膜,恒流200的电流,50分钟,一抗是CST的1:1000,特别改用BSA封闭,抗体稀释液也都是换成BSA了,显影的时候居然出来了,但是是一团团的浓墨状的黑影,非常晕,不知道到底哪里出了问题,应该怎么改正,谢谢!!作者: NBA 时间: 2013-3-15 17:37
我也碰到过这样的情况,加样孔中有沉淀的时候胶跑的不好,曝光后条带很怪异,想知道sds是怎么加的,是直接和煮沸过的样品混合?还是在煮蛋白的时候加?我感觉里边有沉淀可能是里边含脂质教多,我提过肝肺和肾组织的蛋白样品,只有肝组织中出现过几次这样的问题,肺和肾未出现这样的问题,提取肝组织的时候,离心后常见到上边的油状物。谢谢作者: NBA 时间: 2013-3-18 09:55
谢谢楼主!之前的问题已经解决了,现在有另外一个问题需要请教您。我显影的时候膜上荧光强度很高,压片10s条带比荧光上可视条带明显增粗、弥散,减少压片时间后表达程度较高的条带仍增粗较明显,请问应如何解决?降低一抗浓度是否可行?另显影和定影时间约为多少较佳呢?谢谢!作者: NBA 时间: 2013-3-18 11:00
然后我想问你,这个溴酚蓝不能压平会是什么原因?胶的问题?跟跑胶电流大小有关(浓缩胶35mA,分离胶45mA)?电泳液的问题(用过好多次了)? 然后,这样会不会影响结果条带?
还有,如果我就用这张胶片扫描后,用Quantity One 分析,其结果会不会因为条带宽窄不同而影响准确性呢(条带的宽窄会不会影响最终灰度值(曲线下面积)既真正的蛋白定量)?
最后,还有个问题:我做的某些个蛋白,做了几次都很淡(一抗我是参照说明书按最高浓度来的 santa 1:100;曝光压了15min)如图:
然后我想问你,这个溴酚蓝不能压平会是什么原因?胶的问题?跟跑胶电流大小有关(浓缩胶35mA,分离胶45mA)?电泳液的问题(用过好多次了)? 然后,这样会不会影响结果条带?
还有,如果我就用这张胶片扫描后,用Quantity One 分析,其结果会不会因为条带宽窄不同而影响准确性呢(条带的宽窄会不会影响最终灰度值(曲线下面积)既真正的蛋白定量)?
最后,还有个问题:我做的某些个蛋白,做了几次都很淡(一抗我是参照说明书按最高浓度来的 santa 1:100;曝光压了15min)如图:
同一张膜的内参【转膜60min】和另一个目的蛋白都有条带且清晰,nogo-a就是没出过 ,抗体也换了还是没有,试剂公司说是裂解液的问题,nogo-a是核蛋白,我的裂解配方是【50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM PMSF、1 mM EDTA、1% Triton x-100、1%脱氧胆酸钠、0.1% SDS】
大家帮忙看看,这个配方能提出核蛋白吗
我的实验过程和方法有什么需要改正的地方吗 麻烦大家了 先谢过了。作者: NBA 时间: 2013-3-18 11:27
同一张膜的内参【转膜60min】和另一个目的蛋白都有条带且清晰,nogo-a就是没出过 ,抗体也换了还是没有,试剂公司说是裂解液的问题,nogo-a是核蛋白,我的裂解配方是【50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM PMSF、1 mM EDTA、1% Triton x-100、1%脱氧胆酸钠、0.1% SDS】
大家帮忙看看,这个配方能提出核蛋白吗
老师,你好,我最近在跑一个分子量47kd左右的蛋白,内参用的β-actin,每次跑两个胶一板做目的蛋白,一板做内参,两边加样完全相同,除了一抗不同外其它步骤完全相同,但内参显影正常,目的蛋白的那张膜没有目的蛋白显影,膜的边缘经常出现连续的条带,有时是上缘或下缘,有时是整个膜的边缘。请老师指教。暂时没有图片。作者: NBA 时间: 2013-3-18 11:31
老师,你好。我们最近做了WB,先是用了那张膜跑了β-actin,然后曝光效果也很好。然后就把这张膜放在PBST里洗,先洗了2次,每次10分钟,然后观察到β-actin位置上有黄色残留物,就又洗了一次,大约30min,还没洗掉,就放弃了。然后重新加另外一种蛋白的一抗过夜,然后二抗两个小时,然后曝光。加了ECL后,β-actin的位置荧光很强烈,整张膜上也都有荧光,目标蛋白处没有荧光,然后就曝光,5min,结果片子上什么都没有,连β-actin都沒有,特別干净,希望老师能帮忙找出问题。作者: NBA 时间: 2013-3-18 12:14
斑竹您好,因为我收集的是临床病例,很珍贵。所以用TRIZOL提过RNA后想继续提蛋白用于western。按照TRIZOl的说明书离心最后一步1%SDS反复吹打50度温水浴重悬蛋白时很难溶解。我查了下这是个普遍问题,请问斑竹您对此有什么建议促使蛋白溶解?哪位战友有高招欢迎指导,谢谢各位作者: NBA 时间: 2013-3-18 12:54
请问楼主,我做蛋白印迹不知怎么回事一只做不出来,感觉每次蛋白都转过来了,不过我不知道我裂解的细菌一定有我需要的目的蛋白,这个目的蛋白是在布氏杆菌表达的一种外膜蛋白,现在是通过卡介苗来表达这种蛋白,我做的是关于基因疫苗的制备实验,可是我最近用我买的乳胶颗粒抗原以及用布氏杆菌裂解蛋白再次实验,依然没有结果,显色的时候看不到条带,我一抗用的是牛布氏杆菌阳性血清,二抗用的兔抗牛,最后显色用自己配置的DAB,我稀释的浓度都是安说明书来弄的,自己反复思索也找不到原因所在,***楼主解答,谢谢老师了哦!作者: NBA 时间: 2013-3-18 14:47
楼主老师好,我刚开始做WB,P-AKT的蛋白总是做不出来,一直是白板,AKT做的结果很好。我用的抗体都是CST公司的,稀释倍数也是按照说明书来的,用的是化学发光凝胶成像系统。已经一个月了,原来以为是一抗的问题,现在换了新的抗体,还是不出来,想请教一下有什么原因?谢谢~~作者: NBA 时间: 2013-3-18 16:31
我跑WB,曝光时内参GAPDH出来还可以,但是目的蛋白却什么也没有。之前做过几次,虽不漂亮,但是至少有出来很多的条带。我可以肯定,膜没有放反。根据marker的位置切的膜,按理也不可能切掉了目的条带呀。请各位帮忙分析下是什么原因造成的什么也爆不出来》作者: NBA 时间: 2013-3-18 16:45
但是我发现做出来的这个条带大小是55kd和45kd两条,但是我的蛋白有200个氨基酸,而且空白对照材料也有这条带,所以怀疑是非特异性的带。但是在20kd附近没有看到条带啊,或者非常弱不确定是不是有,片子的背景很干净,我用的一抗是1:10000,二抗也是1:10000,请问要怎么做才能提高特异性,把我需要的条带得到?作者: NBA 时间: 2013-3-19 16:18
本人最近做WESTERN是老遇到同一个问题~~~配完胶,上样后,开始跑胶,大概2分钟后,样品从底部先是冒了一个尖尖头,然后就慢慢的飘飘然的漏到了分离胶与积层胶之间,这样虽然不影响内参的曝光,但是目的条带曝光时周围就会漂一层漏掉的蛋白~~很郁闷啊。我的上样量30ug左右。我配的5%、10%胶,目的条带90-110KDa,恒压跑胶,60-110V,我真的没有撬动两个板~~~~~~所有配胶的东西我又重新配了一份,还是不行啊,我真的不知道怎么办了~~楼主有没有什么好建议?作者: NBA 时间: 2013-3-20 14:51
老师您好,我的marker终于出来了,换了转膜配方,之前是:2.93g甘氨酸,5.82g Tris base,0.375gSDS,200ml甲醇,加水至1000ml,现在换成了14.4g甘氨酸,3.03g Tris base,200ml甲醇,加水至1000ml.我的目的蛋白是130和155,老师,请问要加SDS吗?作者: bring 时间: 2013-3-21 15:07
老师您好,我的marker终于出来了,换了转膜配方,之前是:2.93g甘氨酸,5.82g Tris base,0.375gSDS,200ml甲醇,加水至1000ml,现在换成了14.4g甘氨酸,3.03g Tris base,200ml甲醇,加水至1000ml.我的目的蛋白是130和155,老师,请问要加SDS吗?
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要价sds作者: mysmdbl 时间: 2013-3-21 15:10
老师,那还是用2.93g甘氨酸,5.82g Tris base,0.375gSDS,200ml甲醇,加水至1000ml这个配方还是用14.4g甘氨酸, 3.03g Tris base,加SDS,200ml甲醇,加水至1000ml这个配方呢?用后面那个配方的话,SDS的量应该加多少呢?谢谢了作者: 2541 时间: 2013-3-21 15:12
楼主您好,刚刚接触WB,请教一个比较初级的问题,上样的时候要求样品同体积,那么marker呢,是否也要同样体积?比如说我上样量40ul,marker10ul,是否还需要用PSMF补充到40ul呢,还是就用10ul。如果体积与样品不同是否会影响预染marker的条带?先谢过作者: NBA 时间: 2013-3-25 17:21
我感觉pvDF膜这张背景还好啊,和Nc膜这张一抗浓度都是一样,为什么需要调整浓度呢?之前我不是问过为什么我做不同指标时候为什么带都在55K偏下一点的地方么,我想是不是这个原因才导致PVDF膜有两条带,其中稍大的是非特异性条带,稍小的细一些的才是目的条带。作者: NBA 时间: 2013-3-26 10:56
前辈,实验有进展了,电泳及转膜都没有问题,内参跑出来了。但是背景有些高,二抗用了开始用的1:5000,改为1:7500还是有些高。另外做了一个目的蛋白但不知为什么同样条件下目的蛋白背景更高,似乎有了目的条带,但背景太高,不好区别,不知道是什么原因。望老师指点。作者: NBA 时间: 2013-3-26 11:32
版主你好,我有如下问题:
1 “HRP比AP的灵敏度高”,这个说法有根据么?
2 western blot HRP和AP的灵敏度可以检测到哪个级别?(ng?pg?)
3 我使用biorad的半干转仪,25v恒压,电流在200mA左右,30min,观察到Fermentas预染marker上红色条带(70kDa)完全转过去了(在胶上没有条带了,而且在最下面的滤纸上有清晰的红色条带),我需要的目的位置是48kDa,我这种转膜方式是转膜正常么?
抱歉,现在图片不在手边,没法上图了。作者: NBA 时间: 2013-3-26 12:27
版主你好,我有如下问题:
1 “HRP比AP的灵敏度高”,这个说法有根据么?
2 western blot HRP和AP的灵敏度可以检测到哪个级别?(ng?pg?)
3 我使用biorad的半干转仪,25v恒压,电流在200mA左右,30min,观察到Fermentas预染marker上红色条带(70kDa)完全转过去了(在胶上没有条带了,而且在最下面的滤纸上有清晰的红色条带),我需要的目的位置是48kDa,我这种转膜方式是转膜正常么?
抱歉,现在图片不在手边,没法上图了。
货号:Anti-Caspase 3 antibody [E87] (ab32351)
“This antibody is specific for the pro form and the p17 cleaved form of human Capase 3.”
难道我们买的抗体不对?作者: dongdongqiang 时间: 2013-3-26 12:47
请教楼主一个问题,也看到了老师的一些关于WB的精彩解答,近来做WB遇到一个抗体IL-8,样品来源是老鼠的子宫,做的时候很棘手,一抗是abcom的货号是ab7747,一开始就用了16%的SDS-PAGE胶,但是重复过几次,也加大上样量,也提高抗体浓度到1:50,但是曝光还是一片空白,想请问老师这个指标该怎么做会好些,已经做了2个多月了作者: NBA 时间: 2013-3-26 14:58
Transfer Buffer: 25 mM Tris, 190 mM glycine, 20% MeOH, pH adjusted to 8.0.
Note: Since extra negative charges are needed to reach 1 Amp in a wet transfer system, adjust the pH of the transfer buffer to approximately pH 8.0 using NaOH.
For transfer of proteins smaller than 20 kDa, transfer proteins from gel to PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane at 1Amp constant current for 45 mins or equivalent (250 mAmp for 3 hours or 500 mAmp for 90 minutes) in transfer buffer.
For transfer of proteins smaller than 120 kDa, transfer proteins from gel to PVDF membrane at 1 Amp constant current for 1 hour or equivalent (250 mAmp for 4 hours or 500 mAmp for 2 hours) in transfer buffer.
For proteins larger than 120 kDa, transfer to PVDF membrane at 1 Amp constant current for 90 minutes or equivalent (250 mAmp for 6 hours or 500 mAmp for 3 hours) in transfer buffer + SDS.
For Proteins larger than 250 kDa, transfer to PVDF membrane at 1 Amp constant current for 1 hour and 45 minutes or equivalent (500 mAmp for 3.5 hours) in transfer buffer + SDS.
* To ensure complete transfer of large molecular weight proteins (as in 3 and 4 above), 0.05% SDS can be added to the transfer buffer.作者: greenbee 时间: 2013-3-26 15:38
请教楼主:最近在跑LC3蛋白。按理说应该出现两个条带,结果只有一条…LC3一型和二型的分子量分别是14和16KD,请问用什么方法可以使它们分开呢?谢谢!作者: NBA 时间: 2013-3-26 15:38
Transfer Buffer: 25 mM Tris, 190 mM glycine, 20% MeOH, pH adjusted to 8.0.
Note: Since extra negative charges are needed to reach 1 Amp in a wet transfer system, adjust the pH of the transfer buffer to approximately pH 8.0 using NaOH.
For transfer of proteins smaller than 20 kDa, transfer proteins from gel to PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane at 1Amp constant current for 45 mins or equivalent (250 mAmp for 3 hours or 500 mAmp for 90 minutes) in transfer buffer.
For transfer of proteins smaller than 120 kDa, transfer proteins from gel to PVDF membrane at 1 Amp constant current for 1 hour or equivalent (250 mAmp for 4 hours or 500 mAmp for 2 hours) in transfer buffer.
For proteins larger than 120 kDa, transfer to PVDF membrane at 1 Amp constant current for 90 minutes or equivalent (250 mAmp for 6 hours or 500 mAmp for 3 hours) in transfer buffer + SDS.
For Proteins larger than 250 kDa, transfer to PVDF membrane at 1 Amp constant current for 1 hour and 45 minutes or equivalent (500 mAmp for 3.5 hours) in transfer buffer + SDS.
* To ensure complete transfer of large molecular weight proteins (as in 3 and 4 above), 0.05% SDS can be added to the transfer buffer.
楼主您好,我最近做磷酸化ERK,一直做不出来,一抗是CST货号#9106,说明书建议1:2000稀释,。我1:1000,1:500都试过了,可就是没有条带,条带处背景很深,二抗稀释比例也调节了,还是做不出来。但一起做的P-AKT就能做出来,磷酸化水平肯定是有的。用5%BSA稀释抗体试过(封闭是5%脱脂牛奶),偶尔能模糊的看到条带,但背景很深,恳请楼主分析原因,谢谢!作者: NBA 时间: 2013-3-26 15:51
您好,请教您一下,上面为102KD的蛋白,下面为135KD蛋白,每孔上样量300ug,电泳100V,2小时;转膜半干转,恒压20V,1小时30分钟;封闭5%脱脂奶粉;4度过夜,一抗1:500稀释,cell signal technology,TBST洗膜,10分钟,3次;二抗凯基1:2000稀释,TBST洗膜,20分钟,3次;ECL显色。转膜液配方:TRIS:3克,甘氨酸14.4克,SDS1克,定容800ml,未加甲醇。
您好,请教您一下,上面为102KD的蛋白,下面为135KD蛋白,每孔上样量300ug,电泳100V,2小时;转膜半干转,恒压20V,1小时30分钟;封闭5%脱脂奶粉;4度过夜,一抗1:500稀释,cell signal technology,TBST洗膜,10分钟,3次;二抗凯基1:2000稀释,TBST洗膜,20分钟,3次;ECL显色。转膜液配方:TRIS:3克,甘氨酸14.4克,SDS1克,定容800ml,未加甲醇。
1、组织的上样量我们一般是20ug,最多40ug
2、这个抗体本身IgG浓度多少?
3、背景脏,考虑稀释一下二抗作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:08
都是自己配的,而且前后两次是连着做的,内参也都出了,应该没什么问题
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恩
我是怀疑你的体系有问题
另外转膜后
都用丽春红染色检查了吗?作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:08
TBST是我自己配置的,现配现用
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pH值调整了吗?作者: mickeylin 时间: 2013-3-28 12:09
各位大侠,我用的碧云天的BCA蛋白浓度测定试剂盒,96孔板,标准品8孔的吸光值分别是:0.122,0.143,0.152,0.190,0.282,0.344,0.419,0.487。对应的蛋白含量分别是0,0.5,1,2,4,6,8,10。我有几个蛋白样品的吸光值远远高于0.487,达到1以上,超出了有效范围之外,我是不是该稀释后再测定,用什么稀释?我担心稀释后蛋白浓度又低于自己的期望值,影响western的上样,该如何把握?作者: DONT 时间: 2013-3-28 12:09
1、我们检测膜蛋白都是用提取总蛋白来进行的
2、建议湿转,300mA 恒流,2h30min
3、大分子量的蛋白本来就较少,丽春红肯定然不出来作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:28
DNA的影响,有什么办法可以解决这个影响吗?
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加DNase或者短暂超声作者: 薄荷侠 时间: 2013-3-28 12:29
请教楼主一个困扰我多天的问题:做WB时到底用总蛋白还是核蛋白?比如我先来拿来练手的P16抗体。“P16基因编码产物是16KD的蛋白,即P16蛋白,定位于细胞核内”,这样的话,是不是我就要提核蛋白来做?之前一直没做出来,我总在怀疑是不是因为我提取的核蛋白量太少(蛋白定量为1ug/ul)。谢谢楼主~~~作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:29
从Abcam公司购买的抗体:Anti-Aggrecan ARGxx antibody [BC-3] (ab3773)。其中说明书中这两段话不是很清楚,请高手指点,谢谢!
1. Recognises the aggrecanase (ADAMTS-1, -4 & -5)-generated N-terminal neoepitope ARG after cleavage between amino acids EGE and ARG within the interglobular domain of aggrecanase-catabolised aggrecan (Human aggrecan sequence enumeration). This antibody will not recognise the sequence ...ARG.. if it is in the non-cleaved intact aggrecan protein core; i.e. it will only recognise the aggrecanase generated neoepitope ARG... Samples need to be deglycosylated for epitope recognition.
2. Antibodies tested only in recombinant samples are not covered for use on endogenous samples. Please check the datasheet for information on tested species.作者: eric930 时间: 2013-3-29 13:01
如果在上清中用WB检测不到这个蛋白
做后续的实验就没有意义作者: NBA 时间: 2013-3-29 13:10
版主您好,我和deba1116的情况差不多。
我实验细胞来源是兔椎间盘组织,需要检测Collagen I 和 Collagen II两个胶原的蛋白量,内参B-atcin条带每次都能做出来,但目的蛋白都是空白的。我用的是碧云天的强PIPA裂解液,蛋白量也用到了60ug,也加大了一抗浓度,但都得不到条带,两个目的蛋白所用的一抗通过细胞免疫荧光实验检测表达都很好,这两种胶原在椎间盘组织中的含量很丰富,而且说明抗体也不存在问题。
1、现在可能是我细胞裂解这一步出现问题,是不是胶原的三级结构没有打开呢?胶原有三条链,使用的RIPA裂解液不能解开这些链,从而导致抗体不能结合,有这种可能吗?我查文献,有的人在提取蛋白之前,加入胃蛋白酶常温孵育2小时,然后做后续的蛋白提取,胃蛋白酶在这是起到解链的作用吗?
2、这两种胶原在组织中含量很丰富,80%的细胞分泌这些胶原,不应该没有表达,我觉得是样品没有处理好,但为什么内参又能跑出条带呢?
疑惑请赐教。谢谢!
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这两个蛋白分子量比较大,不是很好检测
我检测过一些特异性不是很好作者: NBA 时间: 2013-3-29 13:11
从Abcam公司购买的抗体:Anti-Aggrecan ARGxx antibody [BC-3] (ab3773)。其中说明书中这两段话不是很清楚,请高手指点,谢谢!
1. Recognises the aggrecanase (ADAMTS-1, -4 & -5)-generated N-terminal neoepitope ARG after cleavage between amino acids EGE and ARG within the interglobular domain of aggrecanase-catabolised aggrecan (Human aggrecan sequence enumeration). This antibody will not recognise the sequence ...ARG.. if it is in the non-cleaved intact aggrecan protein core; i.e. it will only recognise the aggrecanase generated neoepitope ARG... Samples need to be deglycosylated for epitope recognition.
2. Antibodies tested only in recombinant samples are not covered for use on endogenous samples. Please check the datasheet for information on tested species.
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第一点有点长,我就不解释了
第二点这个抗体只适用于检测重组蛋白作者: NBA 时间: 2013-3-29 13:12
版主您好,请教以下几个问题:
1、有的一抗会标明 样品必需是non-reducing and non-denaturing,这是什么意思?
2、能具体给出样品制备或准备的操作注意事项吗?与需要变性的样品准备有什么不同之处?
谢谢!
我的抗体说明书上写的是:The product does not react with the thermally-denatured molecule. 是否指的就是non-denaturing呢?还是指在加的loading buffer中可以有DTT及β-巯基乙醇等还原剂和SDS,而仅仅不加热变性呢?
还有一个问题请教版主:我们购买的一抗要怎么验证这个抗体的真假?有专门的防伪网站吗?
谢谢!作者: xueyouzhang 时间: 2013-3-29 13:16
1、一般情况下,封闭时间与曝光结果直接关系不大,除非过长时间封闭或者不封闭
2、用什么ECL?内参一抗用1:500???作者: NBA 时间: 2013-3-29 13:19
谢谢版主。
我的抗体说明书上写的是:The product does not react with the thermally-denatured molecule. 是否指的就是non-denaturing呢?还是指在加的loading buffer中可以有DTT及β-巯基乙醇等还原剂和SDS,而仅仅不加热变性呢?
还有一个问题请教版主:我们购买的一抗要怎么验证这个抗体的真假?有专门的防伪网站吗?
谢谢!
一抗带标签?
带什么标签呢?
你说下看看,看我能不能解释
说明书原话:Western blot against tagged recombinant protein immunogen using ab55015 GilZ / TilZ antibody at 1ug/ml. Predicted band size of immunogen is 37 kDa
描述的实验条件都没问题
1、样品可能没有表达
2、抗体效果不行作者: NBA 时间: 2013-3-30 15:16
说明书原话:Western blot against tagged recombinant protein immunogen using ab55015 GilZ / TilZ antibody at 1ug/ml. Predicted band size of immunogen is 37 kDa
tagged recombinant protein immunogen为啥带标签呢?
说明书网址:cuturl('http://www.abcam.com/GilZ-TilZ-antibody-ab55015.html')
谢谢!
你好,我的目的条带是90KD,内参用的Actin,曝光结果90KD的条带还不错,但是Actin条带很不好看,不知道是什么原因,我的条件是250mA转膜2h,5%脱脂奶封闭2h,一抗用5%BSA稀释(Actin1: 2000,santa的mouse anti Actin)封闭过夜,TBST洗3次,每次10min,二抗用5%BSA稀释(1:2000,santa的goat anti mouse)室温1h,TBST洗3次,每次10min,底物用的Pierce的,特此向fangweibin119请教,是什么原因造成Actin条带成这样呢?
你好,我的目的条带是90KD,内参用的Actin,曝光结果90KD的条带还不错,但是Actin条带很不好看,不知道是什么原因,我的条件是250mA转膜2h,5%脱脂奶封闭2h,一抗用5%BSA稀释(Actin1: 2000,santa的mouse anti Actin)封闭过夜,TBST洗3次,每次10min,二抗用5%BSA稀释(1:2000,santa的goat anti mouse)室温1h,TBST洗3次,每次10min,底物用的Pierce的,特此向fangweibin119请教,是什么原因造成Actin条带成这样呢?
前辈好,我是在原代细胞和耐药细胞两株细胞中提取蛋白然后检测目的蛋白,但是曝光时原代细胞的条带却非常淡且细,耐药细胞的条带却异常深且粗(这个目的蛋白确实是在耐药细胞中高表达的)。是上样的问题么,上样两个都是35ug,一抗的浓度是1:37500(之前一次用的是1:25000但是背景很深所以稀释了一下)还是曝光时间短了?请老师指教啊~谢谢~作者: NBA 时间: 2013-3-30 17:32
我想请教一下关于样品缓冲液的问题,我们实验室一直用的是fermentas的5X protein loading buffer 加入5%比例的巯基乙醇,然后在100度加热5分钟 ,结果时好时坏,我觉得这步应该很关键,想问您是怎么处理样本的?还有其他更好的样品处理液吗?谢谢作者: NBA 时间: 2013-4-3 10:37
請教個問題,我做出來的蛋白分子量在60kD 左右,可是,我的目標蛋白是pSTAT3,大概80kD左右。高手們,這是啥問題呢?蛋白被降解了么?以下是我用的實驗條件。
cells were lysised by RIPA with protease inhibitor (EDTA-free)
total protein load is about 3ug
10% Bio-Rad gel, 200V for 20min for SDA page
100V for 20min for transfering
5% non-fat milk block 1h; primary antibody 1:2000 incubate overnight; secondary antibody 1:2000 incubate 1h
非常感謝!作者: NBA 时间: 2013-4-3 17:21
不是特别靠谱
考虑一下如何消除误差
因为每孔蛋白量相同,但是误差如何排除?
如果可以排除这个蛋白量的误差就可以
目前有一种方法是ELISA,理论上可以定量作者: NBA 时间: 2013-4-3 17:24
請教個問題,我做出來的蛋白分子量在60kD 左右,可是,我的目標蛋白是pSTAT3,大概80kD左右。高手們,這是啥問題呢?蛋白被降解了么?以下是我用的實驗條件。
cells were lysised by RIPA with protease inhibitor (EDTA-free)
total protein load is about 3ug
10% Bio-Rad gel, 200V for 20min for SDA page
100V for 20min for transfering
5% non-fat milk block 1h; primary antibody 1:2000 incubate overnight; secondary antibody 1:2000 incubate 1h
非常感謝!
现提取的蛋白,裂解液中加了PMSF,每孔上样大概8-10ug;现配的胶上层5%、下层15%;电泳80V-120V;转膜稳流200mA、50分钟;现配的5%BSA in TBST封闭1小时;现配的一抗也在5%BSA in TBST中,浓度是1:600,室温半小时-过夜4℃孵育-室温1小时复温;一抗洗膜4次各10分钟;二抗已经是重复利用过一次的了,1:4000的抗兔二抗(直接in TBST),室温1小时;二抗洗膜10分钟1次、6分钟2次;然后就发光了。
现提取的蛋白,裂解液中加了PMSF,每孔上样大概8-10ug;现配的胶上层5%、下层15%;电泳80V-120V;转膜稳流200mA、50分钟;现配的5%BSA in TBST封闭1小时;现配的一抗也在5%BSA in TBST中,浓度是1:600,室温半小时-过夜4℃孵育-室温1小时复温;一抗洗膜4次各10分钟;二抗已经是重复利用过一次的了,1:4000的抗兔二抗(直接in TBST),室温1小时;二抗洗膜10分钟1次、6分钟2次;然后就发光了。
我最近在做MMP-3,MMP-13,TIMP-1 western blot,做了五遍了,条带不特异,要不就是很淡,我用的是abcam的一抗,因细胞中蛋白浓度太低,蛋白上样15微克,用5%BSA的TBST稀释,4度过夜孵育,二抗1:5000,就是不出条带,请教是何原因,望不吝赐教,多谢了!附图如下:分别是:MMP3,MMP13,TIMP-1,ECL孵育2分钟,曝光时间3分钟,请较老师是否一抗稀释有问题?应如何调整?多谢了!
我最近在做MMP-3,MMP-13,TIMP-1 western blot,做了五遍了,条带不特异,要不就是很淡,我用的是abcam的一抗,因细胞中蛋白浓度太低,蛋白上样15微克,用5%BSA的TBST稀释,4度过夜孵育,二抗1:5000,就是不出条带,请教是何原因,望不吝赐教,多谢了!附图如下:分别是:MMP3,MMP13,TIMP-1,ECL孵育2分钟,曝光时间3分钟,请较老师是否一抗稀释有问题?应如何调整?多谢了
您好,老师,我想问一下,蛋白酶抑制剂加几种合适?是不是把配方里的抑制剂都加上,细胞裂解时蛋白降解的少?另外,我的目的蛋白内源性表达为9KD,是个核蛋白,过表达的蛋白为30-40KD大小,可是我坐了3次WBl,每次都是内参可以跑出条带,但是目的蛋白没有跳带?我想问一下,我应该如何改进实验,才能做出来,谢谢了,辛苦您了,作者: NBA 时间: 2013-4-3 17:46
各位老师,你们好!最近做实验遇到两个个问题想请教下大家:1,你们一般都是用哪个公司的发光剂,我们这边的发光剂用起来都不怎么好使,麻烦你们给推荐几个比较好用的。2,昨天我们用一抗二抗去除液(强碱型)再用丽春红染色后发现条带变得很淡了,想问问大家有没有遇到过类似的情况,强碱可以减少PVDF膜上的蛋白么?谢了、、、作者: NBA 时间: 2013-4-5 09:38
过表达的也没有出来,所以我怀疑是抗体出问题了。
系统稳定的情况下
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可能是抗体出问题了
不能下定论
还有几个因素要排除的作者: NBA 时间: 2013-4-5 09:38