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标题: 【求助】iTRAQ数据分析问题 [打印本页]

作者: queen 时间: 2013-4-11 15:19 标题: 【求助】iTRAQ数据分析问题

做了一次iTRAQ，得到了大量的蛋白，请问差异蛋白的界定有没有一个公认的标准呢？我看文献中标准都不相同。望赐教。

作者: dongdongqiang 时间: 2013-4-11 15:20

差异蛋白的选择一般是没有很明确的规定的，根据自己样品的差异大小和所使用的鉴定技术来规定的，常用的是P值小于0.05，差异倍数是大于2倍（或是1.5倍）和小于0.5倍的蛋白作为差异蛋白，iTRAQ置信区间95%以上。

作者: queen 时间: 2013-4-11 15:20

QUOTE:

原帖由 dongdongqiang 于 2013-4-11 15:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

差异蛋白的选择一般是没有很明确的规定的，根据自己样品的差异大小和所使用的鉴定技术来规定的，常用的是P值小于0.05，差异倍数是大于2倍（或是1.5倍）和小于0.5倍的蛋白作为差异蛋白，iTRAQ置信区间95%以上。 ...

谢谢，我选取的是1.2倍，不知道可以不？

作者: mamamiya 时间: 2013-4-11 15:20

QUOTE:

原帖由 queen 于 2013-4-11 15:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢，我选取的是1.2倍，不知道可以不？

iTRAQ由于动态范围差、2级信号抑制等问题，所以差异一向会偏小，所以用1.2也是挺常见的

作者: is2011 时间: 2013-4-11 15:21

很多文献有点差别的。大的2.0也有小的1.2也有
我也做定量。
我先自己用仪器和流程做了一个1:1的样本。即一个样本平均分两份。标记后，做一个正态分布图。用均值加减1.96SD算出来 95%可信区间大概在0.7-1.5. 那么就是说明，理论上1:1的样品，结果95%在0.7-1.5浮动。那么就选择这个值意外的作为有差异的蛋白质。感觉这个比较严谨和有说服力些。

作者: mamamiya 时间: 2013-4-11 15:21

很多文献有点差别的。大的2.0也有小的1.2也有
我也做定量。
我先自己用仪器和流程做了一个1:1的样本。即一个样本平均分两份。标记后，做一个正态分布图。用均值加减1.96SD算出来 95%可信区间大概在0.7-1.5. 那么就是说明，理论上1:1的样品，结果95%在0.7-1.5浮动。那么就选择这个值意外的作为有差异的蛋白质。感觉这个比较严谨和有说服力些。

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那我觉得是不是还要做个1:1.5的混合样本出来看看在itraq里变成什么范围了，然后这个以外的才算呢

作者: xyw5 时间: 2013-4-11 15:22

iTRAQ差异蛋白的选择标准有很多，根据我们的经验和对文献的整理，可以把相关问题细分如下：
1，可靠蛋白的选择标准：首先须判断你选择哪些蛋白来进行差异分析，涉及的标准按照严格程度不同，大致有四种，分别是蛋白95%可靠性，蛋白99%可靠性，蛋白有一条及以上95%以上可靠性的肽段、蛋白有2条及以上95%以上可靠性的肽段。
2，在以上基础之上，同时结合是否有重复数据，进行差异蛋白的选择，主要的标准有以下几类，变化倍数正负1.2倍以上，变化倍数正负1.5倍以上（比较常用），变化倍数正负2倍以上，T测验显著差异（p小于0.05）、T测验极显著差异（p小于0.01）、T测验显著差异（p小于0.05）且变化倍数1.5倍以上
3，以上只是列出并归纳了部分标准，有些文献可能还会采用其它标准，但基本上都是这些类别的衍生，
4，我专门找了两篇有代表性的iTRAQ论文（近两年在MCP杂志上发表的，应该具有一定说服力），你们可以在ppt中看看，也可以自己去下载了解，是免费的，

作者: queen 时间: 2013-4-11 15:22

还想问下，如果我是用血清做的iTRAQ，找到某蛋白为可能差异蛋白。我看文献都是用Western blot来验证，请问，可以用ELISA么？

作者: xyw5 时间: 2013-4-11 15:23

可以的，你看我给写的ppt里面有一篇寻找血清疾病标志物的文章，也是用iTRAQ技术做的，发表在MCP杂志上，就是用了ELISA技术

作者: 阿凡提 时间: 2013-4-11 15:23

这个一般没有固定的，需要你后期做T检验和其它一些生物学信息分析，取决于你的数据质量，如果取1.2倍后P<0.05，证明你的数据质量很高，依然可用，并且会得到一些很有价值的差异表达信息

作者: queen 时间: 2013-4-11 17:24

这个一般没有固定的，需要你后期做T检验和其它一些生物学信息分析，取决于你的数据质量，如果取1.2倍后P<0.05，证明你的数据质量很高，依然可用，并且会得到一些很有价值的差异表达信息

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嗯，学习了。因为我看所有文章都用WB做验证，故而疑惑

作者: 8princess8 时间: 2013-4-11 17:25

那我觉得是不是还要做个1:1.5的混合样本出来看看在itraq里变成什么范围了，然后这个以外的才算呢

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那结果应该是1.5*0.7-1.5 那结果的范围更大。我还没找到什么理由反驳你这个建议。我想想再

作者: 8princess8 时间: 2013-4-11 17:25

我发现有些问题。我用95%可信区间算，均数加减1.96标准差是0.7-1.5，只能说明这些结果可能是1.0的样本。那难道超过这个范围就是有差异了吗，超过这个标准0.7-1.5只能说明他不是1.0的样本，难道1.1 就是真正有区别的蛋白吗。。好晕，再去讨论下。

作者: 8princess8 时间: 2013-4-11 17:26

那我觉得是不是还要做个1:1.5的混合样本出来看看在itraq里变成什么范围了，然后这个以外的才算呢

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先举个类似的例子。
想研究一下正常男生身高/体重的医学参考值范围。选取平原上的1000个正常男生，发现落在2-3之间，那么就说明正常男生的身高/体重，95%的落在2-3之间。之外的就是异常的。

我的实验
我把一个样品分成2分，那么这两份的蛋白种类和含量是很相似的（假设各有1000个一样的蛋白质），分别标记后混合，检测这1000个蛋白质在两组的含量比率，发现95%都在0.7-1.5之间，说明这个就是他的医学参考值范围，以后的实验落在之外的就是异常的。

这样解释觉得还比较合理，和第一次的说明（一个样本分成两份，理论上这1000个蛋白都是1：1）有点修改，感觉这样更确切。欢迎提问

作者: moonlight45 时间: 2013-4-11 17:27

您好，请问您iTRAQ试剂盒是在哪个公司订购的？价格是多少？

另外您了解过TMT 6plex试剂盒么是赛默飞世尔公司的产品

我的实验需要同位素标记，但是现在不知道这两种哪个好用，iTRAQ试剂盒在使用过程中怎么样？容易出什么问题不？

谢谢

作者: mamamiya 时间: 2013-4-11 17:28

您好，请问您iTRAQ试剂盒是在哪个公司订购的？价格是多少？
另外您了解过TMT 6plex试剂盒么是赛默飞世尔公司的产品

我的实验需要同位素标记，但是现在不知道这两种哪个好用，iTRAQ试剂盒在使用过程中怎么样？容易出什么问题不？

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谢谢
itraq比tmt常用，itraq定量动态范围和低丰度蛋白的定量比较差，剩下的主要是看质谱稳定性了，其他么都是很成熟的流程了

作者: zzzz 时间: 2013-4-11 17:28

楼主，你好！我觉得楼上的那个朋友说的挺好的。首先你需要确定的是：你得到的蛋白是确定无疑的。比如每个蛋白需要有2个或2个以上的可靠性肽段。只有在此基础上你才能对你的数据进行统计分析。
l（超过这个标准0.7-1.5只能说明他不是1.0的样本），我不太明白你这句话的意思。你的1:1的样本难道不是一个treatment，另一个假定为control的吗？

作者: any333 时间: 2013-4-11 17:29

您好，请问您iTRAQ试剂盒是在哪个公司订购的？价格是多少？
另外您了解过TMT 6plex试剂盒么是赛默飞世尔公司的产品

我的实验需要同位素标记，但是现在不知道这两种哪个好用，iTRAQ试剂盒在使用过程中怎么样？容易出什么问题不？

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谢谢
itraq试剂盒如果是有AB公司质谱的话在1w3左右，这个就是AB研发的。thermo的不清楚，没用过。具体用哪个要看你去什么地方打质谱，如果有AB公司的就买itraq的，如果用thermo的就买TMT的。

作者: ququer787 时间: 2013-4-11 17:30

我有个问题，在选择一个标准，比如1.5倍，我们委托华大基因给做的，结果回来是log2峰值比较，如果比较差异还原成峰值就是2的幂，最小值是0.没有负数，那下调选择负1.5是没有的。那下调的标准应该怎么选呢？

作者: 3648755 时间: 2013-4-11 17:30

itraq试剂盒停产了么？在英俊的网站上看到的，哪里还可以买到？

作者: 羊子的约会 时间: 2015-8-27 10:38 标题: 回复 #16 mamamiya 的帖子

需要TMT试剂或者itraq试剂可以联系我，电话18543138913，Q:706501998

作者: 羊子的约会 时间: 2015-8-27 11:24 标题: 回复 #16 mamamiya 的帖子

iTRAQ试剂一种体外标记试剂有4标和8标两种，比较效率高，稳定，市场认可度也很高，现阶段标记定量的蛋白组学的实验主要是以iTRAQ为代表，它的技术及相关的配套都是很成熟的，按照相关的使用说明书操作完全没有问题，而且操作步骤简单，而且标记效率高哦。

当然同类的产品有TMT试剂主要包括2、6、10标的，这个也是很不错的。 iTRAQ是ABI公司的， TMT是Therom的，试剂原理完全一样。

需要这两种试剂可以联系我，电话18543138913， Q：706501998

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