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标题: 【讨论帖】包涵体蛋白的纯化及复性讨论专贴 [打印本页]

作者: ukonptp 时间: 2013-4-10 12:05 标题: 【讨论帖】包涵体蛋白的纯化及复性讨论专贴

有很多战友在关于包涵体蛋白的纯化以及透析复性这块存在很多疑问。我从事包涵体蛋白的纯化以及复性这块的时间比较长，有一些经验，希望能与大家一起分享、讨论。大家有什么问题和经验也可以提出来，共同探讨一下。
我先把园子里关于包涵体纯化和蛋白复性这块非常有价值的帖子整理出来供广大战友参考。

作者: xingyi08 时间: 2013-4-10 12:06

请问老师,我想用色谱柱纯化包涵体具体怎么操作?

作者: 8princess8 时间: 2013-4-10 12:06

你得先考虑你要用什么柱子，包涵体复性前还是后作纯化，如果是不复性就纯化的话，柱子能否耐受变性剂，等等。需考虑的很多，不是一句两句就能说得清的，并且详细情况大家也不知道，每个蛋白又有其自己的特性。

作者: ukonptp 时间: 2013-4-10 12:07

这个问题有些大，如果包涵体本身带标签（HIS或GST)那么可以考虑开始变性后用亲和层析，如果没有标签，那么和一般的蛋白分离也没有什么区别。

作者: xingyi08 时间: 2013-4-10 12:08

谢谢各位老师指导,我看了一些关于包涵体用柱纯化的论点,所以也想尝试一下用凝胶柱.包涵体复性后作纯化,因为复性后是沉淀所以不知道怎么办?

作者: ukonptp 时间: 2013-4-10 12:08

包涵体溶解后过凝胶柱其实是一个复性过程，如果条件没摸好很容易沉淀，得到的蛋白也没有活性。建议你先用透析等方法先复性好，再纯化。有兴趣的话，摸好复性条件后再试着用变性剂溶解好的包涵体去上凝胶柱。

作者: lgm 时间: 2013-4-10 12:08

纯化包涵体？还是复性包涵体。估计是复性吧。复性可以先用稀释、透析、凝胶过滤等方法进行。前两种方法简单，你可以先用前两种方法先试一下。过凝胶较复杂，很多条件要摸。

作者: sr9971 时间: 2013-4-10 12:09

　eg:NS5A2B融合蛋白的表达纯化　
NS5A2B融合蛋白以包涵体形式表达。包涵体用8 mol/L脲溶解, 分别用离子交换柱(Q2FF)和凝胶柱(G250)纯化后, 得到高纯度的NS5A2B融合蛋白(图3) , 浓度为0. 73 g/L。可以参考，嘿嘿，新手上路

作者: mamamiya 时间: 2013-4-10 12:09

我也听说过用带his tag的融合蛋白挂在镍柱上，然后通过缓慢的urea梯度洗，让它挂柱复性的
但是自己没有做成功过

作者: minran_1980 时间: 2013-4-10 12:10

不知你是看什么文献上说用"用带his tag的融合蛋白挂在镍柱上，然后通过缓慢的urea梯度洗，让它挂柱复性的",如果是国内的,那你就没有必要在意了,可能是在造假.用这种方法是很难的,你降低urea浓度只能使之沉淀,并不能改变什么.不象在疏水柱上,蛋白的疏水区域与填料结合了,你降低urea浓度不会使之马上沉淀,从而起了一个复性的过程,因为大家多知道复性过程集聚沉淀大部分是由于疏水区域在发生作用的.我也试过"用带his tag的融合蛋白挂在镍柱上，然后通过缓慢的urea梯度洗，让它挂柱复性的",但也没成功

作者: 鹅鹅鹅 时间: 2013-4-10 12:10

各位大哥大姐们，你们有没有人试过破碎完得包涵体沉淀跑了SDS－PAGE后割下目的带，电洗脱后通过透析方法去处小分子物质呀！我不要求有活性的蛋白只要它的线性表位就可以，由于想用来做细胞，就怕SDS透析不出去，不知各位大侠可否有过相似经历那？谢谢指教！

作者: qiangren789 时间: 2013-4-10 12:11

不知你是看什么文献上说用"用带his tag的融合蛋白挂在镍柱上，然后通过缓慢的urea梯度洗，让它挂柱复性的",如果是国内的,那你就没有必要在意了,可能是在造假.用这种方法是很难的,你降低urea浓度只能使之沉淀,并不能改变什么.不象在疏水柱上,蛋白的疏水区域与填料结合了,你降低urea浓度不会使之马上沉淀,从而起了一个复性的过程,因为大家多知道复性过程集聚沉淀大部分是由于疏水区域在发生作用的.我也试过"用带his tag的融合蛋白挂在镍柱上，然后通过缓慢的urea梯度洗，让它挂柱复性的",但也没成功

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分情况的，我做了个蛋白，变性上镍柱后，直接用不含尿素的wash buffer洗。惊讶的是，蛋白没有脱柱。最后elution得到约1mg/mL的蛋白。哥自己都没想到是这样。。。蛋白的脾气真古怪。

作者: 9900 时间: 2013-4-10 12:12

我用pET系统表达CV-N多肽，可是这融合蛋白是以包涵体的形式表达，请问包涵体纯化的方法？？

作者: H2O 时间: 2013-4-10 12:12

包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和 NP40等加EDTA和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50 mM NaCL。这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。EDTA为0.1-0.3 mM。去垢剂如Triton X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp T(37 KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。
对于尿素和盐酸胍的选择：
尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。
盐酸胍溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰。但它也有成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀和对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。
包涵体最后的纯化，一般是离子交换，疏水，或者是亲和层析，亲和层析尤其是金属螯合层析用得比较广泛，而纯化的效果也不错，通常是一步就能达到纯度为95%以上的包涵体。

作者: biabiade 时间: 2013-4-10 12:13

相关疾病：
头痛
关于包涵体的纯化是一个令人头疼的问题，包涵体的复性已经成为生物制药的瓶颈，关于包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化，内容比较庞杂

一、菌体的裂解
1、怎样裂解细菌？

细胞的破碎方法
1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。
2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。
4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。
无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
这是标准配方:
裂解液：50mM Tris-HCl(pH8.5~9.0), 2mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 1mg/ml溶菌酶。(溶菌酶在这个pH范围内比较好发挥作用)
但我个人的经验是:如果你裂解细菌是为了提取蛋白的话,而且蛋白的分子量又小于20kd的话,尽量减少溶菌酶的用量,会引入溶菌酶这种杂蛋白.一般配60ml裂解液用药匙匙柄盛一点就够.判断裂解好坏的标准是,溶液很粘.
protocol是10ml-50ml缓冲液(菌体洗涤液,裂解液等)/1g湿菌体.
如果只做一个鉴定,我觉得100-200ml菌就够了.
但凡超声,我都用60ml裂解液,因为我们的超声仪(现代分子生物学实验技术录象里的那种)很适合用100ml小烧杯,装60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低,不会冒泡泡,也不会洒出来.菌多我就延长超声时间.
沉淀,也就是包涵体沉淀了,如果要上柱纯化,一定要先用4M尿素洗涤一下再用8M尿素溶解.如果不上柱,只是跑跑电泳,可以直接用8M尿素溶解以后,离心取上清,加入适量体积的loading buffer.loading buffer对于包涵体的溶解能力是较弱的.

"取200微升菌液，离心后直接加上样buffer，100度3分钟后上样，然后SDSPAGE. 这个方法到底能不能溶解细菌中的包涵体? "
而楼主的问题,虽然loading buffer对于包涵体的溶解能力是较弱的,但是我觉得你的做法只是在鉴定有无表达,用loading buffer是没有问题的.

2、表达重组蛋白时，细菌裂解方法都有哪些？
在表达重组蛋白时，诱导以后跑SDS-PAGE发现表达都很好，但是在裂解细胞时遇到问题。总是不能彻底裂解细胞。
首先我采用超声裂解，可是不管我如何超声总有部分细菌没有裂解。
我的超声条件如下：宁波新芝超声细胞破碎仪，功率400W，超5秒，间隔5秒，重复99次。然后显微镜观察，不彻底时再重复99次。菌体来自200 ml培养液，用20 ml PBS重悬。
然后我又尝试加溶菌酶，首先加至终浓度100 ug/ml，4C半小时菌液不变粘，加大浓度至1 mg/ml，半小时后仍无明显变化。因为我用的PBS是pH7.4，我怀疑是pH不合适，换用pH8.0 TE buffer，1 mg/ml溶菌酶，4C半小时仍无明显变粘。因为这次使用的溶菌酶是前一天配好的，担心溶菌酶失效，重新称取冻干粉末，直接加入菌液，仍然没有明显变化。
真是郁闷。到底出了什么事？请高手解答，并介绍优化的方案。
同时希望能介绍一下如何选择细胞破碎方法，以及如何确定最佳条件。
溶菌酶在pH7.4时是否没有活性了？可否配成浓缩液保存溶菌酶，如果可以，应如何保存？
加入溶菌酶以后，如果细胞壁已破坏，菌液应该变粘吧，因为核酸被释放出来。
而超声破碎细胞，我觉得菌液是不会变粘的，因为超声可以把大分子核酸打碎成小片段。
我判断细胞破碎不完全是因为，在将破碎后样品离心分离上清和沉淀跑SDS-PAGE观察，发现在细胞碎片组分中除了经常出现的一两条带以外，还有菌体总蛋白样品中的很多带出现。据此可以判断细胞只是部分破碎。
不知我的分析是否正确，请版主和各位高手指教。
如果溶菌酶效果还可以，我觉得先用溶菌酶初步裂解细胞，然后再用超声进一步破碎并断裂大分子核酸以降低粘度的细胞破碎策略可能比较好。因为超声有可能使蛋白变性，但单用溶菌酶不能确定是否完全破碎，还要再加核酸酶降低粘度。这种两步法策略应该还可以减少破碎条件优化的时间。
我用的溶菌酶放置时间比较长了，有可能失活了。我刚从生工又定了一支，不过得后天到货，但愿它有用。
如何观察溶菌酶是否已裂解细胞，通过观察粘度变化是否可以？
只反复冻融是否可以有效裂解大肠杆菌细胞？
溶菌酶只有在pH值大于8.0的条件下才能发挥溶菌作用，请务必保持PBS的pH＞8.0，同时溶菌酶的量一定要足！
在加入溶菌酶后，最好放于磁力搅拌器上搅拌30分钟，再进行超声破菌，我的超声条件是：功率400W，工作2秒，间隔2秒，重复199次。菌体来自500 ml培养物，用30 ml PBS重悬，超声效率还是可以的。
哪儿的溶菌酶好用？
我用生工的溶菌酶，称取干粉20mg。200ml菌液用18 ml NaCl重悬，加入2 ml 25mM Tris-HCl(pH8.0)，将溶菌酶干粉加入体系，混匀，测pH降低到5－6，加20 ul 2M Tris碱，体系pH升到～8。4C放置1小时，菌液上层变澄清，摇动发现体系没有变粘。测pH仍在8左右。再37C保温1小时，还没有变化，我简直不知如何才好了。
另一瓶200ml培养物，溶菌酶处理1小时后超声。条件：300W，超5秒停5秒，重复99次。菌液有变化，但很不明显。继续超声400次，从外观来看没有太大区别。我简直要说tmd了。见鬼了。
我的操作有什么地方不妥当，请各位指正。
溶菌酶的厂商要求是否很重要？
我的诱导物来自1：20过夜培养物接种，37C生长3小时后30C诱导2小时（0.8mM IPTG）。
是否菌液太浓，Pharmacia的说明书200 ml培养物用10 ml重悬，我用20 ml，仍然不够稀？有人告诉我菌液应该稀一些，200 ml用30－40 ml重悬。但实际操作也不够理想。
SDS-PAGE总是观察到细胞破碎效果不够彻底。超声那么多次，蛋白都要被超碎变性了。

作者: biabiade 时间: 2013-4-10 12:13

3、酵母的破碎
酵母是一类单细胞真菌的总称，其成员分别属于不同的真菌纲，细胞壁成分是否会有较大差别，这些都是做破碎酵母细胞前要考虑的。我归纳了一下，做破碎酵母的几种方法：
1 机械的方法：一般的PROTOCOL都是用glass beads：如 sigma G-8772，加玻璃珠后超声，蛋白活性保持较好。
2 化学裂解的方法：10g酵母加1ml的乙酸乙酯，充分搅拌至液体状（希望高手点评）
3 尿素裂解液（尿素8mol/L, NaCl 0.5mol/L,Tris 20mmol/L, EDTA 20mmol/L, 2%SDS, PH值8.0）高压匀浆。（这个好象也该在方法2中）
4 液氮冻融并研磨酵母破壁，我认为这种可能在小试中比较合适。
5 温和的酶法，可能不会会破坏酵母原生质体
酶法裂解主要用两种酶：1。蜗牛酶，可以直接从蜗牛的胃液中获得；2。lyticase，可以从sigma定购。这两种酶解法都可以和上面的几种方法结合使用，尤其是glass beads方法，效果很好。
我用过化学裂解的方法，10g酵母加1ml的乙酸乙酯，充分搅拌至液体状。此法的裂解效果不错的，不妨试一下。
一篇文章是加尿素裂解液（尿素8mol/L, NaCl 0.5mol/L,Tris 20mmol/L, EDTA 20mmol/L, 2%SDS, PH值8.0），据说效果可以
酵母破碎效果好的我所做过的方法中还是玻璃珠，就象microbe 和rongjunli所说的那样，效率很高的，而且对目的蛋白活性不会有什么影响。一般应该用这个方法。

4、超声破碎的条件选择
超声破碎的条件不能一概而论，要看你的实验要求，有的是细菌破碎，有的是对组织细胞进行破碎，要掌握好功率和每次超声时间，功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，必要时在冰浴条件下进行超声破碎。至于每次超声时是否起泡沫到不是关键的问题，这与你超声的量明显有关。

5、如何鉴定细菌超声破碎的程度
最简单的方法：涂片--革兰氏结晶紫溶液染色0.5分钟---显微镜观察

切记：只用结晶紫染色，别忘了染色后再用水稍冲洗一下

6、细菌裂解的DNaseI
不同纯度的酶换算标准不同，所以你最好查查是哪个公司的酶？仔细看说明书，可能会有换算说明。
另外看一下参考文献所用的酶是哪个公司的，到该公司的主页也可能有收获。
我用过华美和TAKARA的DNA酶，华美的是用mg/ml。华美也有RNase free的DNA酶，定量用活性单位。TAKARA的两种酶都是用活性单位定量的。

我在超声裂解细菌时加入一些DNA酶，一般用超声液加不同量的酶做一个预实验，选取符合你需要的酶量。
其实根据目的和方法的不同，所需要的酶量也是可调节的，比如酶切温度（16度或37度）。

7、超声裂解细菌是否完全？
最简单的方法：涂片--革兰氏结晶紫溶液染色0.5分钟---显微镜观察

切记：只用结晶紫染色
二、包涵体的洗涤
1、包涵体的洗涤问题
通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。

包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。
此外刚处理完的包涵体好溶解。冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。

2、如何得到比较纯的包涵体
对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。
包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和 NP40等加EDTA和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50 mM NaCL。这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。EDTA为0.1-0.3 mM。去垢剂如Triton X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp T(37 KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。
对于尿素和盐酸胍的选择：
尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。
盐酸胍溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰。但它也有成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀和对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。
包涵体最后的纯化，一般是离子交换，疏水，或者是亲和层析，亲和层析尤其是金属螯合层析用得比较广泛，而纯化的效果也不错，通常是一步就能达到纯度为95%以上的包涵体。
8M高浓度尿素溶解后离心获得的包涵体溶解液，放在4度冰箱过夜后出现沉淀，这种现象我也在实验中遇到过;开始感觉很奇怪，后来发现是我们的冰箱的温控出了问题实验际温度要比设定温度低至少4度（呵呵，不好意思！）。不过我接着往下进行SDS-PAGE、层析等发现没有什么不良影响。所以，你不用担心也许你的蛋白也只是和你开了个玩笑呢！

作者: biabiade 时间: 2013-4-10 12:14

三、关于包涵体的溶解：
1、请教GST包涵体溶解
直接用8M的脲或 6M胍融解，取上清，测浓度。直接稀释后包被检测相应抗体。（由于快速稀释相当于复性过程，产物用于检测没有问题的）
我所用的包涵体提取方法：
1．PBS或生理盐水洗涤诱导后菌体，Buffer A重悬菌体，超声波破碎至清亮
２．４度，１００００rpm离心１０分钟，弃上清
３．用ＰＢＳ或生理盐水洗涤沉淀２－３次
４．往沉淀中加１９．７ml Buffer A及０．３ml　２０％的ＳＫＬ（十二烷基肌氨酸钠）贮存液，剧烈搅动，使其缓慢溶解，室温静置３０分钟至２小时
５．４度，１００００rpm离心１０分钟，取上清
６．加２０％ＰＥＧ４０００　２１０ul至终浓度为０．２％，加５０mM的氧化型谷胱甘肽４２０ul至终浓度为１mM,加100mM的还原型谷胱甘肽４２０ul至终浓度为２mM,静置３０分钟至２小时（亦可４度复性过夜）
７以ＰＢＳ（pH8.0)或ＴＥ（pH8.0)透析，取出－２０度保存备用
！Buffer A配方：
　　　Tris-base 50mM
EDTA 0.5mM
NaCl 50mM
甘油　　5%
DTT 5mM

2、包涵体的溶解
十二烷基肌氨酸钠与十二烷基肌氨酸在溶解包涵体时，可不可以互相代替？可以替换，调pH不久没什么区别了吗；两者的功能团相同，pH不同，前者钠盐便于保存罢了
3、有关包涵体的溶解问题
强的变性剂如尿素（6-8M）、盐酸胍（GdnHCl 6M），是通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展，一般来讲，盐酸胍优于尿素，因为盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能使尿素不能溶解的包涵体溶解，而且尿素分解的异氰酸盐能导致多肽链的自由氨基甲酰化，特别是在碱性pH值下长期保温时。SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等是去垢剂，可以破坏蛋白内的疏水键，也可溶解一些包涵体蛋白质。另外，对于含有半胱氨酸的蛋白质，分离的包涵体中通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键。还需加入还原剂，如巯基乙醇、二硫基苏糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶，有时还原剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。
4、8M尿素溶解的包涵体溶液应如何保存?
我在4度放了半个月，目前没出什么问题
5、8M尿素溶解的包涵体溶液在室温下可以放多久而不出现问题?
BI溶液在室温放置48小时，可能会对目的蛋白有影响，因为尿素在碱性条件下可使一些氨基酸酰基化，因而早些处理BI溶液比较好。具体有什么影响我也不是很清楚。
6、GST融合蛋白形成包含体不溶，咋办？
GST融合蛋白应该不能用尿素等作用太强的变性剂，否则GST融合蛋白是不能与beads相结合的
GST的Beads是应用酶与底物结合的原理，所以要去除处理因素后才好结合，不知你的温和的去污剂是什么？

做完裂解之后加Triton　X－100轻摇３０min，蛋白溶解的会多些！

四、包涵体的复性
1、包涵体如何复性
包涵体的复性主要有两种方式：
1，稀释溶液，但是操作的液体量大，蛋白稀释
2，透析，超滤或电渗透析去除变性剂
其中透析很适合实验室应用，但是时间长。另外，如果蛋白质右两个以上的2硫键，很可能错误形成配对，应用还原剂。还有，复性的具体方法还要根据前期试验及筛选来确定！
另外，你用多大体积的透析缓冲液？可能不够，要更换几次
你家了多少蛋白呀？蛋白量过大也会使复性困难。
你用的透析代是否是新的，处理过没有？新代有化学杂质！
最后，有些复性过程就是还有沉淀（透析方法的缺点）看看溶液中蛋白含量，说不定已经够用了~~
包涵体的复性还要注意以下几点：

1.首先要获得较高纯度的包涵体。
2.包涵体溶解要彻底，一般应使溶解液体量较大，不要怕蛋白被稀释，要有助溶措施。
3.透析前后均要离心
4.透析不能太快.
5.纯化的最佳条件要摸索。
小技巧：
1）包含体要彻底洗涤干净，洗涤液中加入适量Triton-X100.
2) 包含体溶解后装入透析袋在复性液中复性
3）复性液的组成很有讲究，本人使用 Oxidised Glutathione/ Reduced Glutathione 还加入一定的L-Arginine-Hydrochloride 12-24h
4) 复性完毕在低浓度的缓冲液中连续缓慢透析12-24h
5) 复性率的测定据变性蛋白和非变性蛋白的光学性质不同测定（望有经验的战友能更详细地讲解）
6）TritionX100、SDS这一类去垢剂最后不易去除，在制药行业中一般不允许采用。好像SDS最后残留量不能大于0.5%吧，忘了。
我用Triton洗涤有些包涵体效果不是很好。包涵体洗涤是纯化极为重要的一步，改变培养条件，再洗涤包涵体，有时可以在上柱前已经只剩下3-4条杂带，这样后续的纯化就很方便了。因为色谱柱的纯化条件比较难optimize。
这段文字可以参考：
用Novagen公司《pET System Manual》提供的方法，分别进行细菌渗透休克，超声波裂解，研究融合蛋白在细胞周质，细胞质和包涵体中的分布。
渗透休克用1.2.3方法诱导细菌（10ml体积），测菌液OD600，10000 r/min离心0.5 min去上清，加入渗透休克溶液1（V1= OD 600×V2/5，V1为渗透休克溶液1，V2为培养新鲜菌液），冰浴10 min，10000 r/min离心0.5 min，去上清。加V1体积渗透休克溶液2重悬，摇动冰浴10 min，10000 r/min离心0.5 min，保存上清、细菌沉淀。作如下处理：上清用三氯乙酸(TCA Trichloroacetic acid) 沉淀，加1/10体积100% TCA (w/v)，涡漩15 sec.，冰浴10 min，13000 r/min离心5 min，100 ul丙酮洗涤沉淀，干燥1 h，加V1/2体积1× PBS（pH 10）溶解，-20℃保存，取10 ul加入等体积2×SB，进行12% SDS-PAGE电泳分析，UNIUER SAL HooD-S.N. 75s 成像系统照相。
超声波裂解细菌渗透休克细菌沉淀加1/10培养体积20 mM Tris-HCl（pH 7.5，0℃）重悬，冰浴，超声波裂解，20%工作选择，脉冲粉碎1 min，然后13000 r/min离心5 min，-20℃保存上清、细菌沉淀。上清进行TCA沉淀，处理同上。沉淀用Protein Extraction Reagent（Ni-NTAHi Bind Purification Kit BugBuster. 提供）按 Novagen公司《pET System Manual》提供方法反复处理，洗涤包涵体。包涵体按培养菌100×OD600/3 ul体积加1% SDS溶解，加等体积2×SB，进行12% SDS-PAGE电泳分析，进行蛋白条带灰度扫描，计算融合蛋白Trx-PrPC27-30占细菌总蛋白的相对含量。
1.2.7重组融合蛋白的纯化
PrP-pET-32a（+）转化表达菌E.coli BL21（DE3），TB培养基中，25℃，AMP 200 ug/ml，摇床（250 r／min）培养至OD600约为1.5，更换等体积新鲜TB培养基，加入IPTG至终浓度1 mM，AMP 200 ug/ml，25℃，4 h，4000 g离心收集菌体。按 Ni-NTA HiBind Purification Kit使用说明溶解包涵体，纯化融合蛋白。
或使用笔者改进方法，将Ni-NTA HiBind Purification Kit使用说明中Buffer D改成Wash-Buffer，Buffer-E改成Elute-Buffer，最后用Buffer-E重生Ni-NTA HiBind Rasin，Binding- Buffer平衡以后加50%酒精保存，以免长菌。
洗脱所得蛋白用TCA沉淀，处理同上，得融合蛋白Trx-PrPC27-30，冻干保存。然后12% SDS-PAGE凝胶电泳分析。

3、包涵体复性2
精氨酸可助溶，但精氨酸是代谢产物高浓度对人可能不好。
另外甘氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸有助溶作用。你可以试一试。
对于疏水蛋白的可溶表达，可以降低诱导温度（可以试试4度诱导过夜）和IPTG的量，降低蛋白的表达速度，从而减少包涵体形成的速度，增加正确折叠蛋白的量。或者换成GST融合表达载体，GST可以增加后面融合蛋白的可溶表达。我的蛋白包涵体在经变性纯化后透析复性过程中，在透析液中加入了1%的甘氨酸和5%的甘油，有一定的助溶效果。我想对于你的情况，由于含有二硫键，还要加入一定比例的谷胱甘肽，才能形成正确的二硫键。复性是一个很难捉摸的过程，不同蛋白的复性条件也各不相同。
5、包涵体复性问题
包含体复性三大原则：
1。低浓度
2。平缓梯度
3。低温

作者: biabiade 时间: 2013-4-10 12:14

有蛋白析出最大的可能型是：蛋白浓度太高，建议你稀释以后再作透析。
此外，透析的盐浓度（比如ura）要平缓降低：8m-6m-4m-2m-pbs-H2O。
6、包涵体复性形成聚集物
关键是蛋白在复性过程中凝聚了以后，调节PH可以使其溶解，但是这样复性好的蛋白有没有活性还是问题，虽然样品溶解了，但活性不高或没有也不行呀！

7、复性中蛋白析出！
出现蛋白析出，肯定是条件变化太剧烈了。复性应该采取复性液浓度和PH值逐渐变化的方法，例如根据你包含体的溶液成分，每隔1个PH或浓度值配置一种溶液，逐步透析到正常。此外透析时必须浓度极低，条件温和，使蛋白质能够正确折叠。但是复性的比率应该很低。
若加变性剂尿素可加到2M，盐酸胍可加到1-1.5M；
另外可将甘油浓度增加，范围可在≤30%，且在复性样品中也可加适量甘油；一些拙见。
8、包涵体复性液配方
对于包涵体复性，一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M 左右时结束。对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M 时复性过程已经结束。TRIS系统和PBS系统都没有明确的规定，这些需要你在实验过程中不断试验，确定合适的缓冲系统；不过复性过程主要是注意以下几个问题：
1）最适pH值范围为8.0-9.0之间；
2) 温度适宜选择4℃；
3）复性过程蛋白浓度不宜过大，一般为0.1-0.2mg/mL；
4) 复性时间一般为24-36小时；
5) 低分子化合物如L-Arg有助于增加复性中间产物的溶解度；脲、盐酸胍、烷基脲、以及碳酸酰胺类等，在非变性浓度下是很有效的促进剂，都可阻止蛋白聚集；Tris对蛋白质复性有促进作用；EDTA可以防止蛋白降解；
6) 氧化还原体系，如GSH/GSSG、DTT/GSSG、DTE/GSSG等.。
还有就是你的蛋白质的特性
9、什么叫复性成功
复性效果的检测：
根据具体的蛋白性质和需要，可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。
1，凝胶电泳：一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质，或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。
2，光谱学方法：可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱（CD）等，利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测，但一般只用于复性研究中的过程检测。
3，色谱方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于两种状态的蛋白色谱行为不同，
4，生物学活性及比活测定：一般用细胞方法或生化方法进行测定，较好的反映了复性蛋白的活性，值得注意的是，不同的测活方法测得的结果不同，而且常常不能完全反映体内活性。
5，黏度和浊度测定：复性后的蛋白溶解度增加，变性状态时由于疏水残基暴露，一般水溶性很差，大多形成可见的沉淀析出。
6，免疫学方法：如ELISA、WESTERN等，特别是对结构决定簇的抗体检验，比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。
在正常的生理条件下，组成蛋白质的多肽链都能以独特的方式进行折叠，形成自己特有的空间结构，以执行某一些生命活动。当外界环境改变时，可能造成基因突变和蛋白质序列改变，错误剪接和运输，错误折叠和异常聚积，形成对机体有害的反应，引起构象病的发生和无生物活性、不可溶的包涵体形成。目前对包涵体形成和复性过程中发生聚集的机制尚不清楚，许多已建立的高效复性方法是在反复实验和优化的基础上建立的，且没有普遍性，但从这许许多多的个例中发现了一些规律：如聚集的发生是由链间的疏水相互作用介导、聚集具有相对特异性、折叠中间体可能具有不同的作用等等，并利用这些知识建立了一些重组蛋白质高效复兴性的方法。相信随着结构生物学、生物信息学、蛋白质工程学及相关新技术和新设备的发展和完善，在不久的将来，预测和设计最佳复性方案将成为可能。
另外，还向这位战友荐一文章，有关包涵体蛋白复性的文章！

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10、怎样鉴定融合蛋白复性是否成功
问：最近在做GST融合蛋白的纯化，由于目的蛋白主要存在于包涵体中，所以在变性条件下将包涵体溶解，经复性，透析后用GSH sepharose 4B纯化，结果得到了比较纯的融合蛋白，这是否说明GST的活性已得到恢复（因为能与GSH结合），请问这种情况下，是否能代表我的目的蛋白的活性也得到了恢复？由于我的目的蛋白只是一个蛋白的某一段，不具有酶活性，也不是什么受体之类的，所以不知如何鉴定它的活性。

如果我得到的是变性的融合蛋白，那么用于制备多抗或者单抗会有影响吗？

如果我的融合蛋白是可溶性的，那么用GSH sepharose 4B纯化得到的融合蛋白可以直接用于制备多抗吗？溶液中的GSH，Tis等成分对免疫动物有影响吗？是否需要透析除取这些成分才能去免疫动物呢？

答：1）。不可以。GST 具体多大忘记了，但做为TAG 使用的蛋白一般是很小的一段AA，可以用相对应的抗体做PULL DOWN，亲和纯化等。但蛋白的活性是需要构象存在的，一小段TAG 空间结构几乎没有，就算是没有恢复活性的蛋白也可以与这小段AA 对应的抗体结合。

2）。变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物，用来免疫动物具有更强的抗原性。只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白，可能会有假阳性。做单抗也可以，同样道理，筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。

3）。免疫动物要求抗原体种尽量小。在这种小体积的情况下，缓冲液里的小分子成分只要没毒影响就不大，可以不用考虑。
4） GST为26kd,你得到的蛋白活性应通过目的蛋白功能分析才能验证是否复性。GST融合蛋白可以免疫动物，但抗体纯化须用GSH-sepharose 4B 和蛋白A或G进一步纯化，去掉抗GST抗体，如果你的目的蛋白很大，可以凝血酶切割除去ＧＳＴ，再免疫动物.GSH,Tris 是小分子，没影响。
5）既然目的蛋白没有活性，何来得活性鉴定，复性是否成功，就主要是看是否恢复到原来特有的三级结构，这就要看你目的蛋白的特异性，和天然的目的蛋白片断进行比较，看其复性是否彻底，这必须有个对照，才能知道复性是否完全。不知道你得到目的蛋白有什么用处，如果是用来做抗原，就没有必要进行活性鉴定了。
变性的融合蛋白做抗原是没有影响的，gst的分子量是26kda，当然，如果将融合伴侣除去，抗体的特异性会要更好一些，如果不除，影响也不会很大。最好进行透析，除去溶液中的杂物质，但是Tris没有什么关系，其就如同PBS一样，本身是缓冲体系，不会对免疫造成太大影响。
6）做抗原的话，变性了没关系的；纯化后可以直接免疫动物，我们这就有人做，不过他是用的His融合表达；挂着GST挺好的，不切也行，蛋白大些岂不是抗原性更强些
另外，你看没看过菌液上清里的蛋白量？那里可能有许多的有活性的蛋白呀

五、包涵体的纯化
复性以后的蛋白质的纯化策略与可溶性蛋白质相似，这里不再赘述。（注：当然也可以先纯化然后再复性———一般多采用凝胶柱，或者纯化与复性同步进行———比如柱上复性。）

六、综述以及其他
1、蛋白复性和纯化在线资料
1. 包涵体表达的蛋白的复性 cuturl('http://www.sinobio.net/method/ecoli.htm#1')
2. 重组蛋白纯化方法
组织细胞的破碎 cuturl('http://www.sinobio.net/method/sansheng/dissociation.htm')
目标蛋白的粗提 cuturl('http://www.sinobio.net/method/sansheng/extracting.htm')
蛋白质沉淀方法 cuturl('http://www.sinobio.net/method/sansheng/precipitation.htm')
色谱分离 cuturl('http://www.sinobio.net/method/sansheng/chromatogram.htm')

作者: biabiade 时间: 2013-4-10 12:14

2、综述
蛋白的复性是一个世界性的难题，没有通用的方法，甚至没有靠得住的规律，只能试。

可以参考以下文章。该文出处已经忘了，如果有人知道原创作者或网上出处，请补充。

包涵体表达的蛋白的复性包涵体表达的蛋白的复性

包涵体：
包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。

包涵体的组成与特性：
一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，难溶与水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。

包涵体的形成：
主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
1、表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。因此有人采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。

包涵体表达的有利因素：
1、可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，包涵体表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解。
2、降低了胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高。
3、包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化。
4、对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于破壁，并与细胞膜碎片分离。

破菌：
1、机械破碎
2、超声破碎
3、化学方法破碎

分离：
1、离心：5000-20000g15min离心，可使大多数包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。
2、过滤或萃取方法：

洗涤：
由于脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋白与包涵体粘连在一起，在溶解包涵体之前要先洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂如2M尿素在50mM TrispH7.0-8.5左右,1mMEDTA中洗涤。此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。

溶解：
常用的变性剂有尿素（8M）、盐酸胍（GdnHCl6-8M），通过离子间的相互作用，破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。其中尿素的增溶效果少差，异氰硫酸胍（GdnSCN）最强。

去垢剂：如强的阴离子去垢剂SDS，可以破坏蛋白内的疏水键，可以增溶几乎所有的蛋白。问题是由于SDS无法彻底的去除而不允许在制药过程中使用。

极端pH：可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白。如有人在pH>9.0溶解牛生长激素和牛凝乳蛋白酶包涵体。有些蛋白可以溶解在60mMHCl中。这些方法只适合于少部分蛋白的增溶。
变性剂的使用浓度和作用时间：一般在偏碱性性的环境中如pH8.0-9.0，尿素在碱性环境中不稳定，一般不要超过pH1.0。有些蛋白只能用盐酸胍如IL-4。增溶时一般室温过夜，但盐酸胍在37度1小时便可以使多数蛋白完全变性溶解。

还原剂：
由于蛋白间二硫键的存在，在增溶时一般使用还原剂。还原剂的使用浓度一般是50-100mM2-BME或DTT，也有文献使用5mM浓度。在较粗放的条件下，可以使用5ml/l的浓度。还原剂的使用浓度与蛋白二硫键的数目无关，而有些没有二硫键的蛋白加不加还原剂无影响，如牛生长激素包涵体的增溶。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶，有时还原剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。

复性：
通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M左右时结束。对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M 时复性过程已经结束。

复性中常采用的方法有：
稀释复性：直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制。
透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，有人称易形成沉淀，且不适合大规模操作，无法应用到生产规模。
超滤复性：在生产中较多的使用，规模较大，易于对透析速度进行控制，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。
柱上复性：是最近研究较多并成功的在生产中应用的一种复性方法，如华北制药的G-CSF复性据说是通过柱上复性进行的。常用于复性的层析方法有SEC、HIC等。

还原剂的去除：
还原剂一般和变性剂的去除一起慢慢的氧化去除，使二硫键慢慢形成。但是由于二硫键的形成并不是蛋白质正确折叠所必须的，可以考虑在变性剂完全去除之后，在去除还原剂使已经按照正确的结构相互接近的巯基间形成正确的二硫键。

常用的氧化方法有：
空气氧化法：在碱性条件下通空气，或者加入二价铜离子，能够取得更好的效果，缺点是不易控制氧化还原电势。
氧化还原电对（redox）：常采用GSSG/GSH，通过调整两者的比例来控制较精确的氧化还原电势，也可以在添加了还原剂如BME、DTT的增溶液中直接加入GSSG,如：5mMGSSG/2mM DTT=GSH/GSSG(1.33/1)。

复性的效率：
复性是一个非常复杂的过程，除与蛋白质复性的过程控制相关外，还很大程度上与蛋白质本身的性质有关，有些蛋白非常容易复性，如牛胰RNA酶有12对二硫键，在较宽松的条件下复性效率可以达到95%以上，而有一些蛋白至今没有发现能够对其进行复性的方法如IL-11，很多蛋白的复性效率只有百分之零点几。一般说来，蛋白质的复性效率在20%左右。影响复性效率的因素有蛋白质的复性浓度，变性剂的起始浓度和去除速度、温度、pH、氧化还原电势、离子强度、共溶剂和其他添加剂的存在与否等。

复性过程的添加剂：
1、共溶剂：如PEG6000-20000，据说可以可逆的修饰折叠中间体的疏水集团，此外由于阻止了蛋白质分子间的相互接触的机会，也可能对复性效率的提高起作用。一般的使用浓度在0.1%左右，具体条件可根据实验条件确定。
2、二硫键异构酶（PDI）和脯氨酸异构酶（PPI）：PDI可以使错配的二硫键打开并重新组合，从而有利于恢复到正常的结构，此外在复性过程中蛋白质的脯氨酸两种构象间的转变需要较高能量，常常是复性过程中的限速步骤，而PPI的作用是促进两种构象间的转变，从而促进复性的进行。
3、分子伴侣，即热休克蛋白（HSP），是一种没有蛋白质特异性的促进折叠的蛋白因子，研究发现很多蛋白在缺乏分子伴侣时无法自己正确的折叠。有人构建了与伴侣分子共同表达的菌株，据说效果不错。不过在生产中还没有看到2和3的应用的例子。
4、0.4-0.6ML-Arg：成功的应用于很多蛋白如t-PA的复性中，可以抑制二聚体的形成。
5、甘油等：增加黏度，减少分子碰撞机会，一般使用浓度在%5-30%。
6、一定的盐浓度，可能是为了降低某些带电集团间的斥力，有利于蛋白质的折叠。
7、辅助因子：添加蛋白质活性状态必须的辅助因子如辅酶辅基等或蛋白配体等很多时候对蛋白质正确的折叠是有利的。
8、色谱法：通过将目标蛋白结合到层析柱上，减少蛋白分子间的相互影响，该方法得到越来越多的应用，常用的色谱有SEC、HIC、IEC、IMAC等。

当然，虽然有很多所谓的理性的复性方案设计，目前的复性工作更多的是一个经验的过程，没有一种通用的方法可以套用。

作者: biabiade 时间: 2013-4-10 12:22

复性时的蛋白浓度：
一般使用浓度为0.1-1mg/ml，太高的浓度容易形成聚体沉淀，太低的浓度不经济，而且很多蛋白在低浓度时不稳定，很容易变性。

复性效果的检测：
根据具体的蛋白性质和需要，可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。
1、凝胶电泳：一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质，或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。
2、光谱学方法：可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱（CD）等，利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测，但一般只用于复性研究中的过程检测。
3、色谱方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于两种状态的蛋白色谱行为不同。
4、生物学活性及比活测定：一般用细胞方法或生化方法进行测定，较好的反映了复性蛋白的活性，值得注意的是，不同的测活方法测得的结果不同，而且常常不能完全反映体内活性。
5、黏度和浊度测定：复性后的蛋白溶解度增加，变性状态时由于疏水残基暴露，一般水溶性很差，大多形成可见的沉淀析出。
6、免疫学方法：如ELISA、WESTERN等，特别是对结构决定簇的抗体检验，比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。

几个复性的实例：
1、MHCII JBC 269（47）：1994
增溶：16-40mg Protein,8MGdnHCl,16-32mM DTT,1mM EDTA,50mM Tris pH8.037度1hr.
复性：8-16fold dilution to1-5mg/ml Protein.
2、增溶：10mM DTT,0.1%SDS,25mM Tris,200mMGlucine pH8.5.
复性：10倍稀释到10mM DTT,2mMDodOMalt(dodecyl-beta-D-maltoside),150mMNaCl,10mMTris pH8.0.对起始缓冲液密闭透析16hr，开口透析8hr，对150mMNaCl,10mM Tris pH8.0透析48hr。
3、Bovine Prethrombin-2,JBC 270(1):1990 四对二硫键。
增溶：7M GdnHCl,10mMTris pH8.0,1mM EDTA 4mg/ml.
复性：稀释到100mM Na2HPO4,2 mM EDTA,0.1% PEG,0-4M GdnHCl,0.1 mM GSSG,0.2 mM GSH,pH7.4,0.025 mg/ml Protein.RT 24hr.对4L 25mM sodiumphosphate,2mM EDTA,0.1%PEG,pH7.4 透析3次，温度4度。

纯化：
一般说来，复性液的体积较大，为了减少处理体积，在进行柱纯化以前可以先进行硫酸铵沉淀，沉淀在低速离心收集后复溶的盐浓度较高，可以直接进行HIC纯化，目标峰经适当稀释后（cond<5mS/cm）进行IEX纯化，然后通过SEC脱盐，更换缓冲液，除菌过滤后，在质量合格的情况下便可以进入制剂阶段。
当然在复性浓度较高的情况下，也可以直接将复性液进行IEX纯化，优点是在纯化的同时进行体积的浓缩，为以后的精制创造条件。
从生产的角度看，由于每增加一步纯化工序便降低很多收率，所以可过两到三次柱纯化，工艺越简单越有利于收率的提高。当然这只是一个一般的原则，对于纯度要求较高的产品如重组人白蛋白，不得不进行多次纯化。

作者: 云端ing 时间: 2013-4-10 12:22

我是一位刚来这里的新手，看到这里有这么多热心为大家解答疑难的前辈，和对蛋白质纯化的有着浓厚兴趣的同志，这里的学术气氛很让人受鼓舞啊，只是本人才疏学浅，初来乍到，只有提问的份没有为大家排忧解难的能力，实在敢到惭愧，我有一问题想请教大家，
我现在做的是一个等电点为９．５６含有１４６个氨基酸的蛋白质，有一个半胱氨酸残基，宿主为大肠杆菌，目地蛋白几乎都以包涵体的形式表达，与肝素有亲合力，请问我该如何设计提取目地蛋的的方案，我是一个刚开始下实验室的学生请高手详细指点，多谢！！！！

作者: ukonptp 时间: 2013-4-10 12:23

如果在包涵体情况下还和肝素有亲和,那很简单,直接溶解包涵体,过肝素琼脂糖凝胶柱就可以,如果不是,那需要先复性,然后在过肝素亲和柱就差不多,此外要留意的是不溶解的未必就一定是包涵体,有的蛋白疏水性强,在水中溶解不好,可以加10%甘油,1%trinton或者吐温看能不能溶解.也可以改变pH试试.

作者: 云端ing 时间: 2013-4-10 12:23

QUOTE:

原帖由 ukonptp 于 2013-4-10 12:23 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

如果在包涵体情况下还和肝素有亲和,那很简单,直接溶解包涵体,过肝素琼脂糖凝胶柱就可以,如果不是,那需要先复性,然后在过肝素亲和柱就差不多,此外要留意的是不溶解的未必就一定是包涵体,有的蛋白疏水性强,在水中溶解 ...

我去试一下！
另外我把这个蛋白的碱基序列输入之后，有一条信息是在ph7.0j 10.290不知这个对纯化的方案是否有所帮助？？？
多谢！！！

作者: ukonptp 时间: 2013-4-10 12:24 标题: 回复 #23 云端ing 的帖子

我不做上游，所以不清楚这是什么意思，你可以调不同pH看蛋白溶解特性，例如pH8.5试试

作者: bling 时间: 2013-4-10 12:24

你好，最近在做包涵体的实验，我的蛋白也是有肝素结合位点，请教你一些经验，请问你是溶解后直接上肝素柱呢，还是复性后又上的肝素柱呢？请回复，谢谢……

作者: ukonptp 时间: 2013-4-10 12:25

相关疾病：
头痛
关于包涵体的纯化是一个令人头疼的问题，包涵体的复性已经成为生物制药的瓶颈，关于包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化，内容比较庞杂

一、菌体的裂解
1、怎样裂解细菌？

细胞的破碎方法
1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。
2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。
4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。
无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
这是标准配方:
裂解液：50mM Tris-HCl(pH8.5~9.0), 2mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 1mg/ml溶菌酶。(溶菌酶在这个pH范围内比较好发挥作用)
但我个人的经验是:如果你裂解细菌是为了提取蛋白的话,而且蛋白的分子量又小于20kd的话,尽量减少溶菌酶的用量,会引入溶菌酶这种杂蛋白.一般配60ml裂解液用药匙匙柄盛一点就够.判断裂解好坏的标准是,溶液很粘.
protocol是10ml-50ml缓冲液(菌体洗涤液,裂解液等)/1g湿菌体.
如果只做一个鉴定,我觉得100-200ml菌就够了.
但凡超声,我都用60ml裂解液,因为我们的超声仪(现代分子生物学实验技术录象里的那种)很适合用100ml小烧杯,装60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低,不会冒泡泡,也不会洒出来.菌多我就延长超声时间.
沉淀,也就是包涵体沉淀了,如果要上柱纯化,一定要先用4M尿素洗涤一下再用8M尿素溶解.如果不上柱,只是跑跑电泳,可以直接用8M尿素溶解以后,离心取上清,加入适量体积的loading buffer.loading buffer对于包涵体的溶解能力是较弱的.

"取200微升菌液，离心后直接加上样buffer，100度3分钟后上样，然后SDSPAGE. 这个方法到底能不能溶解细菌中的包涵体? "
而楼主的问题,虽然loading buffer对于包涵体的溶解能力是较弱的,但是我觉得你的做法只是在鉴定有无表达,用loading buffer是没有问题的.

2、表达重组蛋白时，细菌裂解方法都有哪些？
在表达重组蛋白时，诱导以后跑SDS-PAGE发现表达都很好，但是在裂解细胞时遇到问题。总是不能彻底裂解细胞。
首先我采用超声裂解，可是不管我如何超声总有部分细菌没有裂解。
我的超声条件如下：宁波新芝超声细胞破碎仪，功率400W，超5秒，间隔5秒，重复99次。然后显微镜观察，不彻底时再重复99次。菌体来自200 ml培养液，用20 ml PBS重悬。
然后我又尝试加溶菌酶，首先加至终浓度100 ug/ml，4C半小时菌液不变粘，加大浓度至1 mg/ml，半小时后仍无明显变化。因为我用的PBS是pH7.4，我怀疑是pH不合适，换用pH8.0 TE buffer，1 mg/ml溶菌酶，4C半小时仍无明显变粘。因为这次使用的溶菌酶是前一天配好的，担心溶菌酶失效，重新称取冻干粉末，直接加入菌液，仍然没有明显变化。
真是郁闷。到底出了什么事？请高手解答，并介绍优化的方案。
同时希望能介绍一下如何选择细胞破碎方法，以及如何确定最佳条件。
溶菌酶在pH7.4时是否没有活性了？可否配成浓缩液保存溶菌酶，如果可以，应如何保存？
加入溶菌酶以后，如果细胞壁已破坏，菌液应该变粘吧，因为核酸被释放出来。
而超声破碎细胞，我觉得菌液是不会变粘的，因为超声可以把大分子核酸打碎成小片段。
我判断细胞破碎不完全是因为，在将破碎后样品离心分离上清和沉淀跑SDS-PAGE观察，发现在细胞碎片组分中除了经常出现的一两条带以外，还有菌体总蛋白样品中的很多带出现。据此可以判断细胞只是部分破碎。
不知我的分析是否正确，请版主和各位高手指教。
如果溶菌酶效果还可以，我觉得先用溶菌酶初步裂解细胞，然后再用超声进一步破碎并断裂大分子核酸以降低粘度的细胞破碎策略可能比较好。因为超声有可能使蛋白变性，但单用溶菌酶不能确定是否完全破碎，还要再加核酸酶降低粘度。这种两步法策略应该还可以减少破碎条件优化的时间。
我用的溶菌酶放置时间比较长了，有可能失活了。我刚从生工又定了一支，不过得后天到货，但愿它有用。
如何观察溶菌酶是否已裂解细胞，通过观察粘度变化是否可以？
只反复冻融是否可以有效裂解大肠杆菌细胞？
溶菌酶只有在pH值大于8.0的条件下才能发挥溶菌作用，请务必保持PBS的pH＞8.0，同时溶菌酶的量一定要足！
在加入溶菌酶后，最好放于磁力搅拌器上搅拌30分钟，再进行超声破菌，我的超声条件是：功率400W，工作2秒，间隔2秒，重复199次。菌体来自500 ml培养物，用30 ml PBS重悬，超声效率还是可以的。
哪儿的溶菌酶好用？
我用生工的溶菌酶，称取干粉20mg。200ml菌液用18 ml NaCl重悬，加入2 ml 25mM Tris-HCl(pH8.0)，将溶菌酶干粉加入体系，混匀，测pH降低到5－6，加20 ul 2M Tris碱，体系pH升到～8。4C放置1小时，菌液上层变澄清，摇动发现体系没有变粘。测pH仍在8左右。再37C保温1小时，还没有变化，我简直不知如何才好了。
另一瓶200ml培养物，溶菌酶处理1小时后超声。条件：300W，超5秒停5秒，重复99次。菌液有变化，但很不明显。继续超声400次，从外观来看没有太大区别。我简直要说tmd了。见鬼了。
我的操作有什么地方不妥当，请各位指正。
溶菌酶的厂商要求是否很重要？
我的诱导物来自1：20过夜培养物接种，37C生长3小时后30C诱导2小时（0.8mM IPTG）。
是否菌液太浓，Pharmacia的说明书200 ml培养物用10 ml重悬，我用20 ml，仍然不够稀？有人告诉我菌液应该稀一些，200 ml用30－40 ml重悬。但实际操作也不够理想。
SDS-PAGE总是观察到细胞破碎效果不够彻底。超声那么多次，蛋白都要被超碎变性了。

3、酵母的破碎
酵母是一类单细胞真菌的总称，其成员分别属于不同的真菌纲，细胞壁成分是否会有较大差别，这些都是做破碎酵母细胞前要考虑的。我归纳了一下，做破碎酵母的几种方法：
1 机械的方法：一般的PROTOCOL都是用glass beads：如 sigma G-8772，加玻璃珠后超声，蛋白活性保持较好。
2 化学裂解的方法：10g酵母加1ml的乙酸乙酯，充分搅拌至液体状（希望高手点评）
3 尿素裂解液（尿素8mol/L, NaCl 0.5mol/L,Tris 20mmol/L, EDTA 20mmol/L, 2%SDS, PH值8.0）高压匀浆。（这个好象也该在方法2中）
4 液氮冻融并研磨酵母破壁，我认为这种可能在小试中比较合适。
5 温和的酶法，可能不会会破坏酵母原生质体
酶法裂解主要用两种酶：1。蜗牛酶，可以直接从蜗牛的胃液中获得；2。lyticase，可以从sigma定购。这两种酶解法都可以和上面的几种方法结合使用，尤其是glass beads方法，效果很好。
我用过化学裂解的方法，10g酵母加1ml的乙酸乙酯，充分搅拌至液体状。此法的裂解效果不错的，不妨试一下。
一篇文章是加尿素裂解液（尿素8mol/L, NaCl 0.5mol/L,Tris 20mmol/L, EDTA 20mmol/L, 2%SDS, PH值8.0），据说效果可以
酵母破碎效果好的我所做过的方法中还是玻璃珠，就象microbe 和rongjunli所说的那样，效率很高的，而且对目的蛋白活性不会有什么影响。一般应该用这个方法。

作者: ukonptp 时间: 2013-4-10 12:25

4、超声破碎的条件选择
超声破碎的条件不能一概而论，要看你的实验要求，有的是细菌破碎，有的是对组织细胞进行破碎，要掌握好功率和每次超声时间，功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，必要时在冰浴条件下进行超声破碎。至于每次超声时是否起泡沫到不是关键的问题，这与你超声的量明显有关。

5、如何鉴定细菌超声破碎的程度
最简单的方法：涂片--革兰氏结晶紫溶液染色0.5分钟---显微镜观察

切记：只用结晶紫染色，别忘了染色后再用水稍冲洗一下

6、细菌裂解的DNaseI
不同纯度的酶换算标准不同，所以你最好查查是哪个公司的酶？仔细看说明书，可能会有换算说明。
另外看一下参考文献所用的酶是哪个公司的，到该公司的主页也可能有收获。
我用过华美和TAKARA的DNA酶，华美的是用mg/ml。华美也有RNase free的DNA酶，定量用活性单位。TAKARA的两种酶都是用活性单位定量的。

我在超声裂解细菌时加入一些DNA酶，一般用超声液加不同量的酶做一个预实验，选取符合你需要的酶量。
其实根据目的和方法的不同，所需要的酶量也是可调节的，比如酶切温度（16度或37度）。

7、超声裂解细菌是否完全？
最简单的方法：涂片--革兰氏结晶紫溶液染色0.5分钟---显微镜观察

切记：只用结晶紫染色
二、包涵体的洗涤
1、包涵体的洗涤问题
通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。

包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。
此外刚处理完的包涵体好溶解。冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。

2、如何得到比较纯的包涵体
对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。
包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和 NP40等加EDTA和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50 mM NaCL。这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。EDTA为0.1-0.3 mM。去垢剂如Triton X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp T(37 KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。

作者: ukonptp 时间: 2013-4-10 12:26

对于尿素和盐酸胍的选择：
尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。
盐酸胍溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰。但它也有成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀和对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。
包涵体最后的纯化，一般是离子交换，疏水，或者是亲和层析，亲和层析尤其是金属螯合层析用得比较广泛，而纯化的效果也不错，通常是一步就能达到纯度为95%以上的包涵体。
8M高浓度尿素溶解后离心获得的包涵体溶解液，放在4度冰箱过夜后出现沉淀，这种现象我也在实验中遇到过;开始感觉很奇怪，后来发现是我们的冰箱的温控出了问题实验际温度要比设定温度低至少4度（呵呵，不好意思！）。不过我接着往下进行SDS-PAGE、层析等发现没有什么不良影响。所以，你不用担心也许你的蛋白也只是和你开了个玩笑呢！

三、关于包涵体的溶解：
1、请教GST包涵体溶解
直接用8M的脲或 6M胍融解，取上清，测浓度。直接稀释后包被检测相应抗体。（由于快速稀释相当于复性过程，产物用于检测没有问题的）
我所用的包涵体提取方法：
1．PBS或生理盐水洗涤诱导后菌体，Buffer A重悬菌体，超声波破碎至清亮
２．４度，１００００rpm离心１０分钟，弃上清
３．用ＰＢＳ或生理盐水洗涤沉淀２－３次
４．往沉淀中加１９．７ml Buffer A及０．３ml　２０％的ＳＫＬ（十二烷基肌氨酸钠）贮存液，剧烈搅动，使其缓慢溶解，室温静置３０分钟至２小时
５．４度，１００００rpm离心１０分钟，取上清
６．加２０％ＰＥＧ４０００　２１０ul至终浓度为０．２％，加５０mM的氧化型谷胱甘肽４２０ul至终浓度为１mM,加100mM的还原型谷胱甘肽４２０ul至终浓度为２mM,静置３０分钟至２小时（亦可４度复性过夜）
７以ＰＢＳ（pH8.0)或ＴＥ（pH8.0)透析，取出－２０度保存备用
！Buffer A配方：
　　　Tris-base 50mM
EDTA 0.5mM
NaCl 50mM
甘油　　5%
DTT 5mM

2、包涵体的溶解
十二烷基肌氨酸钠与十二烷基肌氨酸在溶解包涵体时，可不可以互相代替？可以替换，调pH不久没什么区别了吗；两者的功能团相同，pH不同，前者钠盐便于保存罢了
3、有关包涵体的溶解问题
强的变性剂如尿素（6-8M）、盐酸胍（GdnHCl 6M），是通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展，一般来讲，盐酸胍优于尿素，因为盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能使尿素不能溶解的包涵体溶解，而且尿素分解的异氰酸盐能导致多肽链的自由氨基甲酰化，特别是在碱性pH值下长期保温时。SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等是去垢剂，可以破坏蛋白内的疏水键，也可溶解一些包涵体蛋白质。另外，对于含有半胱氨酸的蛋白质，分离的包涵体中通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键。还需加入还原剂，如巯基乙醇、二硫基苏糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶，有时还原剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。
4、8M尿素溶解的包涵体溶液应如何保存?
我在4度放了半个月，目前没出什么问题
5、8M尿素溶解的包涵体溶液在室温下可以放多久而不出现问题?
BI溶液在室温放置48小时，可能会对目的蛋白有影响，因为尿素在碱性条件下可使一些氨基酸酰基化，因而早些处理BI溶液比较好。具体有什么影响我也不是很清楚。
6、GST融合蛋白形成包含体不溶，咋办？
GST融合蛋白应该不能用尿素等作用太强的变性剂，否则GST融合蛋白是不能与beads相结合的
GST的Beads是应用酶与底物结合的原理，所以要去除处理因素后才好结合，不知你的温和的去污剂是什么？

做完裂解之后加Triton　X－100轻摇３０min，蛋白溶解的会多些！

作者: ukonptp 时间: 2013-4-10 12:26

四、包涵体的复性
1、包涵体如何复性
包涵体的复性主要有两种方式：
1，稀释溶液，但是操作的液体量大，蛋白稀释
2，透析，超滤或电渗透析去除变性剂
其中透析很适合实验室应用，但是时间长。另外，如果蛋白质右两个以上的2硫键，很可能错误形成配对，应用还原剂。还有，复性的具体方法还要根据前期试验及筛选来确定！
另外，你用多大体积的透析缓冲液？可能不够，要更换几次
你家了多少蛋白呀？蛋白量过大也会使复性困难。
你用的透析代是否是新的，处理过没有？新代有化学杂质！
最后，有些复性过程就是还有沉淀（透析方法的缺点）看看溶液中蛋白含量，说不定已经够用了~~
包涵体的复性还要注意以下几点：

1.首先要获得较高纯度的包涵体。
2.包涵体溶解要彻底，一般应使溶解液体量较大，不要怕蛋白被稀释，要有助溶措施。
3.透析前后均要离心
4.透析不能太快.
5.纯化的最佳条件要摸索。
小技巧：
1）包含体要彻底洗涤干净，洗涤液中加入适量Triton-X100.
2) 包含体溶解后装入透析袋在复性液中复性
3）复性液的组成很有讲究，本人使用 Oxidised Glutathione/ Reduced Glutathione 还加入一定的L-Arginine-Hydrochloride 12-24h
4) 复性完毕在低浓度的缓冲液中连续缓慢透析12-24h
5) 复性率的测定据变性蛋白和非变性蛋白的光学性质不同测定（望有经验的战友能更详细地讲解）
6）TritionX100、SDS这一类去垢剂最后不易去除，在制药行业中一般不允许采用。好像SDS最后残留量不能大于0.5%吧，忘了。
我用Triton洗涤有些包涵体效果不是很好。包涵体洗涤是纯化极为重要的一步，改变培养条件，再洗涤包涵体，有时可以在上柱前已经只剩下3-4条杂带，这样后续的纯化就很方便了。因为色谱柱的纯化条件比较难optimize。
这段文字可以参考：
用Novagen公司《pET System Manual》提供的方法，分别进行细菌渗透休克，超声波裂解，研究融合蛋白在细胞周质，细胞质和包涵体中的分布。
渗透休克用1.2.3方法诱导细菌（10ml体积），测菌液OD600，10000 r/min离心0.5 min去上清，加入渗透休克溶液1（V1= OD 600×V2/5，V1为渗透休克溶液1，V2为培养新鲜菌液），冰浴10 min，10000 r/min离心0.5 min，去上清。加V1体积渗透休克溶液2重悬，摇动冰浴10 min，10000 r/min离心0.5 min，保存上清、细菌沉淀。作如下处理：上清用三氯乙酸(TCA Trichloroacetic acid) 沉淀，加1/10体积100% TCA (w/v)，涡漩15 sec.，冰浴10 min，13000 r/min离心5 min，100 ul丙酮洗涤沉淀，干燥1 h，加V1/2体积1× PBS（pH 10）溶解，-20℃保存，取10 ul加入等体积2×SB，进行12% SDS-PAGE电泳分析，UNIUER SAL HooD-S.N. 75s 成像系统照相。
超声波裂解细菌渗透休克细菌沉淀加1/10培养体积20 mM Tris-HCl（pH 7.5，0℃）重悬，冰浴，超声波裂解，20%工作选择，脉冲粉碎1 min，然后13000 r/min离心5 min，-20℃保存上清、细菌沉淀。上清进行TCA沉淀，处理同上。沉淀用Protein Extraction Reagent（Ni-NTAHi Bind Purification Kit BugBuster. 提供）按 Novagen公司《pET System Manual》提供方法反复处理，洗涤包涵体。包涵体按培养菌100×OD600/3 ul体积加1% SDS溶解，加等体积2×SB，进行12% SDS-PAGE电泳分析，进行蛋白条带灰度扫描，计算融合蛋白Trx-PrPC27-30占细菌总蛋白的相对含量。
1.2.7重组融合蛋白的纯化
PrP-pET-32a（+）转化表达菌E.coli BL21（DE3），TB培养基中，25℃，AMP 200 ug/ml，摇床（250 r／min）培养至OD600约为1.5，更换等体积新鲜TB培养基，加入IPTG至终浓度1 mM，AMP 200 ug/ml，25℃，4 h，4000 g离心收集菌体。按 Ni-NTA HiBind Purification Kit使用说明溶解包涵体，纯化融合蛋白。
或使用笔者改进方法，将Ni-NTA HiBind Purification Kit使用说明中Buffer D改成Wash-Buffer，Buffer-E改成Elute-Buffer，最后用Buffer-E重生Ni-NTA HiBind Rasin，Binding- Buffer平衡以后加50%酒精保存，以免长菌。
洗脱所得蛋白用TCA沉淀，处理同上，得融合蛋白Trx-PrPC27-30，冻干保存。然后12% SDS-PAGE凝胶电泳分析。

作者: ukonptp 时间: 2013-4-10 12:26

3、包涵体复性2
精氨酸可助溶，但精氨酸是代谢产物高浓度对人可能不好。
另外甘氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸有助溶作用。你可以试一试。
对于疏水蛋白的可溶表达，可以降低诱导温度（可以试试4度诱导过夜）和IPTG的量，降低蛋白的表达速度，从而减少包涵体形成的速度，增加正确折叠蛋白的量。或者换成GST融合表达载体，GST可以增加后面融合蛋白的可溶表达。我的蛋白包涵体在经变性纯化后透析复性过程中，在透析液中加入了1%的甘氨酸和5%的甘油，有一定的助溶效果。我想对于你的情况，由于含有二硫键，还要加入一定比例的谷胱甘肽，才能形成正确的二硫键。复性是一个很难捉摸的过程，不同蛋白的复性条件也各不相同。
5、包涵体复性问题
包含体复性三大原则：
1。低浓度
2。平缓梯度
3。低温

有蛋白析出最大的可能型是：蛋白浓度太高，建议你稀释以后再作透析。
此外，透析的盐浓度（比如ura）要平缓降低：8m-6m-4m-2m-pbs-H2O。
6、包涵体复性形成聚集物
关键是蛋白在复性过程中凝聚了以后，调节PH可以使其溶解，但是这样复性好的蛋白有没有活性还是问题，虽然样品溶解了，但活性不高或没有也不行呀！

7、复性中蛋白析出！
出现蛋白析出，肯定是条件变化太剧烈了。复性应该采取复性液浓度和PH值逐渐变化的方法，例如根据你包含体的溶液成分，每隔1个PH或浓度值配置一种溶液，逐步透析到正常。此外透析时必须浓度极低，条件温和，使蛋白质能够正确折叠。但是复性的比率应该很低。
若加变性剂尿素可加到2M，盐酸胍可加到1-1.5M；
另外可将甘油浓度增加，范围可在≤30%，且在复性样品中也可加适量甘油；一些拙见。
8、包涵体复性液配方
对于包涵体复性，一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M 左右时结束。对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M 时复性过程已经结束。TRIS系统和PBS系统都没有明确的规定，这些需要你在实验过程中不断试验，确定合适的缓冲系统；不过复性过程主要是注意以下几个问题：
1）最适pH值范围为8.0-9.0之间；
2) 温度适宜选择4℃；
3）复性过程蛋白浓度不宜过大，一般为0.1-0.2mg/mL；
4) 复性时间一般为24-36小时；
5) 低分子化合物如L-Arg有助于增加复性中间产物的溶解度；脲、盐酸胍、烷基脲、以及碳酸酰胺类等，在非变性浓度下是很有效的促进剂，都可阻止蛋白聚集；Tris对蛋白质复性有促进作用；EDTA可以防止蛋白降解；
6) 氧化还原体系，如GSH/GSSG、DTT/GSSG、DTE/GSSG等.。
还有就是你的蛋白质的特性
9、什么叫复性成功
复性效果的检测：
根据具体的蛋白性质和需要，可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。
1，凝胶电泳：一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质，或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。
2，光谱学方法：可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱（CD）等，利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测，但一般只用于复性研究中的过程检测。
3，色谱方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于两种状态的蛋白色谱行为不同，
4，生物学活性及比活测定：一般用细胞方法或生化方法进行测定，较好的反映了复性蛋白的活性，值得注意的是，不同的测活方法测得的结果不同，而且常常不能完全反映体内活性。
5，黏度和浊度测定：复性后的蛋白溶解度增加，变性状态时由于疏水残基暴露，一般水溶性很差，大多形成可见的沉淀析出。
6，免疫学方法：如ELISA、WESTERN等，特别是对结构决定簇的抗体检验，比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。
在正常的生理条件下，组成蛋白质的多肽链都能以独特的方式进行折叠，形成自己特有的空间结构，以执行某一些生命活动。当外界环境改变时，可能造成基因突变和蛋白质序列改变，错误剪接和运输，错误折叠和异常聚积，形成对机体有害的反应，引起构象病的发生和无生物活性、不可溶的包涵体形成。目前对包涵体形成和复性过程中发生聚集的机制尚不清楚，许多已建立的高效复性方法是在反复实验和优化的基础上建立的，且没有普遍性，但从这许许多多的个例中发现了一些规律：如聚集的发生是由链间的疏水相互作用介导、聚集具有相对特异性、折叠中间体可能具有不同的作用等等，并利用这些知识建立了一些重组蛋白质高效复兴性的方法。相信随着结构生物学、生物信息学、蛋白质工程学及相关新技术和新设备的发展和完善，在不久的将来，预测和设计最佳复性方案将成为可能。
另外，还向这位战友荐一文章，有关包涵体蛋白复性的文章！

作者: ukonptp 时间: 2013-4-10 12:27

10、怎样鉴定融合蛋白复性是否成功
问：最近在做GST融合蛋白的纯化，由于目的蛋白主要存在于包涵体中，所以在变性条件下将包涵体溶解，经复性，透析后用GSH sepharose 4B纯化，结果得到了比较纯的融合蛋白，这是否说明GST的活性已得到恢复（因为能与GSH结合），请问这种情况下，是否能代表我的目的蛋白的活性也得到了恢复？由于我的目的蛋白只是一个蛋白的某一段，不具有酶活性，也不是什么受体之类的，所以不知如何鉴定它的活性。

如果我得到的是变性的融合蛋白，那么用于制备多抗或者单抗会有影响吗？

如果我的融合蛋白是可溶性的，那么用GSH sepharose 4B纯化得到的融合蛋白可以直接用于制备多抗吗？溶液中的GSH，Tis等成分对免疫动物有影响吗？是否需要透析除取这些成分才能去免疫动物呢？

答：1）。不可以。GST 具体多大忘记了，但做为TAG 使用的蛋白一般是很小的一段AA，可以用相对应的抗体做PULL DOWN，亲和纯化等。但蛋白的活性是需要构象存在的，一小段TAG 空间结构几乎没有，就算是没有恢复活性的蛋白也可以与这小段AA 对应的抗体结合。

2）。变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物，用来免疫动物具有更强的抗原性。只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白，可能会有假阳性。做单抗也可以，同样道理，筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。

3）。免疫动物要求抗原体种尽量小。在这种小体积的情况下，缓冲液里的小分子成分只要没毒影响就不大，可以不用考虑。
4） GST为26kd,你得到的蛋白活性应通过目的蛋白功能分析才能验证是否复性。GST融合蛋白可以免疫动物，但抗体纯化须用GSH-sepharose 4B 和蛋白A或G进一步纯化，去掉抗GST抗体，如果你的目的蛋白很大，可以凝血酶切割除去ＧＳＴ，再免疫动物.GSH,Tris 是小分子，没影响。
5）既然目的蛋白没有活性，何来得活性鉴定，复性是否成功，就主要是看是否恢复到原来特有的三级结构，这就要看你目的蛋白的特异性，和天然的目的蛋白片断进行比较，看其复性是否彻底，这必须有个对照，才能知道复性是否完全。不知道你得到目的蛋白有什么用处，如果是用来做抗原，就没有必要进行活性鉴定了。
变性的融合蛋白做抗原是没有影响的，gst的分子量是26kda，当然，如果将融合伴侣除去，抗体的特异性会要更好一些，如果不除，影响也不会很大。最好进行透析，除去溶液中的杂物质，但是Tris没有什么关系，其就如同PBS一样，本身是缓冲体系，不会对免疫造成太大影响。
6）做抗原的话，变性了没关系的；纯化后可以直接免疫动物，我们这就有人做，不过他是用的His融合表达；挂着GST挺好的，不切也行，蛋白大些岂不是抗原性更强些
另外，你看没看过菌液上清里的蛋白量？那里可能有许多的有活性的蛋白呀

五、包涵体的纯化
复性以后的蛋白质的纯化策略与可溶性蛋白质相似，这里不再赘述。（注：当然也可以先纯化然后再复性———一般多采用凝胶柱，或者纯化与复性同步进行———比如柱上复性。）

六、综述以及其他
1、蛋白复性和纯化在线资料
1. 包涵体表达的蛋白的复性 cuturl('http://www.sinobio.net/method/ecoli.htm#1')
2. 重组蛋白纯化方法
组织细胞的破碎 cuturl('http://www.sinobio.net/method/sansheng/dissociation.htm')
目标蛋白的粗提 cuturl('http://www.sinobio.net/method/sansheng/extracting.htm')
蛋白质沉淀方法 cuturl('http://www.sinobio.net/method/sansheng/precipitation.htm')
色谱分离 cuturl('http://www.sinobio.net/method/sansheng/chromatogram.htm')

作者: ukonptp 时间: 2013-4-10 12:27

2、综述
蛋白的复性是一个世界性的难题，没有通用的方法，甚至没有靠得住的规律，只能试。

可以参考以下文章。该文出处已经忘了，如果有人知道原创作者或网上出处，请补充。

包涵体表达的蛋白的复性包涵体表达的蛋白的复性

包涵体：
包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。

包涵体的组成与特性：
一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，难溶与水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。

包涵体的形成：
主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
1、表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。因此有人采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。

包涵体表达的有利因素：
1、可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，包涵体表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解。
2、降低了胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高。
3、包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化。
4、对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于破壁，并与细胞膜碎片分离。

破菌：
1、机械破碎
2、超声破碎
3、化学方法破碎

分离：
1、离心：5000-20000g15min离心，可使大多数包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。
2、过滤或萃取方法：

洗涤：
由于脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋白与包涵体粘连在一起，在溶解包涵体之前要先洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂如2M尿素在50mM TrispH7.0-8.5左右,1mMEDTA中洗涤。此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。

溶解：
常用的变性剂有尿素（8M）、盐酸胍（GdnHCl6-8M），通过离子间的相互作用，破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。其中尿素的增溶效果少差，异氰硫酸胍（GdnSCN）最强。

去垢剂：如强的阴离子去垢剂SDS，可以破坏蛋白内的疏水键，可以增溶几乎所有的蛋白。问题是由于SDS无法彻底的去除而不允许在制药过程中使用。

极端pH：可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白。如有人在pH>9.0溶解牛生长激素和牛凝乳蛋白酶包涵体。有些蛋白可以溶解在60mMHCl中。这些方法只适合于少部分蛋白的增溶。
变性剂的使用浓度和作用时间：一般在偏碱性性的环境中如pH8.0-9.0，尿素在碱性环境中不稳定，一般不要超过pH1.0。有些蛋白只能用盐酸胍如IL-4。增溶时一般室温过夜，但盐酸胍在37度1小时便可以使多数蛋白完全变性溶解。

还原剂：
由于蛋白间二硫键的存在，在增溶时一般使用还原剂。还原剂的使用浓度一般是50-100mM2-BME或DTT，也有文献使用5mM浓度。在较粗放的条件下，可以使用5ml/l的浓度。还原剂的使用浓度与蛋白二硫键的数目无关，而有些没有二硫键的蛋白加不加还原剂无影响，如牛生长激素包涵体的增溶。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶，有时还原剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。

复性：
通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M左右时结束。对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M 时复性过程已经结束。

复性中常采用的方法有：
稀释复性：直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制。
透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，有人称易形成沉淀，且不适合大规模操作，无法应用到生产规模。
超滤复性：在生产中较多的使用，规模较大，易于对透析速度进行控制，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。
柱上复性：是最近研究较多并成功的在生产中应用的一种复性方法，如华北制药的G-CSF复性据说是通过柱上复性进行的。常用于复性的层析方法有SEC、HIC等。

作者: ukonptp 时间: 2013-4-10 12:28

还原剂的去除：
还原剂一般和变性剂的去除一起慢慢的氧化去除，使二硫键慢慢形成。但是由于二硫键的形成并不是蛋白质正确折叠所必须的，可以考虑在变性剂完全去除之后，在去除还原剂使已经按照正确的结构相互接近的巯基间形成正确的二硫键。

常用的氧化方法有：
空气氧化法：在碱性条件下通空气，或者加入二价铜离子，能够取得更好的效果，缺点是不易控制氧化还原电势。
氧化还原电对（redox）：常采用GSSG/GSH，通过调整两者的比例来控制较精确的氧化还原电势，也可以在添加了还原剂如BME、DTT的增溶液中直接加入GSSG,如：5mMGSSG/2mM DTT=GSH/GSSG(1.33/1)。

复性的效率：
复性是一个非常复杂的过程，除与蛋白质复性的过程控制相关外，还很大程度上与蛋白质本身的性质有关，有些蛋白非常容易复性，如牛胰RNA酶有12对二硫键，在较宽松的条件下复性效率可以达到95%以上，而有一些蛋白至今没有发现能够对其进行复性的方法如IL-11，很多蛋白的复性效率只有百分之零点几。一般说来，蛋白质的复性效率在20%左右。影响复性效率的因素有蛋白质的复性浓度，变性剂的起始浓度和去除速度、温度、pH、氧化还原电势、离子强度、共溶剂和其他添加剂的存在与否等。

复性过程的添加剂：
1、共溶剂：如PEG6000-20000，据说可以可逆的修饰折叠中间体的疏水集团，此外由于阻止了蛋白质分子间的相互接触的机会，也可能对复性效率的提高起作用。一般的使用浓度在0.1%左右，具体条件可根据实验条件确定。
2、二硫键异构酶（PDI）和脯氨酸异构酶（PPI）：PDI可以使错配的二硫键打开并重新组合，从而有利于恢复到正常的结构，此外在复性过程中蛋白质的脯氨酸两种构象间的转变需要较高能量，常常是复性过程中的限速步骤，而PPI的作用是促进两种构象间的转变，从而促进复性的进行。
3、分子伴侣，即热休克蛋白（HSP），是一种没有蛋白质特异性的促进折叠的蛋白因子，研究发现很多蛋白在缺乏分子伴侣时无法自己正确的折叠。有人构建了与伴侣分子共同表达的菌株，据说效果不错。不过在生产中还没有看到2和3的应用的例子。
4、0.4-0.6ML-Arg：成功的应用于很多蛋白如t-PA的复性中，可以抑制二聚体的形成。
5、甘油等：增加黏度，减少分子碰撞机会，一般使用浓度在%5-30%。
6、一定的盐浓度，可能是为了降低某些带电集团间的斥力，有利于蛋白质的折叠。
7、辅助因子：添加蛋白质活性状态必须的辅助因子如辅酶辅基等或蛋白配体等很多时候对蛋白质正确的折叠是有利的。
8、色谱法：通过将目标蛋白结合到层析柱上，减少蛋白分子间的相互影响，该方法得到越来越多的应用，常用的色谱有SEC、HIC、IEC、IMAC等。

当然，虽然有很多所谓的理性的复性方案设计，目前的复性工作更多的是一个经验的过程，没有一种通用的方法可以套用。

复性时的蛋白浓度：
一般使用浓度为0.1-1mg/ml，太高的浓度容易形成聚体沉淀，太低的浓度不经济，而且很多蛋白在低浓度时不稳定，很容易变性。

复性效果的检测：
根据具体的蛋白性质和需要，可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。
1、凝胶电泳：一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质，或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。
2、光谱学方法：可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱（CD）等，利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测，但一般只用于复性研究中的过程检测。
3、色谱方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于两种状态的蛋白色谱行为不同。
4、生物学活性及比活测定：一般用细胞方法或生化方法进行测定，较好的反映了复性蛋白的活性，值得注意的是，不同的测活方法测得的结果不同，而且常常不能完全反映体内活性。
5、黏度和浊度测定：复性后的蛋白溶解度增加，变性状态时由于疏水残基暴露，一般水溶性很差，大多形成可见的沉淀析出。
6、免疫学方法：如ELISA、WESTERN等，特别是对结构决定簇的抗体检验，比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。

几个复性的实例：
1、MHCII JBC 269（47）：1994
增溶：16-40mg Protein,8MGdnHCl,16-32mM DTT,1mM EDTA,50mM Tris pH8.037度1hr.
复性：8-16fold dilution to1-5mg/ml Protein.
2、增溶：10mM DTT,0.1%SDS,25mM Tris,200mMGlucine pH8.5.
复性：10倍稀释到10mM DTT,2mMDodOMalt(dodecyl-beta-D-maltoside),150mMNaCl,10mMTris pH8.0.对起始缓冲液密闭透析16hr，开口透析8hr，对150mMNaCl,10mM Tris pH8.0透析48hr。
3、Bovine Prethrombin-2,JBC 270(1):1990 四对二硫键。
增溶：7M GdnHCl,10mMTris pH8.0,1mM EDTA 4mg/ml.
复性：稀释到100mM Na2HPO4,2 mM EDTA,0.1% PEG,0-4M GdnHCl,0.1 mM GSSG,0.2 mM GSH,pH7.4,0.025 mg/ml Protein.RT 24hr.对4L 25mM sodiumphosphate,2mM EDTA,0.1%PEG,pH7.4 透析3次，温度4度。

纯化：
一般说来，复性液的体积较大，为了减少处理体积，在进行柱纯化以前可以先进行硫酸铵沉淀，沉淀在低速离心收集后复溶的盐浓度较高，可以直接进行HIC纯化，目标峰经适当稀释后（cond<5mS/cm）进行IEX纯化，然后通过SEC脱盐，更换缓冲液，除菌过滤后，在质量合格的情况下便可以进入制剂阶段。
当然在复性浓度较高的情况下，也可以直接将复性液进行IEX纯化，优点是在纯化的同时进行体积的浓缩，为以后的精制创造条件。
从生产的角度看，由于每增加一步纯化工序便降低很多收率，所以可过两到三次柱纯化，工艺越简单越有利于收率的提高。当然这只是一个一般的原则，对于纯度要求较高的产品如重组人白蛋白，不得不进行多次纯化。

包涵体：
包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。

包涵体的组成与特性：
一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，难溶与水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。

包涵体的形成：
主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
1、表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。因此有人采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。

作者: ukonptp 时间: 2013-4-10 12:28

包涵体表达的有利因素：
1、可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，包涵体表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解。
2、降低了胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高。
3、包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化。
4、对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于破壁，并与细胞膜碎片分离。

破菌：
1、机械破碎
2、超声破碎
3、化学方法破碎

分离：
1、离心：5000-20000g 15min离心，可使大多数包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。
2、过滤或萃取方法：

洗涤：
由于脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋白与包涵体粘连在一起，在溶解包涵体之前要先洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂如2M尿素在50mM Tris pH7.0-8.5左右,1mM EDTA中洗涤。此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。

溶解：
常用的变性剂有尿素（8M）、盐酸胍（GdnHCl 6-8M），通过离子间的相互作用，破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。其中尿素的增溶效果少差，异氰硫酸胍（GdnSCN）最强。
去垢剂：如强的阴离子去垢剂SDS，可以破坏蛋白内的疏水键，可以增溶几乎所有的蛋白。问题是由于SDS无法彻底的去除而不允许在制药过程中使用。
极端pH：可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白。如有人在pH>9.0溶解牛生长激素和牛凝乳蛋白酶包涵体。有些蛋白可以溶解在60mM HCl中。这些方法只适合于少部分蛋白的增溶。
变性剂的使用浓度和作用时间：一般在偏碱性性的环境中如pH8.0-9.0，尿素在碱性环境中不稳定，一般不要超过pH1.0。有些蛋白只能用盐酸胍如IL-4。增溶时一般室温过夜，但盐酸胍在37度1小时便可以使多数蛋白完全变性溶解。

还原剂：
由于蛋白间二硫键的存在，在增溶时一般使用还原剂。还原剂的使用浓度一般是50-100mM 2-BME或DTT，也有文献使用5mM浓度。在较粗放的条件下，可以使用5ml/l的浓度。还原剂的使用浓度与蛋白二硫键的数目无关，而有些没有二硫键的蛋白加不加还原剂无影响，如牛生长激素包涵体的增溶。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶，有时还原剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。

复性：
通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M 左右时结束。对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M 时复性过程已经结束。
复性中常采用的方法有：
稀释复性：直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制。
透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，有人称易形成沉淀，且不适合大规模操作，无法应用到生产规模。
超滤复性：在生产中较多的使用，规模较大，易于对透析速度进行控制，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。
柱上复性：是最近研究较多并成功的在生产中应用的一种复性方法，如华北制药的G-CSF复性据说是通过柱上复性进行的。常用于复性的层析方法有SEC、HIC等。

还原剂的去除：
还原剂一般和变性剂的去除一起慢慢的氧化去除，使二硫键慢慢形成。但是由于二硫键的形成并不是蛋白质正确折叠所必须的，可以考虑在变性剂完全去除之后，在去除还原剂使已经按照正确的结构相互接近的巯基间形成正确的二硫键。
常用的氧化方法有：
空气氧化法：在碱性条件下通空气，或者加入二价铜离子，能够取得更好的效果，缺点是不易控制氧化还原电势。
氧化还原电对（redox）：常采用GSSG/GSH，通过调整两者的比例来控制较精确的氧化还原电势，也可以在添加了还原剂如BME、DTT的增溶液中直接加入GSSG,如：5mM GSSG/2mM DTT=GSH/GSSG(1.33/1)。

复性的效率：
复性是一个非常复杂的过程，除与蛋白质复性的过程控制相关外，还很大程度上与蛋白质本身的性质有关，有些蛋白非常容易复性，如牛胰RNA酶有12对二硫键，在较宽松的条件下复性效率可以达到95%以上，而有一些蛋白至今没有发现能够对其进行复性的方法如IL-11，很多蛋白的复性效率只有百分之零点几。一般说来，蛋白质的复性效率在20%左右。影响复性效率的因素有蛋白质的复性浓度，变性剂的起始浓度和去除速度、温度、pH、氧化还原电势、离子强度、共溶剂和其他添加剂的存在与否等。

复性过程的添加剂：
1、共溶剂：如PEG6000-20000，据说可以可逆的修饰折叠中间体的疏水集团，此外由于阻止了蛋白质分子间的相互接触的机会，也可能对复性效率的提高起作用。一般的使用浓度在0.1%左右，具体条件可根据实验条件确定。
2、二硫键异构酶（PDI）和脯氨酸异构酶（PPI）：PDI可以使错配的二硫键打开并重新组合，从而有利于恢复到正常的结构，此外在复性过程中蛋白质的脯氨酸两种构象间的转变需要较高能量，常常是复性过程中的限速步骤，而PPI的作用是促进两种构象间的转变，从而促进复性的进行。
3、分子伴侣，即热休克蛋白（HSP），是一种没有蛋白质特异性的促进折叠的蛋白因子，研究发现很多蛋白在缺乏分子伴侣时无法自己正确的折叠。有人构建了与伴侣分子共同表达的菌株，据说效果不错。不过在生产中还没有看到2和3的应用的例子。
4、0.4-0.6M L-Arg：成功的应用于很多蛋白如t-PA的复性中，可以抑制二聚体的形成。
5、甘油等：增加黏度，减少分子碰撞机会，一般使用浓度在%5-30%。
6、一定的盐浓度，可能是为了降低某些带电集团间的斥力，有利于蛋白质的折叠。
7、辅助因子：添加蛋白质活性状态必须的辅助因子如辅酶辅基等或蛋白配体等很多时候对蛋白质正确的折叠是有利的。
8、色谱法：通过将目标蛋白结合到层析柱上，减少蛋白分子间的相互影响，该方法得到越来越多的应用，常用的色谱有SEC、HIC、IEC、IMAC等。
当然，虽然有很多所谓的理性的复性方案设计，目前的复性工作更多的是一个经验的过程，没有一种通用的方法可以套用。

复性时的蛋白浓度：
一般使用浓度为0.1-1mg/ml，太高的浓度容易形成聚体沉淀，太低的浓度不经济，而且很多蛋白在低浓度时不稳定，很容易变性。

复性效果的检测：
根据具体的蛋白性质和需要，可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。
1、凝胶电泳：一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质，或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。
2、光谱学方法：可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱（CD）等，利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测，但一般只用于复性研究中的过程检测。
3、色谱方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于两种状态的蛋白色谱行为不同，
4、生物学活性及比活测定：一般用细胞方法或生化方法进行测定，较好的反映了复性蛋白的活性，值得注意的是，不同的测活方法测得的结果不同，而且常常不能完全反映体内活性。
5、黏度和浊度测定：复性后的蛋白溶解度增加，变性状态时由于疏水残基暴露，一般水溶性很差，大多形成可见的沉淀析出。
6、免疫学方法：如ELISA、WESTERN等，特别是对结构决定簇的抗体检验，比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。

作者: ukonptp 时间: 2013-4-10 12:28

几个复性的实例：
1、MHCII JBC 269（47）：1994
增溶：16-40mg Protein,8M GdnHCl,16-32mM DTT,1mM EDTA,50mM Tris pH8.0 37度1hr.
复性：8-16fold dilution to 1-5mg/ml Protein.
2、增溶：10mM DTT,0.1%SDS,25mM Tris,200mM Glucine pH8.5.
复性：10倍稀释到10mM DTT,2mM DodOMalt(dodecyl-beta-D-maltoside),150mM NaCl,10mM Tris pH8.0.对起始缓冲液密闭透析16hr，开口透析8hr，对150mM NaCl,10mM Tris pH8.0 透析48hr。
3、Bovine Prethrombin-2,JBC 270(1):1990 四对二硫键。
增溶：7M GdnHCl,10mM Tris pH8.0,1mM EDTA 4mg/ml.
复性：稀释到100mM Na2HPO4,2mM EDTA,0.1%PEG,0-4M GdnHCl,0.1mM GSSG,0.2mM GSH,pH7.4,0.025mg/ml Protein.RT 24hr.对4L 25mM sodium phosphate,2mM EDTA,0.1% PEG,pH7.4 透析3次，温度4度。

纯化：
一般说来，复性液的体积较大，为了减少处理体积，在进行柱纯化以前可以先进行硫酸铵沉淀，沉淀在低速离心收集后复溶的盐浓度较高，可以直接进行HIC纯化，目标峰经适当稀释后（cond<5mS/cm）进行IEX纯化，然后通过SEC脱盐，更换缓冲液，除菌过滤后，在质量合格的情况下便可以进入制剂阶段。
当然在复性浓度较高的情况下，也可以直接将复性液进行IEX纯化，优点是在纯化的同时进行体积的浓缩，为以后的精制创造条件。
从生产的角度看，由于每增加一步纯化工序便降低很多收率，所以可以接受的工艺一般要经过两到三次柱纯化，工艺越简单越有利于收率的提高。当然这只是一个一般的原则，对于纯度要求较高的产品如重组人白蛋白，不得不进行多次纯化。

蛋白的复性是一个世界性的难题，没有通用的方法，甚至没有靠得住的规律，只能试。

可以参考以下文章。该文出处已经忘了，如果有人知道原创作者或网上出处，请补充。

包涵体表达的蛋白的复性包涵体表达的蛋白的复性

包涵体：
包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。

包涵体的组成与特性：
一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，难溶与水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。

包涵体的形成：
主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
1、表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。因此有人采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。

包涵体表达的有利因素：
1、可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，包涵体表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解。
2、降低了胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高。
3、包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化。
4、对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于破壁，并与细胞膜碎片分离。

作者: ukonptp 时间: 2013-4-10 12:29

破菌：
1、机械破碎
2、超声破碎
3、化学方法破碎

分离：
1、离心：5000-20000g15min离心，可使大多数包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。
2、过滤或萃取方法：

洗涤：
由于脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋白与包涵体粘连在一起，在溶解包涵体之前要先洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂如2M尿素在50mM TrispH7.0-8.5左右,1mMEDTA中洗涤。此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。

溶解：
常用的变性剂有尿素（8M）、盐酸胍（GdnHCl6-8M），通过离子间的相互作用，破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。其中尿素的增溶效果少差，异氰硫酸胍（GdnSCN）最强。

去垢剂：如强的阴离子去垢剂SDS，可以破坏蛋白内的疏水键，可以增溶几乎所有的蛋白。问题是由于SDS无法彻底的去除而不允许在制药过程中使用。

极端pH：可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白。如有人在pH>9.0溶解牛生长激素和牛凝乳蛋白酶包涵体。有些蛋白可以溶解在60mMHCl中。这些方法只适合于少部分蛋白的增溶。
变性剂的使用浓度和作用时间：一般在偏碱性性的环境中如pH8.0-9.0，尿素在碱性环境中不稳定，一般不要超过pH1.0。有些蛋白只能用盐酸胍如IL-4。增溶时一般室温过夜，但盐酸胍在37度1小时便可以使多数蛋白完全变性溶解。

还原剂：
由于蛋白间二硫键的存在，在增溶时一般使用还原剂。还原剂的使用浓度一般是50-100mM2-BME或DTT，也有文献使用5mM浓度。在较粗放的条件下，可以使用5ml/l的浓度。还原剂的使用浓度与蛋白二硫键的数目无关，而有些没有二硫键的蛋白加不加还原剂无影响，如牛生长激素包涵体的增溶。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶，有时还原剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。

复性：
通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M左右时结束。对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M 时复性过程已经结束。

复性中常采用的方法有：
稀释复性：直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制。
透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，有人称易形成沉淀，且不适合大规模操作，无法应用到生产规模。
超滤复性：在生产中较多的使用，规模较大，易于对透析速度进行控制，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。
柱上复性：是最近研究较多并成功的在生产中应用的一种复性方法，如华北制药的G-CSF复性据说是通过柱上复性进行的。常用于复性的层析方法有SEC、HIC等。

还原剂的去除：
还原剂一般和变性剂的去除一起慢慢的氧化去除，使二硫键慢慢形成。但是由于二硫键的形成并不是蛋白质正确折叠所必须的，可以考虑在变性剂完全去除之后，在去除还原剂使已经按照正确的结构相互接近的巯基间形成正确的二硫键。

常用的氧化方法有：
空气氧化法：在碱性条件下通空气，或者加入二价铜离子，能够取得更好的效果，缺点是不易控制氧化还原电势。
氧化还原电对（redox）：常采用GSSG/GSH，通过调整两者的比例来控制较精确的氧化还原电势，也可以在添加了还原剂如BME、DTT的增溶液中直接加入GSSG,如：5mMGSSG/2mM DTT=GSH/GSSG(1.33/1)。

复性的效率：
复性是一个非常复杂的过程，除与蛋白质复性的过程控制相关外，还很大程度上与蛋白质本身的性质有关，有些蛋白非常容易复性，如牛胰RNA酶有12对二硫键，在较宽松的条件下复性效率可以达到95%以上，而有一些蛋白至今没有发现能够对其进行复性的方法如IL-11，很多蛋白的复性效率只有百分之零点几。一般说来，蛋白质的复性效率在20%左右。影响复性效率的因素有蛋白质的复性浓度，变性剂的起始浓度和去除速度、温度、pH、氧化还原电势、离子强度、共溶剂和其他添加剂的存在与否等。

复性过程的添加剂：
1、共溶剂：如PEG6000-20000，据说可以可逆的修饰折叠中间体的疏水集团，此外由于阻止了蛋白质分子间的相互接触的机会，也可能对复性效率的提高起作用。一般的使用浓度在0.1%左右，具体条件可根据实验条件确定。
2、二硫键异构酶（PDI）和脯氨酸异构酶（PPI）：PDI可以使错配的二硫键打开并重新组合，从而有利于恢复到正常的结构，此外在复性过程中蛋白质的脯氨酸两种构象间的转变需要较高能量，常常是复性过程中的限速步骤，而PPI的作用是促进两种构象间的转变，从而促进复性的进行。
3、分子伴侣，即热休克蛋白（HSP），是一种没有蛋白质特异性的促进折叠的蛋白因子，研究发现很多蛋白在缺乏分子伴侣时无法自己正确的折叠。有人构建了与伴侣分子共同表达的菌株，据说效果不错。不过在生产中还没有看到2和3的应用的例子。
4、0.4-0.6ML-Arg：成功的应用于很多蛋白如t-PA的复性中，可以抑制二聚体的形成。
5、甘油等：增加黏度，减少分子碰撞机会，一般使用浓度在%5-30%。
6、一定的盐浓度，可能是为了降低某些带电集团间的斥力，有利于蛋白质的折叠。
7、辅助因子：添加蛋白质活性状态必须的辅助因子如辅酶辅基等或蛋白配体等很多时候对蛋白质正确的折叠是有利的。
8、色谱法：通过将目标蛋白结合到层析柱上，减少蛋白分子间的相互影响，该方法得到越来越多的应用，常用的色谱有SEC、HIC、IEC、IMAC等。

当然，虽然有很多所谓的理性的复性方案设计，目前的复性工作更多的是一个经验的过程，没有一种通用的方法可以套用。

作者: ukonptp 时间: 2013-4-10 12:29

复性时的蛋白浓度：
一般使用浓度为0.1-1mg/ml，太高的浓度容易形成聚体沉淀，太低的浓度不经济，而且很多蛋白在低浓度时不稳定，很容易变性。

复性效果的检测：
根据具体的蛋白性质和需要，可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。
1、凝胶电泳：一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质，或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。
2、光谱学方法：可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱（CD）等，利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测，但一般只用于复性研究中的过程检测。
3、色谱方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于两种状态的蛋白色谱行为不同。
4、生物学活性及比活测定：一般用细胞方法或生化方法进行测定，较好的反映了复性蛋白的活性，值得注意的是，不同的测活方法测得的结果不同，而且常常不能完全反映体内活性。
5、黏度和浊度测定：复性后的蛋白溶解度增加，变性状态时由于疏水残基暴露，一般水溶性很差，大多形成可见的沉淀析出。
6、免疫学方法：如ELISA、WESTERN等，特别是对结构决定簇的抗体检验，比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。

几个复性的实例：
1、MHCII JBC 269（47）：1994
增溶：16-40mg Protein,8MGdnHCl,16-32mM DTT,1mM EDTA,50mM Tris pH8.037度1hr.
复性：8-16fold dilution to1-5mg/ml Protein.
2、增溶：10mM DTT,0.1%SDS,25mM Tris,200mMGlucine pH8.5.
复性：10倍稀释到10mM DTT,2mMDodOMalt(dodecyl-beta-D-maltoside),150mMNaCl,10mMTris pH8.0.对起始缓冲液密闭透析16hr，开口透析8hr，对150mMNaCl,10mM Tris pH8.0透析48hr。
3、Bovine Prethrombin-2,JBC 270(1):1990 四对二硫键。
增溶：7M GdnHCl,10mMTris pH8.0,1mM EDTA 4mg/ml.
复性：稀释到100mM Na2HPO4,2 mM EDTA,0.1% PEG,0-4M GdnHCl,0.1 mM GSSG,0.2 mM GSH,pH7.4,0.025 mg/ml Protein.RT 24hr.对4L 25mM sodiumphosphate,2mM EDTA,0.1%PEG,pH7.4 透析3次，温度4度。

纯化：
一般说来，复性液的体积较大，为了减少处理体积，在进行柱纯化以前可以先进行硫酸铵沉淀，沉淀在低速离心收集后复溶的盐浓度较高，可以直接进行HIC纯化，目标峰经适当稀释后（cond<5mS/cm）进行IEX纯化，然后通过SEC脱盐，更换缓冲液，除菌过滤后，在质量合格的情况下便可以进入制剂阶段。
当然在复性浓度较高的情况下，也可以直接将复性液进行IEX纯化，优点是在纯化的同时进行体积的浓缩，为以后的精制创造条件。
从生产的角度看，由于每增加一步纯化工序便降低很多收率，所以可过两到三次柱纯化，工艺越简单越有利于收率的提高。当然这只是一个一般的原则，对于纯度要求较高的产品如重组人白蛋白，不得不进行多次纯化。

摘要基因重组蛋白在大肠杆菌中表达时，由于表达量高，往往形成无生物活性的包涵体。包涵体必须经过变性和复性的过程才能获得有活性的重组蛋白。如何提高基因重组蛋白质的复性率，是生物工程技术的一个研究热点。对近年来的重组蛋白质的复性方法做一评述，为研究蛋白质折叠以及复性技术的进一步应用提供依据。
关键词重组蛋白包涵体复性二硫键

到目前为止，人们表达的重组蛋白质已有4000多种，其中用E.coli表达的蛋白质要占90%以上，尽管基因重组技术为大规模生产目标蛋白质提供了崭新的途径，然而人们在分离纯化时却遇到了意想不到的困难，即这些蛋白质在E.coli中绝大多数是以包涵体形式存在，重组蛋白不仅不能分泌到细胞外，反而在细胞内聚集成没有生物活性的直径约0.1~3.0μm的固体颗粒[1]。自从应用大肠杆菌体系表达基因工程产品以来，人们就一直期望得到高活性、高产量的重组蛋白。不可溶、无生物活性的包涵体必须经过变性、复性才能获得天然结构以及生物活性，因此应该选择一个合适的复性过程来实现蛋白质的正确折叠，获得生物活性，近年来的研究可以使复杂的疏水蛋白、多结构域蛋白、寡聚蛋白、含二硫键蛋白在体外成功复性。

包涵体形成的原因

重组蛋白在宿主系统中高水平表达时，无论是原核表达体系或真核表达体系甚至高等真核表达体系，都会形成包涵体[2]。主要因为在重组蛋白的表达过程中，缺乏某些蛋白质折叠过程中需要的酶和辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的[3]。

1、表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。

2、重组蛋白的氨基酸组成，一般说来含硫氨基酸越多越容易形成包涵体。

3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。

4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺少真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。

5、有报道认为，丰富的培养基有利于活性蛋白质的表达，当培养条件不佳时，容易形成包涵体。

减少包涵体形成的策略

1、降低重组菌的生长温度，降低培养温度是减少包涵体形成的最常用的方法，较低的生长温度降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用，从而可减少包涵体的形成[4]。

2、添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂，培养E.coli时添加高浓度的多醇类、蔗糖或非代谢糖可以阻止分泌到周质的蛋白质聚集反应，在最适浓度范围内添加这些添加剂不会影响细胞的生长、蛋白质的合成或运输，其它促重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂还有乙醇（诱导热休克蛋白的表达）、低分子量的巯基或二硫化合物（影响细胞周质的还原态，从而影响二硫键的形成）和NaCl[5]。

3、供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧、pH等。

作者: ukonptp 时间: 2013-4-10 12:30

包涵体的分离及溶解

对于生物制药工业来说，包涵体的形成也是有利的，不仅可获得高表达、高纯度的重组蛋白质，还可避免细胞水解酶对重组蛋白质的破坏。由于包涵体是蛋白质聚集而成的致密颗粒，分离的第一步是对培养收集的细胞进行破碎，比较有效的方法是高压匀浆结合溶菌酶处理，然后5000~20000g离心，可使大部分包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离，接着，包涵体沉淀需用去污剂（Triton X-100或脱氧胆酸钠）和低浓度变性剂（2mol/L尿素或盐酸胍等）洗涤除去脂类和膜蛋白，这一步很重要，否则会导致包涵体溶解和复性的过程中重组蛋白质的降解[6、7、8]。

包涵体的溶解必须用很强的变性剂，如8mol/L尿素、6~8mol/L盐酸胍，通过离子间的相互作用破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。其中尿素的增溶效果稍差，异氰盐酸胍最强；去污剂，如SDS[7]，可以破坏蛋白内的疏水键，可以增溶几乎所有的蛋白，但由于无法彻底去除而不允许用在制药行业中；酸，如70%甲酸[9]，可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白，这种方法只适合少数蛋白质。对于含有半胱氨酸的蛋白，在增溶时应加入还原剂（如DTT、GSH、β-ME）打开蛋白质中所有二硫键，对于目标蛋白没有二硫键的有时也应使用还原剂，为含二硫键的杂蛋白会影响包涵体的溶解，同时还应加入金属螯合剂，如EDTA或EGTA，用来螯合Cu2+、Fe3+等金属离子与还原状态的巯基发生氧化反应[10]。

蛋白质的折叠机理

包涵体蛋白在变性剂作用下，为可溶性伸展态，在变性剂去除或浓度降低时，就会自发的从变性的热不稳状态向热力学稳定状态转变，形成具有生物活性的天然结构[11]。然而在去除变性剂的同时，重组蛋白质在体外折叠，分子间存在大量错误折叠和聚合，复性效率往往很低，包涵体蛋白折叠复性的效率实际上取决于正确折叠过程与聚集过程之间的竞争[1]。对于蛋白质的折叠机制，目前有多种不同的假设，但很多学者认为有一个“熔球态”的中间状态，在“熔球态”中，蛋白质的二级结构已经基本形成，其空间结构也初具规模，再做一些局部调整就可形成正确的立体结构，总之，蛋白质的具体步骤可用下式描述[12、13、14]：

伸展态→中间体→后期中间体→天然态

↓

聚集体

在折叠反应中，从伸展态到中间体的速度是非常快的，只需要几毫秒，但从中间体转变为天然态的过程比较缓慢，是一个限速过程。聚集过程与复性过程相互竞争，故而应尽量避免聚集体的产生。一般认为，蛋白质在复性过程中涉及两种疏水作用，一是分子内的疏水相互作用，可促进蛋白质正确折叠；一是部分折叠的肽链分子间的疏水相互作用，在复性过程中，部分折叠的中间体的疏水簇外露，分子间的疏水相互作用会导致蛋白质聚集。蛋白质的立体结构虽然由其氨基酸的顺序决定，然而伸展肽链折叠为天然活性结构的过程还受到周围环境的影响，如温度、pH值、离子强度、复性时间等因素的影响。

提高重组蛋白质折叠复性的方法

一个有效的、理想的折叠复性方法应具备以下几个特点：活性蛋白质的回收率高；正确复性的产物易于与错误折叠蛋白质分离；折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品；折叠复性方法易于放大；复性过程耗时较少[15]。

1、透析、稀释和超滤复性法：这三种方法是最传统也是应用最普遍的蛋白质折叠复性方法，复性活性回收率低，而且难于与杂蛋白分离。透析法耗时长，易形成无活性蛋白质聚集体；超滤法在膜上聚集变性，易造成膜污染；稀释法处理量太大，不利于工业放大[16]。

2、高蛋白浓度下的复性方法：一个成功的复性过程在于能够在高蛋白浓度下仍能得到较高的复性率。一个方法是把变性蛋白缓慢连续或不连续地加入到复性液中[17]。在两次蛋白加入之间，应有足够的时间间隔使蛋白质折叠通过了易聚集的中间体阶段。这是由于完全折叠的蛋白通常不会与正在折叠的蛋白一起聚集。第二种方法是用温度跳跃策略[4]。变性蛋白在低温下复性折叠以减少聚集，直到易聚集的中间体大都转化为不易聚集的后期中间体后，温度快速升高来促进后期中间体快速折叠为蛋白的天然构象。第三种方法是复性在中等的变性剂浓度下进行[18]，变性剂浓度应高到足以有效防止聚集，同时又必须低到能够引发正确复性。

3、添加促进剂的复性方法：包涵体蛋白质折叠复性促进剂的促进作用可以分为：稳定正确折叠蛋白质的天然结构、改变错误折叠蛋白质的稳定性、增加折叠复性中间体的溶解性、增加非折叠蛋白质的溶解性。通常使用的添加剂有：a、共溶剂：如PEG6000~20000，通过与中间体特异的形成非聚集的复合物，可以阻止蛋白质分子间的相互碰撞机会，减少蛋白质的聚集；b、去污剂及表面活性剂：如Trition X-100、CHAPs、磷脂、磺基甜菜碱等对蛋白质复性有促进作用，但它们能与蛋白质结合，很难去除；c、氧化-还原剂：对于含有二硫键的蛋白，复性过程中应加入氧化还原体系，如GSH/GSSG、DTT/GSSG、DTE/GSSG等，氧化还原系统通过促进不正确形成的二硫键快速交换反应，提高了正确配对的二硫键的产率[19]；d、小分子的添加剂：如盐酸胍或尿素、烷基脲、碳酸酰胺类等，都可阻止蛋白聚集，它们的作用可能为：稳定蛋白的活性状态、降低非正确折叠的稳定性、增加折叠中间体的稳定性、增加解折叠状态的稳定性。e、0.4~0.6M L-Arg：L-Arg能使得不正确折叠的蛋白质结构以及不正确连接的二硫键变得不稳定，使折叠向正确方向进行，可大幅度地提高包涵体蛋白质的折叠效率。f、添加分子伴侣和折叠酶：分子伴侣是指能够结合和稳定另外一种蛋白质的不稳定构象，并能通过有控制的结合和释放，促进新生多肽链的折叠、多聚体的装配或降解及细胞器蛋白的跨膜运输的一类蛋白质[20]。折叠酶有二硫键异构酶、脯氨酸异构酶等。分子伴侣和折叠酶都能在体外调节蛋白质的正确折叠，提高蛋白质的合成效率。但这类蛋白在折叠复性后要除去，而且十分昂贵，因此采用可回收利用的方法如固定化法为好。g、人工伴侣[21]：为模仿分子伴侣而发展的一种方法：首先，变性蛋白被复性液中的去污剂捕获，形成蛋白-去污剂复合体，复合体的形成抑制了蛋白的聚集，然后加入环糊精从复合体中去除去污剂，使得蛋白质正确折叠。h、单克隆抗体[22]：待折叠复性的蛋白质的抗体可有效协助复性，但只限于此蛋白才能获得明显的助折叠作用。I其它：多聚离子化合物如肝素可以促进蛋白质的复性，具有稳定天然蛋白质的作用；甘油可以增加黏度，减少分子碰撞的机会，减少错配以提高复性效率；适量的盐浓度可以降低某些带电基团间的斥力，有利于蛋白质的折叠；辅助因子、短链醇、高渗物等能有效的降低聚集体的形成，对蛋白有稳定的作用。jklmn

作者: ukonptp 时间: 2013-4-10 12:31

4、液相色谱（LC）复性法：液相色谱是一种最有效的纯化蛋白质的方法，已成为基因重组蛋白质纯化的必不可少的手段，现有报道，疏水相互作用色谱（HIC）[23]、离子交换色谱（IEC）[24]、凝胶排阻色谱（SEC）[25]、亲和色谱（AFC）[26]已成功的对变性蛋白进行了复性。与传统的稀释法和透析法相比，液相色谱复性的优点是：在进样后可很快的除去变性剂；由于色谱固定相对变性蛋白质的吸附可明显的减少、甚至完全消除变性蛋白质分子在脱离变性剂环境后的分子聚集，从而避免了沉淀的产生，提高蛋白质复性的质量和活性回收率；在蛋白质复性的同时，可使目标蛋白质与杂蛋白分离达到纯化的目的，使复性和纯化同时进行；便于回收变性剂，降低废水处理成本。4种色谱法，SEC的分离效果是LC中最差的，盐酸胍会在IEC柱上保留，与蛋白一起洗脱下来，AFC使用范围窄、所需时间长、价格昂贵，HIC是其中较为理想的。变性蛋白在HIC上的复性机理为：当蛋白质、变性剂和杂蛋白进入HIC系统后，由于变性剂在柱子上的作用力较弱，变性蛋白质的作用力较强，变性剂首先同变性的蛋白质分离，随流动相一起流出色谱柱，又因HIC固定相能提供较常法高出十至数百倍的能量*，在变性蛋白质被HIC固定相吸附的同时瞬时除去以水合状态附着在蛋白质表面和与固定相表面接触区域的小分子*，而蛋白质的特定的疏水性氨基酸残基与HIC固定相表面作用以形成区域立体结构，接着形成折叠中间体，随着流动相的不断变化，变性蛋白质不断地在固定相表面上进行吸附-解吸附-再吸附，并在此过程中逐渐被复性，形成与天然蛋白质构象相同的蛋白质，并流出色谱柱。HIC固定相是从高盐溶液中吸附变性蛋白质，且与变性剂瞬时分离，不仅大大降低了蛋白质间的聚集作用，还因固定相在分子水平上为变性蛋白提供里很高的能量，使水化的变性蛋白质瞬时失水，并形成局部结构以利于蛋白质从疏水核开始折叠。HIC在蛋白质复性的同时还能与其它杂蛋白进行很好的分离，且HIC柱便宜、快速，故有很好的发展潜力。

5、反胶束复性法[27]：由于蛋白质在反胶束内水相中可以保持其构象和活性，运用相转移技术可以将蛋白质分子包于反胶束内，由于这样可使蛋白质相互分离，减少了蛋白质折叠过程中的聚集作用，通过逐渐降低变性剂的浓度和加入氧化-还原剂，可使变性蛋白质复性，但表面活性剂对蛋白质具有变性作用。

6、双水相复性法[15]：Forciniti用硫氰化钠、氯化钠、溴化锂与聚乙二醇构成的双水相系统使得包涵体的溶解与蛋白质的折叠复性在一步双水相技术操作中完成。由于PEG具有稳定蛋白质构象的作用、高浓度盐则具有去稳定的作用，这样正确折叠的蛋白质会不断进入到另一相中，直到蛋白质的折叠与去折叠达到一个平衡。

蛋白质知道如何折叠，但我们对蛋白质折叠和聚集的机制尚不十分清楚，每种蛋白质都有自己特有的折叠方式和途径，因此对某种蛋白质的复性必须反复试验，利用折叠和聚集的知识建立相对优化、适合生产规模的方法。

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作者: flyxx05 时间: 2013-4-10 12:32

在PET-HIS载体中表达的肽6KD在28度加IPTG0.3mM诱导
结果基本上都在超声沉淀中，由于我的肽中含有3对二硫键
而且用8Murea溶解不了，只能用6M盐酸胍来溶解，用梯度复性结果在2M到1.5M盐酸胍过程中会产生大量沉淀，复性困难，特向各位大虾请教
问题：1.为何难以复性？
2.由于需要大量纯化的蛋白复性的和变性条件的都要，有何好的纯化方法？快速大量的？
3.可否让此肽在溶解状态中表达些，需要改变何条件？
谢谢！
用于制备抗体，我想大量纯化，在变性条件下也性，包涵体如何直接挂柱？？？

作者: wu11998866 时间: 2013-4-10 12:33

问1:复性中蛋白析出最大的可能是：蛋白浓度太高。可以适当稀释(一般为0.1-0.2mg/mL)，再进行复性。

问3：可以尝试更低的温度诱导，如16度。

作者: ukonptp 时间: 2013-4-10 12:33

可能杂蛋白会影响蛋白的复性，对于你的蛋白，可以先用Urea洗涤沉淀，尽量去除杂蛋白，然后用盐算呱溶解，然后可以上Ni柱精纯，纯化后再复性可能比较好。
另外由于你的蛋白分子量比较小，可以用SOURCE RPC纯化，纯化后再复性。
另外，你的二硫键都正确么？如果二硫键不全正确，可以用C18进行分析，正确的二硫键和不正确的二硫键出峰时间是不一样的，可以用于检测复性成功与否。你的二硫键如果可能不正确的话，还是要加入氧化还原对可能会复性的好些。
另外，稀释复性也是比较好的方法。

作者: flyxx05 时间: 2013-4-10 12:34

QUOTE:

原帖由 ukonptp 于 2013-4-10 12:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

可能杂蛋白会影响蛋白的复性，对于你的蛋白，可以先用Urea洗涤沉淀，尽量去除杂蛋白，然后用盐算呱溶解，然后可以上Ni柱精纯，纯化后再复性可能比较好。
另外由于你的蛋白分子量比较小，可以用SOURCE RPC纯化，纯化后再复性。
另外， ...

谢谢。但是变性条件下得NI 条件和buffer如何配置？

作者: ukonptp 时间: 2013-4-10 12:34 标题: 回复 #44 flyxx05 的帖子

条件除了在binding buffer 和elution buffer中都加入8M 盐酸呱外，其他的操作没有区别。
不过用盐酸呱跑电泳比较麻烦，还要处理样品去掉盐酸呱。

作者: #问号# 时间: 2013-4-10 12:35

变性条件下纯化：一般是在binding buffer和elution buffer中加入8mol/L 脲，binding buffer中可以加入5mM 2-巯基乙醇，这样可以减少沉淀，但你的蛋白在8 mol/L尿中不容，因此可以改成6 mol/L盐酸胍
Ni注复性：binding buffer：6mol/L GuHCl + 0.3mol/L NaCl + 20mM PBS + 5mM２-ME (pH7~9), refolding buffer: 1mol/L GuHCl + 0.3mol/L NaCl + 20mM PBS (pH7~9), elution buffer:1mol/L 咪唑 + 1mol/L GuHCl + 0.3mol/L NaCl + 20mM PBS (pH7~9), binding buffer和refolding buffer中可以加入低浓度的咪唑，视你的蛋白保留强弱而定。走梯度，bind to refolding, refolding to elution，

作者: flyxx05 时间: 2013-4-10 12:35

我是用6M盐酸胍溶解的？是不是以后的缓冲buffer及洗脱buffer都用盐酸胍，用urea代替可以吗？我们洗脱下来的蛋白如何除去盐酸胍，用梯度透析吗？
如果需要大量这么操作，你们能不能将具体操作步骤告诉我一下？?
谢谢!

作者: hyuu 时间: 2013-4-10 12:35

脲可以代替，如何除去变性剂，用梯度透析或者SEC都可除去盐酸胍或脲。另外，如果你要求得到的蛋白溶液中不含变性剂的话，你可以直接采用Ni柱复性的方法，只是refolding buffer和binding buffer中不要加GuHCl

作者: tudou85 时间: 2013-4-10 12:36

我是用6M盐酸胍溶解的？是不是以后的缓冲buffer及洗脱buffer都用盐酸胍，用urea代替可以吗？我们洗脱下来的蛋白如何除去盐酸胍，用梯度透析吗？
如果需要大量这么操作，你们能不能将具体操作步骤告诉我一下？?
谢谢!

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可以按你说的只用盐酸胍溶解样品,别的跑柱子的缓冲液用尿素,这样就没有盐酸胍问题,同时有利于提高柱子的载量,PM邮件给我,我可以发给你操作的方法.

作者: flyxx05 时间: 2013-4-10 12:36

脲可以代替，如何除去变性剂，用梯度透析或者SEC都可除去盐酸胍或脲。另外，如果你要求得到的蛋白溶液中不含变性剂的话，你可以直接采用Ni柱复性的方法，只是refolding buffer和binding buffer中不要加GuHCl
请问这个是如何具体操作的？
还有各位有没有用过电洗脱，想知道具体如何操作的，谢谢

作者: 羊咩咩 时间: 2013-4-10 12:37

冒昧问一句，这么短的肽又含有这么多的半胱氨酸，你做的是金属硫蛋白吗？

作者: flyxx05 时间: 2013-4-10 12:37

我做的不是金属硫蛋白，是一种活性肽，呵呵
还有想问问小白龙什么是SOURCE RPC纯化？怎么操作？谢谢

作者: ukonptp 时间: 2013-4-10 12:38

因为你的肽分子量较小，所以比较合适用反相层析分离。相关的应用随着新型聚合物反相层析填料的出现也得到了进一步的扩展。
反相层析的优点在于柱效高，分辨率好，对于差别仅有一个氨基酸的蛋白也能有很好的分离效果。但是，传统的反相层析使用硅胶键合C8~C18等，硅胶可以耐受很高的压力，这种硅胶填料在pH8以上的环境会发生水解，因此不仅限制了工艺的参数，也无法进行常规的碱法CIP，寿命比较短。
而新型聚合物的反相层析为中低压反相层析，以均一的粒径分布在中低压下可以达到很高的柱效和分辨力，而且可以耐受1M NaOH的CIP清洗，这大大增加了反相层析在蛋白质纯化领域的应用。对于制备级的填料可以自行装柱。寿命大大好于传统的硅胶反相层析。纯化条件也有原先的常规的酸性条件扩展到中性甚至碱性，灵活的条件大大改善了某些蛋白的洗脱和分离。

对于包含体复性，杂蛋白的存在会影响目标蛋白的有效复性。因此在复性之前应该尽量得到纯的蛋白。这一点可以通过低浓度的Urea的清洗来去除一部分杂蛋白。然后，可以将用变性剂溶解的蛋白上Source RPC分离，一般流动相采用A: 0.1% TFA in water, B: 0.085% TFA in ACN, gradient: 5~95% B 20CV。可以显著去除杂蛋白。柱压一般在2Mpa左右。
然后去掉TFA/ACN 后，可以进行复性。
复性的分析也可以采用HP-RPC分析柱，可以根据构象不同，将复性和未复性的蛋白分开。

作者: cocacola 时间: 2013-4-10 12:39

我看过一些文献，上面都说包涵体颗粒由重组蛋白，杂蛋白，膜蛋白，质粒dna构成，结构致密。溶解变性包涵体要用高浓度变性剂；而纯化洗涤包涵体要用低浓度变性剂，那么洗涤纯化的原理是什么呢？如果低浓度变性剂不足以溶解包涵体，那么其中的杂志自然不会跑到溶液里面来而要依然留在致密颗粒中，从而就不能达到纯化的目的了，是吗？

作者: wmp1234 时间: 2013-4-10 12:39

一般对包涵体的处理，是先经过洗涤，再变性溶解，然后进行分离纯化，洗涤过程中通常采用低浓度的变性剂，而变性和纯化一般是在高浓度的变性剂浓度下进行，就杂蛋白和包涵体而言，包涵体的结构要比杂蛋白要更致密，所以我们通常用低浓度的变性剂除去杂蛋白，而不会影响到包涵体

作者: cocacola 时间: 2013-4-10 12:40

那么就是说包涵体颗粒是纯粹的重组蛋白，而杂志都是附着在颗粒外面的吗？

作者: bs4665 时间: 2013-4-10 12:40

低浓度的变性剂除去杂蛋白时，要控制好时间，要不将有可能影响到包涵体。

作者: yonger 时间: 2013-4-10 12:40

对于包含体的的洗涤以及纯化，我的见解是，可以先进行复性后纯化，也可以先纯化再复性。其中洗涤包含体要根据自己包含体的特征进行，而不需要遵守死理论。如果你的蛋白质比较容易溶解（比如与GST、Trx等分子伴侣进行融合表达），这时候可以用低浓度的变形剂进行洗涤使得目的蛋白处于上清中，而大部分杂蛋白处于沉淀被除去，如果你的包含体很顽固（许多包含体在8M Urea和6M GuaHCl中也不溶解），那么你可以用高浓度的变形剂进行洗涤，只要足够的目的蛋白处于沉淀中。也就是说，洗涤中要最大限度的去除杂蛋白并保证目的蛋白一定的回收率。

作者: tieshazhang 时间: 2013-4-10 12:41

洗涤：为了除去包涵体上粘附的杂质，如膜蛋白或核酸，应用洗涤液洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂,过高浓度的尿素或盐酸胍会使包涵体溶解，如2M尿素在50mM Tris pH7.0-8.5左右,1mM EDTA中洗涤。此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。
溶解：一般用强的变性剂如尿素（6-8M）、盐酸胍（GdnHCl 6M），通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展或用去垢剂，如SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等，可以破坏蛋白内的疏水键，也可溶解一些包涵体蛋白质。
复性：由于包涵体中的重组蛋白缺乏生物学活性，加上剧烈的处理条件，使蛋白的高级结构破坏，因此重组蛋白的复性特别必要。通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M 左右时结束。对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M 时复性过程已经结束。

作者: 剪刀手520 时间: 2013-4-10 12:41

这是比较个体化的解决方案，对不同蛋白得采取不同的方法。一般是经过洗涤、变性、复性、Q-Sepharose纯化等步骤。变性之后面临的一个问题就是疏水基团的大量暴露使得蛋白聚集，复性时二硫键的正确折叠也决定着蛋白复性与否。可用GroE分子伴侣体系结合变性肽链的疏水位点防止其聚集；然后加入蛋白质二硫键异构酶DsbA有助于形成正确的二硫桥；加入肽基-脯氨酰基顺反式异构酶CypA能催化肽基-脯氨酸的顺反异构化反应。这三种蛋白协同作用，可大大提高重组蛋白的复性活性和收率。将这三种蛋白质固定化在琼脂糖凝胶珠上制成氧化复性层析柱，不但可以提高复性效率，而且复性柱可以反复使用，降低操作成本，利于辅助蛋白与重组蛋白的分离。顺便说一下，精氨酸也是很重要的，一般在复性液中是5mmol/L。

作者: ha111 时间: 2013-4-10 12:42

GST融合蛋白包涵体变性后复性，获得有活性蛋白的几率有多大？我好像看到有人说这种融合蛋白变性复性的过程中融合头的天然构像很容易发生改变，那么复性后究竟还可不可以亲和纯化到蛋白？如有相关文献请上传一份，不胜感激！

作者: XYZQ 时间: 2013-4-10 12:42

GST是原核蛋白,在细菌中表达大多数产生有活性蛋白的,而后面接的融合蛋白可能是无活性的,这样就可能要变、复性，这过程对于GST来说可就是多余的了，它也向变性再复性，这过程必然有损失，但是我想这种损失不会大于其他的多结构域的蛋白吧！

作者: lagua123 时间: 2013-4-10 12:43

如果要变复性还是用histag吧。比较方便。感觉gst变复性不是‘很好。

作者: wmp1234 时间: 2013-4-10 12:44

下列方法已在本实验室验证，复性任何包涵体，必定能得到目的蛋白：

菌体为超声法裂解，裂解溶液中含
50mM Tris-HCl, pH 8.0，
100mM NaCl，
5mM EDTA，
0.1% NaN3，
0.5% Triton-X100，
在使用前加入 0.1mM PMSF

每250毫升裂解液中加入约50克菌体，工作15s，间隔15秒，超声破碎45分钟，超声后加入10mM MgSO4 和0.1mg/ml 的溶菌酶和Dnase 0.01mg/ml，室温放置20分钟，6000RPM离心15分钟，保留沉淀。

再次加入裂解液，超声破细胞后，加溶菌酶和Dnase, 上述过程重复三次。

用下述的溶液将包涵体悬浮，离心收集包涵体。
50mM Tris-HCl, pH 8.0
100mM NaCl
5mM EDTA
0.1% NaN3

用下述溶液悬浮包涵体，离心收集包涵体。
50mM Tris-HCl, pH 8.0
100mM NaCl
5mM EDTA
0.1% NaN3
1M 尿素
如暂时不用，放入－20℃保存。

包涵体的溶解
将包涵体悬浮在下述溶液中，4℃振荡过夜。
100mM Tris
50mM Glycine
8.5M 尿素
溶液用HCl调节到pH 8.0后加入
25mM DTT

6000RPM离心，取上清，去除不溶解物。

包涵体蛋白的复性

将溶解的包涵体装入透析袋，在4℃下将透析袋浸入下列溶液依次透析：
0.1M Tris
0.4M L-Arginine
1 mM EDTA
0.2mM PMSF
4M 尿素溶液pH调节到8.0
透析24小时

0.1M Tris
0.4M L-Arginine
1 mM EDTA
0.2mM PMSF
2M 尿素溶液pH调节到8.0
透析24小时

0.1M Tris
0.4M L-Arginine
1 mM EDTA
0.2mM PMSF
1M 尿素溶液pH调节到8.0
透析24小时

作者: wmp1234 时间: 2013-4-10 12:44

0.1M Tris
0.4M L-Arginine
1 mM EDTA
0.2mM PMSF
0 M 尿素溶液pH调节到8.0
透析24小时

0.025M Tris
0.1M L-Arginine
0.25 mM EDTA
0.2mM PMSF
0 M 尿素溶液pH调节到8.0
透析24小时

10mM Tris-HCl pH8.0
150mM NaCl,
1mM EDTA
0.02% NaN3.
透析24小时

透析时注意透析袋的截留分子量

下面的工作就简单了，因为复性的蛋白已经在生理缓冲液中，进行阴阳离子交换层析爱怎么整就怎么整它了。

作者: zzzz 时间: 2013-4-10 12:45

老兄：透析的时间也太长点了吧？因为时间越长蛋白降解的可能性就越大，根据我们实验室的经验透析12小时/次就足够了！

作者: 婴儿脸 时间: 2013-4-10 12:45

透析不是什么好方法，慢，复性效果差

作者: qiangren789 时间: 2013-4-10 12:46

太可怕了，光透析就要6整天！！

作者: 知了知了 时间: 2013-4-10 12:46

有蛋白酶抑制剂，不会发生蛋白降解。

关于透析时间：

透析确实要花很长时间，但是在透析第一次换溶液的同时，第二天第二个袋子就开始4M尿素的透析了，一周后每天都有东西出来。

之所以要进行梯度透析，是因为比直接对无尿素溶液透析复性效率高得多。多花点时间还是值得的。

作者: jingling845 时间: 2013-4-10 12:47

很不幸，蛋白表达过程中形成了大量的包涵体，对于下一步的纯化设下了严重障碍，望大家予以帮助，助我爬过这个坎。将不胜感激！

作者: ukonptp 时间: 2013-4-10 12:49

你可以加少量的B-巯基乙醇，分解包涵体，释放出你的目的蛋白，然后再提纯，我上次坐试验也碰到同样情况，但是如果你表达的蛋白不是很多，也很难提纯。你表达的时间长吗？如果是时间长引起的，建议减少表达时间，但是如果表达量不足，你就不得不延长表达时间。

作者: yjf1026 时间: 2013-4-10 12:50

有时候,蛋白表达过程中形成包涵体你应高兴才是:
1,说明目的蛋白表达量比较高;
2,表达产物不会被细菌蛋白酶降解,这一点对原核表达短肽尤为重要;
3,表达产物有利于纯化,且纯度较高;
一点体会

作者: remenb 时间: 2013-4-10 12:50

分子克隆第三版说可以将包涵体用Triton X－100溶解，
后续的纯化步骤与上清基本上没什么区别。
我觉得很疑惑，溶解后的蛋白在变性条件下能与柱子上的GS结合吗？
个人觉得GST与GS的结合是一种酶反应，
应该要求GST有活性才行啊，变性条件下可以吗？
谢谢指教！

作者: bring 时间: 2013-4-10 12:51

包涵体应该不可以过柱子纯化的，但是在实际的实验过程中我们发现有的是可以的，原因可能是：
部分蛋白是可溶的；
用Triton 100后，可以将聚集在一起和目的蛋白共纯化的其他蛋白质分散开，这样，部分可溶的蛋白就可以和珠子结合了。
强烈推荐阅读分子克隆第三版相关章节的参考文献。

作者: 66小飞侠 时间: 2013-4-10 12:52

不知你有没有<GST handbook>（园子里有）包涵体是不能与结合到GSTrapp柱子的，<GST handbook>上加入Triton X－100是助溶（非变性条件下的可溶部分可能已经正确折叠，有活性），此外还可加DTT，增加与GS的结合。我们曾按<GST handbook>的troubleshooting的建议（类似你所述的方法）处理过表达的包涵体蛋白，没有成功。

如果你表达的GST融合蛋白是包涵体，可以按分子克隆的方法洗涤包涵体，得到纯的包涵体后再复性纯化。
在目前情况下，可优化表达条件（如温度），以期获得可溶性表达。

作者: yychen 时间: 2013-4-10 12:53

请问GST handbook是什么东西,是买GSTrapp柱子商家的使用手册吗

作者: ukonptp 时间: 2013-4-10 12:53

GST handbook,是关于GST融合蛋白表达的操作手册,在本站的ftp上有下载,

但是你的分数是0分可能下载不了,至少要1分才得,再想想其他办法吧,

或者你可以通过google 搜索得到我以前也是这样下的

作者: ukonptp 时间: 2013-4-10 15:51

QUOTE:

原帖由 kent 于 2013-4-10 15:50 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请教：菌体超声破壁时，所用的频率及时间是怎样的？另外应该菌体完全破壁时，菌液应该是怎样的？（也就是说超声的程度）

超声时所用的频率以及时间是跟你的表达菌的种类以及你目的蛋白的性质密切相关的。比如说你的表达菌的承受能力比较强的话，你就可以适当加大超声频率以及超声时间，另外，比如说你的目的蛋白是以包涵体形式存在的话那么你就要注意你的超声力度了，因为很有可能对目的蛋白有很大的影响。一般实验室的超声仪探头的最大承受频率大概也就是400W，所以可以选用300w，超声10s，停止10s，或是选用400w，超声5s，停止5s。超声如果效果较好的话，整个样品应该是比较清亮的，但是并不是十分清亮，当然这跟你在湿菌体中加入pbs的量是有关系的，加多了，就清亮些，加少了，就浑浊些。还有就是超声效果如果好的话，样品不会出现像原来的那种教粘稠的情况，因为长链核酸全部被打断了。
当然为了减小超声的负担，可以在超声前加入溶菌酶，反复冻融等步骤。这也要根据宿主菌而确定。

作者: ukonptp 时间: 2013-4-10 15:56

QUOTE:

原帖由 kent 于 2013-4-10 15:55 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请教：蛋白质复性的具体步骤，我的目的蛋白溶解在 20mM tris-hcl ,ph 7.2 0.5M Nacl, 复性缓冲液需要Tris缓冲液还是Pbs缓冲液？我用的是 Pbs缓冲液，老是出现沉淀
谢谢 ...

复性问题是表达蛋白过程中的一个很棘手的问题，因为氨基酸组成的不同，造成蛋白不同的性质，同时也使复性变得困难。
包涵体蛋白复性方法大概有如下几种：
稀释复性、透析复性、超滤复性、柱上复性、高蛋白质浓度下的复性，此外，吸附法、反胶束法和双水相萃取法等都可用蛋白质的复性。
鉴于战友的情况，我个人认为应该使用Tris缓冲液较好，因为目前普遍认为大多数蛋白复兴使用Tris缓冲液效果较好（这可是有文献可查的哦）。至于出现沉淀这一点是不用说的，再成功的复性也会出现沉淀，而且我觉得复性也可以看作是一个纯化的过程，我们期望看到沉淀，因为沉淀的不仅仅是我们的目的蛋白，还有一些杂蛋白，即使按比例沉淀，我们的目的蛋白还是越来越纯了，不是吗？而且这一点我认为战友没有必要担心，如果目的蛋白浓度过小的话，你可以在复性结束后浓缩一下以提高浓度。当然如果目的蛋白全部沉淀的话，就说明这种缓冲液不适合你的目的蛋白，就要改变复性方案了。
影响复性效率的因素就有很多了，比如蛋白质的复性浓度、pH和温度等等等等。

作者: ukonptp 时间: 2013-4-10 15:57

QUOTE:

原帖由 kent 于 2013-4-10 15:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢你们
请问Tris缓冲液如何配制?急需

Tris缓冲液：
50mM Tris
0.5mM EDTA
50mM Nacl
5%或10％甘油
如果有条件加入1％的甘氨酸或精氨酸和谷胱甘肽会更好些。也可以在其中
加入氧化还原系统，如双型谷胱甘肽、DTT等。
PH理论上是要根据你蛋白的等电点来确定的，应该是比等电点稍高一些。但是PH7.9、8.0我都试过，效果没区别。

作者: applebook=213 时间: 2013-4-10 15:57

我曾经使用过PH 9.5成功复性目的蛋白

作者: ukonptp 时间: 2013-4-10 15:58

QUOTE:

原帖由 applebook=213 于 2013-4-10 15:57 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我曾经使用过PH 9.5成功复性目的蛋白

如上所述,缓冲液的PH是根据你的目的蛋白的等电点而确定的,呵呵.

作者: finger 时间: 2013-4-10 15:58

复性是一个十分复杂的过程，解决得方法也是多种多样。首先是选择合适的表达载体和表达菌株，尽量少产生包含体。可以先进行预实验确定表达条件，我建议采用正交分析法来进行。一般的我采用4因素3水平的正交实验，因素主要考虑培养温度、诱导物加入量、加入诱导物时的菌浓度和诱导时间。每个因素考虑小、中、大三个水平。我曾经使用这种方法，很好的选择了一个蛋白的表达条件，使其大部分以可溶形式表达。
再谈包含体的复性，在采用通常的方法不行的条件下，可以考虑加入一些化学试剂，一般报道的有PEG、丁酸和多糖。

作者: ukonptp 时间: 2013-4-10 16:00

QUOTE:

原帖由 finger 于 2013-4-10 15:58 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

复性是一个十分复杂的过程，解决得方法也是多种多样。首先是选择合适的表达载体和表达菌株，尽量少产生包含体。可以先进行预实验确定表达条件，我建议采用正交分析法来进行。一般的我采用4因素3水平的正交实验，因素主要考 ...

这位战友说的是正确的.
但是如果表达载体和表达菌一旦确定以后,想在根据温度、IPTG等来控制包涵体的形成我想并不是很现实，因为每次你加入的母液的浓度总是不一样的，即使是做成了，这种实验的可重复性也是比较差的。因为不稳定性因素太多了，呵呵。

作者: memory 时间: 2013-4-10 16:01

用Trition -100可以洗涤任何包涵体吗？会不会有什么影响？

谢谢！

作者: ukonptp 时间: 2013-4-10 16:01

QUOTE:

原帖由 memory 于 2013-4-10 16:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

用Trition -100可以洗涤任何包涵体吗？会不会有什么影响？

谢谢！

曲拉通是一种表面活化剂，润湿及洗涤剂。
在洗涤包涵体的时候是把它当作洗涤剂来用的，也就是主要是把它当作一种去垢剂，用它来洗涤一些杂质或是分子量很大的一些杂蛋白。不能说可以洗涤任何包涵体，因为“任何”包括的太多了。但是我想绝大多数的包涵体还是可以用曲拉通来洗涤的，我也曾经试过用PBS来当作曲拉通来洗涤，效果也还可以，所以说曲拉通的洗涤只是一个可有可无的过程，对于整个包涵体蛋白的纯化来说不是很主要的一个过程。

作者: ukonptp 时间: 2013-4-10 16:13

看了些资料，发到自己的帖子上面，呵呵。

菌体/细胞裂解法：

一、反复冻融法：
1、将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
2、至少3次以上冻溶。
3、IFCC推荐法：
收集细胞悬液，4℃低温离心（3000rpm，5min），弃上清，加入一定量PBS（200ul），轻轻吹打混匀，-200C 冷冻30 min，370C 解冻，如此反复3次，可形成细胞裂解液。
步骤如下：
1）收集细胞悬液
2）40C 低温离心（3000rpm，5min）
3）弃上清，加入一定量PBS（200ul），轻轻吹打混匀，-200C 冷冻30 min，
370C 解冻，如此反复3次，可形成细胞裂解液。
4、用液氮冻融三四次就可以了，细胞冻住后，取出放37度水浴，溶解后震荡，再冻

二、超声波处理法
1、要设定好超声时间和间隙时间，一般超声时间不超过5秒，间隙时间最好大于超声时间，这些都有利于保护酶的活性。我的实验超声时间5秒、间隙时间10秒、工作次数20次。
注意事项：
1）、一个细胞超声仪可以配备不同尺寸的探头，根据你实验中收集细胞的容器大小选择合适规格的探头。
2）、另外冰浴非常重要，空化效应会局部产热，从而使细胞内酶失活，所以我通常将收集细胞的离心管置于冰盒中。
3）、要设定好超声时间和间隙时间，一般超声时间不超过5秒，间隙时间最好大于超声时间，这些都有利于保护酶的活性。我的实验超声时间5秒、间隙时间10秒、工作次数20次，镜下观察细胞破碎效果很好，供参考。不同细胞实验条件得具体摸索。
4）、最后好好看仪器说明书，探头到液面下的距离及与容器底部的距离都有要求。
2、每个样本超声时间5秒,每个间隔5秒,粉碎5次。
3、100ml菌液离心，用8ml缓冲液悬浮，加8mg溶菌酶，冰浴30min，然后超声处理。750W 40％功率。5秒超声，9秒间隔。超声至少90min。超声完毕后，菌液应该是澄清的，略显油状。
4、综合冻融和超声的方法：
1500g离心，弃除上清。冰上，用小体积PBS重悬细胞。
将重悬液集中，1500g离心浓缩，弃除上清。液氮骤冷。用约5倍体积的PBS缓冲液重悬细胞，并搅拌。
可选择：4℃下超声破碎细胞。加入终浓度为0.25M的KCl，15mM的DTT。4℃下111500g×60min离心裂解液。取出上清。过柱子。

三、渗透法：
冰冷的20 mmol/L Tris-Cl（pH8.0），2.5 mmol/L EDTA处理，冰浴放置10min。
《精编分子生物学实验指南》

四、裂解液处理法：
1、细胞裂解液：50 mmol/L Tris-Cl pH 6.8，100 mmol/L DTT，2% SDS，0.1%溴酚蓝，10%甘油。SDS是阴离子型表面活性剂、极易促溶、强变性作用。
2、在loading buffer加SDS，100度5分钟，是变性方法。SDS与蛋白等量结合，可以通过条带位移判断蛋白大小，考染不会影响结果。
3、如果是做小量菌液，跑PAGE胶看其表达情况的话，可以直接加蛋白loading buffer煮沸5分钟即可，需注意的是上样前要离心12000rpm至少5分钟，然后上样时，枪头别吸最底下的。
4、20毫升细胞裂解液配方:40 μL 0.5M EDTA (PH8.0)，4 ml 10% SDS，1 ml 1M Tris-cl(PH6.8)，14.96 ml 蒸馏水。可以适当加入几种蛋白酶的抑制剂，如PMSF，leupeptin等。
5、检测蛋白诱导：
从培养的不同时期各取出1ml，12000g×1min离心。将沉淀重悬于100ul 1×SDS上样缓冲液（50mM Tris-Cl（pH6.8），100mM DTT，2％SDS，0.1％溴酚蓝，10％甘油）中，100℃加热3min，然后12000g×1min离心。上样15ul，6％SDS-PAGE电泳。
《分子克隆》P826
7、5-10秒离心，弃除上清，用50ul蒸馏水重悬沉淀。加入1ul PMSF，再加入50ul热的2×SDS上样缓冲液（100℃加热）。迅速混匀后100℃加热3-5min。将样品冰上放置（或-20℃放置），然后再溶解，煮沸1min。离心30秒。上样5ul进行SDS-PAGE电泳。
2×SDS上样缓冲液：250mM Tris-Cl，6.2％（w/v）DTT，8％SDS，0.002％（w/v）溴酚蓝，40％甘油。
Purification of GST-Fusion Proteins from E. coli。

作者: 831226 时间: 2013-4-10 16:16

我看到你的这个专区很高兴，我正在做这方面的实验，有很多问题想请教你，谢谢。
“Tris缓冲液：
50mM Tris
0.5mM EDTA
50mM Nacl
5%或10％甘油
如果有条件加入1％的甘氨酸或精氨酸和谷胱甘肽会更好些。也可以在其中
加入氧化还原系统，如双型谷胱甘肽、DTT等。
PH理论上是要根据你蛋白的等电点来确定的，应该是比等电点稍高一些。但是PH7.9、8.0我都试过，效果没区别。 ”
关于你提到的Tris缓冲液，请问我用的是20mM Tris，没有加Nacl，有影响吗？甘油有什么作用？
我的蛋白复性后上离子交换柱，无论是阴离子还是阳离子柱，都是大部分穿透，不知是不是复性效果不好造成的。
谢谢！！！急。。。

作者: ukonptp 时间: 2013-4-10 16:17

QUOTE:

原帖由 831226 于 2013-4-10 16:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我看到你的这个专区很高兴，我正在做这方面的实验，有很多问题想请教你，谢谢。
“Tris缓冲液：
50mM Tris
0.5mM EDTA
50mM Nacl
5%或10％甘油
如果有条件加入1％的甘氨酸或精氨酸和谷胱甘肽会更好些。也可以在其中
加入氧化还原 ...

请教不敢当，互相学习吧。

1、关于你提到的Tris缓冲液，请问我用的是20mM Tris，没有加Nacl，有影响吗？
我觉得影响不会很大。
因为包含体蛋白透析主要是根据透析样品中尿素的浓度差的原理来进行的。其实有文献报道透析的复性率只能达到40％（我对这个数字表示怀疑），所以我认为透析这个过程与其说是复性的过程倒不如说是个纯化的过程。

2、甘油有什么作用？
甘油在整个缓冲体系中起到的是稳定蛋白的作用。还有就是保存蛋白的作用，就像细菌保种的时候要加入甘油一样的，如果你想长时间保存就多加点甘油，如果保存时间较短就少加点。

3、我的蛋白复性后上离子交换柱，无论是阴离子还是阳离子柱，都是大部分穿透，不知是不是复性效果不好造成的。
这个我不敢说，因为在没有纯化蛋白之前我考虑了几种纯化方法，最后选择了HIS纯化柱，没用离子交换这种方法，所以知道的不是很多。就我所知道的给您提点建议吧，希望我没有理解错。
我觉得您的这种情况肯定是跟复性的效果有关系的，而且我觉得多数是跟PH值有关，因为离子交换纯化跟缓冲液的PH值以及你蛋白的等电点有很大关系。以ph7的缓冲液为例,如果你的目标蛋白等电点小于7,呢就带负电荷,用阴离子交换的柱子,如果是大于7,那选择阳离子交换的柱子,如果等电点是7,那上样的缓冲液pH大于它的等电点用阴离子,小于7的用阳离子,如此类推就可以.

关于离子交换我只知道这么多了，呵呵。

建议你还是先看一下相关的资料和教材吧。武大赵俊芳编的＜生物化学实验技术和基本原理＞挺好挺详细的。还有一本冷泉港实验室的蛋白质提取纯化的书也挺好的。具体链接如下：
cuturl('http://blog.molezz.org/read.php?143')

希望对你有所帮助。

作者: NBA 时间: 2013-4-10 16:17

蛋白折叠状态不同，表面电荷分布确实会有差异。
但我估计，主要是由于所选的pH不合适，或盐浓度过高。

作者: yapuyapu 时间: 2013-4-10 16:18

非常感谢这个版面，让我学到了很多东西。我现在的困惑是：以前用pET-29b的载体，蛋白表达量非常多，用Ni－His Tag纯化柱过柱后量也非常多很纯，但一复性后，蛋白跑电泳就没有带了，我需要融合蛋白作凝胶阻滞，现在柱子没有了，还有没有不用过柱得到融合蛋白的方法，用尿素是不是可以？但怎么用尿素变性复性啊？
另我还试过GST载体，也是可溶性很不好，也在包涵体里，急死我了，那位战友帮帮我。

作者: nn255 时间: 2013-4-10 16:18

关于上离子柱的PH值，我已经摸索了很多了，还是不理想。你们所讲的PH值是复性时的吗？我的等电点是5.6，复性时是8.5。我用的是稀释复性的方法。希望给予帮助

作者: ukonptp 时间: 2013-4-10 16:19

QUOTE:

原帖由 yapuyapu 于 2013-4-10 16:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
非常感谢这个版面，让我学到了很多东西。我现在的困惑是：以前用pET-29b的载体，蛋白表达量非常多，用Ni－His Tag纯化柱过柱后量也非常多很纯，但一复性后，蛋白跑电泳就没有带了，我需要融合蛋白作凝胶阻滞，现在柱子没有了，还有没有不 ...

上面我说过一次，想改变蛋白以包涵体形式存在不但要有一定的理论知识为基础，而且还需要很大的运气成分，不容易。我试了很长时间也没能改变目的蛋白的存在形式。

我能问一下你用的是什么方法复性的吗？如果用常用的透析复性的话出现多数都是会出现沉淀的，是因为透析液的PH值接近蛋白的等电点，从而导致蛋白不带电荷，也就没有了相互的排斥力，从而产生了蛋白沉淀。最常用的方法就是改变透析液的PH值了，我今天用PH9.5的透析液也透析成功了。

8M的尿素是可以得到可溶性的蛋白，但是如果没有纯化的话是很不纯的。为什么没有镍柱了呢？一个可重复使用的镍柱只需要400块，呵呵。。蛋白纯化的方法有很多种，比如说凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等等，但是用哪种方法都要花钱啊，呵呵。

作者: ukonptp 时间: 2013-4-10 16:20

QUOTE:

原帖由 nn255 于 2013-4-10 16:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
关于上离子柱的PH值，我已经摸索了很多了，还是不理想。你们所讲的PH值是复性时的吗？我的等电点是5.6，复性时是8.5。我用的是稀释复性的方法。希望给予帮助 ...

稀释复性必须对pH, GSH与GSSG的比例与浓度，精氨酸浓度，样品量及复性温度等条件进行优化。现在普遍流行的稀释复性液组成为：20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 含0.5 M 精氨酸，1mM EDTA, 1 mM GSH 及1 mM GSSG。你上面问你没有加Nacl 和20 mM Tris-HCl对于稀释复性是正确的，无需改变。

不知道biosepq斑竹提到的PH是指的什么。我所说的PH是指平衡缓冲液和复性缓冲液还有你蛋白等电点之间的条件优化。应该注意所选择的PH 值应该使目的蛋白和树脂的亲和力达到最大,同时杂蛋白和树脂的亲和力最小,从而在洗脱时达到纯化的目的。真的不好意思，对于离子交换纯化我没有实践基础，所以只能给您指出一点从理论上来说的意见：

如果是阴离子介质，可以先取一毫升介质分别放入4个小试管里，再用pH为7，8，9，10的缓冲液分别平衡5次然后在每个试管中加入样品，样品的pH值要和相应试管的pH值对应。让样品充分和介质反应一段时间后，离心取上清，跑电泳。看看在不同pH条件下样品和介质的结合情况。阳离子介质的pH值可设为3, 4, 5, 6和前面讲的方法一样。还可以先跑一个凝胶柱，把不同的分子量的组分分开，然后根据前面所掌握的蛋白在不同pH条件下的带电情况，进行离子交换层析（仅供参考）。

离子交换chromatography 兄做的非常好，他是专业的，你可以去他那里问问，呵呵。链接如下：
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=1042756&sty=1&tpg=1&age=0')

还有，既然这种方法不理想为什么不换一种纯化方法试试呢？

作者: NBA 时间: 2013-4-10 16:22

复性成功与否，应该有特异性的方法。
总之不管是先纯化后复性，还是先复性再纯化，离子交换挂不上柱应该和复性成功与否关系不是特别大，主要原因是你的条件不合适。当然，折叠状态影响电荷分布，但不会改变的特别大。

你的等电点低，应该考虑用阴离子交换，这和你的复性buffer也比较接近。
那么你的样品电导是多少？最好不要超过5ms/cm，根据实验结果在进行调整。电导过高是binding不上的。
pH3上阳离子是不合适的。

试管试验意义不是很大，对于完全未知的蛋白，pH7.0直接挂柱，试不了几次就可以找到biniding的条件，但只是纯化的第一步，怎么分离度更好才是学问。

作者: 831226 时间: 2013-4-10 16:22

问个关于溶解浓度的问题。
一般大致上是多少的浓度？我现在采用的浓度是1g包涵体（湿重）/ml溶解缓冲液。

作者: ukonptp 时间: 2013-4-10 16:23

QUOTE:

原帖由 831226 于 2013-4-10 16:22 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

问个关于溶解浓度的问题。
一般大致上是多少的浓度？我现在采用的浓度是1g包涵体（湿重）/ml溶解缓冲液。

并无文献上说明具体的比例，说说我的供你参考。

100ml大概能得到0.03－0.05g的包涵体（每次称重都特别不好称，可能是由于每次液体吸的不干净，或是由于天平的误差)。不管得到的是多少我都是加入1.5ml的溶解液（我用的是8M的尿素）后加入15ul的DTT，然后4度过夜，或是室温5小时，效果一直很好。就这样。

我觉得如果不是GST融合蛋白都可以用8M的尿素溶解，而且加多加少不会有很大影响，我们实验室的几个人表达的蛋白都是以包涵体的形式存在的，都是用我上述的方法，效果都一样。

作者: wmp1234 时间: 2013-4-10 16:24

请教：我是用PET-HIS表达蛋白和纯化的，目的蛋白分子量大小为42KD.我是在31° 1mmol/L的IPTG诱导下表达的。表达后蛋白存在于包涵体中。我用6M尿素变性后蛋白都溶解了，然后0.45um过滤后上柱，上柱时发现有结晶析出，好奇怪啊！！我的bingding buffer里也加了6M的尿素了，Elution buffer中没加，20mM咪唑浓度洗脱的，结果什么都没有。是不是我的Elution buffer中没加尿素的缘故？还有说明书上说柱中含有尿素的话低咪唑浓度就可以洗脱了，我的咪唑浓度还需要提高吗？那位战友帮帮我啊。急！谢谢！！

作者: ukonptp 时间: 2013-4-10 16:25

QUOTE:

原帖由 wmp1234 于 2013-4-10 16:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请教：我是用PET-HIS表达蛋白和纯化的，目的蛋白分子量大小为42KD.我是在31° 1mmol/L的IPTG诱导下表达的。表达后蛋白存在于包涵体中。我用6M尿素变性后蛋白都溶解了，然后0.45um过滤后上柱，上柱时发现有结晶析出，好奇怪啊！！ ...

战友有几个问题没有说清楚：

你说上柱时出现结晶，是什么地方出现呢？是在柱内还是在EP管中。如果我没记错的话，6M的尿素的冰点好像是－11度，这样如果避免低温的话，应该不会出现结晶。

你的binding里面加的咪唑浓度是多少，binding buffer的咪唑浓度一定要比最低的洗涤buffer的浓度低。

还有一个就是战友出现了重大错误就是在Elution buffer中没有加入尿素。虽然说咪唑和蛋白竞争柱中的镍离子从而达到纯化的目的，但是我试过如果洗涤液中不加入尿素的话而仅仅用PBS是洗不下来的，具体为什么不能理解，猜测可能是由于蛋白不能溶于其他溶液中，所以即使脱离了镍离子也不能被洗涤流出，而是短暂的脱离后又重新结合了。

镍柱纯化要利用一个咪唑剃度来洗脱目的蛋白，而不是仅仅用一个浓度的洗涤液来纯化。低浓度的咪唑是洗不下来的或者说洗下的非常少（没有结合牢固的蛋白）。所以你要加大咪唑浓度，而且要做一个剃度，看一下在哪个浓度你的目的蛋白的洗脱量达到最大而杂蛋白的洗脱量相对最小。

作者: 98776langtao 时间: 2013-4-10 17:08

上柱时出现结晶,是样本上柱到柱内而不是EP内.我的6M尿素的binding buffer 是保存在4度冰箱中的,而且柱的平衡是用含6M尿素的bingding buffer时也未出现结晶.

我的binding里的咪唑浓度是30M,

还有就是我的HIS-IDA柱的树脂是不是不能再重复利用了,按照战友的说法,树脂里还含有我的蛋白,是不是要重新换过了?

以战友的经验,我做30M,50M,80M,100M这几个梯度可以吗?

作者: ukonptp 时间: 2013-4-11 10:53

上柱时出现结晶,是样本上柱到柱内而不是EP内.我的6M尿素的binding buffer 是保存在4度冰箱中的,而且柱的平衡是用含6M尿素的bingding buffer时也未出现结晶.

我的binding里的咪唑浓度是30M,

还有就是我的HIS-IDA柱的树脂是不是不能再重复利用了,按照战友的说法,树脂里还含有我的蛋白,是不是要重新换过了?

以战友的经验,我做30M,50M,80M,100M这几个梯度可以吗?

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你用的tag是预装柱的还是需要你自己装的，你买的时候应该有说明书的，上面会告诉你树脂能否重复利用，以及tag使用后的处理方法，你仔细看看吧，应该可以重复利用。至于树脂中的蛋白说明书上会告诉你怎么处理掉的，多数都是用EDTA后，用NaOH处理，你看看吧。

你的Bingding buffer里面的咪唑浓度高了，你想目的蛋白是和咪唑竞争镍离子的，如果咪唑浓度太高了，那目的蛋白的结合肯定会不太好，建议使用10mM的，战友你的咪唑浓度应该不会真的是"M"这么大浓度吧？呵呵

为什么出现结晶我也理解不了，我纯化的时候bingding buffer 和elution buffer 都是现用现配的，不进冰箱。你试试吧。

我觉得你试的剃度有点少。我第一次过柱的时候剃度用的是20mM、40、60、80、100、120、150、200、250、300、400、500然后确定在哪个范围目的蛋白洗脱量最多，然后在用更细的剃度纯化以进一步确定最佳洗涤浓度。希望对你有帮助。

作者: wmp1234 时间: 2013-4-11 10:56

不好意思啊，我少打了个m，应该是mM,谢谢！！！！

还有个问题，就是我洗脱蛋白时能不能用一根柱子分段洗脱啊，就是先用20，然后40，60，80等，还是用不同柱子洗脱？

作者: wmp1234 时间: 2013-4-11 10:57

战友，不好意思还有个问题就是PH值是不是一定要7.9啊？我的bingding buffer，washing buffer，elution buffer买的都是成品的，你的washing buffer咪唑浓度是多少啊？我的是20mM

作者: ukonptp 时间: 2013-4-11 11:08

不好意思啊，我少打了个m，应该是mM,谢谢！

还有个问题，就是我洗脱蛋白时能不能用一根柱子分段洗脱啊，就是先用20，然后40，60，80等，还是用不同柱子洗脱？

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用同一个柱子，才好摸条件。

作者: ukonptp 时间: 2013-4-11 11:10

战友，不好意思还有个问题就是PH值是不是一定要7.9啊？我的bingding buffer，washing buffer，elution buffer买的都是成品的，你的washing buffer咪唑浓度是多少啊？我的是20mM

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我没有用washing buffer，直接用binding buffer平衡后用elution buffer洗脱，呵呵。

你是指的什么PH值呢，是各种buffer的吗？如果是的话，那应该用7.9，我其他PH没有试过。

作者: wood533 时间: 2013-4-11 11:11

pH7~8即可，pH降低也是一种洗脱方式，当用imidazole无法达到所需纯度，那么结合起来可能会有好的效果。

作者: DDD 时间: 2013-4-11 11:12

按你说的办法，我的蛋白终于纯化出来了。但是新的问题又来啦。我纯化出来蛋白的分子量接近48KD了，但是我的表达蛋白分子量应该只有42KD，尿素对跑SDS会有影响吗？我真是郁闷死了，纯化的蛋白条带很好，也没有杂带，就是分子量不对。

作者: DDD 时间: 2013-4-11 11:12

我的原蛋白分子量为40.6kd，表达蛋白分子量大小为44.2kd，不好意思啊，我刚才仔细对了一下。为什么SDS跑出来快接近47了啊，真是晕啊

作者: ukonptp 时间: 2013-4-11 11:13

QUOTE:

原帖由 DDD 于 2013-4-11 11:12 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我的原蛋白分子量为40.6kd，表达蛋白分子量大小为44.2kd，不好意思啊，我刚才仔细对了一下。为什么SDS跑出来快接近47了啊，真是晕啊

战友你说的太不清楚了，我有点没看懂。

什么是原蛋白？什么是表达蛋白分子量？你说清楚点大家也好帮你嘛。

你说分子量不一致了，你是跑marker看出来的吗？

作者: ero11 时间: 2013-4-11 11:14

我最近也一直在做融合蛋白的可溶性表达，从前的pET载体作包涵体表达后是不能用于结构分析的，所以就用pEGX载体构建工程菌融合表达。一开始是没有表达现象的，后来仔细阅读说明书之后调整了诱导时间，在25到37下的培养诱导皆有高表达，但是菌体超声后跑SDS-PAGE，发现还是包涵体表达，十分郁闷。请教楼主，是不是认为这主要是高表达造成包涵体表达，还是***作中有问题。超声后的菌液离心一般是7700g吗？我从有的文献上看到11400g，使用TGL-16G离心用了16000R 10分钟，目的蛋白有46KD。是不是我调低温度会好一些。

作者: ukonptp 时间: 2013-4-11 11:15

我最近也一直在做融合蛋白的可溶性表达，从前的pET载体作包涵体表达后是不能用于结构分析的，所以就用pEGX载体构建工程菌融合表达。一开始是没有表达现象的，后来仔细阅读说明书之后调整了诱导时间，在25到37下的培养诱导皆有高表达，但是菌体超声后跑SDS-PAGE，发现还是包涵体表达，十分郁闷。请教楼主，是不是认为这主要是高表达造成包涵体表达，还是***作中有问题。超声后的菌液离心一般是7700g吗？我从有的文献上看到11400g，使用TGL-16G离心用了16000R 10分钟，目的蛋白有46KD。是不是我调低温度会好一些。

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我个人认为造成蛋白质以包涵体形式存在的原因就是由于目的蛋白的表达量很高。要想改变蛋白的存在形式很困难，可以从载体、表达菌的选择，诱导时间、温度、浓度等方面来摸索改变包涵体的条件。

超声后菌液离心速度没有很大影响，我都是离15000或16000的，离心10－15min都可以。

作者: is2011 时间: 2013-4-11 11:16

问个有关透析的问题。
一般透析液的体积是蛋白溶液的几倍？还有透析24小时的话，是不是直接将透析袋放在透析液里就OK了？

作者: ukonptp 时间: 2013-4-11 11:17

问个有关透析的问题。
一般透析液的体积是蛋白溶液的几倍？还有透析24小时的话，是不是直接将透析袋放在透析液里就OK了？

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透析液没有规定的是样品的几倍，但是建议透析之前将样品稀释一倍，这样有可能在一定程度上避免蛋白沉淀形成。比如说待透析蛋白溶液是10ml的话，那么就在其中缓慢加入10ml的透析液，然后将上述20ml的透析样品加入透析袋中，然后放入加入一定体积透析液的烧杯中放入4度冰箱透析即可。

作者: 49888 时间: 2013-4-11 11:18

您好，我想问一下关于尿素溶解包涵体的原理，它是破坏蛋白的什么键而变性的？我用尿素梯度沉淀时得到了纯度还行的包涵体，最终是在2M尿素里溶着的。我想直接用它来免疫小鼠，制备抗体，这样行么？变性蛋白的抗原性会不会有所改变呀？后面要做单抗。
先谢谢了！

作者: ukonptp 时间: 2013-4-11 11:18

您好，我想问一下关于尿素溶解包涵体的原理，它是破坏蛋白的什么键而变性的？我用尿素梯度沉淀时得到了纯度还行的包涵体，最终是在2M尿素里溶着的。我想直接用它来免疫小鼠，制备抗体，这样行么？变性蛋白的抗原性会不会有所改变呀？后面要做单抗。
先谢谢了！

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1、溶解包涵体通常使用尿素和盐酸胍，他们都属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。它们主要是对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用。

2、直接用溶解的包涵体蛋白免疫动物制备多抗还行，但是制备单抗肯定不行，也不是不行，但是那样蛋白毕竟不纯，后期筛选阳性真克隆的工作量太大了，所以不建议使用这种方法。

3、我个人感觉变性蛋白对于蛋白的抗原性并没有什么影响，因为我用复性之前的纯蛋白和复性之后的蛋白分别免疫小鼠之后ELISA的效价差不多，但是可以肯定的是对于抗体的产生肯定有影响，因为复性后的蛋白更接近天然构象，产生的抗体才更接近天然蛋白产生的抗体。所以建议战友您使用传统的纯化包涵体方法，也就是用8M的尿素溶解包涵体后用纯化柱纯化，之后复性，然后用复性的蛋白来制备单抗。你的实验跟我第一个实验是一摸一样的，唯一的不同也许就是蛋白不同了，呵呵。

4、尿素里面溶的蛋白可以用来免疫制备多抗，我做过。

希望能对你有点帮助。

作者: ritou1985 时间: 2013-4-11 11:19

呵呵，太好了，终于有人讨论复性了，我一直以为我是天下最惨的人，原来还是有这么多的难友。
希望以后能跟大家多多交流。尤其是战友20021108。这里先打声招呼罗。

弱弱的问一下，20021108兄你作了这么多年的复性了，
你一般用什么方法复性的？比较上手的又是哪种？有没有自己独道的理念那？

你的复性已经达到什么样的规模了，只是实验室水平还是有中试的经验了。

另外有没有作过重组蛋白的生产，如果有，你是怎么控制复性的批间差的？
期待与你讨论。

作者: ukonptp 时间: 2013-4-11 11:20

呵呵，太好了，终于有人讨论复性了，我一直以为我是天下最惨的人，原来还是有这么多的难友。
希望以后能跟大家多多交流。尤其是战友20021108。这里先打声招呼罗。

弱弱的问一下，20021108兄你作了这么多年的复性了，
你一般用什么方法复性的？比较上手的又是哪种？有没有自己独道的理念那？

你的复性已经达到什么样的规模了，只是实验室水平还是有中试的经验了。

另外有没有作过重组蛋白的生产，如果有，你是怎么控制复性的批间差的？
期待与你讨论。

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不好意思这位战友，我没有作了这么多年的复性了，呵呵。我现在是硕士二年级，我的课题就是从基因克隆到诊断试剂盒的制备，仅仅做复性大概一年时间，所以我做复性仅限于实验室水平，但是由于我们实验室做这个的人比较多，所以有点经验罢了。我主要用透析复性和稀释复性两种方法。参与到这个讨论的也多数都是一些研究生讨论一下自己的课题。

所以我不能回答你上面的问题，但是期待您能参与进来，向大家传授一下经验，呵呵。

作者: ladyhuahua 时间: 2013-4-11 11:21

请问:用6M(或4M,2M,1M)的盐酸胍洗涤包涵体,包涵体的量具体取好多啊?也就是说在提到包涵体之后,是直接取沉淀,用(多少?)盐酸胍洗?还是要先将沉淀用PBS溶解之后再用盐酸胍洗呢?很急!!!!请哪位高手指点一下!谢谢!!!!!

作者: wood533 时间: 2013-4-11 11:21

直接取沉淀,用6M盐酸胍就可以将包含体融解掉了，
用PBS是融解不掉的。

作者: wood533 时间: 2013-4-11 11:22

您的课题就是从基因克隆到诊断试剂盒的制备，呵呵，那我们是同行了，
不过我不当学生很多年了。
希望以后多交流。

作者: ukonptp 时间: 2013-4-11 11:23

请问:用6M(或4M,2M,1M)的盐酸胍洗涤包涵体,包涵体的量具体取好多啊?也就是说在提到包涵体之后,是直接取沉淀,用(多少?)盐酸胍洗?还是要先将沉淀用PBS溶解之后再用盐酸胍洗呢?很急!!!!请哪位高手指点一下!谢谢!!!!!

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包含体的克数称不准的，我们这里的电子天平没有那么准，相信多数电子天平都称不出准确的包含体的克数，因为得到的包含体毕竟太少了，呵呵。

得到包含体沉淀之后，首先要用洗涤液处理一下包含体（而不是PBS,如上面战友所说的哪样，PBS不能溶解包含体，洗涤还可以，但是不如正规的洗涤液效果好。)，这一步对于后续的纯化过程是非常重要的。然后直接在洗涤过后的沉淀中加入盐酸胍或尿素都可以将包含体溶解掉，但是最好在其中加入少量的还原剂如DTT。

作者: Ao7 时间: 2013-4-11 11:24

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感染疾病
呵呵，说的太客气了，
我还太嫩，要不早就学CHROMATOGRAPHY兄一样开一个纯化精华版了。

问一下，20021108 兄，你作重组的，又跟诊断试剂有关系，那应该作重组抗原的罗，呵呵，不会连重组抗体也作吧。

作重组抗原那就势必要作传染病系列的，敢问仁兄作过那些啊。
我这边是TP,HIV,HCV,TORCH,HBV都作的。

作者: ukonptp 时间: 2013-4-11 11:24

QUOTE:

原帖由 Ao7 于 2013-4-11 11:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
相关疾病：
感染疾病
呵呵，说的太客气了，
我还太嫩，要不早就学CHROMATOGRAPHY兄一样开一个纯化精华版了。

问一下，20021108 兄，你作重组的，又跟诊断试剂有关系，那应该作重组抗原的罗，呵呵，不会连重组抗体也作吧。

作重组抗原那 ...

使用重组抗原来做出单克隆抗体，继而看看能不能开发诊断试剂盒，就这样。

跟这位战友比我做过的太少了，呵呵。已经做过TP0453，目前在做Cpn MOMP。

以后会多多请教的。

作者: 831226 时间: 2013-4-11 11:34

知道那个GST有多少个二硫键在里面吗是不是一般接在GST后面的蛋白会形成包涵体表达主要不看目的分子大小，而主要在于二硫键的多少。tac启动子的不严密是不是在诱导剂浓度太高时会形成包涵体表达的原因之一呢？谢谢！

作者: yjf1026 时间: 2013-4-11 11:35

我也是在做用重组抗原作单抗，目的也是做诊断试剂盒，不过我是作动物上的。其实我也想过柱纯化可是老板不舍得买进口镍柱，所以我才很是郁闷，想通过别的办法纯化。我还想请教个问题：
SDS胶回收的蛋白还能通过除去SDS复性么？我同时作了几组免疫老鼠，有胶回收的蛋白，有剃度沉淀后最终溶到2M尿素里的，还有洗涤后的沉淀直接用PBS冲悬的，不知道我这几组都可行么？
还有，您刚说的正规的洗涤液指的是什么？PBS+TritonX100+低浓度尿素么？
看来以后要多在这里向大家请教了：）

作者: ukonptp 时间: 2013-4-11 11:36

知道那个GST有多少个二硫键在里面吗是不是一般接在GST后面的蛋白会形成包涵体表达主要不看目的分子大小，而主要在于二硫键的多少。tac启动子的不严密是不是在诱导剂浓度太高时会形成包涵体表达的原因之一呢？谢谢！

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这位战友问的很深，我也没太看懂，呵呵。但是我觉得我没有解决的这个问题水平，惭愧惭愧。

说说我的看法吧：

包涵体形成的因素有太多太多了，能想到的有：

1、在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
2、基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
3、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
4、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
5、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
6、蛋白质在合成之后，于中性pH或接近中性pH的环境下，其本身固有的溶解度对于包涵体的形成比较关键，即是说，有的表达产率很高，如Aspartase和Cyanase,表达产率达菌体蛋白的30%,也不形成包涵体，而以可溶形式出现。
7、在细菌分泌的某个阶段，蛋白质分子间的离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体的形成。

但是没有想到的因素呢？也许你提到的也是一种可能吧，呵呵。期待有高手进来参与讨论，解决您的问题。

能降低包涵体形成的条件有：

1、降低重组菌的生长温度，降低培养温度是减少包涵体形成的最常用的方法，较低的生长温度降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用，从而可减少包涵体的形成[4]。

2、添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂，培养E.coli时添加高浓度的多醇类、蔗糖或非代谢糖可以阻止分泌到周质的蛋白质聚集反应，在最适浓度范围内添加这些添加剂不会影响细胞的生长、蛋白质的合成或运输，其它促重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂还有乙醇（诱导热休克蛋白的表达）、低分子量的巯基或二硫化合物（影响细胞周质的还原态，从而影响二硫键的形成）和NaCl[5]。

3、供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧、pH等。

作者: ukonptp 时间: 2013-4-11 11:36

我也是在做用重组抗原作单抗，目的也是做诊断试剂盒，不过我是作动物上的。其实我也想过柱纯化可是老板不舍得买进口镍柱，所以我才很是郁闷，想通过别的办法纯化。我还想请教个问题：
SDS胶回收的蛋白还能通过除去SDS复性么？我同时作了几组免疫老鼠，有胶回收的蛋白，有剃度沉淀后最终溶到2M尿素里的，还有洗涤后的沉淀直接用PBS冲悬的，不知道我这几组都可行么？
还有，您刚说的正规的洗涤液指的是什么？PBS+TritonX100+低浓度尿素么？
看来以后要多在这里向大家请教了：）

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一根可重复使用的镍柱只需要400RMB，如果这点钱都舍不得花，那么做单抗后面还要花的更多的钱怎么办。

你的几种免疫方案都可以得到抗体，但是都是没有复性的抗原免疫的，那么产生的抗体肯定会跟天然的抗原产生的抗体有区别，因为抗体跟抗原的空间构象有很大关系，不复性恐怕不行，跟你老板商量商量吧。想做单抗是看重经济效益，但是有舍不得花本钱，太抠门了吧？

SDS胶回收的蛋白倒是能出去SDS复性，但是你靠胶回收得到的蛋白量也太少了，用这样的蛋白免疫动物太辛苦了。

我说到的洗涤液就是洗涤液1和2，配方如下:

洗涤液1：20mM Tris-Cl(PH8.0) 5mM EDTA 0.5% TritonX-100
洗涤液2：20mM Tris-Cl(PH8.0) 5mM EDTA 2M 尿素

洗涤之所以重要是由于包涵体中不仅仅有目的蛋白，还有差不多50％的其他成分，而用一些中性的去垢剂和低浓度的尿素能将其出去，提高蛋白纯度，为后续纯化减轻负担。

作者: mamamiya 时间: 2013-4-11 12:24

cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/2555439_1.html')
按照这位老兄的方法透析复性了一次，前面的步骤中都没有沉淀出现，只是在最后一步时有沉淀出现，电泳后分析了下，大约损失了20－30％，今天打算上阴离子柱纯化，不知道能不能获得比较好的结果。
另外想问个问题，在这个方法中最后一步为什么要加150mM NaCl？起什么作用？降低浓度或者去掉合适吗？
总觉得为了后续的纯化，溶解液中就有那么高的盐浓度，怪怪的。

作者: yjf1026 时间: 2013-4-11 12:25

如果照那种方法作生产，不知道要等死多少人。蛋白质复性本来就很复杂。每一种蛋白都有自己独特的体外复性过程。你想只用一种复性方法处理任何蛋白是不可能的事。在这一领域是没有什么所谓的必胜计的。

另，复性过程中沉淀现象是很正常的。但你那个溶液中盐离子浓度过高了。作阴离子柱不适合，除非你的蛋白在PH8的环境中带强电荷，否则还是优化一下您的BUFFER，要不浪费了您那宝贵的6天等待时间。

作者: mamamiya 时间: 2013-4-11 12:26

其实郁闷就在为了某些实验目的而不能更换培养基条件时，并且在只能用某种载体的时候，只能从IPTG浓度以及培养温度等条件入手是很难改变包涵体表达这一事实的。崩溃的一件事！
那战友有没比较常用的载体，pET-32a、28a, pGEX等的MCS的序列。战友有没有在设计引物方面的技巧呢？

作者: ukonptp 时间: 2013-4-11 12:26

cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/2555439_1.html')
按照这位老兄的方法透析复性了一次，前面的步骤中都没有沉淀出现，只是在最后一步时有沉淀出现，电泳后分析了下，大约损失了20－30％，今天打算上阴离子柱纯化，不知道能不能获得比较好的结果。
另外想问个问题，在这个方法中最后一步为什么要加150mM NaCl？起什么作用？降低浓度或者去掉合适吗？
总觉得为了后续的纯化，溶解液中就有那么高的盐浓度，怪怪的。

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我很同意楼上战友的意见，那位战友的复性方案我也觉得有不妥之处，那么高的盐浓度跟高尿素浓度有什么区别？？而且周期太长了，如果有两次没有优化好的话，半个月就没有了，不太值得试，如果有时间还可以，呵呵。

作者: ukonptp 时间: 2013-4-11 12:27

其实郁闷就在为了某些实验目的而不能更换培养基条件时，并且在只能用某种载体的时候，只能从IPTG浓度以及培养温度等条件入手是很难改变包涵体表达这一事实的。崩溃的一件事！
那战友有没比较常用的载体，pET-32a、28a, pGEX等的MCS的序列。战友有没有在设计引物方面的技巧呢？

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不好意思，战友，我没有比较过，因为研究生一共就三年，课题任务又比较多，我怕做不过来呢，如果将来有时间我一定要试一下的。

引物设计我一般，我们实验室的引物高手倒是有好几个，呵呵。

作者: yjf1026 时间: 2013-4-11 12:27

谢谢!!!!!
那洗涤包涵体的洗涤液具体是怎么配制的呢?
另外,我昨天用了盐酸胍洗了,发现用6M洗涤的沉淀和上清在加了上样缓冲液煮了之后都出现了沉淀,为什么?
这种洗涤后我需要的蛋白到底是在上清还是在沉淀呢?我发现有的在上清,都得在沉淀.

作者: mamamiya 时间: 2013-4-11 12:28

盐酸胍会跟SDS沉淀。

作者: mamamiya 时间: 2013-4-11 12:28

可以将样品稀释6倍再加了上样缓冲液煮了会好一点。

作者: ukonptp 时间: 2013-4-11 12:29

谢谢!!!!!
那洗涤包涵体的洗涤液具体是怎么配制的呢?
另外,我昨天用了盐酸胍洗了,发现用6M洗涤的沉淀和上清在加了上样缓冲液煮了之后都出现了沉淀,为什么?
这种洗涤后我需要的蛋白到底是在上清还是在沉淀呢?我发现有的在上清,都得在沉淀.

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我们常用的洗涤液有两个，配方上面我提到了，分别是：

洗涤液A：20mM Tris-Cl(PH8.0) 5mM EDTA 0.5% TritonX-100
洗涤液B：20mM Tris-Cl(PH8.0) 5mM EDTA 2M 尿素

然后就是在8M尿素中溶解过夜，别忘了加点还原剂。之后包涵体就应该溶解了，目的蛋白在上清中，再纯化上清就可以了。

你的那种包涵体的处理方法好像不对。

作者: yjf1026 时间: 2013-4-11 12:29

谢谢战友!
但是我在前面看到过用盐酸胍来洗的啊.我点样的时候发现看不清条带,好多的沉淀沉在底部.将样品稀释6倍的话,那不是更加看不清楚了!
我今天只发现用1M的盐酸胍处理的沉淀中看到了我的目的蛋白,你们说这样的情况可能出现吗?

作者: mamamiya 时间: 2013-4-11 12:30

包含体是可以用盐酸胍来洗，但那只是低浓度的，比如说1M. 绝对不可能有人用6M的盐酸胍来洗，那样包含体都融解了。你还洗啥啊。
将样品稀释6倍的意思是：如果你已经用6M的盐酸胍融解了包含体。那样的溶液是不能直接加上样缓冲液的，因为6M的盐酸胍会跟SDS反应而沉淀掉。
那为了解决这个问题，最简单的方法就是先将样品稀释6倍，然后再加上样缓冲液，然后再煮，然后再点样，这样会好很多，不会有你那种“好多的沉淀沉在底部."现象了。

"我今天只发现用1M的盐酸胍处理的沉淀中看到了我的目的蛋白,你们说这样的情况可能出现吗?"
本来就应该这样的！

作者: JK.jon 时间: 2013-4-11 12:30

我很同意楼上战友的意见，那位战友的复性方案我也觉得有不妥之处，那么高的盐浓度跟高尿素浓度有什么区别？？而且周期太长了，如果有两次没有优化好的话，半个月就没有了，不太值得试，如果有时间还可以，呵呵。

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我当时就在想加盐是不是跟去掉了L-Arg有关，但是后来想应该关系也不会太大吧。还有，最终的溶液中还有EDTA这个对离子交换有影响吗？
反正昨天用含150mM NaCl的样品纯化基本上是没结合上，昨天将盐全部透析掉了，今天做了纯化，不知道结果怎么样。

作者: 131415 时间: 2013-4-11 12:31

我当时就在想加盐是不是跟去掉了L-Arg有关，但是后来想应该关系也不会太大吧。还有，最终的溶液中还有EDTA这个对离子交换有影响吗？
反正昨天用含150mM NaCl的样品纯化基本上是没结合上，昨天将盐全部透析掉了，今天做了纯化，不知道结果怎么样。

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edta肯定对离子交换有影响。

作者: yjf1026 时间: 2013-4-11 12:31

我这里还有个问题,就是我想用跑胶切胶的方法来纯化样品,那么切胶后,怎么样处理胶去注射兔子好呢?需要好多的胶量来注射?

作者: ukonptp 时间: 2013-4-11 12:31

我这里还有个问题,就是我想用跑胶切胶的方法来纯化样品,那么切胶后,怎么样处理胶去注射兔子好呢?需要好多的胶量来注射?

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我们上面有位师兄，他就是切胶免疫的，具体做法有两种：

一个是首先跑两块胶，一块染色，一块不染，然后比对着将目的蛋白切下，然后放入PBS中，在40度左右的水浴中可以将其溶解。

还有一个就是跑一块胶，然后用1M的kcl浸泡，20min左右可见明显乳白色条带，然后将其切下，之后的步骤同上。

具体需要多少胶要根据你胶的上样量来定了，上样多就能多得到一些，上样少就得到的少了，呵呵，还跟你的蛋白的表达量有关。

作者: yjf1026 时间: 2013-4-11 12:32

哦，我明白了。其实我们实验室有人用过这种方法，但是大部分人是将胶磨碎之后再加水或是PBS溶解，然后注射兔子。

作者: yjf1026 时间: 2013-4-11 12:32

请问你们初次免疫后多久进行加强免疫呢?我看到分子克隆实验指南上说是一个月后,但是我们实验室的好多人都是在一周后就进行加强免疫,检测效价,这样能检测出来吗?

作者: ukonptp 时间: 2013-4-11 12:33

请问你们初次免疫后多久进行加强免疫呢?我看到分子克隆实验指南上说是一个月后,但是我们实验室的好多人都是在一周后就进行加强免疫,检测效价,这样能检测出来吗?

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免疫间隔时间是重要因素，特别是首次与第二次之间更应注意。一个月之后有点长了，但是一个星期之后我觉得又有点短了。我认为应该这样：

第一次免疫后，因动物机体正处于识别抗原和B细胞增殖阶段，如很快接着第二次注入抗原，极易造成免疫抑制。一般以间隔10～20天为好。二次以后每次的间隔一般为7～10天，不能太长，以防刺激变弱，抗体效价不高。

免疫抗原剂量：首次剂量为300～500μg，首次免疫用完全佐剂。加强免疫的剂量约为首次剂量为1/4左右。每隔一段时间加强免疫一次，加强免疫时用不完全佐剂。

免疫方法我想应该用多点免疫，一来因为兔子较大，二来多点免疫的效果好。是在背部多点免疫，免疫了7、8个点。

第一次后测效价肯定不可行，至少要等一个月之后才能测效价，因为免疫后先出现的时IgM，IgM消失后出现的才时IgG。

作者: kuohao17 时间: 2013-4-11 12:33

8M尿素的配方是怎么样的？另外，洗涤液和溶解液的量是怎么确定的呢？还原剂的量加多少啊？

作者: 66+77 时间: 2013-4-11 12:33

请问，用8M尿素溶的包涵体以及除去尿素的包涵体溶在PBS里的，应该怎么保存？4度还是-20，蛋白是用来免疫的，要放1~2个月。反复冻融对免疫用的蛋白有影响么？谢谢！~

作者: ukonptp 时间: 2013-4-11 12:34

8M尿素的配方是怎么样的？另外，洗涤液和溶解液的量是怎么确定的呢？还原剂的量加多少啊？

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配方的说法有很多种，我跟你说一下我们实验室的配方吧：

8M尿素：

urea：8M
Nacl：0.5M
Na2po4：20mM
nah2po4 ：20mM
调PH值至7.4

PBS：

先配好溶液A和溶液B。

溶液A：0.2mol/LNaH2PO4（27.8g NaH2PO4；或者36.14g 2水合NaH2PO4O溶于1000ml水中）。

溶液B：0.2mol/LNa2HPO4（53.65g 7水合Na2HPO4或者71.7g 12水合Na2HPO4溶于1000ml水中）。

溶液A与B按下表比例混合后，用水稀释至终体积为200ml。

体积A（ml）－－－体积B（ml）－－－pH
87.7－－－－－－－12.3－－－－－－6.0
85.0－－－－－－－15.0－－－－－－6.1
81.5－－－－－－－18.5－－－－－－6.2
77.5－－－－－－－22.5－－－－－－6.3
73.5－－－－－－－26.5－－－－－－6.4
68.5－－－－－－－31.5－－－－－－6.5
62.5－－－－－－－37.5－－－－－－6.6
56.5－－－－－－－43.5－－－－－－6.7
51.0－－－－－－－49.0－－－－－－6.8
45.0－－－－－－－55.0－－－－－－6.9
39.0－－－－－－－61.0－－－－－－7.0
33.0－－－－－－－67.0－－－－－－7.1
28.0－－－－－－－72.0－－－－－－7.2
23.0－－－－－－－77.0－－－－－－7.3
19.0－－－－－－－81.0－－－－－－7.4
16.0－－－－－－－84.0－－－－－－7.5
13.0－－－－－－－87.0－－－－－－7.6
10.5－－－－－－－89.5－－－－－－7.7
8.5－－－－－－－－91.5－－－－－－7.8
7.0－－－－－－－－93.0－－－－－－7.9
5.3－－－－－－－－94.7－－－－－－8.0

然后按所需PH值配制即可。

作者: ukonptp 时间: 2013-4-11 12:34

请问，用8M尿素溶的包涵体以及除去尿素的包涵体溶在PBS里的，应该怎么保存？4度还是-20，蛋白是用来免疫的，要放1~2个月。反复冻融对免疫用的蛋白有影响么？谢谢！~

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反复冻融对蛋白的影响很大，建议你放在-80度的超低温冰箱里更保险一点，而且在存放之前最好能在里面加入一定比例的甘油，如20%，这样对于蛋白的稳定有很大的帮助。还有就是免疫前几天取出一点样品跑个page看一下蛋白是否已经降解。

作者: moonlight45 时间: 2013-4-11 12:35

我用小鼠来免疫，剂量大概是多少啊？

作者: ukonptp 时间: 2013-4-11 12:35

QUOTE:

原帖由 moonlight45 于 2013-4-11 12:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我用小鼠来免疫，剂量大概是多少啊？

如果是免疫小鼠的话，不论是用来制备单克隆抗体还是检测目的蛋白的抗原性都可以使用与制备单抗一样的免疫方案，当然如果免疫方法不同的话免疫剂量也会随之产生相应的变化。下面简单介绍一下腹腔免疫的免疫剂量：

首次免疫用50ug抗原（可溶性的）溶解于100或150ul的生理盐水或是PBS中然后加入等量的弗氏完全佐剂充分乳化后行小鼠腹腔注射。

两周后，用同样的剂量和同样的抗原行腹腔免疫。有的说这次免疫可以换为弗氏不完全佐剂，个人认为还是完全佐剂好。

三周后用50ug抗原溶解于100或150ul的生理盐水或是PBS中然后加入等量的弗氏不完全佐剂充分乳化后腹腔注射。

两周后50－80ug的抗原加入生理盐水到200ul行腹腔注射，三天后尾静脉取血测效价确定下一步实验方案。

作者: moonlight45 时间: 2013-4-11 12:36

我按着如上配方配的8M尿素，极难溶，怎么回事啊？可以高压吗？

作者: qianqin1977 时间: 2013-4-11 12:36

请问：听说疏水填料能够在不去除盐酸胍的情况下纯化蛋白，请问大侠们，这种填料要用什么样的洗脱液洗脱蛋白？

作者: mamamiya 时间: 2013-4-11 12:37

高盐上柱，低盐洗脱
这里的盐可以是NACL，一般为硫氨

作者: ukonptp 时间: 2013-4-11 12:37

我按着如上配方配的8M尿素，极难溶，怎么回事啊？可以高压吗？

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加入DTT试试，如果实在还是溶不了，试试提高尿素浓度到10M。

作者: jkobn 时间: 2013-4-11 12:38

试试用6M盐酸胍溶解，效果可能会好一些。

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我按着如上配方配的8M尿素，极难溶，怎么回事啊？可以高压吗？

作者: mamamiya 时间: 2013-4-11 12:38

我按着如上配方配的8M尿素，极难溶，怎么回事啊？可以高压吗？

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请试着将溶液置于37度水浴，因为尿素溶解会吸热

作者: avi317 时间: 2013-4-11 12:39

最近又尝试了新的透析方法，好像问题还是出在除盐这个步骤。
本来已经将最终的透析体系降低到20mM Tris-HCl，而且透析近24小时后检测得率在50％左右。但是在放置了4－5天后再用SDS-PAGE电泳，发现居然蛋白又少了许多，基本上只有之前的1/10，也就是说总得率变成了5％，损失的蛋白大部分都以沉淀出现。难道透析24小时都不算长吗？
郁闷死了，还没上柱样品就已经稀的要命，再用离子柱能纯化下来多少啊～

作者: wsll 时间: 2013-4-11 12:39

有谁做过链亲和素（streptavidin)复性，可以交流一下么，我做3个月了，怎不能成功，***有经验的高手指导，否则毕不了业了。

作者: mamamiya 时间: 2013-4-11 12:40

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原帖由 wsll 于 2013-4-11 12:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
有谁做过链亲和素（streptavidin)复性，可以交流一下么，我做3个月了，怎不能成功，***有经验的高手指导，否则毕不了业了。

我作过，可以讨论一下，但不知道你复性的要求高不高，活性要达到多少单位？理论活性16.8，如果你要求很高，那真的要毕不了业了

作者: mamamiya 时间: 2013-4-11 12:40

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原帖由 avi317 于 2013-4-11 12:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

最近又尝试了新的透析方法，好像问题还是出在除盐这个步骤。
本来已经将最终的透析体系降低到20mM Tris-HCl，而且透析近24小时后检测得率在50％左右。但是在放置了4－5天后再用SDS-PAGE电泳，发现居然蛋白又少了许多，基本上只 ...

应该还是复性的方案没有优化好，经常会有你说的这种情况，以为复性好了。但其实蛋白很不稳定，放置几天就沉淀

作者: bongte 时间: 2013-4-11 12:40

蛋白不稳定是由哪些因素造成的？
因为我是在透析结束后一天做的浓度检测，当时得率是50％，再后面一天也没有很明显的沉淀。
难道沉淀的出现是一个每天积累的过程？

作者: 神经侠 时间: 2013-4-11 12:41

最近又尝试了新的透析方法，好像问题还是出在除盐这个步骤。
本来已经将最终的透析体系降低到20mM Tris-HCl，而且透析近24小时后检测得率在50％左右。但是在放置了4－5天后再用SDS-PAGE电泳，发现居然蛋白又少了许多，基本上只有之前的1/10，也就是说总得率变成了5％，损失的蛋白大部分都以沉淀出现。难道透析24小时都不算长吗？
郁闷死了，还没上柱样品就已经稀的要命，再用离子柱能纯化下来多少啊～

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蛋白不稳定是由哪些因素造成的？
因为我是在透析结束后一天做的浓度检测，当时得率是50％，再后面一天也没有很明显的沉淀。
难道沉淀的出现是一个每天积累的过程？

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一般复性从24－72小时不等，但是我觉得24小时足够了。透析结束候得到50％左右也属于正常，但是蛋白降解如此快就不正常了。

蛋白的降解因素太多了，包括知道的还有一些不知道的。

我建议你在蛋白的透析液中加入一定体积的甘油，加入多少视保存时间长短而定，如果想长时间保存如6个月或更多，就多加一点，可以加到透析液总体积的50％，相反，如果想短时间保存就少加点，最少也要加到透析液总体积的5％。还有就是一定要在超低温冰箱中保存。我的亲身经历：2006年1月20日透析的蛋白，在－20度的昨天跑胶时已经完全降解，但是同一天透析的蛋白-80度一点没有降解。

作者: bongte 时间: 2013-4-11 12:42

透析液总体积的50％？是不是在透析结束后往蛋白溶液里加甘油？

作者: 66小飞侠 时间: 2013-4-11 12:42

最近实验遇到了大麻烦，说出来大伙帮忙想想法。
实验所用菌株为BL21，载体pMAL-p2X，与MBP融合表达，目的蛋白有三对二硫键。最初的设计思想是想通过MBP的信号肽实现可分泌表达，但实验发现主要是包涵体表达。
菌体超声破碎后12000rpm离心，所获得的沉淀不能很好的贴在离心管底，而是处于部分溶解状态，对沉淀再作如下处理：
1、2M尿素洗涤，pH8.5，12000rpm离心，获得的上清不是澄清透明而是略显混浊，这次的沉淀能够牢固的贴在管底。
2、4M尿素洗涤，pH9.0，12000rpm离心，获得的上清不是澄清透明而是略显混浊，这次的沉淀为半溶状态的冻状物。
3、8M尿素溶解上述2中的沉淀，几乎不见不溶的颗粒，但溶液还是略显混浊。
上述三溶液取样电泳，均见较多的目的蛋白。
对3中的溶液取样调pH至12溶液依然混浊。
0.22um过滤，无法去除混浊物。
考虑到混浊物是多聚体，样品中加入1％SDS和0.2％β-Me，都无法改善。
做上述处理，主要考虑到混浊物是目的蛋白，因为目的蛋白设计了6HIS但不能成功的结合Ni柱。
主要想请教这样几个问题：
1、有没有那位战友也碰上我上述的问题，这种问题是如何解决的？
2、我所描述的包涵体的状态说明了什么问题？
3、对与蛋白溶液混浊有什么好的处理方法？

暂不讨论分泌表达的问题。

作者: mamamiya 时间: 2013-4-11 12:43

最近实验遇到了大麻烦，说出来大伙帮忙想想法。
实验所用菌株为BL21，载体pMAL-p2X，与MBP融合表达，目的蛋白有三对二硫键。最初的设计思想是想通过MBP的信号肽实现可分泌表达，但实验发现主要是包涵体表达。
菌体超声破碎后12000rpm离心，所获得的沉淀不能很好的贴在离心管底，而是处于部分溶解状态，对沉淀再作如下处理：
1、2M尿素洗涤，pH8.5，12000rpm离心，获得的上清不是澄清透明而是略显混浊，这次的沉淀能够牢固的贴在管底。
2、4M尿素洗涤，pH9.0，12000rpm离心，获得的上清不是澄清透明而是略显混浊，这次的沉淀为半溶状态的冻状物。
3、8M尿素溶解上述2中的沉淀，几乎不见不溶的颗粒，但溶液还是略显混浊。
上述三溶液取样电泳，均见较多的目的蛋白。
对3中的溶液取样调pH至12溶液依然混浊。
0.22um过滤，无法去除混浊物。
考虑到混浊物是多聚体，样品中加入1％SDS和0.2％β-Me，都无法改善。
做上述处理，主要考虑到混浊物是目的蛋白，因为目的蛋白设计了6HIS但不能成功的结合Ni柱。
主要想请教这样几个问题：
1、有没有那位战友也碰上我上述的问题，这种问题是如何解决的？
2、我所描述的包涵体的状态说明了什么问题？
3、对与蛋白溶液混浊有什么好的处理方法？

暂不讨论分泌表达的问题。

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回答：
1. 你的情况很正常，根据三次沉淀处理情况，应该可以肯定你的蛋白在8M
Urea中是完全可以裂解的。并且该蛋白如若作复性应该可溶性较佳。但根据我个人的经验。如果MBP融合蛋白还是以包含体表达的话是很没有意思的，建议作单独表达，除非单独表达不行。否则即使完全复性，目的蛋白活性也大打折扣。另可优化表达条件，有可能可容表达的，不要放弃，你的破菌上清也可以跑胶看看有没有目的蛋白。
2. 说明蛋白蔬水性不强。
3。有些蛋白裂解后有浑浊非常正常，尤其是MBP融合的，即使做到可容也会有白乎乎浑浊的现象，只要不影响使用就行，没必要在意。

作者: xue258 时间: 2013-4-11 12:44

各位高手：
我原来在25-27度表达出可溶性蛋白，现在23、25、27度均是包涵体。现在，急着纯化，用包涵体（GST融合蛋白）复性纯化可以吗？怎样做？怎样保持目的蛋白的活性？
恳请赐教，先谢谢了

作者: ukonptp 时间: 2013-4-11 12:44

透析液总体积的50％？是不是在透析结束后往蛋白溶液里加甘油？

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不，是直接加在透析液里面。

作者: bongte 时间: 2013-4-11 12:45

不，是直接加在透析液里面。

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加这么多的甘油，我担心对PH的调配会不会有影响？

作者: mamamiya 时间: 2013-4-11 12:45

各位高手：
我原来在25-27度表达出可溶性蛋白，现在23、25、27度均是包涵体。现在，急着纯化，用包涵体（GST融合蛋白）复性纯化可以吗？怎样做？怎样保持目的蛋白的活性？
恳请赐教，先谢谢了！！！

==============================================================================================================

你这个问题好难回答，牵涉的问题太多。
建议你还是找找原因解决蛋白不可容表达的问题。
因为如果你真的要做复性，那首先必须将GST融合蛋白复性好了，该蛋白才能挂柱纯化，但即使如此也不能保证你的目的蛋白能复性好。何况一般情况下复性效率都很低，不超过30%
根据我的经验，如果蛋白GST融合后还包含体表达就一点意义都没有。
所以还是回去解决可容性的问题，这样比把大量时间花在复性上有意义的多。

作者: ukonptp 时间: 2013-4-11 12:45

加这么多的甘油，我担心对PH的调配会不会有影响？

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不要紧，加完甘油后再调PH值，没问题的，我们一直这么做，呵呵。

作者: guagua 时间: 2013-4-11 12:46

你这个问题好难回答，牵涉的问题太多。
建议你还是找找原因解决蛋白不可容表达的问题。
因为如果你真的要做复性，那首先必须将GST融合蛋白复性好了，该蛋白才能挂柱纯化，但即使如此也不能保证你的目的蛋白能复性好。何况一般情况下复性效率都很低，不超过30%
根据我的经验，如果蛋白GST融合后还包含体表达就一点意义都没有。
所以还是回去解决可容性的问题，这样比把大量时间花在复性上有意义的多。

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谢谢了，那我就继续找可容性表达的办法了！

作者: mamamiya 时间: 2013-4-11 12:47

请教大家
我用PQE载体构建的重组体转化了BL-21，已诱导出目的蛋白。打算用该蛋白建立ELISA法检测人群中的抗体。
下面打算纯化目的蛋白，已经购买了申能博彩的BBST NTA Resin
按照说明书的变性条件下从包涵体中纯化His Tag蛋白质方法纯化蛋白。
我的问题是根据我的试验目的，用该树脂纯化之后是否需要进行蛋白复性？
复性的方法是否就是用不同浓度梯度的尿素进行透析？具体该如何操作？
谢谢大家

作者: bongte 时间: 2013-4-11 12:47

我看了下以前大家的回帖，怎么PMSF是用水溶的？我是用无水乙醇溶的，100X的工作浓度，应该不会对透析复性有影响吧。还有这个液体配了以后，4度长期保存会有质量影响吗？

作者: ukonptp 时间: 2013-4-11 12:48

请教大家
我用PQE载体构建的重组体转化了BL-21，已诱导出目的蛋白。打算用该蛋白建立ELISA法检测人群中的抗体。
下面打算纯化目的蛋白，已经购买了申能博彩的BBST NTA Resin
按照说明书的变性条件下从包涵体中纯化His Tag蛋白质方法纯化蛋白。
我的问题是根据我的试验目的，用该树脂纯化之后是否需要进行蛋白复性？
复性的方法是否就是用不同浓度梯度的尿素进行透析？具体该如何操作？
谢谢大家

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首先说明一下，我没有用过你用的申能博彩的BBST NTA Resin，所以不太清楚，下面说说我的看法。

我想无论用什么taq纯化，在纯化之前包含体总是要溶解的，溶解包含体就必须使用变性剂，所以纯化出来的可溶性蛋白也一定是变性的，所以原则上就必须要复性。但是实际上复性究竟效果怎么样没有人知道，我想绝对不会达到变性之前的结构。

不建议使用尿素剃度，这个方法太麻烦了，几乎被淘汰了。可以使用不含尿素的TGE透析，方法较尿素剃度简化了很多，而且效果也很好。具体操作如下：
TGE配法如下：
50mM Tris
0.5mM EDTA
50mM Nacl
5%或10％甘油
如果有条件加入1％的甘氨酸或精氨酸和谷胱甘肽会更好些。调ph值7.9或8.0或其他，根据你的蛋白的等电点来确定，别离等电点太近，否则会出现大量沉淀，甚至目的蛋白全部沉掉，我最大ph用过9.0。

直接将待透析样品装入处理过的透析袋中放入500mlTGE中放入4度冰箱即可。每7、8小时换一次透析液，总透析时间从24－48小时不等。

以上仅供参考。

作者: ukonptp 时间: 2013-4-11 12:48

我看了下以前大家的回帖，怎么PMSF是用水溶的？我是用无水乙醇溶的，100X的工作浓度，应该不会对透析复性有影响吧。还有这个液体配了以后，4度长期保存会有质量影响吗？

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PMSF：
1）抑制丝氨酸蛋白酶（如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，凝血酶）和巯基蛋白酶（如木瓜蛋白酶）；
2）10mg/ml溶于异丙醇中；
3）在室温下可保存一年；
4）工作浓度：17-174ug/ml
（0.1-1.0mmol/L）
5）在水液体溶液中不稳定，必须在每一分离和纯化步骤中加入新鲜的PMSF。

转自汪家政－蛋白质技术手册

作者: mamamiya 时间: 2013-4-11 12:49

但是我还是有点不太明白。
根据该产品的说明书
样品制备好之后进行层析，步骤如下
2．层析
1）将NTA树脂装入合适的层析柱，层析用10倍NTA体积的NTA-0 Buffer洗。
2）将样品（步骤2）加到NTA层析柱中，流速控制在15 ml/h左右，收集穿透部分，用于SDS/PAGE 分析蛋白质的结合情况。
3）层析用5倍NTA体积的NTA-0 Buffer洗，流速控制在30ml/h左右。
4）分别用5倍NTA体积的NTA-20，NTA-40，NTA-60，NTA-80，NTA-100，NTA-200，NTA-1000 Buffer洗脱，流速控制在15ml/h左右，收集洗脱液，每管收集一个NTA体积。
5）确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。最为有效的方式是SDS-PAGE分析。也可以用BBST的Bradford蛋白质测定试剂盒，快速确定蛋白质的含量，然后用SDS-PAGE分析蛋白质的分布。
6）目标蛋白质是否需要进一步纯化应根据蛋白质的用途确定。纯化的目标蛋白质的保存条件需要根据蛋白质的性质和用途确定。
附溶液配方：
GuNTA-0 Buffer:
20 Mm Tris-HCL PH7.9,0.5M NaCl,10% Glycerol,8M 尿素
NTA-20 Buffer:
20 Mm Tris-HCL PH7.9,0.5M NaCl,10% Glycerol, 8M 尿素 20Mm Imidazole
NTA-40 Buffer:
20 Mm Tris-HCL PH7.9,0.5M NaCl,10% Glycerol, 8M 尿素 40Mm Imidazole
NTA-60 Buffer:
20 Mm Tris-HCL PH7.9,0.5M NaCl,10% Glycerol, 8M 尿素 60Mm Imidazole
NTA-100 Buffer:
20 Mm Tris-HCL PH7.9,0.5M NaCl,10% Glycerol, 8M 尿素 100Mm Imidazole
NTA-500 Buffer:
20 Mm Tris-HCL PH7.9,0.5M NaCl,10% Glycerol, 8M 尿素 500Mm Imidazole

因为洗脱液中有尿素，Tris-HCL, NaCl等盐类，用您所说的TGE透析，可以将它们除去吗？

作者: ukonptp 时间: 2013-4-11 12:49

QUOTE:

原帖由 mamamiya 于 2013-4-11 12:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
但是我还是有点不太明白。
根据该产品的说明书
样品制备好之后进行层析，步骤如下
2．层析
1）将NTA树脂装入合适的层析柱，层析用10倍NTA体积的NTA-0 Buffer洗。
2）将样品（步骤2）加到NTA层析柱中，流速控制在15 ml/h左右，收集穿透 ...

可以。

很多纯化柱都是根据咪唑梯度来洗的，我的也是，里面也有尿素，透析后不能完全除去，只是能上百倍的稀释。

因为尿素和咪唑都属于小分子物质，可以自由进出透析带，根据这个将其稀释掉。

作者: mamamiya 时间: 2013-4-11 12:50

非常感谢！
打算用您的方法试试，这样就可以大大的减轻工作量了。
还有想问一下，介绍这些蛋白质纯化方法包括透析有哪些书或资料可以参考？因为我们实验室以前没人做过这些，我想再仔细研究研究。谢谢

作者: bongte 时间: 2013-4-11 12:51

昨天做了添加50％甘油的透析工作，遇到两个问题。
1、电泳有明显的拖带
2、透析后发觉样品液体量减少很明显，估计这也应该是影响带型的原因吧。
希望帮忙解答下。

作者: ukonptp 时间: 2013-4-11 12:51

非常感谢！
打算用您的方法试试，这样就可以大大的减轻工作量了。
还有想问一下，介绍这些蛋白质纯化方法包括透析有哪些书或资料可以参考？因为我们实验室以前没人做过这些，我想再仔细研究研究。谢谢

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这个不好说了，我是在一本叫做从纯化到星辰的书上面看到的。

作者: ukonptp 时间: 2013-4-11 12:52

昨天做了添加50％甘油的透析工作，遇到两个问题。
1、电泳有明显的拖带
2、透析后发觉样品液体量减少很明显，估计这也应该是影响带型的原因吧。
希望帮忙解答下。

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能否发张图来看看拖带到底多明显？你的意思好像是甘油导致了拖带是吗？那不可能，甘油绝对不会导致拖带的，肯定是其他原因，但是我不知道，建议你去SDS讨论帖问一下。

样品有点减少是正常的，我每次做都是减少40%左右，你的又是大概减少了多少呢？透析带绑紧没有？？

作者: 天蝎座 时间: 2013-4-11 12:52

我预备用包涵体免疫小鼠,一共有三个方案:1:包涵体(未溶解)直接免疫2.用尿素溶解后跑胶然后切胶免疫3.将溶解后的包涵体复性再免疫.
问1:这样的方案是否可行.
问2:方案1中:洗涤并离心后的包涵体沉淀.我打算,用PBS先把沉淀充分悬浮,然后也佐剂混合,来免疫小鼠.不知道这样做可不可以?想知道各位老师是怎样做的.
盼复

作者: ukonptp 时间: 2013-4-11 12:53

预备用包涵体免疫小鼠,一共有三个方案:1:包涵体(未溶解)直接免疫2.用尿素溶解后跑胶然后切胶免疫3.将溶解后的包涵体复性再免疫.
问1:这样的方案是否可行.
问2:方案1中:洗涤并离心后的包涵体沉淀.我打算,用PBS先把沉淀充分悬浮,然后也佐剂混合,来免疫小鼠.不知道这样做可不可以?想知道各位老师是怎样做的.
盼复

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回1：可行。我是做过你的方案1和3，没有做过切胶免疫，老板不让。而是做的包涵体直接溶解后没有复性的蛋白去免疫小鼠。

回2：可以。但是要注意量的问题，因为包涵体里面的蛋白浓度是很大的。如果免疫剂量太大的话，可能对动物产生影响，如发热等。但是对于效价有无影响我不知道。

作者: 天蝎座 时间: 2013-4-11 12:54

,还有问题
请教各位老师:
我溶解包涵体的溶液:我的包涵体是在含8mol/L尿素的缓冲液A（50mmol/LTris-HCI；50mmo/L NaCl; 0.5mmol/LEDTA;甘油5%）溶解的。
我的溶解蛋白是在加有1％的甘氨酸的2000ml缓冲液A（50mmol/LTris-HCI；50mmo/L NaCl; 0.5mmol/LEDTA;甘油5%,ph值7.0）中进行透析复性的。

问题1：我现在还不知道这样做复性是否成功。所以请问；这样的溶解液和这样的复性液是否是正确的搭配？有更好的搭配吗？
问题2：若按照我上一帖提出的方案二“将溶解后的包涵体跑SDS-PAGE胶做切胶免疫”,在跑胶前是否有必要把溶解的包涵体也透析一下(降低尿素的浓度)?
问题3：若按照我上一帖提出的方案三“复性的包涵体免疫”，在我用的这样的缓冲液内透析复性，是不是只要调好PH值保证我的蛋白样品不沉淀，就可以把透析复性袋中的蛋白溶液直接混合佐剂免疫老鼠了？
谢谢，请指教。

作者: ukonptp 时间: 2013-4-11 12:54

QUOTE:

原帖由 天蝎座 于 2013-4-11 12:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
,还有问题
请教各位老师:
我溶解包涵体的溶液:我的包涵体是在含8mol/L尿素的缓冲液A（50mmol/LTris-HCI；50mmo/L NaCl; 0.5mmol/LEDTA;甘油5%）溶解的。
我的溶解蛋白是在加有1％的甘氨酸的2000ml缓冲液A（50mmol/LTris-HCI；50m ...

我的8M的尿素配方是这样的：

urea：8M
Nacl：0.5M
Na2po4：20mM
nah2po4 ：20mM
调PH值至7.4
我的透析体系是这样的:
50mM Tris
0.5mM EDTA
50mM Nacl
5%或10％甘油
如果有条件加入1％的甘氨酸或精氨酸和谷胱甘肽。
不知道你的包涵体溶解后还要不要纯化了，如果是的话，我觉得里面那个edta可能不太好，因为它可以影响蛋白与镍柱的结合。
复性跑胶后蛋白依然是变性的，所以切胶只能是切胶后复性或是不复性了。
透析前是要确定你的目的蛋白的等电点然后决定透析液的ph，以尽量避免目的蛋白发生沉淀。

作者: qqq111 时间: 2013-4-11 12:54

我之前就是用切胶纯化的包涵体蛋白以及尿素溶着的包涵体免疫的小鼠，3免完了7天采血作ELISA（用切胶回收的蛋白包被的板子，血清只做到了1：80的稀释），测值后发现，只打了纯佐剂的小鼠和免疫（蛋白加佐剂）小鼠，OD值竟然差不多，平均都在2.7以上，什么都没免疫的小鼠血清OD值也在1.2左右。
请问各位，是不是我的ELISA作的有问题，还是血清稀释度不够，佐剂免疫小鼠的血清怎么会和我切胶回收的包涵体蛋白结合呢？我现在觉得做了 1个多月的免疫好像又失败了，真的好痛苦啊，请大家帮忙分析一下吧~~
ps:虽然此帖不属于纯化复性，但是因为楼主说做过包涵体免疫，所以就把帖子发在这里了。先谢谢了~

作者: ukonptp 时间: 2013-4-11 12:55

QUOTE:

原帖由 qqq111 于 2013-4-11 12:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我之前就是用切胶纯化的包涵体蛋白以及尿素溶着的包涵体免疫的小鼠，3免完了7天采血作ELISA（用切胶回收的蛋白包被的板子，血清只做到了1：80的稀释），测值后发现，只打了纯佐剂的小鼠和免疫（蛋白加佐剂）小鼠，OD值竟然差不多，平均 ...

你这个问题我思考了很久，但是没有得出答案。

我想问一下你的蛋白是什么？因为我能想出的唯一的可能性就是因为完全佐剂加有灭活的分枝杆菌(如卡介苗)或棒状杆菌，会不会跟你的蛋白结合呢？其余的原因我真的想不出，理论上是不可能的，再有就是交叉污染了。不好意思。

作者: mamamiya 时间: 2013-4-11 12:55

1. 什么都没免疫的小鼠血清OD值也在1.2左右，光从这点就可以看出你的ELISA是有问题的，本底太高。先解决你这个检测手段的问题。
2。只打了纯佐剂的小鼠和免疫（蛋白加佐剂）小鼠，OD值竟然差不多。从这点又可以看出，你的免疫是完全失败的。你应该从根本入手，解决你的蛋白的活性问题。基于你已作过切胶纯化的包涵体蛋白以及尿素溶着的包涵体免疫的实验（我一直对这种方法保留意见）。那么不妨尝试一下复性后免疫。
祝顺利。

作者: XYZQ 时间: 2013-4-11 12:55

请教一下：我现在用的是大肠杆菌表达体系，理论上应该得到RNaseA的包涵体，我现在应该用什么方式得到包涵体的粗提物呢？超声波还是溶菌酶？另外，经过洗涤得到的沉淀能否进行电泳分析？如果可以的话，用什么溶液进行溶解呢？谢谢

作者: youyou99 时间: 2013-4-11 12:56

如果用您介绍的透析体系（50mM Tris，0.5mM EDTA，50mM Nacl，5%或10％甘油）透析，但我还想将蛋白浓缩，有什么简单的办法？我试用了millipore的超滤柱，但离心时间要很长（可能是甘油的原因）。
另外，我提纯蛋白的PI一个是5.48，一个是6.68，透析液的ph最好调整到多少？我提纯的蛋白也是用来作抗原供检测用。

作者: ukonptp 时间: 2013-4-11 12:57

请教一下：我现在用的是大肠杆菌表达体系，理论上应该得到RNaseA的包涵体，我现在应该用什么方式得到包涵体的粗提物呢？超声波还是溶菌酶？另外，经过洗涤得到的沉淀能否进行电泳分析？如果可以的话，用什么溶液进行溶解呢？谢谢

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用什么方式得到包涵体的粗提物：反复冻融加超声破菌

经过洗涤得到的沉淀能否进行电泳分析：是的

用什么溶液进行溶解呢：8M尿素

作者: ukonptp 时间: 2013-4-11 12:57

如果用您介绍的透析体系（50mM Tris，0.5mM EDTA，50mM Nacl，5%或10％甘油）透析，但我还想将蛋白浓缩，有什么简单的办法？我试用了millipore的超滤柱，但离心时间要很长（可能是甘油的原因）。
另外，我提纯蛋白的PI一个是5.48，一个是6.68，透析液的ph最好调整到多少？我提纯的蛋白也是用来作抗原供检测用。

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ph值可以调成8.0和8.5两种，然后都透析看效果。

我一直使用的浓缩方法就是PEG包埋，简单实用。

作者: ukonptp 时间: 2013-4-11 12:57

用什么方式得到包涵体的粗提物：

收集湿菌体后，按每克湿菌体加入8mlPBS重悬湿菌体，然后反复冻融（-80度/40min，37度/10min）。反复冻融三四次后，进行超声裂菌，不同的表达体系超声强度不同，我的是PQE30/BL21，超声强度，每100ml 离心后得到的菌体进行300w/150次。

超声结束后分别用洗涤液1和2进行洗涤（洗涤液配方在本帖前面可以找得到）。

之后用8M的尿素4度溶解过夜（8M尿素配方见本贴前面）。

然后离心后取上清。

各段得到的样品都要跑胶以确定蛋白的存在形式。

作者: tianmei001 时间: 2013-4-11 12:58

请教各位战友,我想在NI柱上进行蛋白复性,想用尿素浓度渐低的方法.
最后是尿素浓度为0,再用咪唑把蛋白洗下来.
但是听前面战友说Elution buffer中没有加入尿素,蛋白质洗不下来(不知道理解错误没) ,那么这种在的Elution buffer还是必须加尿素,这样是不是蛋白又变性了?
那么这种方法可以用于蛋白复性吗?是不是或者最后在Elution buffer加入比较低的尿素也行.
谢谢各位!

作者: windy+++ 时间: 2013-4-11 12:58

我们实验室有人试过，没有尿素的情况下用高浓度的咪唑能洗下来的
文献也有很多相关报道
但是提醒，第浓度的尿素有利于复性的，不要直接到0

作者: ukonptp 时间: 2013-4-11 12:59

请教各位战友,我想在NI柱上进行蛋白复性,想用尿素浓度渐低的方法.
最后是尿素浓度为0,再用咪唑把蛋白洗下来.
但是听前面战友说Elution buffer中没有加入尿素,蛋白质洗不下来(不知道理解错误没) ,那么这种在的Elution buffer还是必须加尿素,这样是不是蛋白又变性了?
那么这种方法可以用于蛋白复性吗?是不是或者最后在Elution buffer加入比较低的尿素也行.
谢谢各位!

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这是柱上纯化复性的方法，优点是相对工作量较小。洗脱的决定性因素是咪唑而不是尿素，所以用高浓度的咪唑也能洗脱目的蛋白。但是这种方法的缺点就是洗脱液里面含有咪唑，所以在使用之前还是要想办法把咪唑去掉，也就是透析，也是个复性的过程，所以洗脱的时候有尿素没什么关系，在透析的过程中会一并去除的，而这样的工作量比柱上复性的工作量还小些。

我做的时候没有按尿素剃度做，而是把不同的咪唑溶解在8M的尿素里，然后洗脱后在透析，即复性又去除尿素咪唑以及小分子杂蛋白。

作者: gmjghh 时间: 2013-4-11 12:59

我的蛋白大约是14k,等电点10.3,包含体提取,复性是纯度接近70%,复性后过CM Sepharose FF,用PH6.0的磷酸缓冲液做平衡,没见蛋白交换上,会是什么原因呢?有没有别的交换方法?交换不上会不会与复性条件不好有关呢?

作者: mamamiya 时间: 2013-4-11 13:00

我的蛋白大约是14k,等电点10.3,包含体提取,复性是纯度接近70%,复性后过CM Sepharose FF,用PH6.0的磷酸缓冲液做平衡,没见蛋白交换上,会是什么原因呢?有没有别的交换方法?交换不上会不会与复性条件不好有关呢?

=============================================================================================================

有几个原因：
1。等电点10.3是用软件算的吧，如果是那样，只能作参考用，也就是说不一定非要用阳离子交换，可换用阴离子，也有些蛋白是什么离子柱都不挂的，不要苛求。
2。蛋白没复性好。
3。样品中盐离子浓度过高，导致流穿，即挂不上柱。

作者: standbyme 时间: 2013-4-11 13:00

我的蛋白大约是14k,等电点10.3,包含体提取,复性是纯度接近70%,复性后过CM Sepharose FF,用PH6.0的磷酸缓冲液做平衡,没见蛋白交换上,会是什么原因呢?有没有别的交换方法?交换不上会不会与复性条件不好有关呢?

有几个原因：
1。等电点10.3是用软件算的吧，如果是那样，只能作参考用，也就是说不一定非要用阳离子交换，可换用阴离子，也有些蛋白是什么离子柱都不挂的，不要苛求。
2。蛋白没复性好。
3。样品中盐离子浓度过高，导致流穿，即挂不上柱。

基本上赞同上面兄弟的意见，顺便问一句，你是怎么判断没挂柱的？？？

作者: standbyme 时间: 2013-4-11 13:01

请教一下：我现在用的是大肠杆菌表达体系，理论上应该得到RNaseA的包涵体，我现在应该用什么方式得到包涵体的粗提物呢？超声波还是溶菌酶？另外，经过洗涤得到的沉淀能否进行电泳分析？如果可以的话，用什么溶液进行溶解呢？谢谢

用什么方式得到包涵体的粗提物：反复冻融加超声破菌

经过洗涤得到的沉淀能否进行电泳分析：是的

用什么溶液进行溶解呢：8M尿素

我们单位的也有大肠杆菌表达的包含体，我反复冻融后镜检发现菌体仍旧是完整的菌体形态，没有破碎！超声后菌体破碎。
8M尿素可以溶解包含体蛋白，但进一步纯化比较麻烦，只试用于实验室提取，建议换用别的方法变性复性。

作者: hot_hot_hot 时间: 2013-4-11 13:01

8M尿素纯化后的蛋白可以直接用使用不含尿素的TGE透析复性吗？我的蛋白等电点为8.8，应调节PH值为多少？加入甘氨酸和精氨酸会对后续的实验有影响吗（用于细胞实验的）？如果没有二硫键就不需要用谷胱甘肽了吧？透析前对蛋白的浓度要求是？问题很多，不要见怪，呵呵。

作者: ukonptp 时间: 2013-4-11 13:02

8M尿素纯化后的蛋白可以直接用使用不含尿素的TGE透析复性吗？我的蛋白等电点为8.8，应调节PH值为多少？加入甘氨酸和精氨酸会对后续的实验有影响吗（用于细胞实验的）？如果没有二硫键就不需要用谷胱甘肽了吧？透析前对蛋白的浓度要求是？问题很多，不要见怪，呵呵。

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8M尿素纯化后的蛋白可以直接用使用不含尿素的TGE透析复性吗？
可以
我的蛋白等电点为8.8，应调节PH值为多少？
如果我是你，我就一次调两个PH值，一个9.0，另一个7.9，看效果。
加入甘氨酸和精氨酸会对后续的实验有影响吗（用于细胞实验的）？
我觉得应该没有
如果没有二硫键就不需要用谷胱甘肽了吧？
有条件就加吧，实验是很难预料什么结果的。
透析前对蛋白的浓度要求是？
不要太大，透析前最好先用TGE稀释一倍后再行透析。

FOR YOUR REFERENCE ONLY

作者: duoduo 时间: 2013-4-11 13:02

20mM咪唑浓度洗脱他的浓度肯定低了．．一般用３００mM基本能全下来，，至少也要１００mM，，，大多填料是这样

作者: XYZQ 时间: 2013-4-11 13:03

本人用变性法（8M尿素）裂解1mM IPTG诱导（30度）的细菌DE3（转化带有目的蛋白基因的pET-28a载体），获得裂解液，上Ni-NTA Agarose柱（QIAGEN），参照QIAGEN的操作说明，最后用含8M尿素的缓冲液E洗脱下带His标签的目的蛋白（融合蛋白分子量为17kD左右），现需获取纯化蛋白制备单克隆抗体。现请教：1、蛋白溶液中含如此高浓度的尿素，会不会对抗体的制备造成不利影响？2、若要去除其中的尿素，哪种方法比较有效、简便，是透析还是用G-25柱过滤，还是用其他办法？3、能否指点一下用于单克隆抗体制备的抗原获取和纯化，越详细越好，请不吝赐教，多谢多谢！

作者: XYZQ 时间: 2013-4-11 13:04

请问：什么是TGE？能否告知用TGE透析复性尿素纯化蛋白的具体方法？我的带His标签的融合蛋白分子量为17kD左右，能否用透析的方法复性？透析袋的最小孔径是不是12kD，17kD的蛋白会不会被透过去？在透析液中加入的谷胱甘肽的浓度为多少？TGE透析前蛋白的浓度不要太大，请问这是指在多大的浓度范围之内？以上问题较为幼稚，我是新手，有很多不懂的地方，老板又催的紧，着急，请各位大虾不吝赐教，在此谢过！

作者: ukonptp 时间: 2013-4-11 13:04

请问：什么是TGE？能否告知用TGE透析复性尿素纯化蛋白的具体方法？我的带His标签的融合蛋白分子量为17kD左右，能否用透析的方法复性？透析袋的最小孔径是不是12kD，17kD的蛋白会不会被透过去？在透析液中加入的谷胱甘肽的浓度为多少？TGE透析前蛋白的浓度不要太大，请问这是指在多大的浓度范围之内？以上问题较为幼稚，我是新手，有很多不懂的地方，老板又催的紧，着急，请各位大虾不吝赐教，在此谢过！

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什么是TGE？

TGE是复性液的一种。TGE配法如下：
50mM Tris
0.5mM EDTA
50mM Nacl
5%或10％甘油
如果有条件加入1％的甘氨酸或精氨酸和谷胱甘肽会更好些。调ph值7.9或8.0或其他，根据你的蛋白的等电点来确定，别离等电点太近，否则会出现大量沉淀，甚至目的蛋白全部沉掉，我最大ph用过9.0。

能否告知用TGE透析复性尿素纯化蛋白的具体方法？

直接将待透析样品装入处理过的透析袋中放入500mlTGE中放入4度冰箱即可。每7、8小时换一次透析液，总透析时间从24－48小时不等。

我的带His标签的融合蛋白分子量为17kD左右，能否用透析的方法复性？

可以

透析袋的最小孔径是不是12kD，17kD的蛋白会不会被透过去？

不会

在透析液中加入的谷胱甘肽的浓度为多少？

氧化型：0.05mM 还原型：0.5mM

TGE透析前蛋白的浓度不要太大，请问这是指在多大的浓度范围之内？

我觉得最好不要超过3000ug/ml

以上仅供参考。

作者: XYZQ 时间: 2013-4-11 13:05

请问经TGE透析复性后的蛋白如何检测其复性效率？曾在园中的文章中看到可用非变性的凝胶电泳检测，但没有具体的方法，能否请您介绍一下，以及如何判断结果。另外请问在初次TGE透析复性前，我的蛋白已经经过了Ni-NTA柱的纯化，是不是意味着这样透析后的蛋白经PEG浓缩后可以直接免疫小鼠进行单克隆抗体的制备？若不能的话，我打算先将蛋白作凝胶电泳，KCl染色后切胶，电洗脱后再免疫，这样作可以吗？还是必须要用其他的方法，譬如离子交换？不太清楚电洗脱的条件和方法，也希望您能详细指导一下。还有浓缩后的蛋白作凝胶电泳后再被洗脱下来时是不是已经又被变性了？还能不能免疫小鼠，和作为日后检测抗体效价的抗原？若是那样的话，应该怎么办？是否还要经过TGE的透析复性？还有我的蛋白等电点为8.95，请问TGE透析液的pH为多少比较合适，7.9可以吗？问题多多，不好意思。比较着急，请于百忙中不吝赐教，谢谢！

作者: lixi559 时间: 2013-4-11 13:05

加裂解液后体积太小，也只能用Microtip的探头，超声实际工作时间5分钟差不多，你可以观察菌液的状态，通常变得不黏稠并且有澄清状就可以了

作者: ukonptp 时间: 2013-4-11 13:06

请问经TGE透析复性后的蛋白如何检测其复性效率？曾在园中的文章中看到可用非变性的凝胶电泳检测，但没有具体的方法，能否请您介绍一下，以及如何判断结果。另外请问在初次TGE透析复性前，我的蛋白已经经过了Ni-NTA柱的纯化，是不是意味着这样透析后的蛋白经PEG浓缩后可以直接免疫小鼠进行单克隆抗体的制备？若不能的话，我打算先将蛋白作凝胶电泳，KCl染色后切胶，电洗脱后再免疫，这样作可以吗？还是必须要用其他的方法，譬如离子交换？不太清楚电洗脱的条件和方法，也希望您能详细指导一下。还有浓缩后的蛋白作凝胶电泳后再被洗脱下来时是不是已经又被变性了？还能不能免疫小鼠，和作为日后检测抗体效价的抗原？若是那样的话，应该怎么办？是否还要经过TGE的透析复性？还有我的蛋白等电点为8.95，请问TGE透析液的pH为多少比较合适，7.9可以吗？再问一个有关超声裂解的问题，100ml细菌培养物离心后约0.6克湿重，加1.5ml裂解液后超声裂解，请问用多大功率，多长时间才能完全裂解？我们的超声波机的最大功率600瓦，Microtip limit 为30％。问题多多，不好意思。比较着急，请于百忙中不吝赐教，谢谢！

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如何检测其复性效率我不知道，没做过。

透析复性后可以直接测定蛋白浓度然后按规定的抗原剂量免疫小鼠。不太赞成用切胶免疫的方法，单抗本身就很难发文章，如果把蛋白纯化再改成切胶这种没有一点技术含量的方法恐怕就更难了。当然切胶免疫也可以。

电洗脱你自己在园子里面找找吧，关于这方面的东西有很多，我记得好象是蛋白版里就有一个这方面的精华帖。

透析液的pH原则上面7.9可以，但是为了节省时间我建议你一次多试验几个不同的PH值，比如说7.9、8.5、9.2等等，这样会更快的确定最佳PH值。

超声裂解的方法我的和你的有些不同，我是先超声然后再加裂解液溶解过夜的，而你的是先裂解后超声，我没那样做过。我超声的条件是300W/150次，每次间隔10S。超声的条件要根据你的表达系统来确定，尤其是表达菌的种类，就是这种表达菌能承受超声的能力怎么样，我的表达菌是BL21。

FOR YOUR REFERENCE ONLY

作者: u234 时间: 2013-4-11 13:06

请问经TGE透析复性后的蛋白如何检测其复性效率
？

曾在园中的文章中看到可用非变性的凝胶电泳检测，但没有具体的方法，能否请您介绍一下，以及如何判断结果。另外请问在初次TGE透析复性前，我的蛋白已经经过了Ni-NTA柱的纯化，是不是意味着这样透析后的蛋白经PEG浓缩后可以直接免疫小鼠进行单克隆抗体的制备？若不能的话，我打算先将蛋白作凝胶电泳，KCl染色后切胶，电洗脱后再免疫，这样作可以吗？还是必须要用其他的方法，譬如离子交换？不太清楚电洗脱的条件和方法，也希望您能详细指导一下。

还有浓缩后的蛋白作凝胶电泳后再被洗脱下来时是不是已经又被变性了？还能不能免疫小鼠，和作为日后检测抗体效价的抗原？若是那样的话，应该怎么办？是否还要经过TGE的透析复性？还有我的蛋白等电点为8.95，请问TGE透析液的pH为多少比较合适，7.9可以吗？再问一个有关超声裂解的问题，100ml细菌培养物离心后约0.6克湿重，加1.5ml裂解液后超声裂解，请问用多大功率，多长时间才能完全裂解？我们的超声波机的最大功率600瓦，Microtip limit 为30％。问题多多，不好意思。比较着急，请于百忙中不吝赐教，谢谢！

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复性效率的检测主要是通过活性的检测进行。利用非变性凝胶电泳不是很科学，因为无法判断蛋白复性后立体结构的正确性，这会影响抗体制备实验。电洗脱法太麻烦了，而且没有办法保证蛋白结构，转移过程可能引起蛋白结构的改变，通常的思路是先进行复性，再用亲和柱纯化。超声波破碎细胞的条件文献报道较多，大致选一个即可。

作者: xyw5 时间: 2013-4-11 13:07

非常感谢您的指导。我的宿主菌也是BL21，表达载体为pET28。我会按照您的方法做。谢谢！

作者: huifeng0516 时间: 2013-4-11 13:07

请教一问题:
我的蛋白以包涵体形式表达,之前我做了包涵体洗涤,8M尿素变性后过柱(Ni-his),但是把柱子堵了,之后将变形蛋白做透析复性,又全部形成沉淀.很着急.现在想用没有过柱纯化的包涵体变性液来免疫大鼠,跑胶显示:杂蛋白条带很多,但量不大,目的蛋白占绝大部分.请问:
1. 这样免疫可以吗?
2.我是要获得大鼠的免疫血清来做免疫组化的,这种变性蛋白免疫获得的抗体对做免疫组化有效吗?
3.这种不纯的变性蛋白(蛋白是在大肠杆菌中表达的)可以用来做ELISA检测病人血清吗?(蛋白是要做诊断用的)
盼回复!谢谢!

作者: okhaha 时间: 2013-4-11 13:07

我也刚开始做单抗。pet28a载体 BL21表达出包涵体蛋白，用6M盐酸胍（还包括20mM Tris-Hcl, 0.5M Nacl, 10%甘油）可以溶解。然后通过Ni-NTA亲和层析的方法进行纯化。但对于透析复性还不是很熟。我采用的复性缓冲液配方为20mM Tris-Hcl, 0.5M Nacl, 10%甘油，和4M, 2M,1M, 0M梯度浓度的盐酸胍。每12小时更换低浓度的复性液。但是在2M盐酸胍到1M盐酸胍时就会出现蛋白沉淀。原来的蛋白溶液不是很浓，0.3mg/ml左右吧。我看过有人说降低蛋白浓度，于是在2M复性时，我又用2M复性液对倍稀释了我的蛋白，可是在1M中仍有沉淀析出。请问怎样才能消除蛋白沉淀呢？我要用我的蛋白来免疫小鼠，如果我就用此盐酸胍浓度的蛋白来免疫小鼠可行吗？谢谢赐教。

作者: ukonptp 时间: 2013-4-11 13:08

请教一问题:
我的蛋白以包涵体形式表达,之前我做了包涵体洗涤,8M尿素变性后过柱(Ni-his),但是把柱子堵了,之后将变形蛋白做透析复性,又全部形成沉淀.很着急.现在想用没有过柱纯化的包涵体变性液来免疫大鼠,跑胶显示:杂蛋白条带很多,但量不大,目的蛋白占绝大部分.请问:
1. 这样免疫可以吗?
2.我是要获得大鼠的免疫血清来做免疫组化的,这种变性蛋白免疫获得的抗体对做免疫组化有效吗?
3.这种不纯的变性蛋白(蛋白是在大肠杆菌中表达的)可以用来做ELISA检测病人血清吗?(蛋白是要做诊断用的)
盼回复!谢谢!

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这种蛋白对于做ELISA检测来说就可以，但是如果说是免疫组化可能不好说了。

作者: ukonptp 时间: 2013-4-11 13:08

我也刚开始做单抗。pet28a载体 BL21表达出包涵体蛋白，用6M盐酸胍（还包括20mM Tris-Hcl, 0.5M Nacl, 10%甘油）可以溶解。然后通过Ni-NTA亲和层析的方法进行纯化。但对于透析复性还不是很熟。我采用的复性缓冲液配方为20mM Tris-Hcl, 0.5M Nacl, 10%甘油，和4M, 2M,1M, 0M梯度浓度的盐酸胍。每12小时更换低浓度的复性液。但是在2M盐酸胍到1M盐酸胍时就会出现蛋白沉淀。原来的蛋白溶液不是很浓，0.3mg/ml左右吧。我看过有人说降低蛋白浓度，于是在2M复性时，我又用2M复性液对倍稀释了我的蛋白，可是在1M中仍有沉淀析出。请问怎样才能消除蛋白沉淀呢？我要用我的蛋白来免疫小鼠，如果我就用此盐酸胍浓度的蛋白来免疫小鼠可行吗？谢谢赐教。

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首先说这种蛋白免疫小鼠做单抗可以，我做出来过。但是蛋白复性再怎么说也是一门技术，还是掌握了好。复性时有很多影响条件，没有其他办法，只能时一个一个的试验，最后确定最佳复性条件。

作者: cj_mondy 时间: 2013-4-11 13:09

请教：我是用PET-HIS表达蛋白和纯化的，目的蛋白分子量大小为42KD.我是在31° 1mmol/L的IPTG诱导下表达的。表达后蛋白存在于包涵体中。我用6M尿素变性后蛋白都溶解了，然后0.45um过滤后上柱，上柱时发现有结晶析出，好奇怪啊！！我的bingding buffer里也加了6M的尿素了，Elution buffer中没加，20mM咪唑浓度洗脱的，结果什么都没有。是不是我的Elution buffer中没加尿素的缘故？还有说明书上说柱中含有尿素的话低咪唑浓度就可以洗脱了，我的咪唑浓度还需要提高吗？那位战友帮帮我啊。急！谢谢！！！！

作者: cj_mondy 时间: 2013-4-11 13:09

最近在做GST融合蛋白的纯化，由于目的蛋白主要存在于包涵体中，我的目的蛋白结合GST后为75KD，我按照分子克隆书上做并有GST.BIND KIT试剂，可一直没结果，请问有没有更好或更成熟的方法？

作者: ukonptp 时间: 2013-4-11 13:10

请教：我是用PET-HIS表达蛋白和纯化的，目的蛋白分子量大小为42KD.我是在31° 1mmol/L的IPTG诱导下表达的。表达后蛋白存在于包涵体中。我用6M尿素变性后蛋白都溶解了，然后0.45um过滤后上柱，上柱时发现有结晶析出，好奇怪啊！！我的bingding buffer里也加了6M的尿素了，Elution buffer中没加，20mM咪唑浓度洗脱的，结果什么都没有。是不是我的Elution buffer中没加尿素的缘故？还有说明书上说柱中含有尿素的话低咪唑浓度就可以洗脱了，我的咪唑浓度还需要提高吗？那位战友帮帮我啊。急！谢谢！！！！

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Elution buffer要加urea

20mM不行，你要尝试从20mM到500mM最后确定最佳洗脱浓度。

作者: eric930 时间: 2013-4-11 13:11

相关疾病：
头痛

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请教：我是用PET-HIS表达蛋白和纯化的，目的蛋白分子量大小为42KD.我是在31° 1mmol/L的IPTG诱导下表达的。表达后蛋白存在于包涵体中。我用6M尿素变性后蛋白都溶解了，然后0.45um过滤后上柱，上柱时发现有结晶析出，好奇怪啊！！我的bingding buffer里也加了6M的尿素了，Elution buffer中没加，20mM咪唑浓度洗脱的，结果什么都没有。是不是我的Elution buffer中没加尿素的缘故？还有说明书上说柱中含有尿素的话低咪唑浓度就可以洗脱了，我的咪唑浓度还需要提高吗？那位战友帮帮我啊。急！谢谢！！！！

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我的蛋白过柱也遭遇你这种情况，而且我的结合液和洗脱液都已经加了6M尿素了，蛋白上柱前已经把浓度稀释到0.8mg/ml，结果还是把柱子堵了，我重悬树脂时发现树脂已经结成一团一团的，我分析蛋白可能是在柱内形成沉淀了。后来加8M尿素于树脂上，重悬，蛋白有部分溶解。但是效果还是不好，洗不下来。我现在也头痛。
你的洗脱液要加尿素，这样蛋白才不致柱内沉淀。洗脱时你可以摸个咪唑浓度梯度洗脱，一般100－300mM咪唑能够洗下来。

作者: 桔囿 时间: 2013-4-11 13:12

我有个问题想请教大家：
在《分子克隆》书上说，包涵体经过超声波粗提以后，用0.5M,1M,2M,4M,5M的尿素对其进行洗涤，然后分别对上清和沉淀跑SDS-PAGE，决定哪个浓度梯度最适合,请问什么样的结果是最理想的?(请别见笑,第一次做,很多不懂)还有请问有没有可能在4M的尿素溶液中，上清和沉淀均有我的目的蛋白，如果有，怎么办呢,是不是可以直接用上清来过柱就行了,沉淀可以扔了？

作者: mamamiya 时间: 2013-4-11 13:12

一般情况下是用1M或高至2M的尿素来洗涤就行了，这个帖子里楼主早就总结了，配方拿来用就OK的。
洗涤的结果以包含体够纯，但又损失不多为目标（这个真的很难量化，只能凭经验）。但是要知道，无论用几M的尿素洗，目的蛋白都会损失，只是多少的问题罢了。
如果4M的尿素溶液中，上清和沉淀均有我的目的蛋白（特别是在量都比较多的情况下），我会降低洗涤尿素的浓度，因为洗涤过程中一般不会允许有太多目的蛋白损失。洗涤过程中洗涤液一般都是弃掉的，最后保留的是包含体沉淀。请不要将包含体的洗涤跟后续的纯化混淆了。

作者: 桔囿 时间: 2013-4-11 13:13

请教大家一个问题：
我表达的一个蛋白是包涵体，我想把包涵体溶解后过Ni柱纯化，然后免疫兔子做western 蛋白验证，复性蛋白的步骤要求不高。
处理包涵体时用的细胞裂解液[50mM Tris-HCl(pH8.5~9.0), 2mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% Triton X-100]含有EDTA，溶解包涵体的溶液也有EDTA，这种螯合剂会把Ni从树脂上带下来。
请问我怎么把EDTA去除呢？去除后过Ni柱时，我希望体积不会增加很多。
请问在裂解液中，我不加EDTA，是不是也可以呢？
请各位战友帮我想想办法。谢谢

作者: mamamiya 时间: 2013-4-11 13:13

最省的办法就是不加EDTA，一般情况下是不会有什么影响的（有一种特殊情况我这就不说了）。如果你实在不放心，可以透析或脱盐加EDTA除去。

作者: 速冻虾米 时间: 2013-4-11 13:14

相关疾病：
头痛
虽然看了大家的经验介绍对包涵体变性复性有了一定的了解，可是具体操作过程当中还是遇到了不少麻烦，周围又没人做过，只好到园子里来请教各位高手了，还请各位高手不吝赐教！

本人表达的是GST融合蛋白，形成了包涵体。
大家都知道稀释复性后样品体积很大，而且蛋白浓度也比较低，这样上亲和层析柱纯化不仅费事（上柱体积太大），而且效率也比较低。
不知在上柱前可否先进行蛋白浓缩处理？那么选择什么样的蛋白浓缩方法比较好呢？(NH4)2SO4沉淀？PEG沉淀？丙酮沉淀？还是透析或超滤？
我用PEG6000干粉包埋透析袋的方法（从园子里学到的）试了试，体积倒是缩了不少，可是出现了很多沉淀，离心后上清里什么蛋白都没有，全到沉淀里去了，而且沉淀还不可溶，这岂不是又回到原点了吗？真头疼！是不是还要进行一次溶解再复性呢？
另外稀释复性后变性剂（尿素）的浓度已经很低了（约0.8M），还需要通过透析把它给完全除掉吗？因为我看到很多站友都是稀释复性和透析复性并用的。但是尿素在2M以下不就属于非变性范围了吗？难道0.8M都不行吗？是不是对后续操作如上柱纯化会有影响呢？
还有一点疑虑：用PEG6000干粉包埋透析袋的方法进行蛋白浓缩的时候尿素是不是随着其他液体一起透出去了呢？（如果没透出去的话岂不是把变性剂也给浓缩了，那就适得其反了）而PEG会不会透进来呢？PEG的分子量大小要不要跟透析袋的截留分子量大小进行比较，最好要比截留的大呢？

作者: mamamiya 时间: 2013-4-11 13:14

虽然看了大家的经验介绍对包涵体变性复性有了一定的了解，可是具体操作过程当中还是遇到了不少麻烦，周围又没人做过，只好到园子里来请教各位高手了，还请各位高手不吝赐教！

本人表达的是GST融合蛋白，形成了包涵体。
大家都知道稀释复性后样品体积很大，而且蛋白浓度也比较低，这样上亲和层析柱纯化不仅费事（上柱体积太大），而且效率也比较低。
不知在上柱前可否先进行蛋白浓缩处理？那么选择什么样的蛋白浓缩方法比较好呢？(NH4)2SO4沉淀？PEG沉淀？丙酮沉淀？还是透析或超滤？
我用PEG6000干粉包埋透析袋的方法（从园子里学到的）试了试，体积倒是缩了不少，可是出现了很多沉淀，离心后上清里什么蛋白都没有，全到沉淀里去了，而且沉淀还不可溶，这岂不是又回到原点了吗？真头疼！是不是还要进行一次溶解再复性呢？
另外稀释复性后变性剂（尿素）的浓度已经很低了（约0.8M），还需要通过透析把它给完全除掉吗？因为我看到很多站友都是稀释复性和透析复性并用的。但是尿素在2M以下不就属于非变性范围了吗？难道0.8M都不行吗？是不是对后续操作如上柱纯化会有影响呢？
还有一点疑虑：用PEG6000干粉包埋透析袋的方法进行蛋白浓缩的时候尿素是不是随着其他液体一起透出去了呢？（如果没透出去的话岂不是把变性剂也给浓缩了，那就适得其反了）而PEG会不会透进来呢？PEG的分子量大小要不要跟透析袋的截留分子量大小进行比较，最好要比截留的大呢？

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1. 可以先进行蛋白浓缩处理，如果你觉得必要，但我个人在上柱之前从不浓缩，干吗要多一个步骤呢，层析本来就会有浓缩的作用。
2. 蛋白浓缩方法在实验室做还是PEG比较简单，只需要一个透析袋就够了。但我个人喜欢超虑，不好意思。不建议用(NH4)2SO4沉淀或丙酮沉淀。
3. 不管用哪种方法浓缩，如果浓度一上去蛋白就大量沉淀，那对不起请重新优化你的复性方案。但也请避免过量浓缩蛋白，如果一个蛋白在2mg/ml以下是稳定的，那就千万不要浓缩到3mg/ml。
4. 0.8M尿素一般情况下是不会影响你的挂柱的。
5. 用PEG干粉包埋透析袋的方法进行蛋白浓缩的时候，所有的小分子（只要分子量小于透析袋截留分子量的）都可以自由进出。一般实验室我见过的用10KD左右的透析袋比较多，我想你应该也是用这种的，所以请不要用PEG6000的干粉了，你不是在做浓缩，你是在做PEG沉淀，因为你的PEG都跑透析袋里去了。
以上拙见，仅供参考。

作者: jkobn 时间: 2013-4-11 13:15

紧急求助：
我用PET-28a载体，转化BL21，得到的目的蛋白约为62KDa, 为包涵体，预测等电点8.74，我用的以下方法进行包涵体的变性复复性：
1．PBS或生理盐水洗涤诱导后菌体，Buffer A重悬菌体（20ml），超声波破碎至清亮，４度，１００００rpm离心１０分钟，弃上清，用ＰＢＳ或生理盐水洗涤沉淀２－３次。往沉淀中加１９．７ml Buffer A及０．３ml　２０％的ＳＫＬ（十二烷基肌氨酸钠）贮存液，剧烈搅动，使其缓慢溶解，室温静置３０分钟至２小时。４度，１００００rpm离心１０分钟，取上清。加２０％ＰＥＧ４０００　２１０ul至终浓度为０．２％，加５０mM的氧化型谷胱甘肽４２０ul至终浓度为１mM,加100mM的还原型谷胱甘肽４２０ul至终浓度为２mM,４度复性过夜，ＴＥ（pH8.0)透析。
Buffer A配方：
Tris-base 50mM
EDTA 0.5mM
NaCl 50mM
甘油　　5%
DTT 5mM
TE（pH8.0）配方：
Tris-base 10mM
EDTA 1mM
透析过程中出现较少的沉淀，但透析结束后存放-20度，昨天放在4度里解冻准备超滤纯化浓缩，但发现出现很多蛋白沉淀，我离心后收集沉淀和上清，不敢往下做了。我想请教：
1、收集的沉淀是否是已复性的蛋白，如果不是能否把它当作包涵体重新进行变性复性？
2、我的蛋白大概两星期后就要拿去免疫动物，怎样保存可以保证蛋白的稳定性。
3、我们实验室的另一位战友也遇到一个难题，那就是发现经过包涵体复性后的目的蛋白分子量（45KDa）比没有没有复性前的目的蛋白分子量（40KDa)，也就是SDS-PAGE的时候一个在44KDa Marker 的上面，一个在下面，为什么？

作者: mamamiya 时间: 2013-4-11 13:16

紧急求助：
我用PET-28a载体，转化BL21，得到的目的蛋白约为62KDa, 为包涵体，预测等电点8.74，我用的以下方法进行包涵体的变性复复性：
1．PBS或生理盐水洗涤诱导后菌体，Buffer A重悬菌体（20ml），超声波破碎至清亮，４度，１００００rpm离心１０分钟，弃上清，用ＰＢＳ或生理盐水洗涤沉淀２－３次。往沉淀中加１９．７ml Buffer A及０．３ml　２０％的ＳＫＬ（十二烷基肌氨酸钠）贮存液，剧烈搅动，使其缓慢溶解，室温静置３０分钟至２小时。４度，１００００rpm离心１０分钟，取上清。加２０％ＰＥＧ４０００　２１０ul至终浓度为０．２％，加５０mM的氧化型谷胱甘肽４２０ul至终浓度为１mM,加100mM的还原型谷胱甘肽４２０ul至终浓度为２mM,４度复性过夜，ＴＥ（pH8.0)透析。
Buffer A配方：
Tris-base 50mM
EDTA 0.5mM
NaCl 50mM
甘油　　5%
DTT 5mM
TE（pH8.0）配方：
Tris-base 10mM
EDTA 1mM
透析过程中出现较少的沉淀，但透析结束后存放-20度，昨天放在4度里解冻准备超滤纯化浓缩，但发现出现很多蛋白沉淀，我离心后收集沉淀和上清，不敢往下做了。我想请教：
1、收集的沉淀是否是已复性的蛋白，如果不是能否把它当作包涵体重新进行变性复性？
2、我的蛋白大概两星期后就要拿去免疫动物，怎样保存可以保证蛋白的稳定性。
3、我们实验室的另一位战友也遇到一个难题，那就是发现经过包涵体复性后的目的蛋白分子量（45KDa）比没有没有复性前的目的蛋白分子量（40KDa)，也就是SDS-PAGE的时候一个在44KDa Marker 的上面，一个在下面，为什么？

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1. 收集的沉淀是否是已复性的蛋白?你可以跑SDS-PAGE看看分子量对不对，如果蛋白复性成功是不会沉淀出来的。你可以拿这些沉淀重新变性复性，但我不建议这样做，因为重复性会比较差。
2。有些蛋白不适合－20度保存，反复冻溶不稳定，你可以放4度看看，按你的描述，这个蛋白放4度两个礼拜应该没问题。
3。复性之后跟之前蛋白结构改变会影响分子量，但不多见

作者: vera+ 时间: 2013-4-11 13:16

我觉得如果不是GST融合蛋白都可以用8M的尿素溶解

为什么GST融合蛋白不能用8M的尿素溶解呢？那GST融合蛋白形成了包涵体怎么办呢？盐酸胍吗？

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根据我的经验，如果蛋白GST融合后还包含体表达就一点意义都没有。
所以还是回去解决可容性的问题，这样比把大量时间花在复性上有意义的多。

前辈这句话可真把晚辈给打击死了！一点意义都没有的话我半年的功夫岂不是白费了！我已经花大量时间摸索培养条件等参数以解决可溶性的问题，可是都失败了，所以我才把精力投入到包涵体变性复性上来的。

好像大家用的更多的是pET系列载体，也就是HIS TAG。是不是pET系列载体比pGEX系列载体更有优势呢？如果我换用pET载体是否有希望为可溶性表达呢？如果不幸又是包涵体表达是否纯化过程会比pGEX载体简单容易一些呢？如果是的话我倒是要好好考虑一下是否要换载体了

作者: jkobn 时间: 2013-4-11 13:17

非常感谢你及时给我解答。
我拿过沉淀跑胶，的确是我所需要的目的蛋白，而且我还把透析后蛋白溶液的上清拿去跑胶，里面主要也是我要的目的蛋白。请问沉淀会不会是因为蛋白浓度过高析出来的。另外，我还是有个疑问，透析后浓缩蛋白所析出的沉淀和透析过程中所析出的沉淀有何不同？两者都是没有活性的蛋白吗？
再次感谢你的耐心解答。

作者: mamamiya 时间: 2013-4-11 13:17

根据我的经验，如果蛋白GST融合后还包含体表达就一点意义都没有。
所以还是回去解决可容性的问题，这样比把大量时间花在复性上有意义的多。

前辈这句话可真把晚辈给打击死了！一点意义都没有的话我半年的功夫岂不是白费了！我已经花大量时间摸索培养条件等参数以解决可溶性的问题，可是都失败了，所以我才把精力投入到包涵体变性复性上来的。

好像大家用的更多的是pET系列载体，也就是HIS TAG。是不是pET系列载体比pGEX系列载体更有优势呢？如果我换用pET载体是否有希望为可溶性表达呢？如果不幸又是包涵体表达是否纯化过程会比pGEX载体简单容易一些呢？如果是的话我倒是要好好考虑一下是否要换载体了

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不用气馁，我说话都是分场合的，上次说一点意义都没有的时候是因为那个战友原先是可容表达的。
我只在一种情况下用融合表达，那就是无论如何想尽办法都没法单独表达我的目的蛋白的时候。这个时候想要拿到我的蛋白只好降低要求去融合，如果运气好的话是会可容表达的，但一般情况下一不小心就成包含体了，这个时候也没办法，谁叫人运气差呢，只好去做复性了。但是复性是需要花大量时间跟精力的。看你的样子，复性是难免的了。
PET系列载体有HIS TAG的话在蛋白表达成包含体后纯化明显有优势，因为HIS TAG可以在变性条件下纯化，这个GST就不行了。但是要有心里准备，就象前面说的，单独表达，在PET系统中不一定会成功，不过你可以尝试一下。
总结一下，根据你说的，估计你的这个蛋白即使单独表达，也肯定是包含体，所以复性是必然的，好好查查资料，说不定前人已经有做过的，现成的方案就比较简单了。

作者: mamamiya 时间: 2013-4-11 13:18

我拿过沉淀跑胶，的确是我所需要的目的蛋白，而且我还把透析后蛋白溶液的上清拿去跑胶，里面主要也是我要的目的蛋白。请问沉淀会不会是因为蛋白浓度过高析出来的。另外，我还是有个疑问，透析后浓缩蛋白所析出的沉淀和透析过程中所析出的沉淀有何不同？两者都是没有活性的蛋白吗？
再次感谢你的耐心解答。

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1。蛋白沉淀的原因有很多，比如你说的浓度过高，PH不适合，盐离子影响，氧化还原环境，保护剂缺乏等等。但可以肯定的是析出的沉淀肯定是不稳定体。最简单的就是你说的降低浓度看看，应该会减少沉淀。

2。透析后浓缩蛋白所析出的沉淀和透析过程中所析出的沉淀本质上是没有什么不同的，都是变性的蛋白析出，只不过析出的方式过程不一样而已。

3。你讲的“活性”一词，我觉得每个人的理解都不一样吧，比如说你今天讲的活性是指一个蛋白酶的话，那么这些沉淀肯定是没有活性的，但如果我今天做的是一个重组的抗原呢，那就很难说了，因为有些抗原的活性跟构象没关系，只跟蛋白的一级序列有关，也就是蛋白变不变性它都有活性。
以上个人理解，希望有帮助，有问题请指出。

作者: qhyu 时间: 2013-4-11 13:18

我只在一种情况下用融合表达，那就是无论如何想尽办法都没法单独表达我的目的蛋白的时候。这个时候想要拿到我的蛋白只好降低要求去融合，如果运气好的话是会可容表达的，但一般情况下一不小心就成包含体了，这个时候也没办法，谁叫人运气差呢，只好去做复性了。
单独表达，在PET系统中不一定会成功，不过你可以尝试一下。

pET系统不是有HIS TAG吗？这是融合表达吧？怎么能用PET系统尝试单独表达呢？不明白：（

作者: mamamiya 时间: 2013-4-11 13:19

我只在一种情况下用融合表达，那就是无论如何想尽办法都没法单独表达我的目的蛋白的时候。这个时候想要拿到我的蛋白只好降低要求去融合，如果运气好的话是会可容表达的，但一般情况下一不小心就成包含体了，这个时候也没办法，谁叫人运气差呢，只好去做复性了。
单独表达，在PET系统中不一定会成功，不过你可以尝试一下。

pET系统不是有HIS TAG吗？这是融合表达吧？怎么能用PET系统尝试单独表达呢？不明白：（

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你觉得6个HIS也算融合表达的话那我也没话说了。
那你就作你的融合表达去巴，祝好运。

作者: jkobn 时间: 2013-4-11 13:19

我做蛋白质变性复性的时候，透析过程中没有出现沉淀，但在蛋白质浓缩的时候出现蛋白质结晶，且该结晶不溶于水。
我的蛋白质大约62KDa，我想通过超滤纯化我的蛋白质，我用的超滤管是Millipore Amicon Ultra-15离心超滤管 50KD ，超滤后溶液会被浓缩，但我的蛋白质一浓缩就出现蛋白质结晶，我就收获不到我的蛋白了，怎么办？：(
各位高手，救救我吧！

作者: tudou85 时间: 2013-4-11 13:20

也许我这个问题太幼稚了，但因为我用的是pGEX系列载体，因此对pET系列载体了解不是很多，只知道有6个HIS，我以为只要有TAG就是融合蛋白，见笑了！

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你觉得6个HIS也算融合表达的话那我也没话说了。
那你就作你的融合表达去巴，祝好运。

作者: shenkunjie 时间: 2013-4-11 13:21

我做蛋白质变性复性的时候，透析过程中没有出现沉淀，但在蛋白质浓缩的时候出现蛋白质结晶，且该结晶不溶于水。
我的蛋白质大约62KDa，我想通过超滤纯化我的蛋白质，我用的超滤管是Millipore Amicon Ultra-15离心超滤管 50KD ，超滤后溶液会被浓缩，但我的蛋白质一浓缩就出现蛋白质结晶，我就收获不到我的蛋白了，怎么办？：(
各位高手，救救我吧！

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我也遇到过你这种情况，只不过我不是用透析复性，而是稀释复性，稀释后因为体积太大，蛋白浓度太低，我怕上柱纯化效果不好，因此也想做蛋白浓缩，我选择的是PEG包埋的方法，可是蛋白全都沉淀下来了：（
后来我也尝试了PEG沉淀法（不用透析袋，而是直接将PEG溶液和蛋白溶液混和，遵照汪家政的《蛋白质技术》一书做的），结果沉淀很少，而且跑胶什么都看不到

战友说“我一直使用的浓缩方法就是PEG包埋，简单实用”，不知道您具体是如何操作的呢？你的PEG是多大分子量？透析袋的截留分子量又是多少呢？而eric兄又说“请不要用PEG6000的干粉了，你不是在做浓缩，你是在做PEG沉淀，因为你的PEG都跑透析袋里去了”？是否其中有什么限制条件需要注意的呢？

作者: mysmdbl 时间: 2013-4-11 13:22

看了些资料，发到自己的帖子上面，呵呵。

菌体/细胞裂解法：

一、反复冻融法：
1、将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
2、至少3次以上冻溶。
3、IFCC推荐法：
收集细胞悬液，4℃低温离心（3000rpm，5min），弃上清，加入一定量PBS（200ul），轻轻吹打混匀，-200C 冷冻30 min，370C 解冻，如此反复3次，可形成细胞裂解液。
步骤如下：
1）收集细胞悬液
2）40C 低温离心（3000rpm，5min）
3）弃上清，加入一定量PBS（200ul），轻轻吹打混匀，-200C 冷冻30 min，
370C 解冻，如此反复3次，可形成细胞裂解液。
4、用液氮冻融三四次就可以了，细胞冻住后，取出放37度水浴，溶解后震荡，再冻

二、超声波处理法
1、要设定好超声时间和间隙时间，一般超声时间不超过5秒，间隙时间最好大于超声时间，这些都有利于保护酶的活性。我的实验超声时间5秒、间隙时间10秒、工作次数20次。
注意事项：
1）、一个细胞超声仪可以配备不同尺寸的探头，根据你实验中收集细胞的容器大小选择合适规格的探头。
2）、另外冰浴非常重要，空化效应会局部产热，从而使细胞内酶失活，所以我通常将收集细胞的离心管置于冰盒中。
3）、要设定好超声时间和间隙时间，一般超声时间不超过5秒，间隙时间最好大于超声时间，这些都有利于保护酶的活性。我的实验超声时间5秒、间隙时间10秒、工作次数20次，镜下观察细胞破碎效果很好，供参考。不同细胞实验条件得具体摸索。
4）、最后好好看仪器说明书，探头到液面下的距离及与容器底部的距离都有要求。
2、每个样本超声时间5秒,每个间隔5秒,粉碎5次。
3、100ml菌液离心，用8ml缓冲液悬浮，加8mg溶菌酶，冰浴30min，然后超声处理。750W 40％功率。5秒超声，9秒间隔。超声至少90min。超声完毕后，菌液应该是澄清的，略显油状。
4、综合冻融和超声的方法：
1500g离心，弃除上清。冰上，用小体积PBS重悬细胞。
将重悬液集中，1500g离心浓缩，弃除上清。液氮骤冷。用约5倍体积的PBS缓冲液重悬细胞，并搅拌。
可选择：4℃下超声破碎细胞。加入终浓度为0.25M的KCl，15mM的DTT。4℃下111500g×60min离心裂解液。取出上清。过柱子。

三、渗透法：
冰冷的20 mmol/L Tris-Cl（pH8.0），2.5 mmol/L EDTA处理，冰浴放置10min。
《精编分子生物学实验指南》

四、裂解液处理法：
1、细胞裂解液：50 mmol/L Tris-Cl pH 6.8，100 mmol/L DTT，2% SDS，0.1%溴酚蓝，10%甘油。SDS是阴离子型表面活性剂、极易促溶、强变性作用。
2、在loading buffer加SDS，100度5分钟，是变性方法。SDS与蛋白等量结合，可以通过条带位移判断蛋白大小，考染不会影响结果。
3、如果是做小量菌液，跑PAGE胶看其表达情况的话，可以直接加蛋白loading buffer煮沸5分钟即可，需注意的是上样前要离心12000rpm至少5分钟，然后上样时，枪头别吸最底下的。
4、20毫升细胞裂解液配方:40 μL 0.5M EDTA (PH8.0)，4 ml 10% SDS，1 ml 1M Tris-cl(PH6.8)，14.96 ml 蒸馏水。可以适当加入几种蛋白酶的抑制剂，如PMSF，leupeptin等。
5、检测蛋白诱导：
从培养的不同时期各取出1ml，12000g×1min离心。将沉淀重悬于100ul 1×SDS上样缓冲液（50mM Tris-Cl（pH6.8），100mM DTT，2％SDS，0.1％溴酚蓝，10％甘油）中，100℃加热3min，然后12000g×1min离心。上样15ul，6％SDS-PAGE电泳。
《分子克隆》P826
7、5-10秒离心，弃除上清，用50ul蒸馏水重悬沉淀。加入1ul PMSF，再加入50ul热的2×SDS上样缓冲液（100℃加热）。迅速混匀后100℃加热3-5min。将样品冰上放置（或-20℃放置），然后再溶解，煮沸1min。离心30秒。上样5ul进行SDS-PAGE电泳。
2×SDS上样缓冲液：250mM Tris-Cl，6.2％（w/v）DTT，8％SDS，0.002％（w/v）溴酚蓝，40％甘油。
Purification of GST-Fusion Proteins from E. coli。

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想问一下，检测蛋白诱导情况，可以直接取菌液加loading煮沸然后上样吗？要不要离心？？不离心可以吗？

作者: jkobn 时间: 2013-4-11 13:22

我也遇到过你这种情况，只不过我不是用透析复性，而是稀释复性，稀释后因为体积太大，蛋白浓度太低，我怕上柱纯化效果不好，因此也想做蛋白浓缩，我选择的是PEG包埋的方法，可是蛋白全都沉淀下来了：（
后来我也尝试了PEG沉淀法（不用透析袋，而是直接将PEG溶液和蛋白溶液混和，遵照汪家政的《蛋白质技术》一书做的），结果沉淀很少，而且跑胶什么都看不到

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我用的是PEG20000，透析袋的截留分子量是14000，所以PEG不会进入到透析袋里。但浓缩的时候蛋白一样沉淀出来

作者: mamamiya 时间: 2013-4-11 13:23

想问一下，检测蛋白诱导情况，可以直接取菌液加loading煮沸然后上样吗？要不要离心？？不离心可以吗？

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一般情况下是不需要离心的，因为我这么偷懒了好几年了。
但有一种情况下还是请离心一下，就是上样时溶液非常粘稠，跑胶明显跑不下去的（结果肯定也不会好的），这个可能是核酸过多或有沉淀干扰。

作者: mamamiya 时间: 2013-4-11 13:23

我也遇到过你这种情况，只不过我不是用透析复性，而是稀释复性，稀释后因为体积太大，蛋白浓度太低，我怕上柱纯化效果不好，因此也想做蛋白浓缩，我选择的是PEG包埋的方法，可是蛋白全都沉淀下来了：（
后来我也尝试了PEG沉淀法（不用透析袋，而是直接将PEG溶液和蛋白溶液混和，遵照汪家政的《蛋白质技术》一书做的），结果沉淀很少，而且跑胶什么都看不到

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浓度那么低怎么能作PEG沉淀呢，效果肯定不好！
用PEG浓缩时请将PEG分子量大于透析袋的截留分子量，比如说PEG20000就可以。当然如果你用截留分子量为3500的透析袋，那么PEG6000也是OK的，不过大部分实验室，没事不会去用3500的透析袋啊。
不管你用那种方法浓缩，只要稍微一浓缩蛋白就沉淀，那么肯定是复性没做到家，你的复性溶液配方优化过了吗，不要动不动就拿那个所谓的“万斤油”配方，那会害死你的。
我作复性的时候，就算一个很随便的蛋白复性都要筛选几十种BUFFER,更不用说某些重要的蛋白几百种上千种的BUFFER筛选了。作复性真的很累的，不是什么随便透析一下，稀释一下就OK的。
复性跟纯化一样都是一门艺术。

作者: ukonptp 时间: 2013-4-11 13:24

想问一下，检测蛋白诱导情况，可以直接取菌液加loading煮沸然后上样吗？要不要离心？？不离心可以吗？

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可以直接取菌液加loading煮沸。
但是还是离心一下，煮沸本身就是一个变性的过程，使蛋白成溶解的形式，不离心或多或少会遇到粘稠的沉淀。

作者: babybabe 时间: 2013-4-11 13:24

变性复性过程当中碰到蛋白降解怎么办？复性后如何判断复性效率？

我用楼主提供的TGE透析方法进行复性，一开始透析液的PH值没调好，出现了大量沉淀，后来调整之后好多了，但透析48小时后再离心还是有部分沉淀，而且我碰到了一个很奇怪的问题：在调整PH值的时候每沉淀一次我都把离心后的上清收集起来跑胶了，发现越到后来上清里的杂蛋白越少，难道每沉淀一次就相当于一次纯化？
另外，透析复性后离心所得沉淀拿来跑胶，结果有很多条带，只不过都是一些降解蛋白（我的是GST融合蛋白，这些条带都在26KD以上，应该可以说明是降解蛋白），而离心后的上清跑出来只有一条带，单从分子量来看和我的目的蛋白差不多，这是否说明上清里的蛋白要比沉淀里的稳定呢？只有一条带的上清是否可以直接拿来用（作抗原）而不必再过柱纯化了呢？
不过我又碰到了一个问题，从站友提供的资料来看，判断复性效率的方法有很多，我想通过Western Blot用抗GST抗体来判断复性效率，结果一条带都没看到，好伤心啊！是否证明我的复性是失败的呢？可是我已经透析很长时间了呀（48小时），那PAGE胶上的一条带是怎么回事呢？难道还是变性蛋白？难道真如一些站友所说的GST融合蛋白很难复性？：（

作者: ukonptp 时间: 2013-4-11 13:25

变性复性过程当中碰到蛋白降解怎么办？复性后如何判断复性效率？

我用楼主提供的TGE透析方法进行复性，一开始透析液的PH值没调好，出现了大量沉淀，后来调整之后好多了，但透析48小时后再离心还是有部分沉淀，而且我碰到了一个很奇怪的问题：在调整PH值的时候每沉淀一次我都把离心后的上清收集起来跑胶了，发现越到后来上清里的杂蛋白越少，难道每沉淀一次就相当于一次纯化？
另外，透析复性后离心所得沉淀拿来跑胶，结果有很多条带，只不过都是一些降解蛋白（我的是GST融合蛋白，这些条带都在26KD以上，应该可以说明是降解蛋白），而离心后的上清跑出来只有一条带，单从分子量来看和我的目的蛋白差不多，这是否说明上清里的蛋白要比沉淀里的稳定呢？只有一条带的上清是否可以直接拿来用（作抗原）而不必再过柱纯化了呢？
不过我又碰到了一个问题，从站友提供的资料来看，判断复性效率的方法有很多，我想通过Western Blot用抗GST抗体来判断复性效率，结果一条带都没看到，好伤心啊！是否证明我的复性是失败的呢？可是我已经透析很长时间了呀（48小时），那PAGE胶上的一条带是怎么回事呢？难道还是变性蛋白？难道真如一些站友所说的GST融合蛋白很难复性？：（

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你的第一个问题，我觉得蛋白透析复性本身是一个纯化的过程。
至于是否说明上清里的蛋白要比沉淀里的稳定这个好像有点深了，我不知道，不敢妄语。如果page胶上面只有一条带的话，我觉得可以不过柱，但是要看你是做什么用的，如果实验要求蛋白纯度很高的话，那可能要另当别论了。wb没有做出来还是有很多原因的，比如最多的就是你的操作问题，你下次再作的时候可以做一个阳性对照，就是用别人或者你自己已经做出来的样品一起做wb，看看是否还是没有条带。

作者: babybabe 时间: 2013-4-11 13:26

你的第一个问题，我觉得蛋白透析复性本身是一个纯化的过程。
至于是否说明上清里的蛋白要比沉淀里的稳定这个好像有点深了，我不知道，不敢妄语。如果page胶上面只有一条带的话，我觉得可以不过柱，但是要看你是做什么用的，如果实验要求蛋白纯度很高的话，那可能要另当别论了。wb没有做出来还是有很多原因的，比如最多的就是你的操作问题，你下次再作的时候可以做一个阳性对照，就是用别人或者你自己已经做出来的样品一起做wb，看看是否还是没有条带。

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谢谢楼主的热心解答。

我也认为可能是我做wb的时候有某些操作问题，可是前两天我又做了一次，拿GST做的阳性对照，对照的条带出来了，还很漂亮，可是我要的条带还是没出来：（到底怎么回事呢？难道我弄出来的不是GST融合蛋白？不应该吧！不过有一个情况，原来包涵体状态的时候我也做过wb，也是没出来条带，但是上清里的少量降解蛋白出来条带了，是否我表达出的这个GST融合蛋白折叠不好形成包涵体的时候GST后面的肽段把GST给包裹起来了导致抗体无法识别呢？当然这只是我的一个猜想，无法印证，还请有经验的站友帮忙解答。

作者: TNT 时间: 2013-4-11 13:26

请教各位前辈：
我现在在做His柱纯化一个含His标签的分子量为21KD的蛋白，它存在与包含体中，所以我想用8M尿素溶解后在过镍柱
不知行否？可否告知这一过程的缓冲液的配方？洗涤和结合缓冲液是什么？要在其中加入8M尿素么？

作者: H2O 时间: 2013-4-11 13:26

我的蛋白就是以包涵体形式表达的，用盐酸胍裂解后，透析复性，pH6－8的缓冲液都沉淀，不管你的浓度梯度降的多缓慢，但只要把pH值调到5以下，怎么透析都不沉淀，可是酸性条件不易复性。忘了说了，我做的这个蛋白等电点在10，是不是这个影响的呢？这种状况就算是我把里面的盐透析干净了，是不是蛋白也没复性啊？

作者: ukonptp 时间: 2013-4-11 13:27

请教各位前辈：
我现在在做His柱纯化一个含His标签的分子量为21KD的蛋白，它存在与包含体中，所以我想用8M尿素溶解后在过镍柱
不知行否？可否告知这一过程的缓冲液的配方？洗涤和结合缓冲液是什么？要在其中加入8M尿素么？

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可行

iptg诱导蛋白表达后，离心沉淀菌体，然后超声破菌释放包含体。

洗涤液1洗一次：
洗涤液1：20mM Tris-Cl(PH8.0) 5mM EDTA 0.5% TritonX-100
洗涤液2洗一次：
洗涤液B：20mM Tris-Cl(PH8.0) 5mM EDTA 2M 尿素

然后8m尿素溶解过夜即可。之后再对上清进行纯化。

作者: ukonptp 时间: 2013-4-11 13:27

我的蛋白就是以包涵体形式表达的，用盐酸胍裂解后，透析复性，pH6－8的缓冲液都沉淀，不管你的浓度梯度降的多缓慢，但只要把pH值调到5以下，怎么透析都不沉淀，可是酸性条件不易复性。忘了说了，我做的这个蛋白等电点在10，是不是这个影响的呢？这种状况就算是我把里面的盐透析干净了，是不是蛋白也没复性啊？

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你复性的目的就是去除盐酸胍。

既然你的等电点在10左右，那你就要改变透析液的ph值使其接近等电点。

作者: babybabe 时间: 2013-4-11 13:28

你复性的目的就是去除盐酸胍。

既然你的等电点在10左右，那你就要改变透析液的ph值使其接近等电点。

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我一把透析液pH值调到10，然后透析，小体积的不出沉淀，大体积的4，5个小时之后沉淀就都出来了。愁死了！再把他透回酸性，然后小体积一个一个做？可行吗？
还有呢，我的包涵体0.3％的SKL不能溶解，试了一下，浓度得到5％才能溶解，是我买的SKL不好呢？还是这种状况出现很正常呢？谢谢！

作者: bring 时间: 2013-4-11 13:29

我是用亲和成析的方法纯化蛋白，如何让杂蛋白少些，是在Ｗashing buffer
中的盐的浓度加大些，我现在Ｎacl的浓度是150mＭ，在加大到多少好呢？

作者: qiangren789 时间: 2013-4-11 13:29

请问：包含体变性后，是先复性后再纯化还是先纯化后再复性？那种方法好，区别在那里？透性时，透析液的ph值与透析袋内溶液的ph值是否要一致或接近？

作者: guagua 时间: 2013-4-11 13:29

看了您的关于父亲母亲的文章，很感动！
请问包涵体复性的问题，我通过8MUrea，5mMDTT溶解包涵体后，透析前蛋白浓度3mg/ml，利用您给出的透析体系透析24小时，没有活性，透析后的蛋白浓度是0.1mg/ml.透过电泳有与目的蛋白大小的条带，原来通过8MUrea溶解的杂带又重新沉淀，虽然条带与目的蛋白大小一致，但没有活性不能确定就是我的蛋白。通过稀释的方法也是同样的结果，只不过可溶的蛋白较透析的浓度低。
做了将近一个月复性，很困惑哦，请您指教！谢谢

作者: IAM007 时间: 2013-4-11 13:30

我的GST融合蛋白在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达，我用6M 盐酸胍溶解包涵体后，上阳离子交换柱（我的目标蛋白用蛋白
软件预测等电点在9.2左右），所以我用了ph7.5的50mM 磷酸盐缓冲液作为start buffer, start buffer 里含有8M尿素， elution buffer
里也含8M尿素，还有1M NaCI, 但奇怪的是我的目标蛋白大部分随着 start buffer 给冲洗了下来（SDS-PAGE鉴定），很少挂到柱子上，
需注明的是我的盐酸胍溶解样是可以溶解在start buffer 里的，并且在上柱前是用start buffer 稀释了5倍，并跳ph值到7.5.

小弟现在在做包涵体的纯化及复性！想通过离子交换柱进行尿素浓度梯度复性，但必须得先让目标蛋白吸附到柱子填料上吧，
最近这个鬼复性把我给搞死了，迟迟拿不到我的目标蛋白。

望各位色谱高手给指点指点啊

还有希望做过蛋白复性的高人能多多交流交流！！！

作者: newway 时间: 2013-4-11 13:30

请教各位高手：
溶解在8M尿素中的包涵体用bradford法测浓度，尿素对最终结果影响大不大？

作者: DDD 时间: 2013-4-11 13:31

请问：我的包涵体用8M尿素溶解后，透析梯度复性，但是最后对PBS透析的时候出现大量沉淀，做ＳＤＳ－ＰＡＧＥ的时候上清没条带，但是沉淀条带也很浅，跟对１Ｍ尿素透析沉淀比更浅了，应该更深才对呀，因为肉眼看沉淀更多了，请大家多多指教，实验进度很慢，挠头啊！！！从下数第二个条带是我的目的蛋白

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15596

作者: H2O 时间: 2013-4-11 13:31

想问下版主你透析去除尿素，咪唑以及其它小分子蛋白质，怎么确定完全除去了呢？新手上路，还望多指导，谢谢！

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