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标题: 梯度和等度的问题 [打印本页]

作者: 悠悠白云 时间: 2009-9-4 08:43 标题: 梯度和等度的问题

实验中发现等度不能将目标物洗脱，不是死时间出峰，就是不出峰，而梯度洗脱却可以调整保留时间，这样是不是不合理呢？梯度：0-10min，20%乙腈+80%水（含0.05%TFA）------45%乙腈+55%水（含0.05%TFA）,出峰时间在六分钟左右，减去空白，标准品有两个峰，且峰高相当（标准品是新买的，进口的），难道标准品污染了？等度的条件试了很多，不是不出峰，就是死时间出峰，为什么呢？请教各位了！谢谢！

作者: j-1982 时间: 2009-9-4 08:43 标题: 回复 #1 悠悠白云的帖子

标准品出来两个，会不会存在异构呢？
另外，如果标准品是以某种盐的形式存在，尤其是弱酸盐，峰变成两个会不会由于部分生成了三氟乙酸盐呢？如果这样的话，试试看不加酸如何。

现在还处于方法建立阶段，既然梯度分离效果较好且易于控制，不妨等“两个峰的问题”解决了之后，再考虑等度问题。

我们知道，对于一些极性相似难分离的混合物（如手性分离、顺反异构的分离），用等度能达到最好的分离度；但对于一般分离（极性差别较大），梯度可提高柱效、节约分析时间。

我们一般通过梯度方法找等度配比都是看峰的保留时间所对应的流动相的比例，但这样却忽视了在梯度方法中此点前面的流动相配比对待试品的保留，而出现不保留的情况；然后我们减小流动相洗脱能力，待试品有保留了，但还没有达到分离要求（同时色谱峰变胖了）；于是继续减小流动相洗脱能力以增加保留……直到达到了满意的分离度。这是一个一般的等度摸索步骤，但我们有时也发现这招并不总能走下去，因为随着保留时间的推迟，峰变得越来越胖，越来越矮，再拖下去恐怕连色谱峰都检测不到了呢！你说的等度方法会不出峰的，会不会发生了类似的情况呢？你可以从不保留开始小比例地改变流动相组成，比如一次改变0.5%甚至更小试试。当然，我认为当务之急恐怕并不是要解决这个问题。

祝好运！

作者: sacred 时间: 2009-9-4 10:05

梯度是逐步改变洗脱条件的一种洗脱方式，楼主显然找到了适合的分析方法，另外觉得应该相信自己，怎么会色谱条件好了又考虑标准品纯度了呢？除非有文献说此类标准品不可能那样出峰！！

作者: 358uwcj 时间: 2009-9-4 10:10

朋友说的情况还真是有点特殊啊!!不过我个人觉得,可能是流动相有问题或者确实是标准品有问题(我以前已遇到过新买的标准品有问题的,后来换了新的问题就解决了.).可以改变流动相为30%乙腈+70%水不加四氢呋喃试试看.

作者: 出国吧 时间: 2009-9-4 10:21

有没有可能是进样量（浓度等）比较大，进样阀处有残留，相当于二次进样，所以出两个峰呀。色谱条件用梯度主要是平衡柱子很麻烦，其他没什么，用梯度挺好的。

作者: 实验技术 时间: 2009-9-4 10:39

梯度洗脱出峰，说明在梯度过程里有最适合出峰的流动相比例。等度条件可能没有设对比例。可以通过计算梯度出峰的时候估计出峰时流动相的比例，然后配制等度条件，但是应该没有梯度情况下柱效高。
楼主的意思是不是等度不出峰，梯度标准品出两个峰啊？如果样品只有一个峰，说明标准品分解或者污染了，如果样品也两个峰，可能流动相不合适，试试调节PH。

作者: wtz010 时间: 2009-9-4 11:28

很可能楼主的目标物在一个非常狭窄的流动相比例范围内才能在理想的时间里洗脱，因此可以采用折中法来定位该洗脱浓度比例，相信在不出峰和死时间出峰之间必定有合理的流动相配比存在，不知道楼主都尝试了哪些比例的流动相配比，如果可能请贴个截图上来看看，大家一起分析。
此外，如果不是机密，请把目标物的名称也公布一下，这样更有利于有针对性地探讨哦！

作者: 命运--ses 时间: 2009-9-4 11:29

1.可以换一根其他型号的色谱柱试一下。做这种实验要有相当的耐性啊。
2.标准品应该不会被污染。可能是你等度洗脱没有被洗脱下来的对照品在梯度洗脱的条件下被洗脱出来了。

作者: maicaixiaogu 时间: 2009-9-4 11:35

你可以看下出峰时间的时候，流动相比例是多少，然后按这个比例进行等度试验，或许可以出峰

作者: yyid 时间: 2009-9-4 11:36

1、现象很奇怪,不会是梯度或等度的问题,请认真从你的色谱条件和系统找原因！

2、有些对照品出两个峰很正常，比如枸橼酸盐，富马酸盐好像也是，不知你做的是什么！

作者: aasle 时间: 2009-9-4 19:12

等度的条件试了很多，不是不出峰，就是死时间出峰

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从这两个结果看，在两者中间应该有个位置可以出峰的。

楼主慢慢摸索吧，流动相比例改动稍微小点

作者: huihuidetian112 时间: 2009-9-4 19:12

走梯度，峰出的怎么样?6min，有点短，能分开不？不加四氢呋喃看看，能不能出峰

作者: 花火 时间: 2009-9-4 21:49

建议楼主看看有关色谱分析方面的书籍。搞明白梯度洗脱的含义再说。你的实验过程就是证明了梯度的含义就是增强样品组分的洗脱能力。有些样品只能采用梯度洗脱的方式来增加分离度，以期得到较好的峰形，从而有较好的定量分析结果。

作者: woaifou 时间: 2009-9-4 21:58

在做等度洗脱的时候，平衡时间是否充分。如果标准品出两个峰，是否有一个是前一样品带入。你的进样器是手动还是自动的。
从梯度来看，其中肯定有一种比例是适合的，只是在等度的时候流动相对柱的平衡时间不够。

作者: aa_tang 时间: 2009-9-5 12:09

多肽分析，确实经常遇到这样的问题。

从以往的经验看，乙腈比例的调整对分离有相当大的影响。挺敏感的，色谱保留行为，乙腈有时候微调1-2个百分点，分离有根本性的改变。

标准品出2个峰，一方面可能是色谱条件不合适引起的；另一方面是化合物本身不稳定，溶液状态变坏了。

作者: 猴子 时间: 2009-9-7 11:58 标题: 回复 #1 悠悠白云的帖子

你的试验只有你自己最清楚，谁也帮不了你。只要方法有效就行了，管他等度还是梯度呢？
寻找等度的方法是在能洗脱的前提下，一点一点减小流动相的洗脱能力，保留时间将会被逐渐延长。你找的方法到好，来个要么怎么样，要么怎么样，真不知道你是怎么摸索方法的，心里还有谱没？！

作者: 悠悠白云 时间: 2009-9-7 16:26 标题: 回复 #15 猴子的帖子

你不帮就不帮吧，干嘛说这话？我心里要是有谱还来这求助干嘛？我做液相也不是一天两天了，怎么摸条件我还是知道的，如果像你想的那么简单，这项目早有人做出来了，还等我做呢？

作者: ttkl533 时间: 2009-9-8 15:40

你的问题很简单。

      你的等度洗脱没有问题，而是耐心有问题。也就是说的RUNTIME设置得太短了。原因如下：

      你第一针没有跑出色谱峰就停止了。这个就是你所说的“不出峰”，紧接着你又进了第二针，第一针没有看到的封跑到第

      二针的谱图上了，这就是你所说的“在死时间之前出峰”。


      改一改RUNTIME，看看我说的对不对。

作者: 悠悠白云 时间: 2009-9-9 09:23 标题: 回复 #17 ttkl533 的帖子

呵呵，你说的不对，我重复过很多次了。且每次进样之前都要冲柱子至平衡的。

作者: 悠悠白云 时间: 2009-9-11 08:27 标题: 回复 #19 j-1982 的帖子

非常感谢j-1982的长期关注和支持，我再耐心试试！

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