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标题: 【讨论贴】关于共聚焦激光扫描显微镜的一切问题 [打印本页]
作者: #甜#    时间: 2013-4-11 15:03     标题: 【讨论贴】关于共聚焦激光扫描显微镜的一切问题

发现论坛里涉及共聚焦激光扫描显微镜的知识很少，共聚焦激光扫描显微镜(CLSM) 是继电镜之后形态学上很先进的研究工具。它可以说是显微镜CT，可以进行光学切片，观察切面的多个层面，可以进行三维重建，又可以对靶蛋白等进行定量分析。这是其他的工具难以实现的。现在鉴于共聚焦激光扫描显微镜在科研中的应用也越来越多，在此发起有关共聚焦的话题。希望各位畅所欲言，有经验的请留下您的宝贵经验，比如共聚焦实验过程中需要注意哪些问题？共聚焦可以用来干些什么？有问题的也可以借这个平台在此发问。期待各位的热情参与
作者: #甜#    时间: 2013-4-11 15:03


相关疾病：
肿瘤
荧光显微镜成像为基础，加装了激光扫描装置, 计算机进行图像处理, 使用紫外或可见光激发荧光探针,采用光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统
只要目的结构是用荧光探针标记的，都可用共聚焦激光扫描荧光显微镜观察。

形态学研究：细胞凋亡、肿瘤细胞分类……

分子生物学：原位杂交，DNA、RNA定量，DNA损伤修复、外源性基因在真核细胞的表达、定位，荧光能量共振转移——大分子构象的改变、受体与配体相互作用……

活细胞动态荧光测量：细胞内Ca++、K+、H+等离子的动态分布及动态定量、荧光漂白恢复——细胞连接间的信息沟通……

直接对活组织或整体胚胎观察
作者: #甜#    时间: 2013-4-11 15:04


具体可应用于下列领域：
1.细胞生物学：细胞结构，细胞骨架，细胞膜结构、流动性、受体，细胞器结构和分布变化，细胞凋亡；
2.生物化学：酶、核酸、FISH（荧光原位杂交）、受体分析；
3.药理学：药物对细胞的作用及其动力学；
4.生理学：膜受体，离子通道，细胞内离子含量、分布、动态分析；
5.遗传学和胚胎学：细胞生长、分化、成熟变化，细胞组织的三维结构甚至再***的结构，染色体分析，基因表达，基因诊断；
6.神经生物学：神经细胞结构，神经递质的成分、运输和传递，递质受体，离子内外流，神经组织（如大脑皮质）结构、细胞分布；
7. 微生物学和寄生虫学：细菌、寄生虫形态结构（表面和内部结构）；
8.病理学及病理学临床应用：活检标本的快速诊断，肿瘤诊断，自身免疫性疾病的诊断，HIV，宫颈上皮细胞涂片诊断；
9.生物学，免疫学，环境医学和营养学；
作者: koook5695    时间: 2013-4-11 15:04


想知道一下：

1 研究大分子构象的改变时，怎么做荧光探针标记？
2 分辨率能不能达到 0.1 nm 级别？

谢谢！
作者: mimili_901    时间: 2013-4-11 15:04

不知楼主在有没有用过共聚焦显微镜观察过转到植物组织中的GFP荧光，不知观察的条件和效果如何？能否看到保卫细胞，叶绿体细胞等结构，望指点一二，目前正在做细胞器的GFP荧光定位实验。
作者: hustwb    时间: 2013-4-11 15:05


请问楼主，本人利用脂质体转染pSUPER-EGFP空载质粒到人CD4+T细胞系Jurkat细胞（悬浮），G418筛选后，PBS洗涤2次后上镜检测，发现荧光极弱，属于若有若无型的，但是同样质粒转染SGC7901荧光很强，请问该怎么处理
作者: utt0989    时间: 2013-4-11 15:05


楼主，提一个貌似跟共聚焦比较远的问题：如何用Image J软件分析共聚焦图片的荧光强度？或者其他软件也行。
作者: gemei0115    时间: 2013-4-11 15:06

共聚焦激光扫描显微镜主要是一个实验仪器使用问题，就是如何排出漂亮的图，如果分析这些数据。这些东西不动手操作几乎不能提出问题，而且仪器有厂家区别，因此操作也不尽相同。同时，仪器属于精密仪器，一般国内实验室有专人负责。看视野的和拍片子的不是同一人，因此很难真正自己去精益求精。这可能也是园内没什么人讨论这个问题的原因吧。
共聚焦激光扫描显微镜的应用确实可以很广泛，但原理的知晓对于具体应用其来进行实验研究并无太多帮助。就如果knockout小鼠，IPS的获得，原理大家都懂，但绝大多数人搞不出来一般，生物科学毕竟是门实验科学。因此建议大家提问实验操作中遇到的问题。
我遇到的问题是：
1.哪个公司的488二抗好用，在多处叠加扫描，或荧光信号较弱时不容易淬灭。
2.扫描时有些细胞核和所感兴趣的东西不在一个层面，如果使得叠加的图片更加漂亮。
作者: wanglaoshi    时间: 2013-4-11 15:06

1.哪个公司的488二抗好用，在多处叠加扫描，或荧光信号较弱时不容易淬灭。

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Alexa-488
当然，Dylight488也还不错
都用过
作者: dog002    时间: 2013-4-11 15:07

好吧，看到大家对confocal的热情。
传统我们都认为confocal是用来拍照的，就是成像研究方法，无论是你用染料，还是免疫荧光，还是质粒转染，都试图用confocal来拍照。好吧，那么你的confocol太省心了，这些顶多都是把它当作荧光显微镜或链接实时采集图像CCD的荧光显微镜。对于”共聚焦“，还没有好好利用。confocal相当于细胞CT，所以就看你怎么用了，其中根据它的光路和激光管的配置，可以做FRAp，Fret等，扫描可以线扫，3D 扫描构建，都是confocal轻松搞定的，而且是区别当今流行的活细胞系统或TIRFM的，所以要用好confocal，首先要了解confocal和你实验的目的和要求。当然前提你要有相关的染料或质粒。比如以往的染料，如flu3或flu5，confoal都只能提示半定量数据，而现在Fura2，就可以定量了。

另外，想提一点，有些实验者，先染色或转染，先上显微镜扫张图片，作为第一张，然后又拿回培养箱培养或加相关处理，然后又拿回显微镜，扫图片对比。这时候已经没有意义了，虽然你reuse你的上张图片参数，可是严格意义上，所有标本离开载物台就不能再和以前数据对比了，所以建议购买相关chamber，给药灌流细胞，当然你也可以自制这些。

作者: mickeylin    时间: 2013-4-11 15:07


很高兴看到这个帖子。我近期准备做T细胞与树突状细胞共培养实验，请问楼主有没有相关的protocol，谢谢！
作者: mickeylin    时间: 2013-4-11 15:08


补允一下，我准备用荧光抗体标记，共聚焦检测。
作者: #甜#    时间: 2013-4-11 15:08


这是我从站里复制的前辈的资料，希望对大家有用

【下载】激光共聚焦显微镜教程
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=1278173&sty=3&keywords=%BC%A4%B9%E2%B9%B2%BE%DB%BD%B9%CF%D4%CE%A2%BE%B5')
【资源整理】激光共聚焦显微镜
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/1835142_0.html')
【求助】激光共聚焦显微镜检测AP-1的方法及具体过程!
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=161&id=3307170&sty=3&keywords=%BC%A4%B9%E2%B9%B2%BE%DB%BD%B9%CF%D4%CE%A2%BE%B5')
【求助】激光共聚焦显微镜检测AP-1的方法及具体过程!
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=41&id=3307172&sty=3&keywords=%BC%A4%B9%E2%B9%B2%BE%DB%BD%B9%CF%D4%CE%A2%BE%B5')
求助:Confocal(激光共聚焦显微镜） 检测软骨的活性
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/762748_0.html')
徕卡激光共聚焦显微镜软件教程中文翻译
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/419119_0.html')
请教用激光共聚焦显微镜
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/391646_0.html')
紧急求助：北京哪里有激光共聚焦显微镜？
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/865633_0.html')
求助：激光共聚焦显微镜
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=110&id=2387383&sty=3&keywords=%BC%A4%B9%E2%B9%B2%BE%DB%BD%B9%CF%D4%CE%A2%BE%B5')
【互助小组】激光共聚焦显微镜讨论QQ群
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=2712593&sty=3&keywords=%BC%A4%B9%E2%B9%B2%BE%DB%BD%B9%CF%D4%CE%A2%BE%B5')
【求助】如何制作激光共聚焦显微镜的组织切片
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=2722422&sty=3&keywords=%BC%A4%B9%E2%B9%B2%BE%DB%BD%B9%CF%D4%CE%A2%BE%B5')
（请教）荧光显微镜和激光共聚焦显微镜的区别
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/1310428_0.html')
激光共聚焦显微镜培训讲稿
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/315139_0.html')
【求助】如何制作激光共聚焦显微镜的组织切片
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=2716015&sty=3&keywords=%BC%A4%B9%E2%B9%B2%BE%DB%BD%B9%CF%D4%CE%A2%BE%B5')
关于购买激光共聚焦显微镜的建议
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/893811_0.html')
【讨论】激光共聚焦显微镜哪个品牌和性能最好？
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=74&id=2807230&sty=3&keywords=%BC%A4%B9%E2%B9%B2%BE%DB%BD%B9%CF%D4%CE%A2%BE%B5')
建议讨论一下Confocal(激光共聚焦显微镜）
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/190732_0.html')
有朋友会用激光共聚焦显微镜吗？
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/391136_0.html')
请各位推荐激光共聚焦显微镜的资料
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/895095_0.html')
【5分下载】 Confocal Microscopy 英文教材(激光共聚焦显微镜)
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/1808786_0.html')
[申请上传] Confocal Microscopy 英文教材(激光共聚焦显微镜)
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/1789834_0.html')
Leica 激光共聚焦显微镜操作教程
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/1285910_0.html')
【下载】激光共聚焦显微镜教程
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/1278173')
哪位大侠做过心肌细胞的激光共聚焦显微镜检查？
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/639931_0.html')
【总结】激光共聚焦显微镜资料汇总
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=3311044&sty=3&keywords=%BC%A4%B9%E2%B9%B2%BE%DB%BD%B9%CF%D4%CE%A2%BE%B5')
激光共聚焦显微镜资料汇总
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=41&id=3310800&sty=3&keywords=%BC%A4%B9%E2%B9%B2%BE%DB%BD%B9%CF%D4%CE%A2%BE%B5')
紧急求助：激光共聚焦显微镜的采图和数据分析方法
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/937405_0.html')
分享】蔡氏激光共聚焦显微镜网页介绍及相关小资料 cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=2448887&sty=3&keywords=%BC%A4%B9%E2%B9%B2%BE%DB%BD%B9%CF%D4%CE%A2%BE%B5')
10分可下载】德国Zeiss LSM 510激光共聚焦显微镜使用手册
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=1933234&sty=3&keywords=%BC%A4%B9%E2%B9%B2%BE%DB%BD%B9%CF%D4%CE%A2%BE%B5')
【下载】Zeiss公司激光共聚焦显微镜原理及应用讲座(PPT)
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=1877882&sty=3&keywords=%BC%A4%B9%E2%B9%B2%BE%DB%BD%B9%CF%D4%CE%A2%BE%B5')
【求助】激光共聚焦显微镜能作荧光共振能量转移吗？
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=2767963&sty=3&keywords=%BC%A4%B9%E2%B9%B2%BE%DB%BD%B9%CF%D4%CE%A2%BE%B5')
【求助】激光共聚焦显微镜与全内反射显微镜在原理和应用上有什么区别？
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=41&id=2767974&sty=3&keywords=%BC%A4%B9%E2%B9%B2%BE%DB%BD%B9%CF%D4%CE%A2%BE%B5')
[申请上传] Confocal Microscopy 英文教材(激光共聚焦显微镜) 需要的话帮忙顶！
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/1790009_0.html')
如何制备荧光标记细胞标本用于激光共聚焦显微镜？
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/892690_0.html')
流式和激光共聚焦测细胞内Ca2+各有何优点，费用怎样
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/637282_0.html')
【求助】线粒体膜电位
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/2018689')
请教Fure-2测钙是怎么回事？急！谢谢
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/1730372_0.html')
请教细胞内ca2＋，camp和pkc的检测
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/440530_0.html')

请教细胞内钙离子流测定的方法
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/91490_0.html')

共聚焦显微镜能否取代病理科大夫？
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/2379733')
急寻钙荧光探针fluo-3AM？ cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/561528_0.html')
荧光显微镜下的多彩细胞世界----荧光染色探讨
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/184800_0.html')
求助：有关激光共聚焦象显微镜测量活细胞内钙火花测定
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/429627_0.html')
[求助]如何测定细胞内瞬间的钙离子浓度
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/3175977')
（请教）几个概念
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/1601622_0.html')
关于激光共聚焦
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=41&id=893777&sty=3&keywords=%BC%A4%B9%E2%B9%B2%BE%DB%BD%B9%CF%D4%CE%A2%BE%B5')
细胞自发荧光如何观察与拍摄？
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/256149_0.html')
【原创】免疫细胞荧光图象重叠：达到激光共聚焦效果
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/3363424')
求助：关于细胞内钙离子浓度的测量还有一问 cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=74&id=3173418&sty=3&keywords=%BC%A4%B9%E2%B9%B2%BE%DB%BD%B9%CF%D4%CE%A2%BE%B5')
请教一个激光共聚焦试验的问题！谢谢！
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/1407558_0.html')
（请教）免疫荧光问题
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/1668565_0.html')
欢迎进入钙与细胞凋亡途径的讨论区
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=74&id=2608214&sty=3&keywords=%BC%A4%B9%E2%B9%B2%BE%DB%BD%B9%CF%D4%CE%A2%BE%B5')
求助）荧光染色
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/1043800_0.html')
（请教）用共聚焦观察免疫组化结果比一般光镜好狠多吗？
请问共聚焦显微镜的用途？
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/1696541_0.html')
激光扫描共聚焦显微镜的基本原理和主要生物学应用
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/557601_0.html')
请教：fura-2 和钙在细胞中的荧光发射峰谁看到过？
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/1743510_0.html')
免疫荧光组织化学技术
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/581276_0.html')
激光共聚焦扫描显微镜在生物学上的应用
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/1668567_0.html')
Re:（请教）关于激光共聚焦荧光双标的几个问题
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/1768868_0.html')
作者: 3N4G    时间: 2013-4-11 15:09


我打算用lscm测平滑肌细胞内钙离子浓度，定量，单纯比较两种平滑肌细胞的钙离子浓度差异有无统计学意义，看了一些文章觉得这个是不是有点大材小用了。
还有就是问一下专家，做出来的图片能不能对细胞内钙离子分布的区域差异做一分析那。
有谁做过类似的吗，可能提供一下步骤。
作者: 2541    时间: 2013-4-11 15:10

想知道一下：

1 研究大分子构象的改变时，怎么做荧光探针标记？
2 分辨率能不能达到 0.1 nm 级别？

谢谢！

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光学显微镜分辨率受衍射极限限制，一般分辨率只有0.5-1微米。

即使近几年光学纳米显微成像技术的突破，也只能达到30-100纳米。

虽然有的报道能到达5纳米左右的分辨率，但许多限制条件不容易实现。
作者: wood533    时间: 2013-4-11 15:11

我想用荧光标记三个蛋白，共聚焦示踪，大家说能行得通吗？
作者: yes4    时间: 2013-4-11 15:11

我想用荧光标记三个蛋白，共聚焦示踪，大家说能行得通吗？

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当然可以，标记三个蛋白注意不要窜色就行。
作者: fei1226com    时间: 2013-4-11 15:12

我打算用lscm测平滑肌细胞内钙离子浓度，定量，单纯比较两种平滑肌细胞的钙离子浓度差异有无统计学意义，看了一些文章觉得这个是不是有点大材小用了。
还有就是问一下专家，做出来的图片能不能对细胞内钙离子分布的区域差异做一分析那。
有谁做过类似的吗，可能提供一下步骤。

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您好，非常想请教您的问题：我的共聚焦显微镜对染料的要求有以下几种：fluo-3，fluo-3/fura red ,fluo-4,fluo-5N,fura red (ca -free).我也是想定量观察加药前后细胞内钙离子浓度的变化，不知道能不能选用Fura-2啊？请教您用的是哪个荧光染料啊？希望得到您的指点，非常非常感谢.
作者: qumm1985    时间: 2013-4-11 15:12


楼主你好

想请教一下：为什么很多文章上confocal拍出的照片都是整块的色彩图片，而我拍的都是散点组成的图片？

特别是细胞核的蓝色，我看别人都是整个的，很完整。我每次拍都是一堆的散点组合。


图片附件: 75408252.snap.jpg (2013-4-11 15:12, 89.04 KB) / 该附件被下载次数 14
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15602



图片附件: 74768494.jpg (2013-4-11 15:12, 66.3 KB) / 该附件被下载次数 11
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15603





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