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标题: 【分享帖】Chromatin Immunoprecipitation（ChIP） [打印本页]

作者: superboy 时间: 2013-4-13 10:43 标题: 【分享帖】Chromatin Immunoprecipitation（ChIP）

Chromatin Immunoprecipitation（ChIP）实验指南及技术总结

ChIP是一项比较流行的研究转录因子（ transcription factor, TF）与启动子（promoter）相互结合的实验技术。由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。这个优势是EMSA这个体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的。当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。细胞内，当TF与Promoter相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。
一般ChIP的流程是：甲醛处理细胞——收集细胞，超声破碎——加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合——加入Protein A，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀——对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合——洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物——解交联，纯化富集的DNA片断——PCR分析。
在PCR分析这一块，比较传统的做法是半定量－PCR。但是现在随着荧光定量PCR的普及，大家也越来越倾向于Q－PCR了。此外还有一些由ChIP衍生出来的方法。例如RIP（其实就是用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合，具体方法和ChIP差不多，只是实验过程中要注意防止RNase，最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA）；还有ChIP-chip（其实就是ChIP富集得到的DNA片段，拿去做芯片分析，做法在ChIP的基础上有所改变，不同的公司有不同的做法，要根据公司的要求来准备样品）。
我ChIP做的比较多，RIP和ChIP-chip也做过（ChIP-chip用的是罗氏Nimblegen的产品）。这边主要和大家交流一下做ChIP实验的心得。当然这个帖子肯定会有很多漏洞，但是希望能一起讨论一下。另外如果有同学对RIP或者ChIP-chip有兴趣，可以在回帖中指出来，我尽量及时回答。

PS：我的实验步骤基本参考upstate试剂盒的说明书。

[ 本帖最后由 superboy 于 2013-4-13 10:45 编辑 ]

作者: superboy 时间: 2013-4-13 10:45

一、ChIP实验步骤

第一天：
（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。
1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243ul 37％甲醛，使得甲醛的终浓度为1％。（培养基共有9ml）
2、37摄氏度孵育10min。
3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。
450ul 2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5min即可。
4、吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。
5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中（PBS依次为5ml，3ml和3ml）。预冷后2000rpm 5min收集细胞。
6、倒去上清。按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。
假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80％。即为4×106个细胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。
将2管混在一起，共800ul。
7、超声破碎：VCX750，25％功率，4.5S冲击，9S间隙。共14次。

（二）、除杂及抗体哺育。
8、超声破碎结束后，10，000g 4度离心10min。去除不溶物质。
留取300ul做实验，其余保存于－80度。
300ul中，100ul加抗体做为实验组；100ul不加抗体做为对照组；100ul加入4ul 5M NaCl （NaCl终浓度为0.2M），65度处理3h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。
9、在100ul的超声破碎产物中，加入900ul ChIP Dilution Buffer和20ul的50×PIC。
再各加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。4度颠转混匀1h。
10、1h后，在4度静置10min沉淀，700rpm离心1min。
11、取上清。各留取20ul做为input。一管中加入1ul 抗体，另一管中则不加抗体。4度颠转过夜。

（三）、检验超声破碎的效果。
取100ul超声破碎后产物，加入4ul 5M NaCl，65度处理2h解交联。分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。

第二天：
（一）、免疫复合物的沉淀及清洗。
12、孵育过夜后，每管中加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。
4度颠转2h。
13、4度静置10min后，700rpm离心1min。除去上清。
14、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，在4度颠转10min，4度静置10min沉淀，700rpm离心1min，除去上清。
洗涤溶液：a. low salt wash buffer----one wash
b. high salt wash buffer-----one wash
c. LiCl wash buffer------one wash
d. TE buffer------two wash
15、清洗完毕后，开始洗脱。洗脱液的配方：100ul 10％SDS， 100ul 1M NaHCO3， 800ul ddH2O，共1ml。
每管加入250ul洗脱buffer，室温下颠转15min，静置离心后，收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500ul。
16、解交联：每管中加入20ul 5M NaCl（NaCl终浓度为0.2M）。
混匀，65度解交联过夜。

第三天：
（一）、DNA样品的回收
17、解交联结束后，每管加入1ul RNaseA（MBI），37度孵育1h。
18、每管加入10ul 0.5M EDTA， 20ul 1M Tris.HCl（PH 6.5），2ul 10mg/ml 蛋白酶K。
45度处理2h。
19、DNA片段的回收―――omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100ul ddH2O。

（二）、PCR分析

作者: superboy 时间: 2013-4-13 10:49

二、技术总结
（一）、关于细胞
细胞的生长状态要好。因为细胞的生长状态直接影响细胞内部的基因表达调控网络，也很有可能影响你所研究的TF与其靶Promoter的结合。
一般细胞长到75％－80％比较好。

（二）、关于抗体！
抗体是实验成败的致命因素之一！必须是IP级别的抗体，另外如果经济条件许可的话，尽量买大厂的抗体。不推荐国产抗体和santa cruz的抗体，即使是IP级别的。
单抗与多抗的选择也需要仔细考虑。两种抗体各有利弊。单抗特异性强，背景低。但是单抗有一个致命的弱点，就是识别位点单一，而在ChIP甲醛交联的过程中，很有可能该位点被其它蛋白或核酸结合而被封闭，导致单抗不能识别靶蛋白。多抗虽然没有这个问题，但是多抗特异性较差，背景可能会偏高。
一般而言，如果没有十足把握（单抗的识别位点远离靶蛋白与核酸结合的区域），选择多抗比较稳妥一些。

（三）、关于交联与超声破碎！
这一块的确是ChIP实验中比较难把握的部分。交联的程度会影响到超声破碎的效果，交联的程度越高，超声破碎就越不易把基因组打碎成小片段。
交联不充分，只有一部分靶蛋白与其Promoter相结合，富集得到的Promoter的量不高，实验假阴性。交联过充分，基因组上结合了太多的蛋白，对超声破碎造成障碍。另外也会增加背景。
一般来讲，按照我的经验，交联条件取决于细胞类型。不同的细胞系，交联的条件也不一样。例如：NIH－3T3的交联条件是室温（25摄氏度）下15min，1％的甲醛浓度，而别的细胞系则可能完全不一样。而超声破碎的条件，机器不一样，条件也不一样。当然如果你有bioruptor这样的神器，那么超声破碎对你而言就是小菜一碟了。
一般，理想的超声破碎得到的片段大小是200bp－1000bp。但是200bp－2000bp的范围也是可以接受的。

（四）、关于操作
希望尽可能的保持低温（4度）。
沉淀的时候可以先在4度放置一会，等它自然沉降一些，再超低转速（500rpm等）离心使其完全沉降。
虽然说明书上说ChIP实验的过程中有几个可以停顿的地方，我还是希望你能够连续把它做完，直到PCR结果出来为止。尽量避免实验中不可预知的影响因素。

（五）、关于解交联
虽然说明书上说4小时已经足够，但是我还是希望你可以解交联过夜。因为在那样的环境里，DNA不会降解，过夜解交联更充分些。只是不要忘记在EP管口封上封口膜。

（六）、关于DNA片段的回收
需要注意的是：样品中SDS样品较高，普通的PCR产物回收试剂盒回收，很有可能会在最终的样品中混入SDS，影响PCR实验结果。
小Tip：过柱前，在样品中加入一定量的异丙醇，能有效的消除SDS沉淀。

另外还有一些，一时想不起来。以后慢慢补充吧。

作者: H2O 时间: 2013-4-13 10:50

当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。细胞内，当TF与Promoter相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。

如果是表达的蛋白彼此很靠近，是否会交联成为一个大的团块么？
期待战友们的讨论

作者: Ao7 时间: 2013-4-13 10:50

如果是表达的蛋白彼此很靠近，是否会交联成为一个大的团块么？

你说的对。但是什么是“很靠近”呢？酶和底物；组蛋白和基因组；转录因子和启动子，那种才是靠的很近的关系。

作者: xueyouzhang 时间: 2013-4-13 10:51

对于chip on chip 芯片数据有没有研究呢？

作者: mickeylin 时间: 2013-4-13 10:51

非常感谢楼主分享自己的宝贵经验！

有个问题想问一下，我最近也打算做CHIP，看到很多文献都是用的Upstate的试剂盒，请问楼主也是用的该公司的Kit吗？谢谢！

作者: lxh031 时间: 2013-4-13 10:52

请问：可否用Chip法检测NF-kB与DNA的结合能力吗？与EMSA相比有什么优势吗？

作者: superboy 时间: 2013-4-13 10:52

对于chip on chip 芯片数据有没有研究呢？"

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罗氏直接把分析好的数据寄给我了，我还没有能力进行芯片的数据分析，呵呵。

作者: superboy 时间: 2013-4-13 10:53

”很多文献都是用的Upstate的试剂盒，请问楼主也是用的该公司的Kit吗？“

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我也是用了Upstate的Kit。因为一开始，只有Upstate有ChIP的试剂盒，但是现在有很多厂家开发了ChIP的试剂盒，选择面也很广了。

作者: superboy 时间: 2013-4-13 10:54

”可否用Chip法检测NF-kB与DNA的结合能力吗？与EMSA相比有什么优势吗？“

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与EMSA相比，优势就是直接研究了体内的情况。EMSA，并不能真实地模拟体内的环境，蛋白分子和核酸分子的浓度也发生变化了，更不用说蛋白分子和核酸分子在细胞内的定位问题。
“所谓的EMSA，其实就是在体外，将某一种核酸和某一种蛋白混合在一起，然后看它们是否能相互结合。
但是众所周知，体外环境和体内环境是完全不同的。
很有可能在体内，这种核酸和这种蛋白由于细胞区域定位的问题，根本不会相遇，也根本不会有结合的事情发生。但是在体外，当它们相遇时，它们却能结合。
也有可能在体内，这种核酸和蛋白的浓度相当的低，在这样低浓度的状况下，它们不会结合。但是在体外EMSA实验中，核酸和蛋白的浓度都增加了好几十倍。导致反应向阳性的方向进行，这种情况又该如何解释？
所以EMSA结果阳性，是能结合的必要条件，但却不是充分条件。”
ChIP结合realtime－PCR，基本上还是能相对真实的反映细胞内部转录因子和启动子的结合。但是具体问题具体分析。

作者: abc816 时间: 2013-4-13 10:54

请问楼主做RIP用的什么试剂盒？

作者: superboy 时间: 2013-4-13 10:55

QUOTE:

原帖由 abc816 于 2013-4-13 10:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请问楼主做RIP用的什么试剂盒？

RIP没有用试剂盒，是根据下面链接里的方法做的。
自己配了试剂。这个protocol不错，效果蛮好的，推荐一下：）
cuturl('http://www.epigenome-noe.net/researchtools/protocol.php?protid=28')

作者: qqq111 时间: 2013-4-13 10:55

RIP有专门的试剂盒，8月份新出的，12T据说要五千多，还要配套磁力设备要1千多
17-700 Magna RIP—12 IP reactions, includes negative
control IgGs, no positive control
•17-701 EZ-Magna RIP—12 IP reactions, includes 2
reactions of positive control AbAnti-SNRNP70
•17-704 Magna RIP (Quad)—48 IP reactions
有用upstate ChIP试剂盒基础上改装来做RIP的同志吗？

作者: qqq111 时间: 2013-4-13 11:02

RIP的产物除了荧光定量PCR，还可以进一步做那些实验呢，希望和有经验的同志们交流

作者: any333 时间: 2013-4-13 11:03

借这个帖子忽然想到个问题，目前研究蛋白和蛋白互作有经典的酵母双杂交以及后续的BiFC等；研究蛋白和DNA或是RNA互作有ChIP,如果是研究DNA与DNA或RNA之间的互作有什么方法吗？或者在信号途径的传导中，目前有研究是做DNA与DNA或RNA互作而调控的吗？有高人能回答下吗。

作者: abc816 时间: 2013-4-13 11:04

CHIP的试剂盒用millipore-upstate,货号17-371最为常用,效果老好了,有需要随时联系!
不是卖试剂哦!

作者: 紫烟 时间: 2013-4-13 11:04

好贴，收藏了先。我也打算做ChIP,目前对一些细节还不是很清楚，能否请教一下，启动子区的引物如何设计，如何保证其特异性?谢谢！

作者: duoduo 时间: 2013-4-13 11:14

请教达人：“在样品中加入一定量的异丙醇，能有效的消除SDS沉淀。”
这个怎么加？

作者: lxh031 时间: 2013-4-13 12:32

我对ChIP 的control 不明白。请教 ChIP在Q-PCR 反应中如何选择control, input 是control 吗？ Q-PCR 数据如何分析？
请楼主最好举例说明。多谢！！

作者: superboy 时间: 2013-4-13 12:33

启动子区很长，一般选用文献上已经定位好的启动子区，有些文献甚至会把引物序列公布出来，已经定位好的启动子区一般不会超过200bp。如果你研究的启动子没有细化定位过，那就很麻烦了。

异丙醇加个四分之一嘛

input是用来衡量不同种类的细胞的细胞量的。比如两种细胞A和B，研究某转录因子在这两种细胞中与某一个启动子的结合情况。那么细胞A和B的起始量必须是一样的，这个起始量就用input来控制。相信你已经看了protocol了，在操作过程的某一阶段中，取出等量的样品做为input，衡量input中该启动子的量，算出一定的比例（就是细胞量的比例）。最后ChIP得到的得到的数据要除以这个input的比例，方才是相同细胞量下结合情况的差异。

作者: xueyouzhang 时间: 2013-4-13 12:34

我想问一下UPSTATE的Kit中，做后续IB研究beads加SDS loading buffer是煮10分钟好像，但很多protocol都强调至少煮30反交联，有没有人做过的来解释一下，谢谢！

作者: hyuu 时间: 2013-4-13 12:34

好帖子，最近准备做。请问斑竹，为什么你只作了抗体和未加抗体组，而没有作其他抗体的阳性对照。

作者: superboy 时间: 2013-4-13 12:38

IB研究？不好意思不是很清楚。不过那个beads是agarose材料的。

作者: superboy 时间: 2013-4-13 12:39

QUOTE:

原帖由 xueyouzhang 于 2013-4-13 12:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我想问一下UPSTATE的Kit中，做后续IB研究beads加SDS loading buffer是煮10分钟好像，但很多protocol都强调至少煮30反交联，有没有人做过的来解释一下，谢谢！

抗体组是实验组，未加抗体组是阴性对照组。你可以用个组蛋白抗体之类做个正对照，是否真实需要正对照具体情况具体分析。

作者: superboy 时间: 2013-4-13 17:05

“我拿到了DNA，但是实验组和对照组的量不同，我在做PCR之前是否应该调平呀？还有为了降低背景我的把DNA的量在体系中控制在多少以下？”

ChIP最后得到的DNA的量，实验组和对照组肯定不同，做PCR之前当然需要调平，不然就没有可比性。调平的时候就是Input发挥作用的时候了，实验组和对照组的Input其实就代表了ChIP实验的起始样品量（或者说是细胞量，DNA总量）。以Input为模板，引物扩增，计算出不同样品之间Input量的倍数，然后按照这个倍数，将ChIP产物按比例稀释。就调平了。
不过还是建议你做Q-PCR，Q-PCR更精确些。

至于“还有为了降低背景我的把DNA的量在体系中控制在多少以下？”
这个是要摸索条件的。
不过有一点需要注意下：就是反应体系中样品量最少应为2微升。因为我们所用的最小量程的枪为2.5微升，而枪在取样的时候总有误差。取样越少，那么误差在取样总量中所占比例越大，误差也越大。
Good Luck with your experiments!

作者: 831226 时间: 2013-4-13 18:06

以上谈的基本上都是从细胞开始做的，有没有从组织开始做chip的protocol呢？

作者: dongdongqiang 时间: 2013-4-16 12:30

请问楼主，用的是哪家的抗体？抗体浓度多大呢？1ml的体系，只加1ul的抗体做免疫沉淀，相当于抗体的稀释比为1：1000，这样可以吗？我准备用，cell signaling的，推荐的chip抗体稀释比是1：50，我就觉得一管抗体还不够我做一次预实验呢，非常困惑中，期待您的解答，谢谢！

作者: dongdongqiang 时间: 2013-4-16 12:31

还有就是我超声破碎时，出现了很奇怪的现象，就是大约在100bp处有一团，但弥散的带从5000到100bp都有，请问楼主这是什么状况呀？该如何改善呀？
还有如果我加入SDS Lysis Buffer，使得细胞终浓度为每200ul含4×106个细胞。这样细胞数可以更多一些，这样可以吗？

初次做chip,问题比较多，现在正焦头烂额中，期待得到高手的指点！

作者: dongdongqiang 时间: 2013-4-16 12:31

“将2管混在一起，共800ul。超声破碎：VCX750，25％功率，4.5S冲击，9S间隙。共14次。”
请问楼主，超声时，用的是800ul体系？为啥要准备这么大的体系？还有vcx指最大功率，就是楼主实际用的功率为750*25%=187？

不好意思一下子提了这么多问题，从您的总结里我学了不少，但这些细节问题能够使我少走很多弯路，我提问的时候没有总结好，辛苦楼主了，希望每个问题都能得到解答。万分感谢。

作者: superboy 时间: 2013-4-16 12:32

"请问楼主，用的是哪家的抗体？抗体浓度多大呢？1ml的体系，只加1ul的抗体做免疫沉淀，相当于抗体的稀释比为1：1000，这样可以吗？我准备用，cell signaling的，推荐的chip抗体稀释比是1：50，我就觉得一管抗体还不够我做一次预实验呢，非常困惑中，期待您的解答，谢谢！ "

我用的是Sigma的抗体。加入抗体的量不是用体积来衡量的，而是用质量来衡量。我的抗体是2mg/ml。我加1ul就是2ug的量。

“还有就是我超声破碎时，出现了很奇怪的现象，就是大约在100bp处有一团，但弥散的带从5000到100bp 都有，请问楼主这是什么状况呀？该如何改善呀？
还有如果我加入SDS Lysis Buffer，使得细胞终浓度为每200ul含4×106个细胞。这样细胞数可以更多一些，这样可以吗？”

100bp处的一团是RNA。
提高细胞浓度，调整一下实验条件当然是可以的啊。

““将2管混在一起，共800ul。超声破碎：VCX750，25％功率，4.5S冲击，9S间隙。共14次。”
请问楼主，超声时，用的是800ul体系？为啥要准备这么大的体系？还有vcx指最大功率，就是楼主实际用的功率为750*25%=187？”

因为收集细胞时要配平，所以我用了2管。然后混在一起是800ul。
因为我用的超声破碎仪是探针式的，如果体积太小，探针插入太浅就不好超声。所以我在1.5ml的EP管里用800ul的体系超声。如果你用的是Bioruptor之类的水浴式超声仪，就不用考虑体系大小的问题了。
vcx750是我的超声仪的型号。实际功率的话，我也不是很清楚。每个超声仪，都需要摸下条件。

作者: xyw5 时间: 2013-4-16 12:33

请问大家Novus Biologicals 公司的抗体怎么样啊？

作者: superboy 时间: 2013-4-16 12:33

1 我定了试剂盒，但是试剂都比较少，我想自己配些试剂。在丁香园上看了您的贴子，里面有相关的配方。但是我搞不清楚CHIP dilution buffer 和 elution buffer 有什么区别。上面只有前者的配方，没有后者的。
2 超声后解交联跑出来的竟然是条带，大概是700左右看别人的图都是弥散的啊不知道我做的是不是有什么问题这样可以拿来做实验了吗
3 超声后的上清液冻于-80后，反复解冻上3次用于后面的实验可以吗
4 那个磁珠在免疫沉淀后可不可以离心的，洗时可以用枪吹成悬浮液吧？
5 解交联时放水浴锅（62c）里静置过夜可以吗说明书上说要rotate，我们这没有这样的装置，除非就是摇菌的摇床

answer：
1. CHIP dilution buffer是稀释超声破碎后的产物的； elution buffer 是从Protein A-argose上洗脱目的片段的，成分在protocol后面有，是碳酸氢钠+SDS。
2. 超声后解交联，得到700bp的单一条带？这是不可能的事情。。。。
或者你上个图给我看看。
3. 反复冻融会导致蛋白变性。有2个影响：一是蛋白变性，抗体识别不了目的蛋白；二是蛋白变性，凝聚沉淀。。。。显然后面的影响很恐怖。所以，尽量不要冻融吧。ChIP本来就不好做，何必再加上那些影响结果的过程。
4. 可以离心，但是要低转速，我的经验是700转就够了。悬浮液你还是上下翻EP管吧，用枪吹太激烈！
5. 过夜可以。但是要防止液体挥发，要用封口膜。。解交联可以静置的，我也是静置的。

作者: hyuu 时间: 2013-4-16 12:35

下面的图是我超声解交联后的情况，marker分别是2000,1000,750，500,250

图片附件: 14958764.jpg (2013-4-16 12:35, 3.54 KB) / 该附件被下载次数 46
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15660

作者: hyuu 时间: 2013-4-16 12:35

用上面这个超声条件做后续实验，PCR结果显示加IgG的那组也扩了出来。
后来我把超声的功率加大些，超声后解交联的图如下。很是疑惑。

图片附件: 99322194.jpg (2013-4-16 12:35, 5.39 KB) / 该附件被下载次数 37
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15661

作者: superboy 时间: 2013-4-16 12:36

第一张图750bp处弯弯的东西是样品里SDS含量过高引起的。

第一张图，其实超声的还可以，虽然主要在1000bp--2000bp之间，但总算有个主带。

第二张图，看不懂，加大了功率反而片段更大。

超声是比较麻烦的事情，影响超声片段大小的因素也很多，比如交联的程度。

还是多看看已发表的文章里，别人做ChIP的条件吧。

作者: lixi559 时间: 2013-4-16 12:36

请问楼主，在抗体孵育及免疫复合物沉淀的步骤中，常常要在4度颠转，因为实验室条件所限，我可否将EP管平躺放在冰盒中，然后将冰盒放在侧摆摇床摇呢？这样会对结合有什么影响吗？

作者: superboy 时间: 2013-4-16 12:37

QUOTE:

原帖由 lixi559 于 2013-4-16 12:36 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请问楼主，在抗体孵育及免疫复合物沉淀的步骤中，常常要在4度颠转，因为实验室条件所限，我可否将EP管平躺放在冰盒中，然后将冰盒放在侧摆摇床摇呢？这样会对结合有什么影响吗？ ...

肯定不稳定。

建议你买一个颠转仪，国产的就行，很便宜的，估计也就几百块。
然后把颠转仪放在4度冰箱里做实验。
这样温度，转速相对稳定些。

作者: finger 时间: 2013-4-16 12:37

谢谢楼主的分享。
想请教一下，您说的样品中SDS样品比较高，普通的PCR产物回收试剂盒回收，可能会在最终样品中混入SDS。可以加异丙醇，请问在哪一步中加，浓度大概是多少。是否适用于所有kit.我们用的是quigen 的PCR purification kit. 不知道合用不。
还有请问如何确定自己用的试剂盒是否需要加异丙醇?

作者: finger 时间: 2013-4-16 12:38

还有您说您用的胶回收试剂盒，请问这个和pcr的试剂盒有什么区别不。是不是把第一个buffer直接加在最后的溶解液里。我们这里有QUIGEN的gel extraction kit.不知道是不是一样合用。
我看了一下我们这里有3种试剂盒，都是QUIGEN的。
1。QIAquick PCR purification kit. 这里面的第一个PBIbuffer里面含有异丙醇(这个我自己是不是就不用加iso了)（Isopropanol）
2.QIAquick gel extraction kit.这个kit和上面的kit几乎一样只是第一个buffer不一样，我看了一下说明书，说如果直接从溶液中提而不溶gel的话，自己加点iso就可以了。
2。QIAEXII 可以溶解gel也可以直接提DNA,但是这个kit不用过滤柱，似乎提的比较不纯。但是它没提加iso的事情。

作者: finger 时间: 2013-4-16 12:38

又来请教楼主了，最终的elution solution 一共是500ul，这个容积很大，用试剂盒做感觉很费试剂呢。我看到有的实验室用60代替250去溶最后的beads，不知道这样是否能完全溶解。或者用100之类的，尽可能减少最终体积，不知道楼主是否做过，对结果是否有影响。谢谢。

作者: finger 时间: 2013-4-16 12:38

继续请教，关于甲醛固定。我一直以为甲醛37度固定10分钟后，不管交联如何，至少细胞应该是死亡的。现在用贴壁细胞做，固定10分钟后用typan blue染色计数，可以见到细胞死亡，染色为蓝色。
可是我也用悬浮细胞baf3做了一次，发现相同条件下固定10分钟后，用bypan blue染色计数的时候发现细胞并没有染色，仍然是白色可见细胞核的状态（同固定前颜色形态一致）。请问这种是为什么，细胞是否死亡，交联是否建立?

作者: finger 时间: 2013-4-16 12:39

还有您说您用的胶回收试剂盒，请问这个和pcr的试剂盒有什么区别不。是不是把第一个buffer直接加在最后的溶解液里。我们这里有QUIGEN的gel extraction kit.不知道是不是一样合用。
我看了一下我们这里有3种试剂盒，都是QUIGEN的。
1。QIAquick PCR purification kit. 这里面的第一个PBIbuffer里面含有异丙醇(这个我自己是不是就不用加iso了)（Isopropanol）
2.QIAquick gel extraction kit.这个kit和上面的kit几乎一样只是第一个buffer不一样，我看了一下说明书，说如果直接从溶液中提而不溶gel的话，自己加点iso就可以了。
2。QIAEXII 可以溶解gel也可以直接提DNA,但是这个kit不用过滤柱，似乎提的比较不纯。但是它没提加iso的事情。

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折腾了一圈，这个问题自己可以稍微解决一下了，写出来共享。
1，  pcr purification 可用于提取各种溶液中的断片，适用于提取chip最后DNA。但是kit里的binding buffer－PBI 量太少，可以去该公司购买buffer PB，成分和PBI基本一样，只是缺少一个可以用来检测PH值的成分，而这个有没有并不重要。
2，  QIAquick gel extraction kit.这个kit可以用来直接提取孝素切溶液。但是不能用来直接提取PCR溶液。Chip可能也不适用。跑胶后可以。
3，  QIAEXII，不能用来直接提取PCR溶液中的DNA。跑胶后可以。Chip恐怕也不适用。

加不加iso仍待回答。

作者: 49888 时间: 2013-4-16 12:39

ChIP是一项比较流行的研究转录因子（ transcription factor, TF）与启动子（promoter）相互结合的实验技术。由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。这个优势是EMSA这个体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的。当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。细胞内，当TF与Promoter相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。
一般ChIP的流程是：甲醛处理细胞——收集细胞，超声破碎——加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合——加入Protein A，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀——对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合——洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物——解交联，纯化富集的DN***断——PCR分析。
在PCR分析这一块，比较传统的做法是半定量－PCR。但是现在随着荧光定量PCR的普及，大家也越来越倾向于Q－PCR了。此外还有一些由ChIP衍生出来的方法。例如RIP（其实就是用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合，具体方法和ChIP差不多，只是实验过程中要注意防止RNase，最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA）；还有ChIP-chip（其实就是ChIP富集得到的DN***段，拿去做芯片分析，做法在ChIP的基础上有所改变，不同的公司有不同的做法，要根据公司的要求来准备样品）。
我ChIP做的比较多，RIP和ChIP-chip也做过（ChIP-chip用的是罗氏Nimblegen的产品）。这边主要和大家交流一下做ChIP实验的心得。当然这个帖子肯定会有很多漏洞，但是希望能一起讨论一下。另外如果有同学对RIP或者ChIP-chip有兴趣，可以在回帖中指出来，我尽量及时回答。

PS：我的实验步骤基本参考upstate试剂盒的说明书。附件就是upstate的推荐说明书。

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推荐阅读：染色质免疫沉淀（ChIP）技术的难点及应用(作者：柴晶晶博士)

染色质免疫沉淀技术的原理是：在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DN***段沉淀下来。染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA的纯化，以及DNA的鉴定。因为ChIP实验涉及的步骤多，结果的重复性较低，所以对ChIP实验过程的每一步都应设计相应的对照，而且对结果的分析也需要有一定的经验。对于刚刚开始使用ChIP技术的研究人员来说，使用成熟的商品化试剂盒和相关的技术服务会达到事半功倍的效果，比如Millipore公司的EZ-ChIP试剂盒就是专门为初学者设计的入门产品。下面我们就最基本的实验步骤，实验中的小技巧以及需要注意的问题简单介绍一下。

全文地址:cuturl('http://blog.milliporechina.com/entry/ChIP1.html')

作者: zranqi_1 时间: 2013-4-16 12:40

推荐：RIP 技术，研究肿瘤发生和转移中microRNA失调的有力工具(作者：钟丹丹博士)
摘要：miRNA对许多生理过程产生重要影响，如细胞生长、凋亡、应激应答、干细胞分化潜能的维持以及新陈代谢等。据估计，脊椎动物基因组编码多达1000种不同的miRNA，研究人员推测，这些miRNA可能调控至少30%的基因的表达。尽管研究人员目前已在人体内发现超过530种miRNA，但仍需进一步研究以了解这些分子的确切的细胞学功能，及其在疾病发生中所扮演的角色。

全文地址：cuturl('http://blog.milliporechina.com/entry/RIP.html')

作者: zranqi_1 时间: 2013-4-16 12:40

推荐易用型ChIP试剂盒：cuturl('http://www.millipore.com/catalogue/item/17-371')
升级版磁珠ChIP试剂盒：cuturl('http://www.millipore.com/antibodies/ab2/magna_chip')
经ChIP实验验证的抗体：cuturl('http://www.millipore.com/antibodies')
密理博技术支持热线：400-889-1988

作者: xueyouzhang 时间: 2013-4-16 12:41

楼主辛苦了，好贴，做了两次都是阴性，很是打击，今天看到此贴似乎见到了点曙光

作者: KGZ564 时间: 2013-4-16 12:41

好贴子。最近有打算进行chip实验。可是一直没什么头绪。老板希望我能够开展起来。
期待通过拜读您的帖子能很快入门！

作者: jrwyyplt 时间: 2013-4-16 12:41

有没有从组织开始的protocol呢？

作者: any333 时间: 2013-4-16 13:51

这里说的大多是用打断的方法进行ChIP实验的，楼主有没有用过MNase酶切来做ChIP呢，我现在的问题是我的酶切条件一直都不稳定，并且总是在100bp出出现一条带，这个带也是RNA吗？

作者: bamboo16 时间: 2013-4-16 14:25

酶切的片段比较均一，不会出现那么小的片段啊，一般200bp+

作者: yapuyapu 时间: 2013-4-16 14:25

用BIOVISION的，我用的这个效果很好啊~~

作者: 66+77 时间: 2013-4-16 14:26

我要做RNA-chip，不知道和DNA的CHIP有哪些不同？你说“具体方法和ChIP差不多，只是实验过程中要注意防止RNase，最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA”，能不能详细点说啊！！好不容易看到有做过RNA-chip的啊！！

作者: superboy 时间: 2013-4-16 14:27

我要做RNA-chip，不知道和DNA的CHIP有哪些不同？你说“具体方法和ChIP差不多，只是实验过程中要注意防止RNase，最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA”，能不能详细点说啊！！好不容易看到有做过RNA-chip的啊！！

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关于RNA-ChIP，基本原理和DNA-ChIP差不多。详细的Protocol可以参见附件！来自国外知名医学院。
如果你下载不了附件。这个是链接：cuturl('http://www.epigenome-noe.net/WWW/researchtools/protocol.php?protid=28')
希望对你有用！

作者: am10 时间: 2013-4-16 14:29

谢谢LZ提供的宝贵资料。

我有2个问题想请教一下：
1、chip试验中60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA这个东西是干什么用的？只能用这个吗？
2、你提到TF和Promoter是生物意义上的结合，我想知道这个“生物意义上的结合”是什么样的一种结合方式，它与化学键的结合有什么区别？是指电子力吗？

多谢指教~

作者: wood533 时间: 2013-4-16 14:31

非常感谢楼主。

我记得在哪看过，在交联DNA和蛋白质的时候，可以用甲醛，也可以用一种酶，我当时没留意，给忘了，好像两种方法所适合的范围不同，真遗憾，找了半天也没再查到。。。

还有个问题，可以用组织来进行CHIP吗？

作者: superboy 时间: 2013-4-16 14:31

2、你提到TF和Promoter是生物意义上的结合，我想知道这个“生物意义上的结合”是什么样的一种结合方式，它与化学键的结合有什么区别？是指电子力吗？

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我所说的生物意义上的结合就像酶与底物的结合，核小体蛋白与DNA的结合。等等。。
至于“Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA”是指用鲑精DNA/BSA饱和的Protein A琼脂糖。
Protein A能特异的识别抗体的Fc段，从而能与所有的IgG抗体结合，加入鲑精DNA/BSA是为了掩盖掉琼脂糖表面空白的地方，降低背景。原理和Western需要封闭一样的。至于为啥用鲑精DNA，那是因为鲑精DNA与人的同源序列少。用鲑精DNA，即使最终的产物中混杂了鲑精DNA，也不会影响到后续的荧光定量PCR检测。

不好意思。很久没登陆了。。。

作者: sunnyB 时间: 2013-4-16 14:32

请问下自己的ProteinA+G agarose用来做Chip实验，该怎么预处理，，salmon sperm DNA和BSA自己都有的，求详细步骤。

作者: avi317 时间: 2013-4-16 14:33

大家好！

我刚刚接触ChIP，帮忙看看这个sonication是否可行？（没有经过DNA抽提，只是裂解产物离心上清经过RNAase 和蛋白酶K消化）

另请各位高手给点建议，

不胜感激！！

图片附件: 93505325.snap.jpg (2013-4-16 14:33, 123.87 KB) / 该附件被下载次数 23
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15662

作者: redbutterfly 时间: 2013-4-16 14:46

RIP以用甲醛是不是不可交联啊，如果我用甲醛把感兴趣的蛋白和其他蛋白交联到一起，那么拉出来的RNA岂不是很杂，不知道想得对不对，请指教。

作者: 831226 时间: 2013-4-16 14:47

楼主！我的问题是我的chip结果阴性对照也有阳性带！而且重复了好几次，都有阳性带，郁闷！！！

作者: wood533 时间: 2013-4-16 14:51

我有一个问题想请教：就是CHIP里DNA纯化那一步用纯化柱的话，第一个BUFFER加进去后会有很多沉淀产生，这沉淀是什么呢？是SDS吗？可以直接离心丢掉吗？急盼回复，非常感谢。

作者: yychen 时间: 2013-4-16 14:51

哪位有做CHIP的cell lysis buffer 及nuclear lysis buffer的配方可否分享一份呢？

作者: TAT 时间: 2013-4-16 14:52

弱弱地提问一下：chip是只能做已知启动子与蛋白的结合吗？如果是转录因子与其他顺式元件结合的可以吗？后者的结合可能没有前者结合那么紧密，对实验的结果影响如何啊？如果不清楚启动子，后序的PCR该怎么做呢？急求解答啊，谢谢！

作者: 98776langtao 时间: 2013-4-16 14:54

看了帖子获益良多啊！有些问题不是很清楚，还请高手指教啊：input对照的作用是什么？是不是所有的引物在input对照里都能P出条带？看帖子又说用抗体同源的血清做对照的，这个对照是不是阴性对照？用的时候加多少血清呢？

作者: utt0989 时间: 2013-4-16 14:55

想请教楼主抽提DNA后，是否需要将DNA调平后再做QPCR？还是直接等PCR结束后用Input来调整，可调整后IgG组也有一定的百分率，虽然相对抗体组为低，十分困惑！另外我用IgG来做阴性对照，Background总是很高。谢谢楼主指教！

作者: utt0989 时间: 2013-4-16 14:56

我查了一些对CHIP QPCR结果分析，发现有的方法根据每个样品的Input来进行调整，但这只是单个样本的结果，没有将IgG的background进行消除，另外的方法只是把将实验组与IgG组的Ct相减，又没有将Input的情况考虑进去。楼主有没有好的分析方法？苦闷中.......

作者: wmp1234 时间: 2013-4-16 14:58

请教一下chip可以反映组蛋白甲基化程度的原理是什么啊？请各位多多指教非常感谢

作者: superboy 时间: 2013-4-16 14:59

谢谢LZ提供的宝贵资料。

我有2个问题想请教一下：
1、chip试验中60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA这个东西是干什么用的？只能用这个吗？
2、你提到TF和Promoter是生物意义上的结合，我想知道这个“生物意义上的结合”是什么样的一种结合方式，它与化学键的结合有什么区别？是指电子力吗？

多谢指教~

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你好：
1、Protein A琼脂糖和鲑精DNA混合物。鲑精DNA是用来封闭琼脂糖上面的非特异性结合位点，降低背景的。protein A 琼脂糖是结合和抗体之后，把蛋白-抗体复合物沉淀下来的。
2、我认为化学上的结合是有化学键的，比较稳定。生物学意义上的结合，其实就像“酶与底物”之间的结合一样，靠的比较紧而已。

作者: superboy 时间: 2013-4-16 15:11

非常感谢楼主。

我记得在哪看过，在交联DNA和蛋白质的时候，可以用甲醛，也可以用一种酶，我当时没留意，给忘了，好像两种方法所适合的范围不同，真遗憾，找了半天也没再查到。。。

还有个问题，可以用组织来进行CHIP吗？

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你好！
交联都是需要甲醛的。在甲醛的作用下，”蛋白-蛋白“，”蛋白-核酸(包括DNA和RNA)“之间会产生化学键。形成比较稳定的复合物。
随后的细胞破碎阶段，可以用超声破碎，也可以用一种酶（具体我也不记得了）。
组织也可以进行ChIP。只是交联的条件可能需要好好摸索下。

作者: superboy 时间: 2013-4-16 15:12

请问下自己的ProteinA+G agarose用来做Chip实验，该怎么预处理，，salmon sperm DNA和BSA自己都有的，求详细步骤。

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详细的步骤，可以查看millipore upstates的试剂盒说明。
鲑精DNA需要先超声破碎成一定长度。另外还需要叠氮钠之类的。
配好溶液后，与琼脂糖反复置换，把琼脂糖溶液置换掉即可。

作者: superboy 时间: 2013-4-16 15:21

RIP以用甲醛是不是不可交联啊，如果我用甲醛把感兴趣的蛋白和其他蛋白交联到一起，那么拉出来的RNA岂不是很杂，不知道想得对不对，请指教。

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RIP可以用甲醛交联。
甲醛是会交联蛋白-蛋白。所以交联时间的长短对于ChIP很重要。

作者: superboy 时间: 2013-4-16 15:21

楼主！我的问题是我的chip结果阴性对照也有阳性带！而且重复了好几次，都有阳性带，郁闷！！！

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这样的结果在ChIP里面是很正常的。
说到底，ChIP只不过是通过抗体，富集了和特定蛋白结合的DNA而已。仅仅是富集。
对于目标条带，如果实验组是对照组的好几倍，而管家基因的条带差不多，那么就是实验成功了。

当然，ChIP实验比较难，失败了也是很大概率的事情。

作者: superboy 时间: 2013-4-16 15:21

我有一个问题想请教：就是CHIP里DNA纯化那一步用纯化柱的话，第一个BUFFER加进去后会有很多沉淀产生，这沉淀是什么呢？是SDS吗？可以直接离心丢掉吗？急盼回复，非常感谢。

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是的。这个沉淀是SDS。
SDS沉淀会连带DNA一起沉淀。会对实验造成影响。
我的解决方法是：把洗脱液分成几份，加水稀释，这样SDS也被稀释了。加入Buffer之后，也不会有沉淀。最后将纯化产物合并到一起。

作者: superboy 时间: 2013-4-16 15:23

弱弱地提问一下：chip是只能做已知启动子与蛋白的结合吗？如果是转录因子与其他顺式元件结合的可以吗？后者的结合可能没有前者结合那么紧密，对实验的结果影响如何啊？如果不清楚启动子，后序的PCR该怎么做呢？急求解答啊，谢谢！

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转录因子与DNA的结合也是可以用ChIP检测的。
后续PCR检测时，引物的设计是个问题，一般是参考文献查询。实在找不到文献，那么就在最有可能的区段设计引物吧。

作者: superboy 时间: 2013-4-16 15:23

看了帖子获益良多啊！有些问题不是很清楚，还请高手指教啊：input对照的作用是什么？是不是所有的引物在input对照里都能P出条带？看帖子又说用抗体同源的血清做对照的，这个对照是不是阴性对照？用的时候加多少血清呢？

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input是用来调节起始的细胞量的，使得对照组和实验组的起始细胞量一致。
抗体同源的血清是用来做为抗体负对照的，这样的负对照比较严格。但其实，只需要用一个来源物种一致的无关抗体就可以了。或者买只有Fc片段的抗体。

作者: superboy 时间: 2013-4-16 15:24

想请教楼主抽提DNA后，是否需要将DNA调平后再做QPCR？还是直接等PCR结束后用Input来调整，可调整后IgG组也有一定的百分率，虽然相对抗体组为低，十分困惑！另外我用IgG来做阴性对照，Background总是很高。谢谢楼主指教！

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用Input调平后，用Q-PCR检测。
IgG组比抗体组低就可以了，恭喜你。
如果要降低背景，那么在实验过程中，一些小细节再注意下就行了。

作者: utt0989 时间: 2013-4-16 15:24

想请问一下为什么不推荐用santa抗体呢，愿闻其详

作者: summerxx 时间: 2013-4-16 15:25

你好，我接下来准备做动物组织的CHIP，不知楼主有没有这方面的经验，希望楼主不吝赐教，谢谢！！

作者: DNA 时间: 2013-4-16 15:26

用Input调平后，用Q-PCR检测。
IgG组比抗体组低就可以了，恭喜你。
如果要降低背景，那么在实验过程中，一些小细节再注意下就行了。

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还以为没人理睬，幸亏今天上来看看。感谢LZ！还有些不明白的，LZ提到用Input调平是在做Q-PCR之前吗？根据Input的DNA含量来确定各组做Q-PCR的DNA含量？我现在各组DNA大约是2-10NG，各组之间不是均等的，等Q-PCR做完后，再根据Input来调整IgG和抗体组，请LZ指教

作者: superboy 时间: 2013-4-16 15:28

你好，我接下来准备做动物组织的CHIP，不知楼主有没有这方面的经验，希望楼主不吝赐教，谢谢！！

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动物组织的ChIP貌似交联比较困难，我一直都是做的细胞。不好意思，不能给予经验了。

作者: superboy 时间: 2013-4-16 15:28

还以为没人理睬，幸亏今天上来看看。感谢LZ！还有些不明白的，LZ提到用Input调平是在做Q-PCR之前吗？根据Input的DNA含量来确定各组做Q-PCR的DNA含量？我现在各组DNA大约是2-10NG，各组之间不是均等的，等Q-PCR做完后，再根据Input来调整IgG和抗体组，请LZ指教

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你好！
input存在的意义在于，调节实验组和对照组的细胞量（总DNA量）一致。倘若实验组的细胞量是对照组的一倍，那么，最后得到的产物，就来检测目的条带的量的话，肯定是不准的。
在做Q-PCR的时候，倘若设置了管家基因（例如beta-actin）的PCR对照，那么可以根据管家基因的量来调节。
总之，就是让实验组和对照组的起始DNA量一致。

作者: hold住 时间: 2013-4-16 15:29

动物组织的ChIP貌似交联比较困难，我一直都是做的细胞。不好意思，不能给予经验了。

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我想再问一个问题，就是说在超声之后是否有方法可鉴定一下超声后的片段大小，因为初次做可能超声的时间、强度等这些条件都需要摸索，而做CHIP的话那个试剂盒也比较贵，所以我想着可否先鉴定下超声后的片段大小，然后进一步用试剂盒去做。谢谢楼主！！

作者: superboy 时间: 2013-4-16 15:30

我想再问一个问题，就是说在超声之后是否有方法可鉴定一下超声后的片段大小，因为初次做可能超声的时间、强度等这些条件都需要摸索，而做CHIP的话那个试剂盒也比较贵，所以我想着可否先鉴定下超声后的片段大小，然后进一步用试剂盒去做。谢谢楼主！！

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超声之后跑电泳检测。是一条200bp-1000bp之间的smear

作者: BOSS2011 时间: 2013-4-16 15:31

超声之后跑电泳检测。是一条200bp-1000bp之间的smear

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为啥俺每次超声以后都是在200bp-1000bp之间有一条亮的条带？不是弥散的。

作者: NBA 时间: 2013-4-16 15:31

楼主把荧光定量前后的步骤给我们说一下
还有就是最后得到数据后该怎么处理

作者: IAM007 时间: 2013-4-16 15:32

我的不加抗体的和加抗体的pcr结果都有条带，但都比INPUT的条带暗很多，不加抗体的不应该扩不出条带的吗？

作者: 831226 时间: 2013-4-16 15:33

RIP没有用试剂盒，是根据下面链接里的方法做的。
自己配了试剂。这个protocol不错，效果蛮好的，推荐一下：）
cuturl('http://www.epigenome-noe.net/researchtools/protocol.php?protid=28')

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这个链接打不开，楼主能不能给我一份，我都弄了几个月了，连siRNA阳性的都没有拉出来，怎么回事啊？请不吝指点，谢谢楼主了。

作者: ending 时间: 2013-4-16 15:34

请教lz
想问做ChIP必须要用细胞吗？是什么细胞呢，导师说我提基因组DNA就成。我是想找跟猪的A性状相关的一些基因，做ChIP-seq。因为看到好多ChIP的步骤，交联的地方都是要用细胞的，我一直很困惑这个细胞是啥。导师的意思是说采猪的某一个器官，然后提取基因组DNA，然后做ChIP，然后做测序，我还是云里雾里的不懂是该怎么做的。
先谢过啦！

作者: yes4 时间: 2013-4-16 15:35

准备做CHIP ，正在实验设计阶段，想请教一下，目的基因的引物设计有什么特别要求吗？看论坛里有位战友曾经问楼主引物设计是不是需要针对目的基因的启动子，于是感到矛盾，因为先前我接触的引物的设计均是以基因的CDS区来设计的，谢谢

作者: yes4 时间: 2013-4-16 15:44

请楼主帮我分析一下我的超声的结果啊，谢谢了，我的超生参数是功率20% 超2 秒间隔5秒，请问楼主最下面的亮的是不是SDS ，第五个泳道和第六个比较有裂解效果吗？

图片附件: 34731475.png (2013-4-16 15:45, 43.74 KB) / 该附件被下载次数 32
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15663

作者: yes4 时间: 2013-4-16 15:47

忘了说了，总共超了4min ,产物用RNaseA 和蛋白酶K 处理后跑的胶，然后marker的大小是100bp .谢谢了

作者: ukonptp 时间: 2013-4-16 15:54

楼主，我想用人的外周血做CHIP，和培养的细胞在开始做的时候有什么不同？盼回复，谢了！

作者: Ao7 时间: 2013-4-16 15:56

恳请指教：我欲检测一个基因启动子区组蛋白甲基化修饰的变化，据说基因的启动子在-2000 bp到 +200 bp之间，但我具体针对那一小段设计引物呢？
谢谢！

作者: standbyme 时间: 2013-4-16 15:56

请问甲醛交联后必须用glycine终止反应吗？可不可以直接用不加不加蛋白酶抑制剂的PBS洗两遍？是不是用PBS洗过以后可以直接用细胞刮刀将细胞刮下来放到-80度保存。因为想多保存一点样本，到时候一并做。谢谢

作者: www.1 时间: 2013-4-16 15:57

ChIP是一项比较流行的研究转录因子（ transcription factor, TF）与启动子（promoter）相互结合的实验技术。由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。这个优势是EMSA这个体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的。当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。细胞内，当TF与Promoter相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。
一般ChIP的流程是：甲醛处理细胞——收集细胞，超声破碎——加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合——加入Protein A，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀——对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合——洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物——解交联，纯化富集的DNA片断——PCR分析。
我是刚刚进入实验室的菜鸟，请问proteinA是干啥的，如果我测S蛋白与某段基因有没有相互作用，应该怎么操作呢，请大神稍作指点，不胜感激。

作者: lixi559 时间: 2013-4-16 15:58

我们做了半年了，但是一直没有成功，想请教一下楼主……
我们不是单纯用的超声，而是用的MNase酶消化+超声（有用甲醛交联），western检测input中含有我们想要的目的蛋白条带，但是IP后的产物中就没有目的蛋白的条带，一直找不到原因，希望楼主能帮忙参考一下，谢谢……

作者: dog002 时间: 2013-4-16 15:58

能详细描述一下你做chip 后的QPCR 过程么？做qPCR需要设置内参（如Actin ,GAPDH）,需要建立标准曲线么？你获得的数据最后是如何分析处理的啊？谢谢！

作者: XYZQ 时间: 2013-4-16 16:02

这样的结果在ChIP里面是很正常的。
说到底，ChIP只不过是通过抗体，富集了和特定蛋白结合的DNA而已。仅仅是富集。
对于目标条带，如果实验组是对照组的好几倍，而管家基因的条带差不多，那么就是实验成功了。

当然，ChIP实验比较难，失败了也是很大概率的事情。

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请问管家基因是从Input里面扩增的么？
我有个疑问，不知道这样进行实验是否可行？
在超声后，去200uL的样品，加入1.8mL的ChIP dilution buffer稀释，然后分出一部分做Input，其余的等分成两份，一组加入抗体，一组不加抗体，这样的可以作为实验组和对照组么？

如果这样做的话，怎样对比实验组和对照组的管家基因表达情况呢？实验组中抗体不一定能拉的下来管家基因呀？
急求呀！

作者: XYZQ 时间: 2013-4-16 16:07

用Input调平后，用Q-PCR检测。
IgG组比抗体组低就可以了，恭喜你。
如果要降低背景，那么在实验过程中，一些小细节再注意下就行了。

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另外，求问IgG组比抗体组低几倍算是可以滴呢：）我目前的实验结果只有4倍左右（即Ct值相差2），不知道算不算有差异？多谢啦！

作者: 831226 时间: 2013-4-16 16:11

另外，求问IgG组比抗体组低几倍算是可以滴呢：）我目前的实验结果只有4倍左右（即Ct值相差2），不知道算不算有差异？多谢啦！

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这种差别用半定量能走出来很漂亮的结果了

作者: lgm 时间: 2013-4-16 16:12

你好，看了你的帖子很受用啊。我刚开始接触ChIP，有2个简单的问题想请教。
1.在超声后，将超声裂解液分装3管，一管加抗体作为实验组，一管不加抗体作为试剂空白组，有点不明白第三管加入NaCl的目的。
2.在这里提到，加入NaCl，65℃3h解交联，但是稍后又是2h解交联。这个时间有关系吗？其次，解交联是将蛋白与DNA分开吗？最后，解交联是65℃的作用，还是NaCl的作用？如果是NaCl的作用的话为什么只有第三管加？
谢谢解答！

作者: lgm 时间: 2013-4-16 16:12

看了帖子后很受用。我刚开始接触ChIP，有几个简单的问题想请教下：
1.检测超声破碎的效果是不是需要加入抗体沉淀并将DNA分离出来了才做，并不是如你步骤的顺序那样是超声后马上电泳。
2.NaCl解交联的原理是什么？是不是3管（抗体组、不加抗体组、空白组）都要加的，还是只在空白组加入？
谢谢解答？

作者: moonlight45 时间: 2013-4-16 16:12

你好.
我是做一个样品的ChIP.现在有个q-RT检测的问题.
是否可以用实验组比对照组的ct差值表示富集水平,因为理论上上样量一致的前提下是不用考虑actin之类的.如果考虑了actin才是不严谨的,因为actin只能说明你残留的游离DNA量的多少.

作者: 8princess8 时间: 2013-4-16 16:13

楼主，你好。我现在在链霉菌中组ChIP实验，但是目前遇到了非常棘手的问题，按照标准的protocol ChIP下来的DNA，跑琼脂糖胶发现，位置在10k之上，尽管INPUT 解交联后集中在100-300bp，不能出现这么大的条带。对ChIP-DNA进行PCR验证，结果也是符合预期的。排除了proteinA 的因素。还是不知道是哪里出现了问题。
请问楼主有什么建议么？

作者: 831226 时间: 2013-4-16 16:15

chip 的好帖子，刚开始做了一把chip, IgG和抗体组都是阴性结果，input组是阳性，目前还不清楚问题出在哪里。个人有些小疑问：
1.是否要设置阳性对照，如用组蛋白抗体或RNA polymerase II 抗体，有没有推荐的此类抗体。
2.在超声上清中是直接加入抗体，还是抗体与agarose protein G 先结合后再去结合蛋白DNA复合体，不清楚那样结合最有效率。
3.免疫复合物的沉淀和清洗时是低盐，高盐，LI盐的顺序还是低盐，LI盐，高盐的顺序，还有TE buffer 洗是什么意思，其意义是什么。大家有没有这些盐溶液的配方。
我就是根据这个帖子的步骤做的一把，一个星期摸超声条件，第二个星期开始做到最后，可惜结果都是阴性，希望高手能够指教下，欢迎大家讨论学习，谢谢大家。。。。

作者: qianqin1977 时间: 2013-4-16 16:16

刚开始做chip，想问一下大家，chip试验中的input对照，阳性对照以及阴性对照一直都没有搞清楚，为什么要做这些对照

作者: qianqin1977 时间: 2013-4-16 16:16

超声之后跑电泳检测。是一条200bp-1000bp之间的smear

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初学chip，想请教一下，超声后应该是蛋白质和DNA的复合物，能跑电泳检测片段长度吗

作者: jujuba 时间: 2013-4-16 16:17

我们做了半年了，但是一直没有成功，想请教一下楼主……
我们不是单纯用的超声，而是用的MNase酶消化+超声（有用甲醛交联），western检测input中含有我们想要的目的蛋白条带，但是IP后的产物中就没有目的蛋白的条带，一直找不到原因，希望楼主能帮忙参考一下，谢谢……

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我不是楼主，没做过Chip，做过IP，看起来你这个很像抗体的问题呀，有做阳性对照吗？

作者: 831226 时间: 2013-4-16 16:18

你好，看了一些您发的帖子，估计您应该是对CHIP有了很深入的了解。
想问一个问题，就是我要研究GATA1这个转录因子对下游基因的结合，在药物诱导条件下是否增强了。由于GATA可以结合在beta-globin locus的上游多个位点，我该选择哪个位点来设计引物呢？谢谢。

作者: wood533 时间: 2013-4-16 16:19

我问一个比价低级的问题，我现在准备做一个A基因的组蛋白甲基化的变化，主要是H3K9Me2和H3K9Me3，我看见文献上说是用chip的方法，但是我有点不是很清楚，chip具体是怎么测定某个基因的组蛋白甲基化的变化的，我们的抗体是A基因的抗体是不？能否说得具体点，谢谢哈。

作者: 8s5g 时间: 2013-4-16 16:19

我是新做ChIP的~~~最近做实验加错东西了，想问下会不会后果很严重
在65°解交联过夜时本应加20ul 5M NaCl的，结果加成了20ul Tris-HCl。。。。过夜了之后又37°加了RNaseA 1小时
这时候才发现自己之前搞错了，不得不重新加NaCl。。。
这样不会不后果很严重啊。。。
急~~~求解答

作者: vvmmoy 时间: 2013-4-16 16:19

楼主，你好！最近刚做了一次ChIP实验，结果出来后是阴性结果，就是没有检测到富集位点，但是阳性对照的结果很好，这个能否说明我的体系还是没有问题的呀？

图片附件: 12840390.png (2013-4-16 16:20, 22.82 KB) / 该附件被下载次数 70
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15664

作者: 04906 时间: 2013-4-16 16:20

能介绍chip on chip和chip seq么？我是新手，请多指教

作者: AmyJetWH 时间: 2014-11-21 14:50 标题: ChIP试剂盒—染色质免疫共沉淀研究完整方案

作为最专业的表观遗传学产品供应商，Epigentek独创地推出了一个独一无二的植物染色质免疫沉淀试剂盒：EpiQuik Plant ChIP Kit（p-2014），极大地拓展了染色质免疫沉淀的应用领域。植物染色质免疫共沉淀(ChIP)试剂盒提供了对植物细胞样品进行染色质免疫沉淀反应所需的所有试剂。

艾美捷向您提供一站式的ChIP相关实验解决方案，除了通用ChIP试剂盒外，还有与ChIP实验相关的ChIP级抗体和重组蛋白。更有组蛋白甲基化ChIP试剂盒（可特异性针对单甲基，双甲基，三甲基），组蛋白乙酰化ChIP试剂盒，以及甲基化DNA结合蛋白的ChIP试剂盒等多领域试剂盒，切实为您提供一站式服务，让您的研究更上一层楼！

Epigentek集团公司是全球领先的创新技术和表观遗传学相关研究产品的开发商和供应商。公司开发了包括400多个专利产品的全面的产品组合，为表观遗传学方面的研究和新药研发提供全面系统的解决方案。作为Epigentek集团中国区域的总代理，艾美捷将其引入中国，作为其中国区域代理，将为客户提供完整的表观遗传解决方案，产品包括表观遗传研究用分析试剂盒、抗体以及相关的抑制剂/拮抗剂等产品。同时我们作为多家国际知名品牌的的中国代理或区域代理，艾美捷能为您提供系列的实验室解决方案。如果您对上述产品感兴趣，请致电免费客户专线400-6800-868到艾美捷科技有限公司垂询相关的产品信息及完整实验解决方案。

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