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标题: 【讨论帖】western显影常见现象、原因及解决方案 [打印本页]

作者: dream2013 时间: 2013-4-5 14:30 标题: 【讨论帖】western显影常见现象、原因及解决方案

特贡献了western显影常见问题及解决方案，是我的经验总结，以供大家参考。其中绝大部分问题是我所遇到过的，其他个别我没遇到过的是参照pierce公司的说明书。限于字数，语言比较简洁，如对其中内容有疑问或建议可跟帖。

Western荧光检测取决于抗原含量—一抗敏感度—二抗敏感度—底物敏感度—显影和定影效率这一系统。我的经历认为确保万无一失的做法是如果看到荧光则压10~30s，看不到则同时压两张，10~30min洗一张，如果无则再补一张,1h后洗。再无，则压过夜。共3张片，根据每次结果调整。
其中两张片子的压法如下描述: 先剪一张比膜长2~3厘米的片子（以供贴胶带），然后剪2片细小透明胶带贴到片子的左右两边（贴时胶带留一半用于粘到封口膜上），然后将片子压到膜上，并使透明胶带留出的一半粘到封口膜上。这样就固定了第一张胶片，就不会因为放、取第二张胶片而使第一张移动了。然后放第二张胶片，与第一张片子贴在一起就行，注意片子要干燥，压片前用纸擦干封口膜，以避免被底物液体污染导致与下面一张粘在一起。取时用手轻轻拂过就可以把上面片子与下面一张错开了，不要用手抠，否则下面一张也移动了。在洗下面一张片子时一定要取掉粘在片子上的胶带，否则在胶带的地方会影响显影。荧光经过下面一张胶片会稍微有些衰减，所以下面一张胶片感光稍微比上面一张强一些。

现象-- - - - - - - - - - - - - - - - - - --原因 - - - - - - - - - - - - - - - - --- -- -- --- -- ---解决

反影(白色条带,黑色背景) ---- -- -1 HRP过高(背景较高) - - - - - - - - ---- - - - 至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注1
显影后膜上条带处变为黄色---- - -2 HRP过高(敏感性太高)- - - - - - - - - ---- -至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注2

信号弱或无---- - - - - - - - - - ---- 3 HRP过高引起底物迅速耗竭- - - - - -- - - -至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注3
--- - - - - - - - - - - - - - ---- - - - --4 抗体-抗原系统敏感性过低- --- - - - - - - 提高抗体浓度/蛋白上样量*注4
- - - - - - - - - - - - - - - ---- - - - --5 转膜不充分/过转- -- -- - - -- - - - - ---- -优化转膜条件*注5
-- - - - - - - - - - - - - - ---- - - - - -6 HRP或底物活性降低---- - - -- - - -- - ----测试活性或选用敏感底物 *注6

高背景---- - - - - - - - - - - - - - - -7 HRP过高(背景较高) - -- - - - - - - - - - -- 至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注7
---- - - - - - - - - - - - - - --- - - ----8 封闭时间不足- - - - - - - - - - - -- - - - -- 延长封闭时间4度过夜最好*注8
--- - - - - - - - - - - - - - --- - -- -- -9 抗体与封闭液有交叉----- - - - - - - - - - -更换封闭液(如3%BSA的TBST)*注9
--- - - - - - - - - - - - - - - -- - -- - -10 TBST洗脱不足 - - - - - - - ---- - --- - - -增加洗脱时间、次数、用量*注10
---- - - - - - - - - - - - - - -- - -- - --11 暴光时间过长 - - - - - ---- - - ------ -- --降低暴光时间*注11
- - - - - - - - - - - - - - - - -- - - ----12 抗原-抗体浓度过高 - - - - - - -- --- - - - 降低抗体浓度或蛋白上样量*注12

条带内无显影的白点----------------13 转膜不良（如有气泡在胶-膜之间) -- -- 精细操作*注13
--- - - - - - - - - - - - - - - -- - - ----14 膜平衡不均/油脂污染- - - - - - - - - - - 按说明书平衡膜/戴手套用平头镊子持膜*注14
---- - - - - - - - - - -- ------------ -- 15 膜与X光片间有气泡- -- - - - - - - - - - --显影前去除气泡*注15

非特异性条带- - - - - --------- -- - -16 抗体交叉反应- - - - - - - - - - - -- -- - --至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注16
- - - - - - - - - - - - - - - --- ---- - - -17 SDS非特异性结合蛋白条带 - - --- - ---使用无SDS转膜液*注17

散在小圆斑 - - - - - -- - -- -- - - ---18 封闭液有杂质颗粒- -- - --------- ------- 静置牛奶使大颗粒沉淀，仅用上层*注18

*注1 其具体问题有二：一是背景较高,二是没有条带.形成机制为条带处HRP很快将底物耗竭，则不发光不使胶片感光而为白色,周围因背景HRP较低而持续发光一段时间使胶片感光为黑色。这种常见于高浓度抗体并且封闭/洗脱不好的情况下。如果没有背景则就是原因3的现象。在暗室可以看到条带周围荧光而条带处为暗。如是则要么通过降低抗体解决，要么动作迅速早期未耗竭底物时压片，否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题。也可以过一段时间鼿RP稍减后重加底物迅速压片。还有另外一种反影现象就是压出条带粗大模糊，但条带中心是空的白色，原因和上面的一样，主要是条带中心耗竭底物引起的，也可以在暗室看到中空的荧光带，但与上面的区别主要在于特异性要好一些，若继续发展则就是原因3的现象。其分析和解决同上。

*注2 其原因主要是HRP太高超速催化底物生成的产物使膜发黄,压出的片子可以是正常的或和原因1或原因3的现象同时存在，只是一种现象，在压过的膜可以看出来（只在加底物后一段时间出现，几小时后可能还会消退，有时甚至刚加底物1~2min就可以看出来，所以要把握时机）。如果没有达到原因1和原因3的程度，那么这种情况一定能够看到很强的荧光，是一种良好的状态,是我们所期盼的。如果压出正常片子而不出现原因1和原因3的现象,可以不予处理。但因为荧光太强极易导致条带增粗变大，所以也可以不稀释抗体而通过调整压片时间来解决，一般压10s~30s，甚至可以3~5s，即时根据结果在暗室调整,荧光持续时间长的话都可连续压十数张片子而效果良好。但也有这种情况，就是由于HRP过强无论怎么减少压片时间条带都依然粗大（如果时间过短如<3s则可因感光不足导致条带太淡，这样就不可取了，但依然是粗大的、非条带的本来面目），那么如果想获得漂亮条带则必须通过降低抗体浓度（减少上样量很不稳定且能力有限，故很少使用）来解决。原因1和3若如是则解决也是一样的。

*注3 这是与1类似但抗体特异性较好时的一种表现，经常与下面的原因4、5、6混淆，特别需要注意。主要出现在HRP极高的情况下，来不及压片就已耗竭底物，往往伴有原因2的现象。可通过加入底物后迅速进入暗室观察荧光确定，也可以根据原因2的现象确定，以区分于原因4、5、6。除非动作迅速早期未耗竭底物时压片，否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题。也可以过一段时间待HRP稍减后TBST简单洗膜重新加底物压片。这种情况下一/二抗稀释可高达10倍而依然荧光明显。

*注4 提高抗体上样量以及下述的使用敏感底物/延长压片时间比较简单,在此不赘述，只提醒一下随抗体浓度增高背景和非特异性可能会增加。关于上样量的极限在此发表我的看法：对于裂解的混合蛋白以上样孔底面积(平方毫米)乘30ug作为极限上样量，而落实到每一个具体条带（同一分子量的所有蛋白或仅做单一蛋白电泳），则以0.3ug/平方毫米底面积作为极限上样量。(见《抗体技术实验指南》的免疫印迹一章)，超过此量可能会导致条带变形。条带信号弱可以通过加大上样量/提高抗体浓度/使用敏感底物/延长压片时间解决。但实际上样量的极限并不以我说的极限上样量为准，因为这个极限上样量是确保所有分子量的条带都跑的很漂亮的极限,而上样超量的表现是随量的加大变形的条带由低分子量逐渐往高分子量延伸。所以western极限上样量的真正操作标准是以目的条带不变形作为极限。比如对于150kd，完全可以超出我所说的极限上样量的2倍而不变形（此时中低分子量条带早已融合或挤为棒槌形了）

*注5 对于非小分子量尤其是大分子量（>100kd）蛋白而言，一般不会出现过转情况，转膜不充分是主要原因，增加转膜力度无非是加大电压/电流，延长时间。但对于小分子蛋白（<30kd就要注意了，<15kd尤其要当心）很可能出现过转，丽春红染膜或观察marker有没有穿膜可以确认，没有丽春红也可以考染转膜后的胶，如果是一片空白，则要小心了，可适当降低转膜力度。对于低分子量一般转膜液不要加SDS以防过转，《抗体技术实验指南》提供的针对中低分子量的湿转缓与高分子量的相比也是不含SDS的。

*注6 测试HRP或底物活性：于暗室EP管加底物A、B液各500ul，加入1ul HRP偶联二抗，若底物立即发出蓝光并于随后数分钟内消失说明HRP和底物尚好。此外试剂公司还开发一些超级底物，其敏感度可达到pg级，但价格昂贵，对某些表达较低的蛋白效果会好些，而且也超级省抗体（其推荐抗体稀释比高达1:10,000以上）。我用的是敏感度为ng级的底物，大部分western都还可以，pg级的还放在手里，没舍得用。

作者: dream2013 时间: 2013-4-5 14:30

*注7 高背景原因是因为HRP偶联二抗结合到膜上，其原因包过直接结合、通过膜上蛋白间接结合、通过一抗（主要指多抗中的杂抗体）间接结合、通过封闭物（与封闭物交叉反应）间接结合、洗脱不彻底等原因造成的。在稀释抗体降低背景的同时也会降低对目的蛋白的结合效率，意即以牺牲信号强度为代价。不过在此提出另外一种和稀释抗体恰相反的做法——提高抗体浓度。这种办法适用于HRP结合到膜上较多而且底物相对极其敏感（如pg级底物，因极其敏感可把结合到膜上的极其微量抗体产生的背景也显示出来，而这种背景在ng级底物即使压片过夜也没有显示），无论如何稀释抗体和加强洗膜都不能消除背景或者条带和背景随稀释呈等比例递减甚至条带递减速度比背景还快，如果稀释抗体则压片时间需延长而背景反而因此更加明显。这种情况下认为需要提高抗体含量以提高条带显示程度，而背景随抗体浓度提高并不加强的很厉害，如是则可以通过减少压片时间而达到突出条带降低背景的目的（我最近带一个研究生使用pg级超级底物时发现此现象并使用此方法解决背景高的难题，当时一抗稀释为原来的4倍，二抗稀释为原来的10倍，即总稀释为原来的40倍仍然可以看到背景的荧光但条带的荧光却减了许多导致条带和背景都无法区分了，后来回复原来浓度并稍微延长孵育时间则条带荧光明显盖过背景并减少压片时间至5s解决）。

*注8 这一点似乎多数人都不重视，所以有时候会有些意外。我一般室温2~4h，但4度过夜确实是最好的。另外在平皿中摇似乎比封口膜更容易掌握并获得较好的效果，对新手似乎更好。

*注9 实际上牛奶对于多数抗体来说还是很好的，但所有二抗也都写着：与牛奶可能有交叉反应。BSA蛋白单一，可降低因牛奶其他成分引起的背景。单用TBST也可以，此法虽然减少了交叉，但单就封闭能力而言却也因此而降低

*注10 一般10min*3次就足够了，如果不放心可按自己意志加强时间、次数、洗脱液用量。

*注11 以牺牲敏感度为代价其最低标准是使目的条带能够正常显影，对一切原因有效，但效果局限。

*注12 以牺牲敏感度为代价其最低标准是使目的条带能够正常显影，仅对膜上蛋白和一抗引起的有效。

*注13 主要是气泡在胶-膜之间引起的绝缘区使蛋白无法通过而不能到达膜上，这一步在操作时尤其要小心，我自己犯过，也看到其他人犯过。我的办法是把胶铺到膜上，先使其一边接触膜的一边，这样就会在胶和膜交界的地方形成一个水相前缘，然后慢慢落下凝胶，这样这个水相前缘就会逐渐推进直至胶膜重合，如是则不会有气泡产生。把胶铺到膜上而非相反是因为胶是透明的，可以看到水相前缘以及有无气泡产生。

*注14 膜平衡不均或有油脂污染的表现是膜上有疏水的通明色和蛋白几无（丽春红染），这点并不多见。

*注15 这一点我是抄pierce的说明书的，我没遇到过，膜与X光片间有气泡也不影响荧光通过，这个我可以肯定。似乎不透明的东西才会导致。

*注16 非特异性条带在普通多抗比较多见，纯化多抗会好的多，但单抗也不是绝对没有，我也遇到过。关于wetern的抗体选择在此提出我的观点：最理想的是混合单抗，其次是纯化多抗，单抗和多抗各有局限和特点，根据个人对特异性需求和蛋白的稳定性而定。考虑的参数主要是抗原表位和特异性两个因素，不包含每个抗体价格。混合单抗虽然针对多个表位但代价太高，需购置多个单抗然后混合，很少有人这么做。纯化多抗基本具有混合多抗的性质和优点，表位多，稳定性好，特异性也不差，我觉得是实际中的首选。单抗虽然特异性好，但如果其针对的表位在提取蛋白时被破坏则其敏感度为会下降甚至为0，故不稳定。普通多抗虽然表位多，但因含其他抗体，特异性差了好多，会有很多杂带乃至背景。实际我做的抗体多数都是普通多抗，只要封闭的好，效果还是很不错的；单抗虽说不稳定，但实际中我都能做出来，尤其是内参，强烈推荐只选单抗。

*注17 此点我根本不知道，完全是拷贝pierce说明书的

*注18 主要原因是牛奶里面会有一些不悬浮的大颗粒，这些东西对封闭无益。我所有的牛奶全是配好后在4度静置（最好放在尖底的管子内），这样那些大颗粒就会沉淀到底部，吸取时不要担心牛奶不均而特意混匀，我只吸上面的，下面的颗粒则不要取。如是则在也没有遇到这种现象。不推荐过滤牛奶，因为耗时极长且得率极低。我用过几次但后来废弃了这种做法。

作者: dream2013 时间: 2013-4-5 14:31

一楼的帖子基本上都补全了，今后最多再添加一点东西，也算是我对dxy的一点回报吧。因为4月底必须结束恼人的CHIP实验（我还在努力争取把它做出来），5月份到6月底还要参加见习科目的考试（内科、外科、妇产、神经病、眼科、耳鼻喉、康复、急诊等8门），于6月底进入临床通科轮转（实习）一年，之后是2年的临床技能培训，结束7年的大学。过了5月份就要告别我呆了3年的实验室进临床了，估计后面3年是不会做实验的了，所以在实验方面的交流和提高可能就到此为止了。今后还会来dxy蛋白版看帖学习的，但时间肯定没这么多了。所以急急整理了这么一个帖子，是我做western的失败的教训和成功的经验，希望对western的初学者和与我遇到同样情况的战友有所帮助和启示。
如果战友有问题并且我能够解决的可以发我有能力的话我会及时回复。

作者: dream2013 时间: 2013-4-5 14:32

注1 另外一种反影现象就是压出条带粗大模糊，但条带中心是空的白色

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作者: dream2013 时间: 2013-4-5 14:33

注2
但因为荧光太强极易导致条带增粗变大

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15524

作者: dream2013 时间: 2013-4-5 14:33

注7
高背景
注16
非特异性条带
注18
散在小圆斑
因为封闭不充分,这3者很容易联合出现,下面是一张典型图,3者均含

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15525

作者: dream2013 时间: 2013-4-5 14:33

注16
非特异性条带
下面是一张非特异性较高的图,虽有背景但相对较低

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作者: dream2013 时间: 2013-4-5 14:34

注13
主要是气泡在胶-膜之间引起的绝缘区使蛋白无法通过而不能到达膜上
气泡主要是中间一条带的上缘的半圆形缺失.我实际的片子上可以隐约看出是一个圆形的气泡,周围一圈还有个很形象的边界

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作者: dream2013 时间: 2013-4-5 14:34

再提供一个如何在western显影图上判断蛋白降解的例子.
如下图,与最右边一条带相比,左边3条带显影分子量散落下移（不能有上移，因分子量变小），拖拉一片，即为降解。在考染胶上判断有无降解一是大分子量是否完全，二是背景是否清晰，三是小分子量区是否模糊。降解是非均一性的，蛋白会不同程度断裂形成大大小小的片段。在胶上则降低各条带含量，增加条带间蛋白形成背景，小片段在小分子量区堆积。在western显影图（我这张图用的是多抗）则体现为分子量递减的一连续片段（就如同一群人有人断胳膊，有人断腿，有人断头，有人断手指，有人什么也没丢，大家断的是随机的，断下来的都坠落在小分子量区，剩下的从统计上来看就是以原分子量为首的一段区域。我用的是多抗，所以可识别这一群片段，如果是单抗，则只能识别那些表位完整的片段，就不是这种图形了。没做过，猜测是稍微增长的一段（肯定比多抗短的多），但要淡得多。

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作者: 算盘阿星 时间: 2013-4-5 14:35

版主帖子对我很有帮助，我现在的western blot几乎陷入困境，因为几次重复作出的结果都没有目标条带，出现的是分子量为目标蛋白分子量约一半的三条带，诸位专家能否为小弟指点迷津，我用的是DAB显色，附图一张

图片附件: 45983473.jpg (2013-4-5 14:35, 13.82 KB) / 该附件被下载次数 11
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15529

作者: 算盘阿星 时间: 2013-4-5 14:36

蛋白降解用何种办法可以准确的测出来？是不是一抗的问题呢？

作者: mamamiya 时间: 2013-4-5 14:37

你提供的信息不足以分析你的原因,如果有时间请将下面粗表填全,以便于应助战友充分了解信息.是我临时写的粗表,相对烦琐可能还不算实用,以后我会改进一下的,不好意思.

斑竹如果看中的话可组织力量完善,以便于战友应助.

目的蛋白名称：；分子量： kd
样本组织/细胞名称：
目的蛋白表达亚定位（胞膜/胞浆/胞核/分泌型）：；提取蛋白（胞膜胞浆/胞核/培养上清或血浆/总蛋白）：
一抗品种（普通多抗/单抗/纯化多抗）：；一抗公司（最好有货号，便于网上查说明书）：；一抗质量评价（贮存时间，是否做出来过）：
分离胶浓度：
加样孔底面积（宽×厚）： mm× mm；上样量：ug
转膜方式（湿转/半干）；转膜强度（恒压/恒流）×时间
封闭液名称(5%牛奶TBST/3%BSATBST等等)：；封闭温度和时间：
一抗说明书推荐稀释度：；实际使用稀释度：；一抗反应温度和时间：
二抗说明书推荐稀释度：；实际使用稀释度：；二抗反应温度和时间：
洗膜时间×次数：
显色（时间）/显影（压片时间）：
结果描述:
具体的问题：

作者: mamamiya 时间: 2013-4-5 14:38 标题: 回复 #12 mamamiya 的帖子

谢谢你，mamamiya 师兄，非常感谢您能救小弟于危难之中！我把师兄制作的表填了填，师兄和诸位高手帮着分析分析！
目的蛋白名称：；分子量：98kd
样本组织/细胞名称：大鼠背根神经节组织
目的蛋白表达亚定位（胞膜/胞浆/胞核/分泌型）：；提取蛋白（胞膜胞浆/胞核/培养上清或血浆/总蛋白）：胞膜；
一抗品种（普通多抗/单抗/纯化多抗）：单抗；一抗公司（最好有货号，便于网上查说明书）：上海***公司代理的以色列阿罗们公司的产品；为抗trpv4离子通道蛋白的抗体
一抗质量评价（贮存时间，是否做出来过）：自从开始做western blot，从未作出来过。
分离胶浓度：
加样孔底面积（宽×厚）： mm× mm；上样量：20
转膜方式：湿转；
转膜强度（恒压/恒流）×时间：200mA 2.5小时
封闭液名称(5%牛奶TBST/3%BSATBST等等)：5%牛奶TBST ；
封闭温度和时间：室温2小时
一抗说明书推荐稀释度：1：200 使用稀释度： 1：200；一抗反应温度和时间：室温 2小时
二抗说明书推荐稀释度：1：1000到1：3000 ；实际使用稀释度：1：1500 ；二抗反应温度和时间：室温2小时
洗膜时间×次数：洗三次，分别为10分钟、5分钟、5分钟
显色（时间）/显影（压片时间）：用DAB 显色
结果描述:没有出现目标条带，只出现分子量为其一半左右的3条带（45kd左右），内参跑得很漂亮
具体的问题：不知道是目标蛋白降解了，还是一抗在运输过程中发生问题，或是一抗的来源有问题，还是我的实验步骤有误

作者: mamamiya 时间: 2013-4-5 14:39

QUOTE:

原帖由 mamamiya 于 2013-4-5 14:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你提供的信息不足以分析你的原因,如果有时间请将下面粗表填全,以便于应助战友充分了解信息.是我临时写的粗表,相对烦琐可能还不算实用,以后我会改进一下的,不好意思.

斑竹如果看中的话可组织力量完善,以便于战友应助 ...

这种蛋白是种离子通道蛋白，叫做trpv4蛋白

作者: dream2013 时间: 2013-4-5 14:39

QUOTE:

原帖由 mamamiya 于 2013-4-5 14:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

这种蛋白是种离子通道蛋白，叫做trpv4蛋白

我没做过你的蛋白，只提供一般分析：
目标蛋白降解判断见前文考染（你内参好，问题不大）
还是一抗在运输过程中发生问题（很少发生），
或是一抗的来源有问题（可能是蛋白表达量低，没有被检测到，若是表位在蛋白提取中破坏则没有办法，但发生不多）

你没写胶浓度，不过看你marker似乎在10％左右，98kd的，建议可以6~8％（注意迁移谱会改变许多，要marker定）,这样有利于转膜。你组织量很少，所以蛋白量不多，但似乎20ug太少。你没写加样孔底面积，但从条带上看似乎是4～5mm宽的，按你厚度1mm算，你摸条件（不要做多，2孔即可）分别用用标准上样量（极限上样量的一半）和极限上样量（见一楼注4）做。你单抗，见一楼注16，不知你裂解液会不会破坏表位。你基本没背景，所以我下面是我的建议，主要是提高信号强度，只写有改变的

加样孔底面积（宽×厚）： mm× mm；上样量：标准+极限两孔足够（如果蛋白不够则任取其一，只做1孔）
一抗使用稀释度： 1：100，反应温度和时间： 4度过夜（即>6h）
二抗实际使用稀释度：1：800 ；
洗膜时间×次数：洗三次，均为10分钟

作者: 算盘阿星 时间: 2013-4-5 14:42

我犯了一个严重的错误，就是在当初使用抗体时，没有研究清楚抗体的说明书，从师兄那儿直接拿来就用了，结果今天才发现自己犯了一个大错，这种抗体是种多克隆抗体，而且当初说明书上并未告诉我们哪一条是目标条带，（说明书样品图见下），实际上这种抗体可以在杂交瘤上显现出六七条目标带，真是郁闷，特异性这么差，最终表达出来的只有一些非目标的条带，而目标条带却由于表达量少而不显色，真是一招不慎满盘皆输！诸位战友一定要引以为鉴，实验每一步都要谨慎哪！！

作者: dream2013 时间: 2013-4-5 14:44

不好意思,上次弄错成TRPV1了,这次改过来了.

附件附的只是一个western的推荐操作而已,并非抗体说明书.而且它建议上样量50ug.
我不贴图了,这是说明书网址 cuturl('http://www.alomone.com/p_postcards/database/326.htm') ,提示表位仅19个AA（可能容易破坏，或产生非特异性），但其上显示的是~65kd 的主条带,其他几条带中~100kd的可能是前体，小的可能是其他减切片段或非特异性，你可以查查相关资料,至于哪一个与你课题有关我也不晓得，你要查资料。你说的98kd是它的前体（Molecular weight: 98010 Da [This is the MW of the unprocessed precursor]，见 cuturl('http://ca.expasy.org/cgi-bin/niceprot.pl?Q9ERZ8') ）。
这是SIGMA公司的相同的抗体,见
cuturl('http://www.sigmaaldrich.com/sigma/datasheet/T9075dat.pdf')
其上也没有说分子量.
这是santa cruz的抗体说明书,也没有说分子量
cuturl('http://www.scbt.com/Datasheets_list/sc-16485.pdf')
你可以查阅各个抗体说明书后的参考文献确定trpv4的western blot相关信息。
Abcam、CELL SIGNALING 、BD、R&D都没有相关抗体。
下面这篇免费文献可能对你有一定的帮助：
cuturl('http://www.jbc.org/cgi/content/full/278/13/11520?ijkey=7a170dd6904b24ce91af09ed2d0b1ba8648bbf03')

作者: zranqi_1 时间: 2013-4-5 14:44

我想请教一个有关抗体选择的问题.对于同一种蛋白的抗体,试剂公司一般回有几种针对它的抗体:比如针对C-末端.或者是N末端的,还有的写着是R-14(against a peptide mapping wethin an internal region of the protein of human origin),尤其是最后一种是什么意思?我不理解.在选择买哪种抗体时该如何选择?还请各位多指教!

作者: dream2013 时间: 2013-4-5 14:45

我想请教一个有关抗体选择的问题.对于同一种蛋白的抗体,试剂公司一般回有几种针对它的抗体:比如针对C-末端.或者是N末端的,还有的写着是R-14(against a peptide mapping wethin an internal region of the protein of human origin),尤其是最后一种是什么意思?我不理解.在选择买哪种抗体时该如何选择?还请各位多指教!

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你的问题可能超出我的能力范围，因为我对抗体的制备方法并不熟悉。我想你查的是不是santa的说明书？那上面也是这么标的，我没遇到过你的问题，也没有咨询过他们的技术员，但我大体给你回答一下吧，要你自己去确认或者请抗体制备的高手来确认。
我找了一个抗体说明书，是C3的，和你说的情况差不多，见：
cuturl('http://www.scbt.com/Datasheets_list/sc-31299.pdf')
其上说法如下：C3a/α (R-14) is an affinity purified goat polyclonal antibody raised against a peptide mapping within an internal region of C3 of human origin.我的理解如下：
1 是山羊源亲和纯化多抗
2 抗体表位是用人C3分子内部的某一肽段来制备产生并纯化的（但不局限于人，说明书会详介其种属）
3 价格比一般抗体要贵。

你也可以查查其他抗体公司，看有没有针对你目的蛋白的抗体，然后看他们怎么说。

作者: kuohao17 时间: 2013-4-5 14:46

由于加ECL比例加错了,重新用T-TBS洗膜两次,每次十分,再压片,但片子没任何印记
想问错在何处,谢谢

作者: dream2013 时间: 2013-4-5 14:48

由于加ECL比例加错了,重新用T-TBS洗膜两次,每次十分,再压片,但片子没任何印记
想问错在何处,谢谢

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这种办法我也干过，一般来说用你这种办法第二次加底物后信号强度会减少一些（其机制我并不清楚，可能是酶活减弱？但似乎不会这么快的），最多减为一半左右，很少有从有到无的质的改变。因为有时信号强时我前一天做的片子在第二天重做另一抗体（一、二抗都是没有交叉的，排除了重新杂交的干扰）时第一天的甚至还可以看到荧光。所以关键的问题不是你这一步操作的错误。从你给的信息看不出有什么直接导致你结果的错误。其可能原因纷杂，我不太好判断，而且前帖已有论述，不在此赘述。但底物对酶活的影响很小，无论是谁出现在正好质变的那点都是小概率事件，不是首要考虑的，而应该是排除其他更加可能的原因之后再考虑的。一句话，你这步操作错误的可能性极小。

作者: xingyi08 时间: 2013-4-5 14:49

想请问一下由于压片时间没有掌握好，导致片子模糊不清，想重新利用PVDF膜再次显影压片，不知道此种方法是否可行，如果可行，最长的时间能够相隔多久？而且一次压片几张的时候，在同一片盒中的几张胶片是否需要隔开呢？谢谢

作者: dream2013 时间: 2013-4-5 14:50

可行，以下是3种非标准做法，你可以按顺序选择，会干扰定量的准确度（程度也不是很高，相对还是可信的），非万不得已不要用

1 不加抗体再次压片：先用TBST简单洗一下膜去除废底物。时间根据你HRP含量而定，一般强的话可以1～2天都没问题，但信号肯定会不同程度的减低

2 重新加（重新封闭加一抗可省，也可选择）二抗孵育（我推荐重加二抗是做过1后的首选或者是三种做法中的首选，应该说是干扰较小而效果较好的），然后行后续。效果会提高一些，时间比1也会延长一些，应该说我们压片子的后的膜都适用。如果加一抗则同3

3 洗脱后（用stripping buffer）重新封闭行后续，时间为正确保存的膜（如干膜或TBST4度贮存的膜或压片子的后的膜）至少半年以上有效，但会导致不均匀洗脱，某些公司正在开发均匀洗脱液但至今仍未有通过。效果与洗脱强度有关。总体评价是三者中最好的。

”同一片盒中的几张胶片是否需要隔开呢“是什么意思？如果说是同一张膜上压的片子贴在一起就行，不要隔开，注意片子要干燥，压前用纸擦干封口膜，以避免被底物液体污染导致与下面一张粘在一起了。取时用手轻轻佛过就可以把片子与下面一张分开了，不要用手抠，否则下面一张也移动了。

作者: qianqin1977 时间: 2013-4-5 14:56

我想请教一个问题：
我上了9个样，染膜的时候染的很好，为什么曝光的时候有时总是只有一条或者两条带有荧光，曝光的时候也只能爆出一条或者两条？？？？？？
是一抗或者二抗没孵匀还是什么原因？？？
请多指教！谢谢！！

作者: junhun 时间: 2013-4-5 14:56

可能原因
1 表达本来就有差异，低的不在检测敏感范围之内
2 转膜不均偶发生在半干转膜的中间位置，染膜对比可确认。解决为增厚滤纸（上下各6层）稳定体系
3 孵育不均多发生于膜的周边部分证明：同一样本上同样量的若干孔行后续。解决：用转盘效果会高。若为封口膜水平摇床注意不要封的太死要留足空间使牛奶能够运动并有蛋白的面靠上接触牛奶
4 底物加到膜上铺的不均匀，以及荧光耗竭或不足，不在赘述。

3的可能性还是比较大的。上面几点你都注意一下。同时注意曝光的技巧。

作者: dream2013 时间: 2013-4-5 14:58

请dream2013来帮我分析一下我的这个时虚,时实的情况

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图很漂亮。
最大特点：这个图是对称的，中间不好，而与目的蛋白量多少无关。

首先排除转膜不均和抗体孵育不均。
重点考虑显影液和定影液以及显影定影技术是否过关，尤其显影液。
如果此片曝光10秒以内，则极有可能是信号过强和压片时间短的问题，采用降低抗体延长压片解决。否则可排除。
暂不考虑蛋白降解和上样量不妥以及抗体质量问题和封闭问题。

作者: avi317 时间: 2013-4-5 14:58

图很漂亮。
最大特点：这个图是对称的，中间不好，而与目的蛋白量多少无关。

首先排除转膜不均和抗体孵育不均。
重点考虑显影液和定影液以及显影定影技术是否过关，尤其显影液。
如果此片曝光10秒以内，则极有可能是信号过强和压片时间短的问题，采用降低抗体延长压片解决。否则可排除。
暂不考虑蛋白降解和上样量不妥以及抗体质量问题和封闭问题。

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有个问题，与显影液会有怎样的关系呢?
这种问题不一定出现在中间,也不一定出现这么多泳道,而且也是最近才出现的问题.
我觉得有可能是转膜时,膜与胶在有些部位贴得不紧造成的.
抗体浓度应该没有问题,这个工作浓度已经使用过很长时间了,一直都很正常,不过显影液确实是新配的.

作者: dream2013 时间: 2013-4-5 14:59

既然大家都认为首先是转膜的问题，那么可以选择相应的验证方案，简单并可确诊的就是丽春红染。
没有怀疑你的抗体浓度，只是你的膜很长，有可能引起孵育不均，先排除上面的再考虑这个。

显影液的问题主要是效率不足导致定影后正常条带的边缘也出现模糊而非锐利，这一点容易与信号过强引起的条带粗大并且周围模糊相混淆。

作者: kuaizige 时间: 2013-4-5 14:59

你好，我想请问我做蛋白的差异表达，但做出来差异不明显。因为之前做过基因芯片是有差异的，所以我想排出人为因素造成的差异不明显，可以给我系统讲一下吗？
我初步分析是：一抗二抗浓度时间相应降低，相较而言二抗的效果更明显？所以可以先不动一抗，变变二抗浓度。蛋白上样量增加是否会增加差异？显影曝光时间的缩短。
谢谢！

作者: dream2013 时间: 2013-4-5 14:59

首先必须明确mRNA和蛋白中间隔着一个翻译过程，还有蛋白酶解，蛋白亚细胞分布和蛋白提取，上样都是影响因素。
如果是条带粗大引起的，那么降低抗体可以使条带漂亮。提到的降低信号的方法都可以。
如果本身就没有差异，那么也没有方法。

作者: 鸽子不哭 时间: 2013-4-5 15:00

请dreanm2013来帮我分析一下我的这个时虚,时实的情况

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这个问题我也碰到过，我想这个与压片的关系不是很大，因为对同一张膜，我压过好几次，不管时间长短都没法改变这种虚实的情况，显影液也没问题，因为在此片前后压的片都很正常，这种虚实的情况并不常见，我想这种情况可能的原因是，凝胶不好，电泳过程中，蛋白弥散？或是如版主所说，转膜质量出现了问题（并不是转没转上的问题）？
我觉得这个问题出现的偶然，可以再重复一次，看是否还回出现这样的情况，当然在重复的过程中尽量排除一些可以避免的误差。

作者: lgm 时间: 2013-4-5 15:07

这个问题我也碰到过，我想这个与压片的关系不是很大，因为对同一张膜，我压过好几次，不管时间长短都没法改变这种虚实的情况，显影液也没问题，因为在此片前后压的片都很正常，这种虚实的情况并不常见，我想这种情况可能的原因是，凝胶不好，电泳过程中，蛋白弥散？或是如版主所说，转膜质量出现了问题（并不是转没转上的问题）？
我觉得这个问题出现的偶然，可以再重复一次，看是否还回出现这样的情况，当然在重复的过程中尽量排除一些可以避免的误差。

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非常感谢您的看法,我们做实验的总是兼听则明嘛.
实际上实验我是重复过的,如果出现模糊的现象,每次出现的区域和区域的大小都是不同的,我也曾经怀疑过是凝胶的原因,非常谢谢甜甜桂香的建议!

作者: any333 时间: 2013-4-5 15:08

请版主和各位战友帮我分析一下失误之处及原因

目的蛋白名称：MMP-2；分子量：63kd; Actin；分子量：43kd
样本组织名称：大鼠肾脏
一抗品种（多抗）：MMP-2,sc-10736; Actin,sc-7210, Santa Cruz
一抗质量评价：2周前还能做出结果，自从新购买1，2抗后，未再做出结果，1抗未变。
分离胶浓度：10%
转膜方式：湿转；
转膜强度（恒压）×时间：110 V，50 min
封闭液名称：5%牛奶TBST ；
封闭温度和时间：37度2小时
一抗说明书推荐稀释度：1：50-500; 使用稀释度:1：500; 一抗反应温度和时间: 室温 2h/室温1h+4度过夜+室温1h
二抗说明书推荐稀释度（自从更换2抗后1次也没做出过）：1：5000到1：20000 ；实际使用稀释度：1：5000/8000 ；二抗反应温度和时间：室温2小时
洗膜时间×次数：洗三次，10/15分钟均用过
显色（时间）/显影（压片时间）：用ECL 显色，显色及压片均5 min
结果描述:几乎是白板，没有出现目标条带，内参也看不到

1. 电泳、转膜肯定没有问题（a.丽春红染过有条带，考马染胶无蛋白条带；b.Marker仅胶上清晰，但转不到膜上？？？？；c.2周前还能做出结果）

2. 1抗较贵，师兄已经说我在喝抗体了，急

作者: dream2013 时间: 2013-4-5 15:09

既然内参都有问题，那么建议先停止目的蛋白只作内参，直到内参稳定为止。如下：
1 一二抗不匹配这种低级错误先排除。
2 测试HRP和底物活性：于暗室EP管加底物A、B液各100ul，加入0.5ul HRP偶联二抗，若底物立即发出蓝光并于随后数分钟内消失说明二抗和底物尚好。
3 拿一小片灯光下曝光的片子显影定影以确保显影液正常。
4 定性信号过高/过低：做1次内参western，加了底物后立即到暗室看有无荧光。如3min内未看到荧光，那么压一张过夜的片子。或者采用同时压片2～3张，不同曝光时间，具体见1楼。

作者: sunnyB 时间: 2013-4-5 15:10

请问，如何解决非特异性条带的问题，对于这个看了您的帖子我还是不是很清楚，显影后我的非特异性条带出现的比较严重，看起来条带几乎都出现了，请问这是不是与封闭的不好有关？

作者: qumm1985 时间: 2013-4-5 15:10

是啊，我的也是出现了问题啊，非特异性的问题比较严重，内参部分非特异性的多，但是目的的又还好，不知道为什么呢，难道是封闭的原因，希望哪位高手指点一下呢？还是内参出了问题？

作者: yychen 时间: 2013-4-5 15:11

第一次做Western，没敢上抗体，只做内参，但已经有问题了

目的蛋白名称：Actin；分子量：43kd
样本组织名称：小鼠晶状体、视网膜
样本提取：采用先买的RIPA和PMSF。一个星期前取材，第二天提蛋白，-70度保存。
样本浓度：晶体蛋白为80微克/微升；其余的视网膜蛋白为10-13微克/微升。
上样量：50微克，其中晶体蛋白用裂解液（含PMSF)稀释20倍，其余稀释4倍，加现成的5*loading buffer。总上样体积大约在15微升。
样本特殊情况：也因为样本量不多，我按照10微升分装，前天测浓度后，在冰上放了1个多小时，然后放到-20度，第二天跑胶）
一抗：Actin,Cell signal 第一次一个老师没做出来，然后要求公司换了抗体，这次是第一次用）
一抗质量评价：第一次一个老师没做出来，然后要求公司换了抗体，这次是第一次用
分离胶浓度：12% （其中AP，TMED，丙烯酰胺，TRis-HCl PH8.8 原装进口）分离胶过夜）
跑胶：80V-浓缩胶；120V-分离胶（手动换）
转膜方式：湿转；
转膜强度（恒流）×时间：60mA，150 min
封闭液名称：5%牛奶TBST ；
封闭温度和时间：37度2小时
一抗说明书推荐稀释度：1：1000; 使用稀释度:1：1000;
一抗反应温度和时间: 4度过夜，但早上发现一抗漏了，重新加一抗，37度1小时+室温摇床1小时
二抗说明书推荐稀释度：1：1000到1：3000 ；实际使用稀释度：1：2000；（进口了，买的时候进两千，别人用过，做出的条带很漂亮）
二抗反应温度和时间：37度1小时
洗膜时间×次数：洗三次，10分钟
显色（时间）/显影（压片时间）：用ECL 显色，无荧光，压片5分钟，自动显影
结果描述:内参条带很弱而且很淡
跑胶情况：用的是Bio-Rad电泳槽和电泳仪。本想预电泳，电压为10V，但总被提示No Load，没法跑胶。在浓缩胶的时候，纵向压缩还可以，但是横向扩散很严重，从胶片的创导情况可以看出。但到分离胶后，纵向扩散。
胶和膜的靠然情况：仍然显示串道，五个样本其中有一个样本大分子量部位很淡，但在小分子量的时候有浓聚。

作者: 131415 时间: 2013-4-5 15:12

我是用测浓度的剩余样本跑胶

作者: tuuu2 时间: 2013-4-5 15:13

我做WB，actin内参，100V转60min，5%BSA 4度封闭过夜，一抗天津津脉actin，1：200稀释，室温孵育1.5h，然后用TBST洗6次，每次15min，二抗天津津脉1：4000稀释，室温孵育1.5h，TBS洗4次，每次10min，用ECL（Perice）显影，压片1min，背景特高请高人指点谢谢！
还有一个问题，就是转完膜后用立春红染膜，什么也看不到，为什么？谢谢

图片附件: 77113414.jpg (2013-4-5 15:13, 13.61 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15530

作者: summerxx 时间: 2013-4-5 15:14

大家一般在裂解细胞时加多少细胞裂解液，６孔板，１２孔板？

作者: kulee 时间: 2013-4-5 15:15

其实有个最好的办法，就是买一台化学发光成像仪，可以动态捕捉累加发光信号，我们实验室就是这样的，国产的才12万就可以搞定，不用显影定影液了，也不用压片，获得一系列动态图片，从中选择最漂亮的一张。整个发光过程只需要不到10分钟。

作者: 雪山飞鹿 时间: 2013-4-5 15:15

我刚开始做western遇到了问题而看到这个帖子，却是两年前的发帖，不知道您是不是还会回顾这个帖子给我解答？
1.电泳电压应该如何确定？8V/cm & 10V/cm？正负极之间的距离又该如何测量？我们电泳仪的说明书不知道让谁给弄丢了……我用不同的电压跑胶，跑完胶需要的时间为1-2小时不等，考马斯亮兰染色发现跑胶两个小时的结果和一个小时的结果没太大的差别。是不是说明我可以用一个小时跑完？
2.我第一次显影的结果是“反影”以及“显影后膜上条带处变为黄色”，第二次做的时候，我把一抗稀释了2倍，二抗稀释了4倍，结果还是出现了“显影后膜上条带处变为黄色”的现象。另外，在无光暗室中，可见膜上印迹点的荧光，压片后底片上的荧光很弱，延长压片时间至30min，底片上无印记出现，但膜上印记处仍有微弱荧光可见。我应该继续稀释二抗吗？？？

作者: mamamiya 时间: 2013-4-5 15:17

楼主你好，想请问你一个问题，我做的目的蛋白是34KD的，用半干转，稳流（35mA）院子里好多人说稳流可以转出高质量的膜，我想问下什么样的膜算高质量呢？胶上没蛋白条带是吗？

作者: yes4 时间: 2013-4-5 15:17

我昨天晚上试着用两张胶片同时曝光，8min后取出下面的胶片显影、定影，上面的胶片却一点都没感光，所以两张胶片同时放是不太合适的，不知道其他园友有这种情况吗

作者: qhyu 时间: 2013-4-5 15:17

我的泳道也被显出来了为什么的啊？稀释了一抗二抗就做不出来了

作者: qhyu 时间: 2013-4-5 15:20

版主能不能帮我分析下我的片子的问题？谢谢cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=13681258&sty=1&tpg=1&age=0')

作者: 66小飞侠 时间: 2013-4-5 15:21

我显影后发现胶片上出现了marker的条带，但是目的条带没有出来，整个胶片很干净，除了隐约有mark的条带什么都没有，不知为何？难道一抗都结合到maker上去了？
我的一抗是兔来源的多克隆抗体，cst的，希望楼主给予解答！

作者: bling 时间: 2013-4-5 15:21

分析的太好了，原来我做出来的一片漆黑叫“反影”，我以为二抗便宜，就1:2000在做，昏啊，强烈鄙视我自己。

作者: TAT 时间: 2013-4-5 15:22

我过一段时间也要作western，不过我的蛋白质分子量很小，只有15KD，是不是很不容易做出结果啊？谢谢了

作者: TAT 时间: 2013-4-5 15:23

看来楼上很多对western很了解。我最近想做内质网内的蛋白质得联系，想跑凝胶电泳，但是怎样特异性地提取内质网中的蛋白质，不想提全蛋白，用全蛋白去跑电泳会很麻烦。。。不知道各位高人有没有好的方法？

作者: wood533 时间: 2013-4-5 15:23

我前几次做的时候条带很好，最近几次做出来条带老怪怪的，内参都连在一起的而且两头高中间低，不知道是上样问题还是蛋白浓度太高~~~我上样量用了60ug

作者: okhaha 时间: 2013-4-5 15:24

您好，要是上样孔里面有胶对实验结果有什么影响呢？

作者: 831226 时间: 2013-4-5 15:27

做出来的片子怎么白一块黑一块的，背景模糊呢，就像有脏东西

作者: mickeylin 时间: 2013-4-5 15:28

条带的一头黑，一头不黑，请教是不是就是前面所讲的转膜不均或者抗体孵育不均的问题?
转膜是半干转；
一抗孵育是封口袋内2-3ml抗体稀释液，santa一抗，1:800稀释，4°冰箱过夜；
二抗1:5000封口袋内摇床1h；
哪里有问题呢?请教。

作者: standbyme 时间: 2013-4-5 15:29

看见荧光曝5S就行了吧？比如内参我都是曝3S

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