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标题: 【讨论帖】蛋白质PEG化修饰与纯化 [打印本页]

作者: 韩梅梅 时间: 2013-4-18 11:02 标题: 【讨论帖】蛋白质PEG化修饰与纯化

聚乙二醇具有较广的分子量分布，随着平均分子量的不同，性质也产生差异，当分子量小于1000Da时，聚乙二醇是无色无臭粘稠的液体，高分子量的聚乙二醇则是蜡状白色固体，固体聚乙二醇的熔点正比于分子量，逐渐接近67℃的极限。毒性随分子量的增加而减少，小于400Da的 PEG在体内会经乙醇脱氢酶降解成有毒的代谢物，而分子量大于1000 Da的PEG经过多年应用于食品业、化妆品业和制药业证明没有毒性。

聚乙二醇分子中含有大量乙氧基，能够与水形成氢键，因而具有良好的水溶性，同时又可溶于除乙醚、己烷、乙二醇以外的大部分有机溶剂。大多数蛋白质经聚乙二醇修饰后，除保留或增加其水溶性外，还可以获得在一些有机溶剂中的溶解性。在蛋白质溶液中，聚乙二醇无论是处于游离还是结合形式，即使浓度很高，对蛋白质分子都没有副作用。聚乙二醇修饰的蛋白质一般构象不会改变，其结合物的生物学活性主要由结合物的蛋白质部分产生。

聚乙二醇具有免疫学惰性，即使分子量高达5.9×106Da，本身的免疫原性也很低。临床上使用聚乙二醇修饰蛋白治疗未发现抗聚乙二醇抗体产生。

在20种构成蛋白质的常见氨基酸中，只有具有极性的氨基酸残基的侧链基团才能够进行化学修饰。常用的反应氨基酸包括赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸，N-端氨基和C-端羧基。这些氨基酸残基上的反应性基团多呈亲核性，其亲核活性通常按下列顺序依次递减：巯基>氨基>氨基>羧基(羧酸盐)>羟基。根据化学修饰剂与蛋白质之间反应性质的不同，修饰反应主要分为酰化反应、烷基化反应、氧化还原反应、芳香环取代反应等类型，对蛋白质进行氨基、巯基和羧基等侧链基团进行化学修饰。巯基通常存在于蛋白质的二硫键和活性位点上，而羧基如果不与蛋白质上的氨基发生分子间或分子内中和反应，也很难活化。因此，蛋白质或多肽分子最容易与修饰剂发生作用的位点是分子表面赖氨酸残基上的氨基，包括氨基或氨基。

聚乙二醇修饰又称分子的PEG化（PEGylation），是20世纪70年代后期发展起来的修饰方法。将活化的聚乙二醇与蛋白质分子相偶联，影响蛋白质的空间结构，最终导致蛋白质各种生物化学性质的改变：化学稳定性增加，抵抗蛋白酶水解的能力提高，免疫原性和毒性降低或消失，体内半衰期延长，血浆清除率降低等。

对PEG修饰有一定了解，希望同行多多交流、互相学习，少走弯路

作者: 韩梅梅 时间: 2013-4-18 11:03

聚乙二醇修饰反应类型
在20种构成蛋白质的常见氨基酸中，只有具有极性的氨基酸残基的侧链基团才能够进行化学修饰。常用的反应氨基酸包括赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸，N-端氨基和C-端羧基。这些氨基酸残基上的反应性基团多呈亲核性，其亲核活性通常按下列顺序依次递减：巯基>alpha氨基>E氨基>羧基(羧酸盐)>羟基。根据化学修饰剂与蛋白质之间反应性质的不同，修饰反应主要分为酰化反应、烷基化反应、氧化还原反应、芳香环取代反应等类型，对蛋白质进行氨基、巯基和羧基等侧链基团进行化学修饰。巯基通常存在于蛋白质的二硫键和活性位点上，而羧基如果不与蛋白质上的氨基发生分子间或分子内中和反应，也很难活化。因此，蛋白质或多肽分子最容易与修饰剂发生作用的位点是分子表面赖氨酸残基上的氨基，包括alpha氨基或E氨基。
氨基修饰
蛋白质分子表面的游离氨基具有较高的亲核反应活性，一般不处于活性中心部位，因而成为化学修饰中最常用的被修饰基团。主要修饰氨基是赖氨酸的e-、alpha-氨基和末端氨基。游离氨基在蛋白质分子中含量较高，亲电性活化聚乙二醇和氨基酸的游离氨基反应时，多为随机修饰，常有几个氨基被修饰，导致多态混合物的产生，即使只结合一个聚乙二醇，也可能结合在不同的氨基位点上，产生位点异构体。由于蛋白质只有一个末端氨基，因此对它的修饰可以减少多态混合物和位点异构体的产生，但修饰末端氨基的聚乙二醇反应时需使用硼氢氰化钠，有一定的毒性。氨基修饰最常用的修饰剂为SS-PEG、SC-PEG、SPA-PEG、NHS-PEG2和ALD-PEG等。
巯基修饰
活化半胱氨酸的巯基往往处于蛋白质的活性中心部位，位于蛋白质表面的自由巯基远少于氨基，因此修饰效率低下，修饰后蛋白活性损失较大，但其优点是修饰专一性高于氨基修饰。若天然蛋白中不含半胱氨酸，则可通过基因工程改造方法在蛋白的特定区域引入一个或一个以上的自由半胱氨酸，对蛋白质进行定点修饰，从而使生物活性损失最小化，但也可能导致蛋白形成二聚或多聚体。最常用的修饰剂为MAL-PEG。
羧基修饰
羧基的修饰位点包括天冬氨酸、谷氨酸及末端羧基。首先将聚乙二醇分子中的羧基转化为氨基，再在羧二亚胺存在的条件下与蛋白质的羧基结合，但同时也易产生其它的交联反应。目前使用较少。

作者: am10 时间: 2013-4-18 11:04

PEGylate 后的修饰物的分离也曾是一个难点，但现在已经可以通过一步层析，将单点修饰的PEG蛋白与未修饰蛋白及多点修饰蛋白分开。如果是自身的二聚体或多聚体，使用经典的分子筛就可解决问题了。

作者: 04906 时间: 2013-4-18 11:06

支持！学习中！以前没有注意过这方面内容，

请教：这个主要的应用领域，是否是在药物代谢方面？

作者: 韩梅梅 时间: 2013-4-18 11:06

PEGylate 后的修饰物的分离也曾是一个难点，但现在已经可以通过一步层析，将单点修饰的PEG蛋白与未修饰蛋白及多点修饰蛋白分开。如果是自身的二聚体或多聚体，使用经典的分子筛就可解决问题了。

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愿问其详，GEHealthcare战友能否把这种方法详细说明，若能一步层析就可以拿到单点修饰的PEG产物，下面我要讲的PEG产物纯化就要改改了。三年前我做PEG产物纯化的时候试过分子筛，疏水，离子交换，最后还是离子交换解决了问题，但在区分单点和多点修饰产物上还是花费了很多时间。

谢谢

作者: 韩梅梅 时间: 2013-4-18 11:07

支持！学习中！以前没有注意过这方面内容，

请教：这个主要的应用领域，是否是在药物代谢方面？

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一语中的，PEG修饰的目的就是改善蛋白药物（尤其是小蛋白药物）在体内的抗原性、半衰期，长效干扰素、长效胰岛素等药物出现，不但改良了药效，而且由于体内半衰期延长，减少病人打针的次数，方便病人并降低了痛苦

作者: 韩梅梅 时间: 2013-4-18 11:07

聚乙二醇衍生物的分类
聚乙二醇末端的羟基是其在化学修饰反应中的功能基团，但它的反应活性较低，只有在较为强烈的条件下才能与其它基团反应，而这样的条件通常是蛋白质无法耐受的，因此必须先对聚乙二醇进行活化，使其在温和的反应条件下以高反应速率与蛋白质偶联。根据活化方式、电性、结构和端基等的不同，聚乙二醇衍生物可有不同的分类方法。
按活化方式的分类
按照活化方式的不同分为同端基遥爪聚乙二醇和异端基遥爪聚乙二醇。将聚乙二醇两端的羟基用不同的基团取代，得到异端基遥爪聚乙二醇，如果两端的取代基团均为活性基团，则称为异端双功能基遥爪聚乙二醇，如果两个取代基团中一个为不活泼或者惰性基团，另外一个为活泼基团，则称为异端单功能基遥爪聚乙二醇。由于聚乙二醇两端同时活化不但要消耗较多的活化试剂，而且在化学修饰过程中容易发生蛋白交联，有些情况下还不得不加入其它化合物来阻止或抑制交联反应的发生，所以同端基遥爪聚乙二醇目前已经很少使用。异端双功能基遥爪聚乙二醇较难合成，并且在用于化学修饰时也会象同端基遥爪聚二醇那样发生不期望的交联反应，因此实际应用也较少。相比之下，异端单功能基遥爪聚乙二醇由于容易合成，很少或不发生交联反应而得到了广泛的应用。通常采用一端羟基被甲基封闭，不能参与反应的单甲氧基聚乙二醇（mPEG）进行活化，通用分子式为：
CH3O–(CH2–CH2O)n–CH2–CH2–OH
按端基的电性分类
根据端基电性的不同，聚乙二醇衍生物可以分为亲电和亲核两大类。亲电类聚乙二醇衍生物比较常用，种类也很多，如琥珀酰亚胺琥珀酸酯聚乙二醇(PEG Succinimidyl Succinate, SS-PEG), 苯并三唑甲酯聚乙二醇（PEG Benzotriazole carbonate, BTC-PEG），琥珀酰亚胺丙酸酯聚乙二醇（PEG Succinimidyl Propionnate, SPA-PEG），琥珀酰亚胺二聚乙二醇 (PEG2 Succinimide, NHS -PEG2)，醛类聚乙二醇（PEG Aldehyde,ALD-PEG）、N,N’-羰基二咪唑聚乙二醇（PEG Oxycarbonyl imidazole,CDI-PEG ）等。亲核类聚乙二醇衍生物有聚乙二醇胺类衍生物（PEG-O-CH2CH2-NH2, PEG-NH2）、马来酰亚胺聚乙二醇（PEG Maleimide, MAL-PEG）等。
按发展历史分类
根据发展历史可分为第一代和第二代聚乙二醇。第一代聚乙二醇局限于应用低分子量的mPEG(<20000Da)。常用的修饰剂有SS-PEG、琥珀酰亚胺甲酸酯聚乙二醇（PEG Sucinimidyl Carbonate, SC-PEG）等，其中大部分通过酰基化反应修饰蛋白质。第一代PEG修饰药物通常表现出不稳定性、较大的毒性和免疫原性，生物活性、药代动力学的性质与原型药物没有本质的改变。第二代聚乙二醇分子量可大于20000Da，在二醇污染、稳定性、活性保留、专一性等方面均优于第一代聚乙二醇，常用的修饰剂有SPA-PEG、BTC-PEG、NHS-PEG2、ALD-PEG、MAL-PEG等。

作者: yjf1026 时间: 2013-4-18 11:08

PEGylate 后的修饰物的分离也曾是一个难点，但现在已经可以通过一步层析，将单点修饰的PEG蛋白与未修饰蛋白及多点修饰蛋白分开。如果是自身的二聚体或多聚体，使用经典的分子筛就可解决问题了。

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我想你应该是GE公司的吧，
你应该没有怎么做过这个实验
实际上也没有你说的那么简单吧（但还是想了解你们这个填料的信息，好象比较贵）
GE公司的那个专门分离纯化PEG-Protein的填料不是每个蛋白的效果有这么好
也许就是一两个能达到这样的效果吧

我想要分离纯化比较理想的单位点PEG修饰蛋白还是要用离子交换和反相比较实用点，
当然离子交换要比反相好，但主要是有时候小分子的蛋白PEG修饰后离子交换挂不上，
反相分离度高，但最后要除酒精，也容易使蛋白变性，而且我感觉重复性不高，不知道为什么！
对于用分子筛不好扩大。

现在正在为这个有点愁！！！！！！
还想请楼主多指点。

作者: 韩梅梅 时间: 2013-4-18 11:09

QUOTE:

原帖由 yjf1026 于 2013-4-18 11:08 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
PEGylate 后的修饰物的分离也曾是一个难点，但现在已经可以通过一步层析，将单点修饰的PEG蛋白与未修饰蛋白及多点修饰蛋白分开。如果是自身的二聚体或多聚体，使用经典的分子筛就可解决问题了。

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我现在还不了解GE介质的信息，迫切希望GEHealthcare战友能贴出来
楼上战友的问题也是我当时摸索条件的时候碰到的问题

PEG修饰产物纯化难主要是由于PEG分子在水溶液中具有伸展的构象，其流体动力学体积远远大于同样分子量的球状蛋白质，使得球状蛋白质与PEG的分离非常困难

虽然有人用SEC分离出PEG修饰的单点产物，但这只是个别情况，因为PEG线性分子并不像蛋白质的球形，PEG在SEC中运行的轨迹很复杂，不想蛋白质那么简单，这点从PEG的SDS-PAGE电泳也能看出来，在SDS——PAGE电泳上表现得是很糊的一片，光从这个角度来看，SEC是不适合分离PEG话的蛋白的，何况还有多点，单点和未修饰蛋白表观分子量差别情况

反相虽然分离度高，但缺点正如vicardin所说，用反相分离无活性的小肽倒是可能，但分离活性蛋白不是很好

我推荐用离子交换，我们做过好几种蛋白，不论是碱性蛋白还是酸性蛋白，用离子交换一步就能得到纯品，现在很多活化的PEG都是修饰氨基，氨基在蛋白质中是带正电的，PEG修饰后会出现正电荷减少的情况，另外还有PEG的封闭作用，使得PEG修饰的蛋白等电点都靠近中性。基于这些情况，选用阳离子交换柱是比较好的选择，但不全按照离子交换的原理来进行的，在后面的纯化一章会说明

作者: 韩梅梅 时间: 2013-4-18 11:10

这一篇主要是讲PEG修饰条件
影响PEG修饰蛋白的反应条件一般有修饰剂用量、反应pH值、反应时间、反应温度等，某些种类的PEG需要加入其它试剂（如mPEG-ALD需加入硼氢氰化钠）时，也应考虑所加试剂的反应条件。
修饰剂用量：PEG用量越大，修饰率和修饰多态性越高，一般增加PEG分子量可延长药物的循环半衰期，但除个别蛋白的PEG修饰对蛋白质活性影响不大外，大多数蛋白质的活性随着修饰PEG数目和分子量的增加而降低，因此在修饰率、修饰多态性、活性保留率和成本之间需寻求平衡点。
就应pH值：PEG衍生物在不同的pH值条件下反应活性和修饰位点有明显差异，亲电性的琥珀酰亚胺在碱性环境下反应活性较高，主要与赖氨酸残基的E氨基反应，而在酸性环境下反应活性较低，主要与组氨酸的咪唑基反应。虽然先灵葆雅公司采用pH6.5的反应条件制备PEG修饰的干扰素PEG Intron A，但从修饰效率考虑，大多数亲电性PEG衍生物采用碱性条件反应。
反应时间：不同的PEG衍生物和不同的蛋白最佳反应时间各不相同
反应温度：一般为保留蛋白活性多采用低温条件。

作者: yjf1026 时间: 2013-4-18 11:10

也希望大家能踊跃出来说说话
把自己实验中遇到的问题说说
也许这里能为你指点小道
我相信riboenzyme是在这个行业非常有经验的老师

有很多话要说
可是现在时间计较紧
网络不是很方便
等晚上有时间回去好好来这里写写自己的一些感受
也希望大家一起来交流一下
特别像riboenzyme老师一样的人
希望主要说一下实验中的操作问题
至于理论的东西还是可以看看书了解

作者: 韩梅梅 时间: 2013-4-18 11:11

呵呵，说得也是，前面主要是些理论，PEG难点是纯化，接下来我会把电泳分析,柱分析的图片贴上，我在看怎么可以直接贴图片，我还不会

作者: 3N4G 时间: 2013-4-18 11:12

如楼上所说，任何一个技术都不可能解决所有问题，文中的分离也只是一个较理想的例子，但不失为一个可以尝试的新方法。

如果不违反此坛的规则，我可以提供免费样品，各位可以试试自己的样品的分离效果。也可在此交流试用后的效果，不管是满意的还是不满意的。

作者: 3N4G 时间: 2013-4-18 11:12

可以自己下载参考文献：

cuturl('http://www1.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/WD%3AMacroCap+SP%28327299504-D525%29?OpenDocument&hometitle=search')

cuturl('http://www1.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/WD%3AOptimization+of%28336661211-D525%29?OpenDocument&hometitle=search')

cuturl('http://www1.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/WD%3ALiving+large+-+%28340092199-J450%29?OpenDocument&hometitle=search')

作者: 韩梅梅 时间: 2013-4-18 11:13

如楼上所说，任何一个技术都不可能解决所有问题，文中的分离也只是一个较理想的例子，但不失为一个可以尝试的新方法。

如果不违反此坛的规则，我可以提供免费样品，各位可以试试自己的样品的分离效果。也可在此交流试用后的效果，不管是满意的还是不满意的。

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我仔细看了下，也是离子交换原理，和下面介绍的内容差不多。我在做离子交换也用过SP，但分离效果没有这篇文章说得那么好

作者: 韩梅梅 时间: 2013-4-18 11:13

PEG修饰产物的分离纯化方法
沉淀法
蛋白质在一定浓度的盐溶液或有机溶剂中会发生沉淀，而PEG由于其两亲性则继续保持溶解状态，通过简单的离心就能将蛋白质与PEG分离开来。唐微等采用硫酸氨沉淀法可将rIL-2和PEG完全分离开。
膜过滤法
透析膜或超滤膜上具有一定孔径大小的微孔，若在膜中加入不同分子量的混合物，则小于孔径的分子会透过膜，而大分子则留在原处。由于分辨率低，一般仅用其除去修饰混合物中的游离PEG或浓缩分离产物超滤法适合于分离产物的浓缩和换液，与沉淀法相比活性损失小，无需脱盐，但缺点是成本较高，易吸附蛋白。
凝胶过滤层析法
凝胶过滤层析的分离原理是分离颗粒介质中具有大量孔径均一的网状孔道。分离样品中的小分子物质可以进入颗粒内部，所经历的路程较长，因此流出时间较长，后出峰；大分子物质从颗粒外通过，因此先出峰，据此可以分离不同分子量的物质。PEG修饰蛋白质的分子量大于天然蛋白质，因此出峰较天然蛋白质早，PEG偶联越多，修饰蛋白质出峰越早。McGoff等用GF柱分离PEG修饰SOD，可将未修饰、单点、两点修饰SOD分开。
离子交换层析法
离子交换层析在分离纯化蛋白质的层析手段中使用最广泛，其分离原理是离子交换树脂结合带有大量电荷的侧链，当溶液pH偏离等电点时，蛋白质就会带电荷，若所带电荷与离子交换树脂侧链电荷相反，蛋白质就可与之结合，结合的蛋白质可根据结合力的不同用不同浓度的盐离子洗脱，从而达到分离纯化效果。影响PEG修饰蛋白质带电荷数的因素目前认为有两个，一方面大多数PEG修饰的位点是蛋白质表面的游离氨基，由于氨基在酸性和中性环境下结合氢质子而带正电荷，PEG修饰蛋白质后这些氨基失去与氢质子结合能力，蛋白质的正电荷数会减少，等电点偏酸。另一方面PEG自身不带电荷，当PEG覆盖于蛋白质表面时可能会阻碍蛋白质与离子交换树脂侧链的结合，从而导致修饰蛋白质的洗脱盐浓度比天然蛋白质低。采用离子交换层析分离PEG修饰蛋白质的最大优势在于PEG不带电荷保证了它不会吸附于柱上，因而可以很方便的将PEG与蛋白质分开。刘丽军等用CM Sepharose FF分离PEG修饰的rhIFN-2b，洗脱峰依次为未结合的PEG、多点修饰产物、单点修饰产物和未修饰的rhIFN-2b。根据结果分析PEG修饰蛋白质在离子交换层析中主要受PEG屏蔽作用影响，无论是用阴离子还是阳离子交换层析，蛋白上偶联PEG个数越多，结合力越弱，出峰越早；其次受氨基修饰的影响，由于阴离子交换树脂结合的主要是蛋白质的羧基，受氨基修饰影响较小，因而分离效果不如阳离子交换树脂。离子交换层析时缓冲液pH值至少应与蛋白质等电点相差一个单位，修饰样品应用缓冲液或水稀释以降低样品的离子强度。
疏水层析和反相色谱法
疏水层析和反相层析的原理是分离介质带有疏水侧链，蛋白质在高盐浓度溶液或有机溶剂中变性，暴露出疏水部位，与分离介质结合，降低盐浓度或有机溶剂浓度可将其洗脱下来。PEG具有两亲性，但与蛋白质相比疏水性更强，因此PEG修饰蛋白质的疏水性强于天然蛋白，与分离介质的结合力更强，较天然蛋白晚出峰。Katre等采用疏水层析的梯度洗脱法成功将rIL-2与PEG-rIL-2分开。反相层析由于使用有机溶剂作为流动相，导致蛋白质失活，一般用来分析而不是分离活性蛋白。

到此整个PEG修饰纯化的理论就结束了，接下来是实验了，热烈欢迎大家讨论

作者: 韩梅梅 时间: 2013-4-18 11:14

A蛋白PEG修饰纯化，已经开始大量生产

图片附件: 77346774.jpg (2013-4-18 11:14, 32.94 KB) / 该附件被下载次数 21
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15690

作者: 韩梅梅 时间: 2013-4-18 11:15

B蛋白修饰纯化，实验室规模

希望大家对这两个不同蛋白的纯化过程进行讨论

图片附件: 12606086.jpg (2013-4-18 11:15, 32.79 KB) / 该附件被下载次数 20
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15691

作者: DNA 时间: 2013-4-18 11:38

我觉得单点和多修饰很难彻底分开

作者: DNA 时间: 2013-4-18 11:38

B蛋白的修饰率比较低

作者: 韩梅梅 时间: 2013-4-18 11:39

主要是单点和多点性质相近而难以分离，这时候就要求对离子交换的盐离子梯度进行调整。B蛋白的修饰率可以很高，但多点修饰也多，所以我必须选择单点修饰最多的条件，因为B蛋白自产，所以不需要考虑太多成本

作者: cj_mondy 时间: 2013-4-18 11:39

我想从血清中纯化IgG蛋白，先用硫酸铵沉淀，然后再透析，最后想再过一个ProteinA蛋白的柱子，可是硫酸铵沉淀的饱和度我没有摸索，直接从师姐那里抄的步骤，我今天才知道沉淀用的硫酸铵是要摸条件的，可是我用了饱和度为50，和33的，然后全部丢弃了上清，不知道结果会怎么样？
在我过柱子前，我还需要把透析的蛋白做那些处理较好？谢谢大家帮忙。
我看在这里讨论的都是高手，就把我这个暂时和PEG纯化无关的问题拿来问了，呵呵

作者: vcve 时间: 2013-4-18 11:40

我想问你几点
1 我想问一下你们的PEG是哪个公司的
2 为什么两个蛋白都是用20000的PEG修饰?(A蛋白用20000的还勉强,但B蛋白就不是很理想哦)
3 我看你的B蛋白的第5条带，就算是单个的PEG修饰的，那也未必就都是在蛋白的一个位点修饰的啊，你这个是怎么处置的？？？？？？？
4 你电泳是用的什么胶？？？（效果还不错，PEG的影响不大，与普通的SDS-PAGE有什么改进的吗？）
5 你们最后的蛋白是用什么方法定蛋白浓度的??
6 如果你们用的是BCA /LOWRY 、、的话PEG有没有影响测定？？

呵呵在说几点看法：
A蛋白做的修饰和分离效果都比较好，就是不知道最后有没有达到你要蛋白改变的目的，我建议你要是用个30000的双连的就会比较好。
要说B蛋白用的PEG就更小了（但单点修饰率还是比较高），最后改变的效果就更不明显了，要是用个40000的双链的就最好了，还有那后面两个峰的分离度不够高，这样以后用于大生产的话上样量就会很小，会加大很多生产成本，我建议你后面用阶梯剃度洗的话分离效果可能会好点，这样也比较好扩大生产。

作者: 韩梅梅 时间: 2013-4-18 11:40

你的问题非常好
1：以前用得都是Nektar的，现在国产的也有了，效果也还可以，国内的厂家你可以在DXY查查
2：这两个蛋白都用过很多修饰剂做得，SPA5000，NHS10000 SPA20000等，发现SPA20000反应活性较高就采用SPA20000做得
3：单点修饰并不是同一个点修饰，单点在不同的点也有可能，但通常蛋白上总有一个氨基活性是最高的，修饰的可能性也最大，如果你要确定那个点进行了修饰，可能要对修饰蛋白进行酶解后分析了
4：常规胶，200V到底，也有电泳不好看的，呵呵。上面是纯化后的，PEG的浓度较低，照片也好看些，B蛋白那张图片有个修饰混合物，里面有很多未修饰PEG，就不是很好，后面我会贴出很多难看的，PEG确实会影响电泳结果的
5：Lowry方法测得，与OD280结果做过对照，差不多
6：你可以在BAC里看看PEG的影响，我们在Lowry里没有发现

作者: 韩梅梅 时间: 2013-4-18 12:18

其实不一定要PEG完全包住，这需要多者之间找到平衡点，PEG修饰后，蛋白活性肯定下降，但在血浆中保留性，稳定性，时效性有所上升，若有可能需要多加比较，从而找到平衡点

作者: 韩梅梅 时间: 2013-4-18 12:18

我想从血清中纯化IgG蛋白，先用硫酸铵沉淀，然后再透析，最后想再过一个ProteinA蛋白的柱子，可是硫酸铵沉淀的饱和度我没有摸索，直接从师姐那里抄的步骤，我今天才知道沉淀用的硫酸铵是要摸条件的，可是我用了饱和度为50，和33的，然后全部丢弃了上清，不知道结果会怎么样？
在我过柱子前，我还需要把透析的蛋白做那些处理较好？谢谢大家帮忙。
我看在这里讨论的都是高手，就把我这个暂时和PEG纯化无关的问题拿来问了，呵呵

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IgG的纯化我也做过一点，但印象不是很深刻。我记得有两个硫酸铵浓度的，开始是去除血清白蛋白，然后是沉淀IgG，我回去查查以前的记录，晚上贴出来

作者: 韩梅梅 时间: 2013-4-18 12:19

A蛋白多种修饰剂反应

图片附件: 90241528.jpg (2013-4-18 12:19, 29.12 KB) / 该附件被下载次数 30
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15692

作者: fsdd817 时间: 2013-4-18 12:19

也希望更多的战友一起来讨论

1、PEG试剂我倒是国产和进口的都用过，做过对照，国产的有凯正和健凯的，都要比进口的差点，不知道你用哪家的。
2、我用过LOWRY测过，但有很多的絮状沉淀，用BCA到是没有，但就不知道准不准。

作者: 韩梅梅 时间: 2013-4-18 12:20

国产的我没有用过，絮状沉淀是不是因为蛋白浓度高了？你是蛋白是纯化后测得么？我们这里好像没有出现这种情况

可能PEG修饰的热度过了，现在讨论的比较少，等我把PEG整个过程做完，我们开始抢Chromatography的生意，做蛋白纯化问题解答，哈哈

作者: fsdd817 时间: 2013-4-18 12:21

A蛋白多种修饰剂反应

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呵呵，从这张图上看10000的修饰效果更好啊，但可能后面的药效不是很理想吧，是不是这样啊riboenzyme??

作者: fsdd817 时间: 2013-4-18 12:21

国产的我没有用过，絮状沉淀是不是因为蛋白浓度高了？你是蛋白是纯化后测得么？我们这里好像没有出现这种情况

可能PEG修饰的热度过了，现在讨论的比较少，等我把PEG整个过程做完，我们开始抢Chromatography的生意，做蛋白纯化问题解答，哈哈

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没有，蛋白的浓度很低的，做过比较，只有含PEG的才有沉淀物，且只在LOWRY中有。
呵呵强GE的生意，呵呵呵呵、、、、
那也只能抢PEG-Protein分离这一快的吧。
但从精神上我强烈的支持你，
现在GE公司的产品价格高的离谱

作者: 韩梅梅 时间: 2013-4-18 12:22

你是测纯化的PEG修饰产物的浓度么？那出现絮状沉淀就很奇怪了，我们一直都是用Lowry测得，这么经典的方法我就不贴出来了

GE产品都是美金报价，有关系你可以拿到比较便宜的价格的

作者: fsdd817 时间: 2013-4-18 12:24

呵呵，我们测的是纯化后的样品，方法应该不会错的，我们用过这种方法测过其他的蛋白没事，不知道是PEG试剂的问题么？你们是进口试剂吧，我们用的是国产的，而且两中方法测的结果相差很大。

作者: zhenxin 时间: 2013-4-18 12:24

请问大家用的柱子的填料都是自己活化的吗？

我作出来的效果特别差，请高人点拨一二。

作者: fsdd817 时间: 2013-4-18 12:25

呵呵\\\\
一般都是买的吧
也不知道你具体指的是什么拄
希望能说清楚点
大家也好给你个很好点的答复

作者: 韩梅梅 时间: 2013-4-18 12:27

呵呵，我们测的是纯化后的样品，方法应该不会错的，我们用过这种方法测过其他的蛋白没事，不知道是PEG试剂的问题么？你们是进口试剂吧，我们用的是国产的，而且两中方法测的结果相差很大。

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也有可能，你用Lowry法单独检测过国产的PEG

从前面CM纯化两种不同的PEG修饰蛋白来看，PEG修饰后，PEG屏蔽作用对蛋白的电荷影响最大，不管是酸性蛋白还是碱性蛋白，CM的结果都是多点先下来，因为屏蔽得多，接着是单点，屏蔽少些，还有些电荷与CM介质作用，最后是未修饰蛋白，很多电荷与CM介质结合。这里的等电点聚焦的结果也是这样的，PEG修饰后，蛋白等电点靠近中性

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作者: 韩梅梅 时间: 2013-4-18 12:28

（1）纯化A的缓冲液确实是4.0左右，CM 工作pH6-10但可以在pH4-13可以长期保存的，我们做下来没什么关系
（2）平衡这三者之间只有多选择几种修试剂，纯化以后看活性保留力，体内半衰期等后期工作了，如果是做药的话，PEG修饰，主要是在修饰剂的选择上面
（3）计算修饰率，一是通过SDS-PAGE，扫描初步看看，真是确定是在纯化后的，纯化以后测单点修饰产物浓度的，有点不准确，偏低

多讨论

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> 如您所言，Pegylation现在真的是有点过热，这可能与它的市场前景也有关。但修饰后产物的分离纯化确有难度，希望韩梅梅老师能够深入的讲下去。
>
> 有几个问题想请教：
> （1）您的Protein A的PI=5.20,选用CM Sepharose FF的话，pH应该选的是4.0左右吧，但好像CM的工作范围是6－10，超出此范围影响大吗？看您的纯化结果蛮好的，影响应该不大，那该工艺对树脂的损伤大吗？树脂可重复用多少次？
> （2）Protein A选用mPEG-SPA20000是不是由于电泳上可见未修饰的蛋白量变少了，但用这么大分子量的PEG修饰势必对蛋白活力影响更大，您是怎么平衡活力、PEG分子量以及修饰率之间的关系的。
> (3) 您是怎样计算修饰率的？
>
> 谢谢

作者: loli 时间: 2013-4-18 12:29

谢谢您的解答.

我做一个修饰后蛋白的纯化也几个月了,但目前仍是没一点眉目.

由于是非定点修饰,修饰后产物的异构体太多,未修饰蛋白和修饰后的蛋白很好分,但多修饰和单修饰就不好分了,单修饰的纯度始终达不到要求.

也想过阳柱更好一些,但CM和SP试过了都一般,跟Q没什么差别.

我想是不是存在这样的情况,有的单修饰的色谱行为跟多修饰很接近,毕竟有那么多异构体存在,以至于单从电荷上是很难将它们分开的.换言之,离子交换很难将它门纯化出来.

填料换了很多了,阴阳都用过,包括SOURCE和Mono,效果总是不那么理想,

作者: 韩梅梅 时间: 2013-4-18 12:30

QUOTE:

原帖由 loli 于 2013-4-18 12:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
谢谢您的解答.

我做一个修饰后蛋白的纯化也几个月了,但目前仍是没一点眉目.

由于是非定点修饰,修饰后产物的异构体太多,未修饰蛋白和修饰后的蛋白很好分,但多修饰和单修饰就不好分了,单修饰的纯度始终达不到要求.
...

不知道你用的是什么修饰剂，修饰氨基很难做到定点修饰，前面我做的A蛋白的单点修饰也很难说是同一个氨基修饰的。对于您说的单修饰的色谱行为和多修饰很接近，这点很难说。不知道你上离子柱后这些多点单点修饰产物是不是都结合上了，梯度洗脱的情况是怎么样的，理论上来说，单点和多点修饰净电荷差别还是有一些的，我是改变洗脱条件而分离单点的。能把你的FPLC图和电泳图贴出来了，私下交流也可以

另外提醒一点：你修饰的pH值是多少？上样缓冲液的pH呢？一般修饰pH和上样缓冲液的pH是不一样的，如果你修饰混合物直接上柱肯定不行，这时候需要用上样缓冲液稀释修饰混合物，然后上样

作者: 韩梅梅 时间: 2013-4-18 12:31

CM未优化前的图谱

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作者: 韩梅梅 时间: 2013-4-18 12:31

DEAE纯化PEG修饰A图谱，cpubio战友，你的图谱是不是和这张有点像

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作者: finger 时间: 2013-4-18 12:32

我的结果是有点像上面的DEAE,多修饰和单修饰没有分开的趋势.成一个大峰洗下来,前面的多修饰多一些,后面的单修饰占绝大部分.

您的CM跑梯度时虽然没有完全分开,但至少有个分开的趋势,且趋势很明显,单修饰和多修饰成两个峰.我也用过CM,一个大峰就下来了,没有任何分开的趋势.更严重的是,有时蛋白会沉在柱子上,提高盐浓度也洗不下来.

您那张CM未优化前的图谱是修饰后的产物初分吗?应该不是碘染色吧?不然穿透峰不会没有条带的.从图上看您的修饰率的确很高,未修饰的蛋白只是很少的一部分.但多修饰的比重占的有些大.

不知道下面的纯化该怎么做,还望多多指教,谢谢!

作者: 韩梅梅 时间: 2013-4-18 12:32

是初分，优化后的CM图前面我也贴出来了，蛋白常规染色呀，穿透峰里应该是未修饰的PEG了。你的蛋白怎么会沉淀到介质上？

作者: finger 时间: 2013-4-18 12:33

猜测沉在上面的,因为高盐洗不下来.

CM填料前两次用还行,至少能洗下蛋白,第三次在同样盐浓度情况下电导上不去,蛋白洗不下来.以NaOH洗可洗下蛋白,填料处理后就没再用了.

据说处分修饰后蛋白对填料损伤很大,riboenzyme老师遇到这样的情况了吗?比如载样量和分辨率下降等.

我的蛋白在酸性条件下不是很稳定,活力损失不大,但可能形成聚集体.Q和DEAE效果不好,换阳柱也是迫不得己啊.

作者: 韩梅梅 时间: 2013-4-18 12:33

哦，A蛋白都已经开始生产了，没碰到PEG修饰产物对层析介质有很大影响，小试时，装100ml介质，可以重复用很久，大概有十几二十次吧，中间做过CIP和SIP

在酸性条件不稳定那就比较麻烦，你蛋白pI大概多少？

作者: finger 时间: 2013-4-18 12:34

蛋白PI是5.8,在试用CM时采用的是pH4.5 第一次是检验该条件下能否挂柱及洗脱,结果尚可;接下来跑梯度,也正常,只是蛋白一个很锐的峰就下来了.

上CM的样品已初步纯化过,未反应的PEG和蛋白早已去除,只是想把单修饰和多修饰分开.结果不理想.

其实我一直有个想法,在使用大分子量PEG时,由于PEG的柔性结构将蛋白表面电荷掩盖的很厉害,个别多修饰的异构体和单修饰的异构体在离子交换柱色谱行为上的差异并不大. 所以,归根到底一句话, 这东西分不开.呵呵

但这话是万万不能跟老板讲的,我只能接着试下去,希望能出一个好的结果

作者: 韩梅梅 时间: 2013-4-18 12:34

你用的是什么修饰剂？哪个公司的？

你用什么方法初步去除未反应的PEG和蛋白的，我个人怀疑可能是第一步和第二步衔接上的问题，你能多贴些图片看看么。

单点修饰和多点修饰在电荷屏蔽上肯定是有差别的，我这里没有多点产物的等电聚焦图片。我把我的方法说一下：PEG修饰后，用10倍体积的上样缓冲液稀释，上样，可以参照A蛋白的方法进行

作者: finger 时间: 2013-4-18 12:34

PEG的功能团是NHS,Nektar的健凯的都试用过.

初分蛋白我过的Q柱,把未反应的PEG和蛋白去掉,效果还是不错的.这时的修饰蛋白在碱性Buffer里,我用HAc-NaAc pH4.5调节pH到4.5附近.

我也是怀疑衔接上有问题,有的时候可以,有的时候就不行,所以CM 的具体工艺我还没去摸索.

作者: fsdd817 时间: 2013-4-18 12:35

是初分，优化后的CM图前面我也贴出来了，蛋白常规染色呀，穿透峰里应该是未修饰的PEG了。你的蛋白怎么会沉淀到介质上？

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riboenzymeEG 在280nm下有吸收值??
我试过了,银染的效果还没有R250的效果好

我想如果他的蛋白是沉淀到介质上有可能是蛋白浓度高了,或者温差大了的原因. 这样可以先稀释上样试试,应该会好点

作者: 韩梅梅 时间: 2013-4-18 12:36

PEG的功能团是NHS,Nektar的健凯的都试用过.

初分蛋白我过的Q柱,把未反应的PEG和蛋白去掉,效果还是不错的.这时的修饰蛋白在碱性Buffer里,我用HAc-NaAc pH4.5调节pH到4.5附近.

我也是怀疑衔接上有问题,有的时候可以,有的时候就不行,所以CM 的具体工艺我还没去摸索.

我是南京的,呵呵,还请riboenzyme老师多多指教.

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你先用Q柱，得到单点和多点修饰产物，然后调pH，接着上CM，你测过上CM前的电导么？可能上CM时电导太高了，另外你这样先Q后CM也比较麻烦，建议直接上CM，开始梯度慢些，你的蛋白可能和我的A蛋白差不多，应该没问题，我大概会在26或27到南京，有机会聊

作者: 韩梅梅 时间: 2013-4-18 12:36

riboenzymeEG 在280nm下有吸收值??

我试过了,银染的效果还没有R250的效果好

我想如果他的蛋白是沉淀到介质上有可能是蛋白浓度高了,或者温差大了的原因. 这样可以先稀释上样试试,应该会好点

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PEG在280是有吸收峰的，mPEG-SPA20000过Sephacryl S-200凝胶过滤层析后有两个峰，第一个是PEG的，后面一个电泳什么都没有

染色我们一直用CBB染的，PEG用过碘染，CBB染色是足够了的

我觉得他上样浓度太高，从而会结合到介质上的，我们都是稀释十倍左右上样

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作者: fsdd817 时间: 2013-4-18 12:36

PEG在280是有吸收峰的，mPEG-SPA20000过Sephacryl S-200凝胶过滤层析后有两个峰，第一个是PEG的，后面一个电泳什么都没有

不会吧!!!!
PEG在280nm有吸收峰???
我还真没主意到这个,我记的是没有的啊!!!
他怎么会有吸收峰呢?? 没有肽键啊!!!!
而且我还全波长扫描过啊!!!

你怎么检测第一个峰是PEG的??
CBB染料是什么??

作者: 韩梅梅 时间: 2013-4-18 12:37

这个问题也困惑我很久，但Superdex75 和Sephacryl S200 都是一样的结果，我也作了PEG的全波长扫描，在280确实没有特征吸收峰，而在199nm和258nm出现峰，多讨论

CBB是考马斯亮蓝，电泳分析的第一个峰有PEG

PEG染色方法可以参考：
Kurfürst M. M. Detection and molecular weight determination of polyethylene glycol-modified hirudin by staining after sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis[J]. Anal. Biochem. 1992, 200(2): 244–248

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作者: vvmmoy 时间: 2013-4-18 12:38

这里讨论PEG修饰很热烈阿。我也是深受单修饰多修饰分不开之苦久矣。目前准备使分子筛。已做过初步实验，柱效超过8000才有分开的希望，因为单点和多点修饰在分析高效柱中挨得都比较近。不知做这方面得战友有无这方面的经验，可以互相讨论下。
关于PEG，在280nm处肯定没有吸收的。我不知riboenzyme战友在做分子筛时有没有对整阶段流出液都进行碘染检测。第一个峰里有PEG并不代表这是因为紫外吸收是由PEG带来的，可能是由于脱落的小分子或者杂质，而在电泳里是看不出来的，或许和PEG出峰有重叠。这也只是我的猜想。

作者: 速冻虾米 时间: 2013-4-18 12:39

你写的PEG的修饰反应中好像漏掉了一个很重要的因素：蛋白质浓度。

尤其是和NHS基团反应的时候，不同的蛋白浓度，产率有成倍的变化呢

这是影响修饰反应产率的最主要因素。

至于PEG修饰产物的纯化，个人认为最关键的因素有两个，PEG分子量，

和离子交换填料的载样量，对多修饰和单修饰分离有很大影响。

作者: 速冻虾米 时间: 2013-4-18 12:40

纯的PEG在280nm是没有吸收的，活化后的NHS基团在280有强吸收，如果是
PEG-ADL就没有吸收了，和蛋白质反应后，置换下来的NHS在分子筛的全保留体积内出峰，紫外有强吸收，但电泳检测没有东西。

作者: popo520 时间: 2013-4-18 12:40

当采用琥珀酰亚胺活化修饰剂时，N－羟基琥珀酰亚胺会在凝胶色谱小分子位置出峰，由于NHS在碱性条件下最大吸收在260nm左右，我们修饰剂活性就是采用UV法测定端基官能团活性的，所以280nm也有吸收

作者: popo520 时间: 2013-4-18 12:41

也希望更多的战友一起来讨论

1、PEG试剂我倒是国产和进口的都用过，做过对照，国产的有凯正和健凯的，都要比进口的差点，不知道你用哪家的。
2、我用过LOWRY测过，但有很多的絮状沉淀，用BCA到是没有，但就不知道准不准。

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您好！不知您用的凯正修饰剂哪个方面觉得比进口的差？希望看到您的宝贵意见，我们会继续提高PEG修饰剂质量

作者: popo520 时间: 2013-4-18 12:41

这里讨论PEG修饰很热烈阿。我也是深受单修饰多修饰分不开之苦久矣。目前准备使分子筛。已做过初步实验，柱效超过8000才有分开的希望，因为单点和多点修饰在分析高效柱中挨得都比较近。不知做这方面得战友有无这方面的经验，可以互相讨论下。
关于PEG，在280nm处肯定没有吸收的。我不知riboenzyme战友在做分子筛时有没有对整阶段流出液都进行碘染检测。第一个峰里有PEG并不代表这是因为紫外吸收是由PEG带来的，可能是由于脱落的小分子或者杂质，而在电泳里是看不出来的，或许和PEG出峰有重叠。这也只是我的猜想。

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你的猜想非常正确，游离的PEG的确穿透，280是NHS

作者: popo520 时间: 2013-4-18 12:43

这个问题也困惑我很久，但Superdex75 和Sephacryl S200 都是一样的结果，我也作了PEG的全波长扫描，在280确实没有特征吸收峰，而在199nm和258nm出现峰，多讨论

CBB是考马斯亮蓝，电泳分析的第一个峰有PEG

PEG染色方法可以参考：
Kurfürst M. M. Detection and molecular weight determination of polyethylene glycol-modified hirudin by staining after sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis[J]. Anal. Biochem. 1992, 200(2): 244–248

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不知您的uv谱是PEG还是PEG修饰剂？如果NHS修饰剂，溶解到buffer或水中修饰剂会水解（mPEG－SC，mPEG－SPA等水解时间不同，但是pH7左右半衰期也就20分钟左右），释放N羟基琥珀酰亚胺，碱性中最大吸收260nm左右

作者: popo520 时间: 2013-4-18 12:43

PEG的功能团是NHS,Nektar的健凯的都试用过.

初分蛋白我过的Q柱,把未反应的PEG和蛋白去掉,效果还是不错的.这时的修饰蛋白在碱性Buffer里,我用HAc-NaAc pH4.5调节pH到4.5附近.

我也是怀疑衔接上有问题,有的时候可以,有的时候就不行,所以CM 的具体工艺我还没去摸索.

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是否用用我们凯正修饰剂啊？效果不错的。^_^是否有些自卖自夸

作者: popo520 时间: 2013-4-18 12:44

国产和进口的PEG还是有一定距离的，国产的PEG离散度和纯度都要差一点点，跑电泳就能明显的看出来。不过支持发展国产活化PEG试剂，打破国外垄断。nektar不卖就不卖，咱自己有。

作者: 韩梅梅 时间: 2013-4-18 12:44

这里讨论PEG修饰很热烈阿。我也是深受单修饰多修饰分不开之苦久矣。目前准备使分子筛。已做过初步实验，柱效超过8000才有分开的希望，因为单点和多点修饰在分析高效柱中挨得都比较近。不知做这方面得战友有无这方面的经验，可以互相讨论下。
关于PEG，在280nm处肯定没有吸收的。我不知韩梅梅战友在做分子筛时有没有对整阶段流出液都进行碘染检测。第一个峰里有PEG并不代表这是因为紫外吸收是由PEG带来的，可能是由于脱落的小分子或者杂质，而在电泳里是看不出来的，或许和PEG出峰有重叠。这也只是我的猜想。

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用分子筛做PEG修饰产物纯化有一定难度哈，因为PEG在流动过程中并不是以圆形存在，而是线条形的，兄弟要有心理准备哈，另外一点你用分子筛做纯化，以后放大也是问题

对于PEG的吸收峰，我是每段都染色的呀

作者: 韩梅梅 时间: 2013-4-18 12:45

你写的PEG的修饰反应中好像漏掉了一个很重要的因素：蛋白质浓度。

尤其是和NHS基团反应的时候，不同的蛋白浓度，产率有成倍的变化呢

这是影响修饰反应产率的最主要因素。

至于PEG修饰产物的纯化，个人认为最关键的因素有两个，PEG分子量，

和离子交换填料的载样量，对多修饰和单修饰分离有很大影响。

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蛋白质浓度是比较重要，蛋白量与PEG量应有最佳摩尔比

对于PEG修饰产物的纯化，能否更加详细探讨些

作者: popo520 时间: 2013-4-18 12:45

不知道你用的是什么修饰剂，修饰氨基很难做到定点修饰，前面我做的A蛋白的单点修饰也很难说是同一个氨基修饰的。对于您说的单修饰的色谱行为和多修饰很接近，这点很难说。不知道你上离子柱后这些多点单点修饰产物是不是都结合上了，梯度洗脱的情况是怎么样的，理论上来说，单点和多点修饰净电荷差别还是有一些的，我是改变洗脱条件而分离单点的。能把你的FPLC图和电泳图贴出来了，私下交流也可以

另外提醒一点：你修饰的pH值是多少？上样缓冲液的pH呢？一般修饰pH和上样缓冲液的pH是不一样的，如果你修饰混合物直接上柱肯定不行，这时候需要用上样缓冲液稀释修饰混合物，然后上样

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修饰NH2如果想选择修饰N端，可以用醛基修饰剂，如果想定点修饰lys的氨基，目前还没有这种特异修饰剂，只能靠调整pH达到修饰不同lys目的

作者: popo520 时间: 2013-4-18 12:45

PEG修饰蛋白分离纯化中应注意问题
除了riboenzyme中谈到的问题，还要注意所用PEG修饰剂种类，即使都采用琥珀酰亚胺类的修饰剂，由于修饰反应后，残留PEG带电不同，也要选择不同填料。如果用mPEG－SC修饰，由于反应后是游离mPEG－OH，所以采用阴离子交换或阳离子交换，mPEG－OH都直接穿透，当然如果你采用glysine封闭未反应修饰剂，那麽mPEG－gly采用sp柱穿透，但如果用DEAE可就不是穿透了。
用mPEG－SPA的化，水解产物是mPEG丙酸，如果用醛基修饰，采用氨基乙醇封闭，可以是中性
所以在分离纯化时一定要考虑所用PEG修饰剂种类

作者: 韩梅梅 时间: 2013-4-18 12:46

不知您的uv谱是PEG还是PEG修饰剂？如果NHS修饰剂，溶解到buffer或水中修饰剂会水解（mPEG－SC，mPEG－SPA等水解时间不同，但是pH7左右半衰期也就20分钟左右），释放N羟基琥珀酰亚胺，碱性中最大吸收260nm左右

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还是制备PEG修饰剂的大牛呀？留个号，我现在这块做的比较少，但还有朋友在做这个，现在都是用国产的了

作者: popo520 时间: 2013-4-18 12:47

还是制备PEG修饰剂的大牛呀？留个号，我现在这块做的比较少，但还有朋友在做这个，现在都是用国产的了

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你好！我是北京凯正生物研发负责人，主要从事PEG修饰剂研究开发，希望你的朋友用的是我们修饰剂。

作者: popo520 时间: 2013-4-18 12:47

这一篇主要是讲PEG修饰条件
影响PEG修饰蛋白的反应条件一般有修饰剂用量、反应pH值、反应时间、反应温度等，某些种类的PEG需要加入其它试剂（如mPEG-ALD需加入硼氢氰化钠）时，也应考虑所加试剂的反应条件。
修饰剂用量：PEG用量越大，修饰率和修饰多态性越高，一般增加PEG分子量可延长药物的循环半衰期，但除个别蛋白的PEG修饰对蛋白质活性影响不大外，大多数蛋白质的活性随着修饰PEG数目和分子量的增加而降低，因此在修饰率、修饰多态性、活性保留率和成本之间需寻求平衡点。
就应pH值：PEG衍生物在不同的pH值条件下反应活性和修饰位点有明显差异，亲电性的琥珀酰亚胺在碱性环境下反应活性较高，主要与赖氨酸残基的E氨基反应，而在酸性环境下反应活性较低，主要与组氨酸的咪唑基反应。虽然先灵葆雅公司采用pH6.5的反应条件制备PEG修饰的干扰素PEG Intron A，但从修饰效率考虑，大多数亲电性PEG衍生物采用碱性条件反应。
反应时间：不同的PEG衍生物和不同的蛋白最佳反应时间各不相同
反应温度：一般为保留蛋白活性多采用低温条件。

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不过千万不要把你的NHS活化修饰剂溶解在你的高pHbuffer中，否则你可能得到依然是你未修饰蛋白，因为修饰剂已完全水解。如果你需要溶解PEG修饰剂的话，要溶解在酸性溶液中比如1mM HCl中，然后加入到蛋白溶液中

作者: memory 时间: 2013-4-18 12:47

我打算做pal酶的PEG修饰，现在刚刚开始查资料。大家能不能给小弟介绍几篇比较经典的文章。

作者: memory 时间: 2013-4-18 12:48

如果大家都这么感兴趣，我可以建个关于PEG修饰的群，大家在群里尽情讨论怎么样？

作者: popo520 时间: 2013-4-18 12:48

我认为比较经典的文献的有
Introduction and overview of peptide and protein pegylation
PEGylation, successful approach to drug delivery
Beyond PEGylation
Peptide and protein PEGylation a review of problems and solutions
Chemistry for peptide and protein PEGylation
刚开始接触这行，看看这几篇就有整体了解和把握了

作者: popo520 时间: 2013-4-18 12:49

我打算做pal酶的PEG修饰，现在刚刚开始查资料。大家能不能给小弟介绍几篇比较经典的文章。

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推荐一本书
polyethylene glycol chemistry and biological application是J.M.harris编写1997年版
还有个更早的版本

作者: popo520 时间: 2013-4-18 12:49

如果大家都这么感兴趣，我可以建个关于PEG修饰的群，大家在群里尽情讨论怎么样？

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是个不错的建议。不过有个PEG群，里面也有些做PEG修饰的朋友，只是很少有人讨论PEG修饰技术

作者: 韩梅梅 时间: 2013-4-18 12:50

你好！我是北京凯正生物研发负责人，主要从事PEG修饰剂研究开发，希望你的朋友用的是我们修饰剂。

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我只是把以前了解的一些内容拿出来和大家讨论，popo兄才是这方面的专家呀，相信jfyan兄对很多蛋白PEG修饰都有所研究，如果不涉及商业秘密的话，希望jfyan兄能讲解PEG修饰最新进展

作者: fsdd817 时间: 2013-4-18 12:50

推荐一本书
polyethylene glycol chemistry and biological application是J.M.harris编写1997年版
还有个更早的版本

Introduction and overview of peptide and protein pegylation
PEGylation, successful approach to drug delivery
Beyond PEGylation
Peptide and protein PEGylation a review of problems and solutions
Chemistry for peptide and protein PEGylation
刚开始接触这行，看看这几篇就有整体了解和把握了

不知道这几位兄台能上传到这里么??很想看看
发到邮箱可以么??

如果大家都这么感兴趣，我可以建个关于PEG修饰的群，大家在群里尽情讨论怎么样？

作者: popo520 时间: 2013-4-18 12:51

DEAE纯化PEG修饰A图谱，你的图谱是不是和这张有点像

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用mPEG－SPA修饰，游离的修饰剂不在穿透峰中，可能混在你的peg－protein中，所以一般用SP柱子较好，否则还要除掉游离PEG

作者: fsdd817 时间: 2013-4-18 12:52

您好！不知您用的凯正修饰剂哪个方面觉得比进口的差？希望看到您的宝贵意见，我们会继续提高PEG修饰剂质量

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我有一个问题想问下严先生:
不知道是我个人现象还是都这样
我用LOWRY测蛋白浓度是一加试剂就出现一种绿色的絮状沉淀
你们的客户有没有向你们反映过这种情况??
还有在最后怎么/用什么方法确定MPEG的残留及含量??

作者: popo520 时间: 2013-4-18 12:52

我有一个问题想问下严先生:
不知道是我个人现象还是都这样
我用LOWRY测蛋白浓度是一加试剂就出现一种绿色的絮状沉淀
你们的客户有没有向你们反映过这种情况??
还有在最后怎么/用什么方法确定MPEG的残留及含量??

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目前还没有客户反映，因为我们蛋白浓度采用280nm测定，由于PEGylation并不影响蛋白质uv吸收，所以用uv280测定peg－protein应该是准确的。
mPEG残留目前一般采用测定是HPLC－ELSD，也就是液相色谱蒸发光散射检测，hplc也可以是SE－HPLC，因为修饰蛋白和游离PEG在GF250或TSK3000pwxl等柱上可以分开，如果目前没有ELSD检测，用示差检测也可以就是灵敏度低一些
另外关于lowry法测蛋白浓度，不知您是否使用过我们修饰剂，不过我们会试一下，到时结果通报大家

作者: popo520 时间: 2013-4-18 12:53

我有一个问题想问下严先生:
不知道是我个人现象还是都这样
我用LOWRY测蛋白浓度是一加试剂就出现一种绿色的絮状沉淀
你们的客户有没有向你们反映过这种情况??
还有在最后怎么/用什么方法确定MPEG的残留及含量??

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你说的沉淀我个人感觉就像是氢氧化铜的沉淀，理论上讲PEG修饰不会影响肽键，当然也就不会影响Cu络合物形成，不知道您使用的是哪种修饰剂？
确定已经分离纯化得到PEG－Protein？还有没有其他？

作者: popo520 时间: 2013-4-18 12:54

氢氧化铜应该是蓝色絮状沉淀

作者: popo520 时间: 2013-4-18 12:54

推荐一本书
polyethylene glycol chemistry and biological application是J.M.harris编写1997年版
还有个更早的版本

Introduction and overview of peptide and protein pegylation
PEGylation, successful approach to drug delivery
Beyond PEGylation
Peptide and protein PEGylation a review of problems and solutions
Chemistry for peptide and protein PEGylation
刚开始接触这行，看看这几篇就有整体了解和把握了

不知道这几位兄台能上传到这里么??很想看看
发到邮箱可以么??

如果大家都这么感兴趣，我可以建个关于PEG修饰的群，大家在群里尽情讨论怎么样？

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nektar的catlogue，不过里面有很多关于修饰剂以及pEGylation和罗列一些参考文献

作者: popo520 时间: 2013-4-18 12:55

不知各位有没有用mPEG－MAL特异性修饰蛋白质半胱氨酸的，遇到的问题经验大家讨论一下

作者: 韩梅梅 时间: 2013-4-18 12:55

我们实验室曾经通过基因工程方法在蛋白N端接了一个半胱氨酸，采用mPEG-Mal20000修饰，没有成功，可能原因是N端Cys被降解，我们在SDS-PAGE非还原条件下发现二聚体的踪迹，但量太少。jfyan兄有什么高见

作者: popo520 时间: 2013-4-18 12:55

QUOTE:

原帖由 韩梅梅 于 2013-4-18 12:55 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我们实验室曾经通过基因工程方法在蛋白N端接了一个半胱氨酸，采用mPEG-Mal20000修饰，没有成功，可能原因是N端Cys被降解，我们在SDS-PAGE非还原条件下发现二聚体的踪迹，但量太少。jfyan兄有什么高见 ...

最近客户询问mPEG－MAL修饰后，产物不太稳定，大概几个小时PEG就脱落，国内国外修饰剂都是一样。

作者: popo520 时间: 2013-4-18 12:56

cysteine与mal形成硫醚键比较稳定，一般亚胺键在碱性条件下易水解。目前我们准备用N－乙酰基半胱氨酸研究一下，我想知道是不是大家都发现这种现象？

作者: popo520 时间: 2013-4-18 12:56

我们实验室曾经通过基因工程方法在蛋白N端接了一个半胱氨酸，采用mPEG-Mal20000修饰，没有成功，可能原因是N端Cys被降解，我们在SDS-PAGE非还原条件下发现二聚体的踪迹，但量太少。jfyan兄有什么高见

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如果是在N末端引入，直接N端测序不就知道cys是否还在？因为mPEG－MAL与cys反应还是比较容易，一般室温1～2各小时就反应完全，所以上不去的原因应该是cys降解掉了

作者: duoduo 时间: 2013-4-18 12:57

现在要买peg了，在丁香园上看到三个公司。不知道那个好些，在此请教各位大侠：
凯正，健凯，海格里斯的peg那个相对会更好用些？

谢谢！！！！

作者: popo520 时间: 2013-4-18 12:57

你自己要好好判断啊！有的公司目录整个就是翻译的nektar目录。凯正和键凯有相同产品，也有不同的，最好你都买一些，做个比较。

作者: jkobn 时间: 2013-4-18 12:58

你的问题非常好
1：以前用得都是Nektar的，现在国产的也有了，效果也还可以，国内的厂家你可以在DXY查查

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您好，您能给出购买mPEG（Mw10kda与20kda）的具体信息吗？？现在nektar好像不卖了，多谢，在线等。

作者: jkobn 时间: 2013-4-18 13:00

最近客户询问mPEG－MAL修饰后，产物不太稳定，大概几个小时PEG就脱落，国内国外修饰剂都是一样。

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应该查一下修饰剂的化学结构，有些PEG修饰剂的活性基团与聚合物之间的链不稳定。如用异型双功能试剂SMCC连接mPEG-NH2制备末端带有Mal的巯基专一性修饰剂，所用的SMCC在溶液中就不稳定！

作者: popo520 时间: 2013-4-18 13:01

您好，您能给出购买mPEG（Mw10kda与20kda）的具体信息吗？？现在nektar好像不卖了，多谢，在线等。

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不知您想买进口?还是国产?
如果进口的话,sunbio和NOF,价格200元/g左右;如果买国产的话,北京一有一家据说是代理英国的产品,我测过,二羟基含量5%.不过价格比sunbio和nOF便宜不少.
如果买修饰剂,当然找我就行了

作者: popo520 时间: 2013-4-18 13:01

应该查一下修饰剂的化学结构，有些PEG修饰剂的活性基团与聚合物之间的链不稳定。如用异型双功能试剂SMCC连接mPEG-NH2制备末端带有Mal的巯基专一性修饰剂，所用的SMCC在溶液中就不稳定！

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采用修饰剂是mPEG-MAL,大家可以讨论一下mPEG-MAL修饰cys的条件

作者: popo520 时间: 2013-4-18 13:01

应该查一下修饰剂的化学结构，有些PEG修饰剂的活性基团与聚合物之间的链不稳定。如用异型双功能试剂SMCC连接mPEG-NH2制备末端带有Mal的巯基专一性修饰剂，所用的SMCC在溶液中就不稳定！

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修饰剂是采用mPEG-MAL,马来酰基和PEG之间没有其它连接分子

作者: 韩梅梅 时间: 2013-4-18 13:02

不知您想买进口?还是国产?
如果进口的话,sunbio和NOF,价格200元/g左右;如果买国产的话,北京一有一家据说是代理英国的产品,我测过,二羟基含量5%.不过价格比sunbio和nOF便宜不少.
如果买修饰剂,当然找我就行了

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上次我问了一个朋友，上海生物制品研究所的，用的是凯正的PEG修饰剂，在大规模修饰吧，如果他们的能够报出来，你就多了一个大客户了

另外对园子的弟兄应该提供试用装，特别是新手，他们试用后有效果肯定找你了

作者: popo520 时间: 2013-4-18 13:02

PEG修饰剂的保存.
可以参考我上传的nektar目录.最近有些客户询问PEG开始时能修饰,可用过一段时间就不能修饰了.这主要是由于保存不当引起.特别是NHS活化的修饰剂如mPEG-SC,mPEG-SPA,mPEG-SBA以及mPEG2-NHS,由于这些修饰剂容易水解,所以从冰箱中取出后,应先放置到室温再开启瓶盖,以防止空气中水份冷凝潮解.
另外也可以根据自己需要分装一下,这样可以避免多次开启瓶盖,防止失效.

作者: popo520 时间: 2013-4-18 13:03

您好，您能给出购买mPEG（Mw10kda与20kda）的具体信息吗？？现在nektar好像不卖了，多谢，在线等。

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不知您的mPEG买到了吗?是准备自己做修饰剂

作者: popo520 时间: 2013-4-18 13:03

国产的我没有用过，絮状沉淀是不是因为蛋白浓度高了？你是蛋白是纯化后测得么？我们这里好像没有出现这种情况

可能PEG修饰的热度过了，现在讨论的比较少，等我把PEG整个过程做完，我们开始抢Chromatography的生意，做蛋白纯化问题解答，哈哈

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最近做了个实验,如果采用lowry法测定,mPEG-OH会干扰测定,引起沉淀.各位也可以试一下,lowry试剂+mPEG会产生沉淀,所以如果残存PEG太多,会影响lowry法测定蛋白浓度结果

作者: 羊咩咩 时间: 2013-4-18 13:07

详细读了全篇，受益匪浅。
为了让更多的工程蛋白人获得上述信息，本贰拾面体转载到我们的网站的蛋白工程栏目了，如果有版权异议，请到我的网站跟贴声明，我一定尊重版权。
我的网站在百度搜索贰拾面体就到。谢谢。

作者: qumm1985 时间: 2013-4-18 13:08

最近要做peg-ALD定点修饰N端了，对于反应条件请教一下各位老师？是不是蛋白与peg的比例越小，定点修饰的几率越大？
谢谢各位了！

作者: 韩梅梅 时间: 2013-4-18 13:08

最近要做peg-ALD定点修饰N端了，对于反应条件请教一下各位老师？是不是蛋白与peg的比例越小，定点修饰的几率越大？
谢谢各位了！！

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很少蛋白能拿到单点修饰产物，蛋白与PEG的比例需要进行条件摸索，在修饰率和单点修饰得率之间做个平衡，PEG太少，修饰率太低，很多蛋白你都浪费了

作者: popo520 时间: 2013-4-18 13:09

最近要做peg-ALD定点修饰N端了，对于反应条件请教一下各位老师？是不是蛋白与peg的比例越小，定点修饰的几率越大？
谢谢各位了！！

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一般的化,PEG-ALD修饰N末端,PEG:protein大概1:1~3:1,PEG修饰剂需要稍稍过量,这样尽可能使蛋白PEG化,因为毕竟蛋白比修饰剂贵得多.另外定点修饰和PEG比例没有关系,只取决于PEG修饰剂本身和蛋白.
PEG-ALD既可以和N端反应(当然N端必须有NH2,如果你的N端是Pro或其他二级氨,PEG-ALD是不能反应的),也可以与lys反应,通过控制pH值,调节lys与N末端的NH2质子化程度,选择性反应.
当然PEG-丁醛和PEG-ALD由于中间连接linker不同,活性可能有差别

作者: 韩梅梅 时间: 2013-4-18 13:11

相关疾病：
原发性醛固酮增多症
关于PEG醛选择性修饰N末端中还原剂的问题:
文献中报道,PEG醛基偶联N末端采用氰基硼氢化钠还原胺化,由于氰基硼氢化钠的毒性,那麽能否用硼氢化钠代替?
采用氰基硼氢化钠可以将烯胺还原成烷基胺,而不还原醛;而采用硼氢化钠,醛基也会被还原,并且在酸性条件下,硼氢化钠不稳定.
一般PEG醛基偶联蛋白N末端是在弱酸性条件下,所以采用氰基硼氢化钠.
所以不能用硼氢化钠代替氰基硼氢化钠

作者: 韩梅梅 时间: 2013-4-18 13:12

希望大家相互交流,除了PEG修饰过程优化,分离与纯化,也希望能够交流PEG修饰蛋白的结构表征与分析

作者: youyou99 时间: 2013-4-18 13:12

mPEG-丁醛修饰蛋白时，要加氰基硼氢化钠，好多文献说在室温下反应。
室温下蛋白特别容易降解，能不能在4度反应呢？

作者: NBA 时间: 2013-4-18 13:13

QUOTE:

原帖由 youyou99 于 2013-4-18 13:12 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
mPEG-丁醛修饰蛋白时，要加氰基硼氢化钠，好多文献说在室温下反应。
室温下蛋白特别容易降解，能不能在4度反应呢？

可以在4度反应.由于醛基和氨基反应比较慢,只是4度反应比室温反应会慢.

作者: NBA 时间: 2013-4-18 13:13

A蛋白多种修饰剂反应

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图中蛋白A与peg-5000反应物中，蛋白A上面的那条特浓的带是不是单点修饰的？谢谢！！
初做peg-5000修饰，本来是单点修饰，但电泳后的分子量并不是目的蛋白的分子量与peg-5000的和，而是与popo老师的修饰图类似，怀疑是不是两个点修饰？

作者: 韩梅梅 时间: 2013-4-18 13:14

QUOTE:

原帖由 NBA 于 2013-4-18 13:13 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
A蛋白多种修饰剂反应

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图中蛋白A与peg-5000反应物中，蛋白A上面的那条特浓的带是不是单点修饰 ...

由于PEG表面结合许多水分子,所以表观体积较大,当用电泳检测时,如果用蛋白做标准品,分子量会有很大偏差.
测定是单个修饰还是多修饰方法(1)MALDI-TOF测定分子量(2)多角度激光散射-UV-IR联用测定.(3)PEG分子量标准,PEG染色,SDS-PAGE

作者: 王蜜蜜 时间: 2013-4-18 13:14

最近在做peg残留~头昏~HPLC-ELSD做过~电泳做过~都不太理想~请问各位大侠~具体点的实验方法~~^_^

作者: NBA 时间: 2013-4-18 13:15

QUOTE:

原帖由 王蜜蜜 于 2013-4-18 13:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

最近在做peg残留~头昏~HPLC-ELSD做过~电泳做过~都不太理想~请问各位大侠~具体点的实验方法~~^_^

说说为什麽采用HPLC-ELSD测定结果不理想?

作者: 王蜜蜜 时间: 2013-4-18 13:15

QUOTE:

原帖由 NBA 于 2013-4-18 13:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

说说为什麽采用HPLC-ELSD测定结果不理想?

PEG的峰和吐温-80的峰重叠~~~~

作者: NBA 时间: 2013-4-18 13:16

QUOTE:

原帖由 王蜜蜜 于 2013-4-18 13:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

PEG的峰和吐温-80的峰重叠~~~~

不知你的PEG分子量多大？如果你的PEG分子量远远大于吐温80，可以采用SEHPLC－ELSD的方法测定啊。

作者: NBA 时间: 2013-4-18 13:17

另外为什么不在原液测定残存PEG？而在制剂产品中测定？

作者: tie8 时间: 2013-4-18 13:17

请教一下，你们那里能提供工业生产规模用的PEG原料吗？
有通过cGMP的吗？？

作者: kswl870 时间: 2013-4-18 13:18 标题: 回复 #114 tie8 的帖子

我们亦庄GMP车间正在建设之中

作者: 王蜜蜜 时间: 2013-4-18 13:18

不知你的PEG分子量多大？如果你的PEG分子量远远大于吐温80，可以采用SEHPLC－ELSD的方法测定啊。

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PEG20000

作者: 王蜜蜜 时间: 2013-4-18 13:19

另外为什么不在原液测定残存PEG？而在制剂产品中测定？

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这个~~~~还有纯化的过程，修饰上的PEG不会掉吗？原液纯化后条带就与PEG的分不开了~PEG残留这个有相关规定吗？

作者: tie8 时间: 2013-4-18 13:19

请教一下，你们GMP车间生产的材料，和实验室用的科研材料有什么不同？

是不是大规模生产时纯度会低一些？

另外，你们PEG的原料是自己合成还是进口？二醇含量能控制在多少？？

作者: 韩梅梅 时间: 2013-4-18 13:20

这个~~~~还有纯化的过程，修饰上的PEG不会掉吗？原液纯化后条带就与PEG的分不开了~PEG残留这个有相关规定吗？

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我的原液是指PEG化蛋白,这时还没有加入土温等制成制剂

作者: 韩梅梅 时间: 2013-4-18 13:20

请教一下，你们GMP车间生产的材料，和实验室用的科研材料有什么不同？

是不是大规模生产时纯度会低一些？

另外，你们PEG的原料是自己合成还是进口？二醇含量能控制在多少？？

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我们GMP车间正在建设,所以目前是实验室规模;对于GMP生产和实验室区别,对于PEG修饰剂来说主要是内毒素,杂质限量.目前原料进口,二醇含量<2%

作者: 韩梅梅 时间: 2013-4-18 13:21

这个~~~~还有纯化的过程，修饰上的PEG不会掉吗？原液纯化后条带就与PEG的分不开了~PEG残留这个有相关规定吗？

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一般情况下,修饰上PEG与蛋白是采用共价偶联,短时间应该稳定,否则做成药品时只能做成冻干纷针.况且如果脱落,更加应该在PEG化蛋白原液测定.
如果分子量20KD左右蛋白,修饰上一个PEG20Kd分子,SE-HPLC可以分开

作者: 韩梅梅 时间: 2013-4-18 13:21

PEG20000

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用凝胶色谱PEG20000应该和土温80可以分开的

作者: 王蜜蜜 时间: 2013-4-18 13:22

用凝胶色谱PEG20000应该和土温80可以分开的

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是用ELSD?能介绍一下流动相吗？

作者: 王蜜蜜 时间: 2013-4-18 13:22

一般情况下,修饰上PEG与蛋白是采用共价偶联,短时间应该稳定,否则做成药品时只能做成冻干纷针.况且如果脱落,更加应该在PEG化蛋白原液测定.
如果分子量20KD左右蛋白,修饰上一个PEG20Kd分子,SE-HPLC可以分开

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我们现在也在考虑这个问题~不过目前用的是健凯的PEG，不够理想~不知道是否因为PEG本身的问题~按道理分子量20KD左右蛋白,修饰上一个PEG20Kd分子电泳也应该可以分开阿~~~555~~~哭死~~~

作者: c86v 时间: 2013-4-18 13:23

我们现在也在考虑这个问题~不过目前用的是健凯的PEG，不够理想~不知道是否因为PEG本身的问题~按道理分子量20KD左右蛋白,修饰上一个PEG20Kd分子电泳也应该可以分开阿~~~555~~~哭死~~~

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可以试验一下凯正修饰剂,如果有什么问题,我们公司可以帮你解决

作者: c86v 时间: 2013-4-18 13:23

是用ELSD?能介绍一下流动相吗？

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ELSD可选择醋酸铵等可挥发流动相

作者: 王蜜蜜 时间: 2013-4-18 13:24

ELSD可选择醋酸铵等可挥发流动相

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请问您做过PEG修饰蛋白后样品里游离PEG的检测吗？用的是什么流动相？什么色谱柱？ELSD对于流动相的选择除了不能含盐还有别的吗？我真的急需这方面的信息~~~多谢~~~

作者: zranqi_1 时间: 2013-4-18 13:24

我的peg-丁醛是在贵公司买的，修饰率还不错，我想请教一下，您说的(3)PEG分子量标准,PEG染色,SDS-PAGE，在哪里能买到？
.

作者: zranqi_1 时间: 2013-4-18 13:25

昨天过凝胶柱结果蛋白全挂柱子上了，郁闷！！各位大虾！！修饰后的蛋白过凝胶柱是不是经常会全挂在柱子上洗不下来？

作者: zranqi_1 时间: 2013-4-18 13:25

我的peg-丁醛是在贵公司买的，修饰率还不错，但会有多点修饰，我想请教一下，您说的(3)PEG分子量标准,PEG染色,SDS-PAGE，在哪里能买到？

作者: 韩梅梅 时间: 2013-4-18 13:26

昨天过凝胶柱结果蛋白全挂柱子上了，郁闷！！各位大虾！！修饰后的蛋白过凝胶柱是不是经常会全挂在柱子上洗不下来？

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没有发现这种现象，缓冲液里有0.15M NaCl么？用分子筛很难分开修饰的和未修饰蛋白

作者: 韩梅梅 时间: 2013-4-18 13:26

我的peg-丁醛是在贵公司买的，修饰率还不错，但会有多点修饰，我想请教一下，您说的(3)PEG分子量标准,PEG染色,SDS-PAGE，在哪里能买到？
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关于PEG染色,有专门文献.采用碘化钡,可以自己配置

作者: 韩梅梅 时间: 2013-4-18 13:27

我的peg-丁醛是在贵公司买的，修饰率还不错，但会有多点修饰，我想请教一下，您说的(3)PEG分子量标准,PEG染色,SDS-PAGE，在哪里能买到？
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Staining Procedure
After electrophoresis the gel was soaked in a 5% glu-
taraldehyde (Merck) solution for 15 min at room tem-
perature for fixation. Afterward the gel was stained for
PEG as follows. First, the gel was put in 20 ml of perchlo-
ric acid (0.1 M) for 15 min, and then 5 ml of a 5% barium
chloride solution (Riedel de Haen) and 2 ml of a 0.1 M
iodine solution (Merck, Titrisol 9910) were added ac-
cording to the procedure described by Skoog (3).
ANALYTICAL BIOCHRMISTRY 200,244-248 (1992)
上传不了整个文件,只能将PEG染色部分摘录,另外醛基修饰产生多修饰,你可以将修饰缓冲液pH降低

作者: ququer787 时间: 2013-4-18 13:27

昨天过凝胶柱结果蛋白全挂柱子上了，郁闷！！各位大虾！！修饰后的蛋白过凝胶柱是不是经常会全挂在柱子上洗不下来？

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我们一般用凝胶色谱SE-HPLC监测反应,常用TSK 3000或GF250柱,流动相PBS,还没有发现你出现的问题.
制备分离一般采用SP介质离子交换

作者: ququer787 时间: 2013-4-18 13:28

窄分布PEG标准品,许多卖凝胶色谱仪器厂家都有销售,但是比较贵;你可以利用PEG如PEG5K,PEG10K,PEG20KD等做标准,PEG染色做粗略估计修饰几个PEG.
最好是得到纯化产品用maldi-TOF测定分子量.

作者: wawa 时间: 2013-4-18 13:28

看到大家讨论的这么热闹，真好！我没有接触过PEG修饰蛋白的问题，但很感兴趣。
实在不好意思，有一个弱弱的问题想问一下。
读了以上的内容，但除了这一句
“将活化的聚乙二醇与蛋白质分子相偶联，影响蛋白质的空间结构，最终导致蛋白质各种生物化学性质的改变：化学稳定性增加，抵抗蛋白酶水解的能力提高，免疫原性和毒性降低或消失，体内半衰期延长，血浆清除率降低等。”
好像没有关于PEG修饰蛋白的目的的介绍了。有没有哪位老师可以介绍一下，PEG修饰的目的、作用、研究方向什么的。

作者: purrr 时间: 2013-4-18 13:29

求助：
我要用MAL-PEG-NHS修饰一段10个氨基酸残基的寡肽，主要反应是NHS基团与肽上的NH2基团反应，把PEG 联到肽上，但不知具体的的反应条件，故想请教一下，谢谢！

作者: 剪刀手520 时间: 2013-4-18 13:29

虽然我不做蛋白质的PEG化，但是仍然受益匪浅，这里想问一下有人做过如何使一段DNAPEG化吗？谢谢!

作者: mysmdbl 时间: 2013-4-18 13:30

QUOTE:

原帖由 剪刀手520 于 2013-4-18 13:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

虽然我不做蛋白质的PEG化，但是仍然受益匪浅，这里想问一下有人做过如何使一段DNAPEG化吗？谢谢!

文献
Polymer-conjugated Bioactive
Oligonucleotides

作者: birdfish 时间: 2013-4-18 13:31

我现在做的课题是蛋白质修饰方面的，不过不是使用PEG,而是表面功能化的无机纳米材料，材料用琥珀酰碳酸酯表面功能化了。我觉得我做的课题和PEG修饰蛋白有很多共同点，所以也了解了一部分这方面的内容。现在的问题是我只是把我们的材料和牛血清白蛋白（tiicine缓冲溶液）混合，然后紫外检测280nm又没有峰，已确定材料是否和蛋白相结合，以后怎么进展实验我现在一点头绪都没有，请大家指点一下，谢谢了！

作者: lgm 时间: 2013-4-18 13:31

请问一般要测定蛋白PEG化修饰程度有哪些方法？如果您方便的话能不能提供一些具体操作的文献。
看了TNBS测定的方法，如果以BSA为标准，那么，是不是直接以bsa里面的赖氨酸含量（60个）来计算其游离氨基数目？

作者: 9900 时间: 2013-4-18 13:31

PEG修饰度常用方法TNBS，荧光胺，多角度激光散射，毛细管电泳，以及MALDI－TOF等。

作者: okhaha 时间: 2013-4-18 13:32

条件所限，可能只能用TNBS,查了下
ESTIMATION OF AMINO GROUPS USING TNBS
REFERENCE: Fields, R. 1972. Methods in Enzymology. 25:464-469.

MATERIALS:
Solution A: 100mls of 0.1M Na2SO3 (fresh each week)
Solution B: 1.0l of 0.1M NaH2PO4
Solution C: 1.0l of 0.1M Na2B4O7 in 0.1M NaOH (make up in acid and ddH2O- washed glass).
Trinitrobenzene sulfonate (TNBS) 10g in 10ml H2O, heat to dissolve and remove black flecks of oil by centrifugation. Add HCl to 2M and cool to room temp. Wash the crystalline precipitate on a glass filter with 1M HCl. Desiccate and store at 4oC in brown bottle. Make up to 1.1M fresh daily (100mg recrystallized TNBS in 0.2ml H2O).
METHOD:
1.  make fresh daily Solution D: 1.5ml Solution A + 98.5ml Solution B
2.  standard curve: BSA at 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, and 2.0 mg/ml in 0.25ml H2O.
3.  samples: same concentration range as above in same volume.
4.  add 0.25ml solution C
5.  add 10µl TNBS (take note of time!)
6.  Incubate exactly 5 min at 23oC.
7.  add 1ml solution D to stop reaction.
8.  measure OD420. Standard curve should range from about 0.09 to >1.8
CALCULATION:
OD420 = 1.0 = 52nmol amino groups = 78nmol/1.5ml assay mix
"1.0mg/ml" BSA sample (0.25mg) = OD420 of 0.945 = 73.41nmol NH3
therefore, 0.25 mmol BSA = 73.41 nmol NH3 groups
67,000
3.73nmol BSA = 73.41 nmol NH3
therefore 1 molecule BSA = 19.8 molecules of lysine.
但是他的计算过程有点看不明白，他那个OD420 = 1.0 = 52nmol amino groups 是怎么算出来的，BSA包含60个赖氨酸，他算的1 molecule BSA = 19.8 molecules of lysine是什么意思

作者: 不请自来 时间: 2013-4-18 13:32

关于TNBS等方法测定PEG修饰度可参考analytical biochemistry 254,254-262(1997);
comparison of results of various methods used to fetermine the extent of modification ofmethoxy polyethylene glycol 5000-modified bovine cupri-Zincsuperoxide dismute,
这篇文章对不同方法测定修饰度做了比较。计算也没有你的那麽复杂。
由于我只有复印文本，所以无法上传

作者: jingling845 时间: 2013-4-18 13:33

各位老师,我想问一下,如果要把一个蛋白修饰后做为一个新药申报.
1.还要做哪些新的工作（与原蛋白药品比较）
2.他和其他蛋白药品申报有什么特别的地方。

作者: 831226 时间: 2013-4-18 14:23

测定PEG修饰度的另一种比较简易的比色法，抗干扰性强，实验简单。

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这个方法我们用来测定游离PEG,如果用这个方法测定修饰度的话,需要将PEG从蛋白上脱掉,然后测定PEG的量,最后根据蛋白和PEG测定修饰度,比较麻烦的;最常用的还是HAbeeb的TNBS测定

作者: moonlight45 时间: 2013-4-18 14:25

QUOTE:

原帖由 831226 于 2013-4-18 14:23 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
测定PEG修饰度的另一种比较简易的比色法，抗干扰性强，实验简单。

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这个方法我们用来测定游离PEG, ...

这种方法只需要将游离的PEG除去后测定结合到蛋白上的PEG吧，我们的样品已经除去未结合的PEG了，所以想用这种方法

作者: wmp1234 时间: 2013-4-18 14:26

样品需要除去未结合的PEG,然后用水解或酶解方法将偶联到蛋白上的PEG脱下来,然后测定PEG的量.

作者: moonlight45 时间: 2013-4-18 15:03

QUOTE:

原帖由 wmp1234 于 2013-4-18 14:26 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
样品需要除去未结合的PEG,然后用水解或酶解方法将偶联到蛋白上的PEG脱下来,然后测定PEG的量.

看了那篇文献，没有提到将结合的PEG也洗脱下来，我打算这种方法和TNBS做对照看看，到时候看看有没有区别

作者: wood533 时间: 2013-4-18 15:31

你可以试一试,不过铁硫氰酸氨在水和氯仿相平衡很慢,这种方法我们专门做过,工作曲线线性不是太好,重现性差一些.
祝你成功!

作者: 羊咩咩 时间: 2013-4-18 15:31

你可以试一试,不过铁硫氰酸氨在水和氯仿相平衡很慢,这种方法我们专门做过,工作曲线线性不是太好,重现性差一些.
祝你成功!

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蛋白遇氯仿沉淀，导致结合的PEG无法进入氯仿相，此法有待改进

作者: popo520 时间: 2013-4-18 15:32

蛋白遇氯仿沉淀，导致结合的PEG无法进入氯仿相，此法有待改进

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没错,所以我说要将PEG脱落下来

作者: 羊咩咩 时间: 2013-4-18 15:32

没错,所以我说要将PEG脱落下来

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用酶切？

作者: ending 时间: 2013-4-18 15:35

我们做过酶切,酸解,碱解都可以,所以铁硫氰酸氨方法实际并不简单

作者: qqq111 时间: 2013-4-18 15:36

我们做过酶切,酸解,碱解都可以,所以铁硫氰酸氨方法实际并不简单

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TNBS法有没有具体的操作过程？在反应后如何计算修饰度？有的文献报道的是吸光度比浓度的斜率比较，我这边做了下，发现结果不是预期的那样，而且不同的波长，相差比较大。

作者: dongdongqiang 时间: 2013-4-18 15:38

最近，许多咨询mPEG－OH的活性与端基取代度有何不同？
mPEG－OH端基取代度表明的是聚乙二醇末端OH被取代的程度，端基取代率高，不一定所需要的活性高，因为羟基可能被其它基团取代。
而PEG修饰剂活性是官能团的活性。这个指标才是反映修饰剂反应活性的真正指标。
所以购买PEG修饰剂时要区分两个指标

作者: abc816 时间: 2013-4-18 15:39

最近做了个实验,如果采用lowry法测定,mPEG-OH会干扰测定,引起沉淀.各位也可以试一下,lowry试剂+mPEG会产生沉淀,所以如果残存PEG太多,会影响lowry法测定蛋白浓度结果

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如果没有残留的MPEG，PEG-protein中的PEG也一样会影响他的结果吧！在LOWRY中！

作者: summerxx 时间: 2013-4-18 15:39

没有残留mPEG，mPEG－protein中的PEG在lowry法测定浓度范围内，不会引起沉淀，至于是否影响蛋白浓度测定，待研究后告诉大家

作者: caihong 时间: 2013-4-18 15:40

我用LOWRY测定PEG化蛋白质的浓度是有一定干扰的,PEG分子量越大,结果误差越大,用BCA测定的结果倒是和280nm结果相符.

另外,请问JFYAN兄,贵公司有没有专门用于C-末端羧基修饰的活化PEG?
mPEG-male修饰的产物真的不稳定吗?

作者: bling 时间: 2013-4-18 15:41

专利中说mPEG－MAL在高pH条件下会开环

欢迎大家来讨论啊

作者: fsdd817 时间: 2013-4-18 15:41

QUOTE:

原帖由 bling 于 2013-4-18 15:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

专利中说mPEG－MAL在高pH条件下会开环

欢迎大家来讨论啊

请问下有人做过MAL修饰吗？
不稳定？
是mPEG与MAL之间的键还是 MAL与蛋白之间的键不稳定啊？

作者: qiangren789 时间: 2013-4-18 15:42

是马来酰亚胺的环打开，既不是mPEG与MAL之间的键也不是MAL与蛋白之间

作者: fsdd817 时间: 2013-4-18 15:42

哦哦哦
我的化学知识很差
不知道这里的几个键谁稳定
哪在什么条件下稳定呢？温度，ph值？

还有我想问下：
如果一个PEG40000-protein与游离的PEG40000的在C18反相条件下能分开么？
protein分子量4000左右
现在公司还没有ELSD
真郁闷哦
有没有别的办法啊？
什么柱子合适啊？
大哥能推荐一下么？

作者: mimili_901 时间: 2013-4-18 15:43

哪位高手能解释一下，PEG与寡肽反应时，为什么有时寡肽需要保护，有时候又不用呢。

作者: fsdd817 时间: 2013-4-18 15:43

哪位高手能解释一下，PEG与寡肽反应时，为什么有时寡肽需要保护，有时候又不用呢。

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你问题说的不是很清楚
其中我认为和你寡肽所处的环境有关，
1.你的寡肽样品提供的每次不一样（活性残基状态不一样）
2.你的寡肽在你保存的环境不稳定
3.你的PEG活性不稳定（主要不知道你用的什么衍生物）

作者: DDD 时间: 2013-4-18 15:44

好多朋友又在询问PEG取代度和官能团活性差别？
PEG取代度一般采用核磁共振NMR的方法测定，主要是检测残存的mPEG－OH中羟基的残存量（通过计算OH与CH3的比例得到取代度）；而PEG修饰剂官能团的活性代表的是真正的反应活性，比如mPEG－ALD中是醛基的含量，mPEG－MAL中是能与SH反应马来酰基含量。
如果mPEG－OH的端基被其他基团取代，而不是你所需要的官能团，取代度也会很高，但活性不高。
所以真正能够反映PEG修饰剂性质的应该是官能团活性，而不是端基取代度。

作者: avi317 时间: 2013-4-18 15:59

呵呵，受益匪浅了。这些问题也是苦恼我的，ge的那个macro sp 实在是太贵了，用普通的sp纯化，peg修饰后蛋白载量降低的太多。定点的修饰倒好（其实所谓定点修饰，并不是完全依赖peg，有一句话，叫case by case,peg-ald是最早被成为定点修饰的，与N末端形成烷基键。其他的都基本是形成个酰胺健，如sc，nhs等等，其实对于这种peg，控制反应ph，使亲核位点质子化或去质子化，都可以使修饰位点的比例发生偏移，有几篇文献就是通过控制反应ph来达到获取同分异构体的目的，进而进行测定先灵的peg-intron就是冻干粉的，说明这个his上的酰胺健是容易水解的，反过来说就是容易被去质子化，低ph下即暴露出亲核位点。而lys的N原子则要高ph才能去质子化。）

另外，修饰蛋白的均质性（老外叫homogenity）也是影响纯化的一个主要原因，我曾做过天然蛋白，分泌性蛋白，包涵体蛋白的peg修饰，剔除修饰位点的影响，总的感觉是一个比一个难以纯化。（呵呵，一家之言，有共同感觉的筒子们希望能和我说说）

fsdd817兄弟的话很有道理，介质载量是影响纯化的主要原因。一般的Q-SEPHOROSE及sp吸附peg-protein载量太小。macro sp说明书上说了一句话很好：当与peg-protein结合的配基少的时候，在loading的过程中，unpeg-protein会交换peg-protein，这样一来，整个层析过程就更加复杂。

对应macro sp这个介质的，有个叫ceramic Q HYPER D的介质，好想现在也不生产了，先灵的peg-intron就是用这个纯化的。他的说明书我也看过，叫gel in shell。。可惜没用过。。

帖子回的比较凌乱，正如我对peg修饰蛋白纯化的认识。希望和大家多多交流，能理顺，归纳，总结。

作者: avi317 时间: 2013-4-18 16:15

1. Obstacles and pitfalls in the PEGylation of therapeutic proteins

V. Gaberc-Porekar, I. Zore, B. Podobnik, V. Menart.

Curr. Opin. Drug Discov. Dev., 2008,11:242–250.

cuturl('http://www.biomedcentral.com/render/render.asp?arx_id=cd-877276&type=pdf&access=denied')

2. PEGylation: an approach for drug delivery. A review.

Jain A, Jain SK.

Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 2008;25(5):403-47. Review.

cuturl('http://dl.begellhouse.com/journals/3667c4ae6e8fd136'),5c6300a248a5f5e1,171be91337221ac9.html

3. The impact of PEGylation on biological therapies

Veronese FM, Mero A.

BioDrugs. 2008;22(5):315-29. Review.

cuturl('http://chinesesites.library.ingentaconnect.com/content/adis/bio/2008/00000022/00000005/art00004#avail')

4. Emerging PEGylated drugs

Kang JS, Deluca PP, Lee KC.

Expert Opin Emerg Drugs. 2009 May 20.

cuturl('http://www.informapharmascience.com/doi/abs/10.1517/14728210902907847?cookieSet=1&journalCode=emd')

5. PEG-modified ***aceuticals

Bailon P, Won CY.

Expert Opin Drug Deliv. 2009 Jan;6(1):1-16. Review.

cuturl('http://www.informapharmascience.com/doi/abs/10.1517/17425240802650568')

6. Advances in PEGylation of important biotech molecules: delivery aspects

Ryan SM, Mantovani G, Wang X, Haddleton DM, Brayden DJ.

Expert Opin Drug Deliv. 2008 Apr;5(4):371-83. Review.

cuturl('http://www.informapharmascience.com/doi/abs/10.1517/17425247.5.4.371')

作者: wood533 时间: 2013-4-18 16:20

正在准备做多肽的PEG修饰，从头看到尾了，发现最近上来讨论的战友很少了，这是一个很好的帖子，希望大家不要让他下沉了。

作者: is2011 时间: 2013-4-18 16:21

正在准备做多肽的PEG修饰，从头看到尾了，发现最近上来讨论的战友很少了，这是一个很好的帖子，希望大家不要让他下沉了。

作者: eric930 时间: 2013-4-18 16:22

请问下有人做过MAL修饰吗？
不稳定？
是mPEG与MAL之间的键还是 MAL与蛋白之间的键不稳定啊？

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mPEG－MAL与游离SH反应在pH6.5～7.5形成稳定的硫醚键，在pH>7.5时，会与NH2反应，并且发生马来酰基水解反应，在PH7时MAL与SH是NH2的1000倍.

作者: eric930 时间: 2013-4-18 16:22

mPEG－SC，MPEG－SPA，mPEG2－NHS等琥珀酰亚胺类修饰剂通常被认为是选择性修饰N端和lys的氨基，但是实际上除了这些基团，也可能连结在serine，tyrosine或者threonine的OH部分，解决的方法就是在高pH下修饰，在pH9～10时，形成的酯键不稳定，pH越高，脱PEG越快

作者: hyuu 时间: 2013-4-18 16:22

请问涉及到PEG修饰技术的专利哪个快过期了？

作者: 2541 时间: 2013-4-18 16:23

你好，购买贵公司的20K,mpeg-MAL。修饰的一个化学合成的4K小肽，CYS在C端最后一位，修饰率很好，我们肽上有两个LYS,C端最后一位的CYS上接的是-NH2,而不是-COOH,因此修饰的PH放在5.0-5.5，。纯化后纯度达98%,ELSD检测无游离PEG,但是制剂稳定性考察时发现稳定性不好，做了很多制剂配方都不行。稳定性主要是在PEG-肽主峰前出现小峰，且3个月考察后能增加到50%，ELSD检测此小峰和PEG有关。
修饰方法做过很多验证，包括加入微量的LYS,终止时用巯基乙醇，cys等等。结果都不理想。
我看了前面的讨论，不知道是不是和PEG开环有关，怎么验证降解是因为开环，而不是其他原因导致？如果是，有什么方法解决开环？
同时，我们也购买过键凯的PEG,结果一样。

作者: popo520 时间: 2013-4-18 16:28

您好！十分感谢对凯正生物支持！关于mPEG－MAL的开环，目前还没有太好的办法，但是开环不会引起PEG脱落。

作者: youyou99 时间: 2013-4-18 16:39

需要分离那么纯么？
单点修饰意义是什么？
谢谢

作者: ritou1985 时间: 2013-4-18 16:40

请问关于PEG残留问题，是否有相关法规要求，PEG的最大残留量（安全剂量）是多少？
如何制定质量标准中PEG的限度才算比较合理？

多谢盼回复

作者: NBA 时间: 2013-4-18 16:43

PEGylate 后的修饰物的分离也曾是一个难点，但现在已经可以通过一步层析，将单点修饰的PEG蛋白与未修饰蛋白及多点修饰蛋白分开。如果是自身的二聚体或多聚体，使用经典的分子筛就可解决问题了。
学长，这个一步层析具体如何做啊，我现在在用PEG修饰PLGA，反应完后，我也不确定到底修饰上了没有，以及反应后得到的粗产品纯度是多少，无法确证，就做不了下一步了，请教一下，如何做呀？

作者: fei1226com 时间: 2013-4-18 16:44

这些问题也是苦恼我的，ge的那个macro sp 实在是太贵了，用普通的sp纯化，peg修饰后蛋白载量降低的太多。定点的修饰倒好（其实所谓定点修饰，并不是完全依赖peg，有一句话，叫case by case,peg-ald是最早被成为定点修饰的，与N末端形成烷基键。其他的都基本是形成个酰胺健，如sc，nhs等等，其实对于这种peg，控制反应ph，使亲核位点质子化或去质子化，都可以使修饰位点的比例发生偏移，有几篇文献就是通过控制反应ph来达到获取同分异构体的目的，进而进行测定先灵的peg-intron就是冻干粉的，说明这个his上的酰胺健是容易水解的，反过来说就是容易被去质子化，低ph下即暴露出亲核位点。而lys的N原子则要高ph才能去质子化。）

另外，修饰蛋白的均质性（老外叫homogenity）也是影响纯化的一个主要原因，我曾做过天然蛋白，分泌性蛋白，包涵体蛋白的peg修饰，剔除修饰位点的影响，总的感觉是一个比一个难以纯化。（呵呵，一家之言，有共同感觉的筒子们希望能和我说说）

gehealth兄弟的话很有道理，介质载量是影响纯化的主要原因。一般的Q-SEPHOROSE及sp吸附peg-protein载量太小。macro sp说明书上说了一句话很好：当与peg-protein结合的配基少的时候，在loading的过程中，unpeg-protein会交换peg-protein，这样一来，整个层析过程就更加复杂。

对应macro sp这个介质的，有个叫ceramic Q HYPER D的介质，好想现在也不生产了，先灵的peg-intron就是用这个纯化的。他的说明书我也看过，叫gel in shell。。可惜没用过。。

帖子回的比较凌乱，正如我对peg修饰蛋白纯化的认识。希望和大家多多交流，能理顺，归纳，总结。

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macro sp这个填料也不见得有多好用。流速慢，不耐压。对工业放大不利。
PEG蛋白的纯化，主要和蛋白性质有关，不能一概而论。理论看来看去是那样，做起来没那么简单。

作者: wood533 时间: 2013-4-18 16:45

求助几篇文献!先谢谢了
Covalent conjugation of Poly(ethylene glycol) to protein and peptides:strategies and methods
methods Mol. Biol 2011 751:95-129
Cojugates of peptide and proteins to polyethylene Glycols
Methods molecular biology 2004, 283,45-70
State of the art in pegylation:The great vesatility achieved after forty years of reseached
Journal of controlled release 2011 vol.7

作者: fsdd817 时间: 2013-4-18 16:46

学长，这个一步层析具体如何做啊，我现在在用PEG修饰PLGA，反应完后，我也不确定到底修饰上了没有，以及反应后得到的粗产品纯度是多少，无法确证，就做不了下一步了，请教一下，如何做呀？

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呵呵，你这个问题应该很简单吧，你把原肽和反应混合物同时走一个HPLC分析一下，2个色谱图对照一下就能基本确定有没有链接上啊。

作者: redbutterfly 时间: 2013-4-18 16:46

有做PEG修饰小分子药物的么?

作者: wood533 时间: 2013-4-18 16:47

稳定性考察前面的峰增加很大,是否考虑过PEG-修饰蛋白聚集引起?

作者: wood533 时间: 2013-4-18 16:48

我仔细看了下，也是离子交换原理，和下面介绍的内容差不多。我在做离子交换也用过SP，但分离效果没有这篇文章说得那么好

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MSP这个填料应该是GE专门为PEG蛋白研制的。其实它就是个大孔径的SP介质。但是，个人使用后觉得跟蛋白关系比较大。想实现一步纯化也比较困难。它的缺点就是流速慢、贵。对放大特别不利

作者: wood533 时间: 2013-4-18 16:48

mPEG-SC修饰蛋白后样品里游离PEG的检测问题：用HPLC-ELSD效果怎样？用的是什么流动相？什么色谱柱？ELSD对于流动相的选择有哪些注意的吗？实验无进展，我真的急需这方面的信息~~~先谢谢了~~~！！！

作者: yychen 时间: 2013-4-18 16:49

用SMCC偶联纳米球与Cys-寡肽,偶联后会发生解偶联现象对么?

作者: wanglaoshi 时间: 2013-4-18 16:50

大家好，我是做肽组学的，想问下大家用阳离子交换柱能不能把分子量为300-1500范围内的PEG与分子量为1000-2000范围的多肽分开呢？一般选择什么流动相？PEG在pH2-3的溶液中会带什么电荷呢？能去除PEG的方法还有哪些呢？

图片附件: 93959422.png (2013-4-18 16:51, 33.63 KB) / 该附件被下载次数 28
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15700

作者: Owangsheep 时间: 2014-5-9 11:07 标题: 请问有mPEG-SC修饰多肽末端氨基的最佳反应时间是多久?

请问mPEG-SC修饰多肽末端氨基的最佳反应时间是多久?或者有这方面的文献吗？还有mPEG-SC的水解半衰期是多久？

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