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标题: 【讨论帖】最近做原核表达的几点教训和体会 [打印本页]
作者: ukonptp    时间: 2013-4-19 13:20     标题: 【讨论帖】最近做原核表达的几点教训和体会


最近在做原核表达，包涵体。以前也做过，但经验不多。从园子里也学到不少。一点失败的教训以及纯化过程中的体会，贴出来与大家共享，同时希望得到同行们的指正

1. 首先介绍一下背景。载体是novagen公司的pET22b，Amp抗性。菌株是Invitrogen的BL21 star DE3，是一个蛋白降解酶突变菌株，也就是说是一种优化表达菌株。

2. 第一次失败。第一次做诱导的时候，重复了很多次，但总是诱导不出来。PCR，酶切都正确。但没等测序结果出来就开始做了。失败了。曾在园子求助。后来证明是引物错误。我们实验室合成引物都要先发给purchasing office，然后才由他们与公司交涉。这个office的老太太把引物弄掉了一个碱基。
教训：在实验过程中，再仔细都是不为过的。引物来了后管壁上贴有序列，但我忽略了。

3. 第二次失败。后来重新构建，转化，诱导。第一次诱导时根本就没带。见附图（图片质量太差了，sorry，下面几个帖会逐渐好转。我们都在失败中提高，进步，不是吗）

然后开始找闷头原因。周一下午5点我就接了DE3菌，由于那天人非常不舒服，去看医生了，等了很久，到第二天中午11点才转接！而且是按1:50转接的！也就是菌在转接之前培养了18 h！

我们都知道，带Amp的E.coli在含Amp的平板上培养超过16 h后，菌周围会长出小菌落，我们叫它卫星菌落。这是因为细菌在生长的时候，为了抵抗Amp，会分泌B－内酰胺酶，而该酶会降解培养基中的Amp。对Amp产生抗性的机制和其他抗生素的情况是不同的（具体可以翻看分子克隆）。到菌体生长到足够浓度的时候，培养基的Amp就会慢慢减少。一旦细菌失去选择压力，就可能造成质粒丢失。当Amp降到很低，不足以抑制细菌生长时，未携带质粒的菌就会长得比带质粒的快。所以当培养时间足够长后，培养基中的B－内酰胺酶就会积累到很高的浓度。转接时（我是1:50转的），高浓度的酶可能破坏新鲜培养基中的Amp（而且我用的浓度是50 ug/ml）。这样，就造成最后收集的菌中，大部分都是没有带质粒的菌了。

当然还有一个可能的原因就是死亡的菌体分泌一些降解酶，使得表达检测失败。

这两种推测都只是推测，但我觉得第一种情况应该引起我们的重视。在使用Amp抗性的时候要格外注意。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15734

作者: ukonptp    时间: 2013-4-19 13:20

谈，下一话题

4. 第三次做诱导就格外小心了。首先，晚上12点我才接菌，到第二天早上就开始转接了。这次用的是100 ug/ul的Amp浓度。转接的时候是1:500稀释。（我不知道1:100行不行，一朝被蛇咬，十年怕井绳啊。在OD600达到0.8的时候诱导。
转接的时候做对照：IPTG 0 h，
同时做诱导：2 h, 3 h

结果见附图。图注的大概意思：
从左到右的泳道依次是：阴性对照，诱导2 h，诱导3 h；由于我做的是包涵体，所以前面点的都是沉淀，16，17点的上清。但这两个泳道太难看了。后面的胶会好一点，sorry

主要结果有三：
A. 有表达，
B. 阴性对照也有表达，所以这个结果不是很convincing
C. 目的蛋白应该在30 kD，但分子量显示是36 kD左右（这个问题是个低级错误，接下来的帖子会指出）。

原因分析：
为什么阴性对照会有带？我想起表达毒性蛋白的protocol. 表达毒性蛋白的时候，由于DE3可能根本就不长，或者长得很慢，这时候我们会在培养基中加glucose。当培养基中有其他首选碳源，如glucose时，细菌会优先选择glucose，而glucose会抑制cAMP的活性从而关闭乳糖操纵子。
为什么要加入glucose呢？我们用的DYT或者LB培养基中含有丰富的tryptone。后者可能含有微量的乳糖。所以虽然没有加IPTG，其中的lactose同样可能诱导蛋白的表达。这样毒性蛋白在加IPTG前就开始表达了，杀死或者抑制了细菌的生长。

那么我的这个实验中，阴性对照出现的带是不是也是因为这个原因引起的呢？

为了验证，进一步做了实验，结果见下一贴。

图片附件: 40837764.jpg (2013-4-19 13:20, 51.79 KB) / 该附件被下载次数 33
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15735

作者: ukonptp    时间: 2013-4-19 13:27


要验证阴性对照中的带是不是由于培养基中的微量lactose的，可以做如下实验，
A. 测培养基中乳糖含量；
B. 购买无乳糖培养基；

但是我不愿浪费时间在这上面。。。卖个关子哈

实际上，我做了如下的一组处理：
a. 阴性对照＋2％glucose
b. 阴性对照 without glucose
c. 诱导2 h
d. 诱导3 h
这个处理其实存在设计上的错误。如果要得出严谨的结论，应该要加一个2％glucose的诱导处理。这样，预期的结果就是：

a, 无目的条带，
b, 有目的条带，但不够多，
c, 有
d, 有
e, 2％glucose, 诱导，无目的条带或者仅有很浅的带。

很抱歉，e没有做。那天很久没用的两瓶glucose中的一瓶被污染了。。。

结果见附图。
图注的大概意思：
从左到右的泳道都是按a, b, c, d处理排列的。5－8以及13－16泳道是positive expression control。是pET15b携带b-galactosidase的一个构建。泳道1－8是全细胞蛋白电泳；泳道9－12是取沉淀电泳；13－16是上清电泳。结果：
a. 有glucose的阴性对照无带（或非常浅）
b. 无glucose的阴性对照有带，但整体来说比诱导的弱
c. 诱导的有带
d. 蛋白大小还是不对（其实是对的，我冤枉它了，请看后面的帖子）。

结论：培养基中确实很可能存在lactose。而且应该是造成阴性对照有表达的原因。

图片附件: 30859696.snap.jpg (2013-4-19 13:27, 50.45 KB) / 该附件被下载次数 31
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15736

作者: ukonptp    时间: 2013-4-19 13:27

相关疾病：
头痛
现在头疼的就是分子量的问题了。

首先，切胶做MS。见附图。那三个洞洞就是偶挖滴

根据公司的报告，这个蛋白就是我们要的蛋白。

然后就开始怀疑分子量marker了。

细心的战友可能发现了，我下面这个图marker其实跟上面几个图都是一样的，但标的不一样了。这就是我说的低级错误：

我之前的图是按Tris-HCl buffer，12％的胶标的。但我跑的Bis-Tris胶，而且是MES buffer。而marker在这两种buffer（胶）中所代表的分子量是不同的。有兴趣的战友可以查看下帖中的pdf文件。

图片附件: 92803121.jpg (2013-4-19 13:27, 29.45 KB) / 该附件被下载次数 28
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15737

作者: 雪山飞鹿    时间: 2013-4-19 13:28

版主大人就是强，总结的相当详细，尤其是对自己每步的错误分析，以及解决的办法的思考更是有参考意义。

做实验吗，犯错误是难免的，最重要的不是去郁闷，而是想办法如何分析和解决问题
作者: bs4665    时间: 2013-4-19 13:28

鉴定目的蛋白不能从分子量来确定，它只是一个参考，而且不同公司的蛋白Marker跑出的带肯定不会一样的，有的差别会很大。鉴定目的蛋白可以通过直接测序，Western or Elisa,等给予目的蛋白的特性来确定的方法进行，否则都不太准。
还有版主的阴性对照好像含有目的片断是么？ 作诱导表达为什么不做一个空载体作诱导呢？这样直观一些，而且可以分清该蛋白是否为细菌的本底表达。跑PAGE时沉淀和上清最好是分开跑，除非你重容沉淀时用和上清同样的BUFFER，否则它会影响带跑出的效果。
恭喜版主所在的实验室有这么好的条件，祝实验顺利！
以上是我个人的一点想法，望各位大侠赐教。
作者: bs4665    时间: 2013-4-19 13:30

鉴定目的蛋白不能从分子量来确定，它只是一个参考，而且不同公司的蛋白Marker跑出的带肯定不会一样的，有的差别会很大。鉴定目的蛋白可以通过直接测序，Western or Elisa,等给予目的蛋白的特性来确定的方法进行，否则都不太准。
还有版主的阴性对照好像含有目的片断是么？ 作诱导表达为什么不做一个空载体作诱导呢？这样直观一些，而且可以分清该蛋白是否为细菌的本底表达。跑PAGE时沉淀和上清最好是分开跑，除非你重容沉淀时用和上清同样的BUFFER，否则它会影响带跑出的效果。
恭喜版主所在的实验室有这么好的条件，祝实验顺利！
以上是我个人的一点想法，望各位大侠赐教。
作者: qiangren789    时间: 2013-4-19 13:30

对第一点，有不少战友再提问时都提到分子量不大一样，其实大多是比较正常的，异源表达，出来的蛋白肯定会和原来稍有不同，作个Western就很能够说明问题了。当然有条件的作个测序或者MS/MS也不错

第二点也很重要，阴性对照就应该是dada2006说的这样，还可以加上空白对照：原始菌种，以及阳性对照：已知目的蛋白，就更为完善了

祝好！
作者: ukonptp    时间: 2013-4-19 13:31

关于蛋白marker，我们用的是bio-rad公司的，胶也是precast的，buffer也是它们公司的MES buffer，所以是相当准确的，就是太奢侈了 几乎每次跑胶的时候都跟别人合着跑一块胶，否则太心疼

至于marker看实际蛋白的分子量，相对MS来说肯定是粗略，但结果仍然是可信的。不同公司的marker，只要其中每条ladder的蛋白是同一个东西，比如BSA, Lysozyme等，应该都是一样。而且公司会有说明的。需要注意的是自己的buffer是不是公司所指出的buffer（之一）。

鉴定目的蛋白，测序是比较贵的。我认为MS identification已经足够。如果测序正确，对照严格，大小正确，可以初步确定目的蛋白的表达；
同意您的意见，western or Elisa是进一步鉴定蛋白的常用办法。

我的阴性对照是含有目的片段的。确实缺少一个空载体的对照。严格的说，还应该有个不含任何质粒的DE3全蛋白电泳对照。但我当时就拿positive expression control的当没有含我需要表达的目的片段的negative control了。您可以比较一下，positive control的泳道里是没有这条带的。有偷懒的成分在里面但实验成本也确实有点高了，呵呵。

您说的上清沉淀分开跑的问题我真没仔细想过。多谢了。

希望以后能有更多机会与您交流，共同进步！
作者: yjf1026    时间: 2013-4-19 13:31


提个小小的笔误

pET应该是Novagen的原核表达品牌
作者: 子衿青青    时间: 2013-4-19 13:32


LZ确实细心。以前做过很长时间的表达，与LZ比较起来，真实惭愧，很多问题都没有细细钻研，往往想当然认为怎么样怎么样了。所以谢谢LZ，一方面是这么细致的心得，另一方面是对待实验中出现的问题的钻研态度哈。
作者: 子衿青青    时间: 2013-4-19 13:34


LZ确实细心。以前做过很长时间的表达，与LZ比较起来，真实惭愧，很多问题都没有细细钻研，往往想当然认为怎么样怎么样了。所以谢谢LZ，一方面是这么细致的心得，另一方面是对待实验中出现的问题的钻研态度哈。
作者: 分子式    时间: 2013-4-19 13:35

关于分子量我觉得大一点是正常的，这个里面牵涉到修饰问题，虽然是原核表达但是也存在一定的修饰，所以实际的分子量往往都是比理论上的大一点。
作者: tianmei001    时间: 2013-4-19 13:35


转接的时候，需要那么小的比例呀，都１／５００！？我做的是kan抗性，用１／１００（按制备感受态的要求做的），行吗？我问别的同学，还用过１／２５呢，要求严格吗？
作者: ukonptp    时间: 2013-4-19 13:41

kan抗性1:100没问题。但1:25我觉得高了点。因为过夜培养的菌里有部分死菌，对转接后生长不利；否则直接用过夜培养的菌就可以了，何必要转接？转接后高速培养（大约220 rpm）就是让细菌在较短的时间内达到对数生长期，达到活力最佳状态。否则

Amp的问题在首贴里已经提了。

谢谢讨论
作者: @STAR@    时间: 2013-4-19 13:42

结论：培养基中确实很可能存在lactose。而且应该是造成阴性对照有表达的原因。

对你的这个问题我想发表一下自己的想法，你培养基中的乳糖含量应该是微乎其微的，而且即使有微量的不足以引起诱导表达。我认为你的阴性对照中的表达蛋白是你在上样的过程中溢出来的。我曾经作出过，阴性对照和阳性菌株蛋白图谱完全一样的电泳图。最终试验结果证实，主要是上样品的过程中不够细心，溢出造成。
再一个就是，你要做一个空表达载体的阴性对照，更有说服力。
作者: @STAR@    时间: 2013-4-19 13:43

结论：培养基中确实很可能存在lactose。而且应该是造成阴性对照有表达的原因。

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对你的这个问题我想发表一下自己的想法，你培养基中的乳糖含量应该是微乎其微的，而且即使有微量的不足以引起诱导表达。我认为你的阴性对照中的表达蛋白是你在上样的过程中溢出来的。我曾经作出过，阴性对照和阳性菌株蛋白图谱完全一样的电泳图。最终试验结果证实，主要是上样品的过程中不够细心，溢出造成。
再一个就是，你要做一个空表达载体的阴性对照，更有说服力。
作者: ukonptp    时间: 2013-4-19 13:44

很高兴一起讨论。同意您提出的阴性对照问题。谢谢！

关于前面的问题，

1. 我用的是DYT培养基，比LB中的tryptone含量高一倍。
2. BL21 Star DE3是一种优化的表达菌株，invitrogen网站上有一张图片，用该菌株做表达，产量要高于未突变的DE3，因为前者是某（些）蛋白降解酶的突变菌株。
3. T7 promoter 具有很强的可诱导性。在表达毒性蛋白的时候常用到glucose或者pLysE 菌株。前者抑制蛋白的本底表达；后者能产生一种酶使得在T7 promoter控制下的基因表达得到抑制。这些都是因为培养基能诱导一些本底表达。

所以，您用的是什么菌株呢？表达量跟菌株，外源片段，加IPTG的时间等等都有关系。从图上您可以看到，我这个蛋白的表达是非常高的。除了加入的lysozyme （14k 左右的那条带），目的蛋白在总蛋白中的量恐怕要达到80％了。所以微量的lactose很有可能诱导出较多的蛋白。

关于漏样的问题。胶上有说明，18 wells，30 ul。我都是点10 ul样。另外，同样的操作，在第三张胶图中看不到漏样的现象。(可以比较positive control旁边的带）。

Anyway，我的这个结论缺乏直接的证据。所以我用的描述是”培养基确实很可能存在lactose，而且应该是造成阴性对照表达的原因“。

要证明这个问题，可以用不含tryptone的培养基，比如Minimal培养基和DYT做个对比。这样也能说明问题。也许等下次做蛋白表达的时候会考虑做一个，到时候再把结果贴上来

再次感谢您的讨论。
作者: dongdongqiang    时间: 2013-4-19 13:45

毒性蛋白表达非常不稳定
作者: ukonptp    时间: 2013-4-19 13:45

毒性蛋白表达非常不稳定 您的毒性蛋白表达protocol发一个
多谢

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表达毒性蛋白也有不同的毒性level。园子里关于毒性蛋白表达的帖子肯定不少。

一般的来说，将菌培养到高OD（要用丰富培养基，比如TB），OD600到4-5，甚至有人做14-16的，然后用低浓度IPTG短时间诱导（如0.4 mM 1 h）。具体的最优化条件，我认为不同的蛋白应该摸索不同的条件（诱导时细菌状态，时间等）。

也可以用表达毒性蛋白的strain，很多公司都有卖的。如BL21(DE3)pLysS.
作者: @STAR@    时间: 2013-4-19 13:46

关于前面的问题，

1. 我用的是DYT培养基，比LB中的tryptone含量高一倍。
2. BL21 Star DE3是一种优化的表达菌株，invitrogen网站上有一张图片，用该菌株做表达，产量要高于未突变的DE3，因为前者是某（些）蛋白降解酶的突变菌株。
3. T7 promoter 具有很强的可诱导性。在表达毒性蛋白的时候常用到glucose或者pLysE 菌株。前者抑制蛋白的本底表达；后者能产生一种酶使得在T7 promoter控制下的基因表达得到抑制。这些都是因为培养基能诱导一些本底表达。

所以，您用的是什么菌株呢？表达量跟菌株，外源片段，加IPTG的时间等等都有关系。从图上您可以看到，我这个蛋白的表达是非常高的。除了加入的lysozyme （14k 左右的那条带），目的蛋白在总蛋白中的量恐怕要达到80％了。所以微量的lactose很有可能诱导出较多的蛋白。

关于漏样的问题。胶上有说明，18 wells，30 ul。我都是点10 ul样。另外，同样的操作，在第三张胶图中看不到漏样的现象。(可以比较positive control旁边的带）。

Anyway，我的这个结论缺乏直接的证据。所以我用的描述是”培养基确实很可能存在lactose，而且应该是造成阴性对照表达的原因“。

要证明这个问题，可以用不含tryptone的培养基，比如Minimal培养基和DYT做个对比。这样也能说明问题。也许等下次做蛋白表达的时候会考虑做一个，到时候再把结果贴上来

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谢谢！
在诱导中，乳糖会被不断的降解，这也是我判断培养基中微量的乳糖不会影响诱导的原因。你已经表达出来了，这个问题就不值得深究了。

祝你试验顺利
作者: ukonptp    时间: 2013-4-19 13:46

谢谢！
在诱导中，乳糖会被不断的降解，这也是我判断培养基中微量的乳糖不会影响诱导的原因。

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这就是为什么用IPTG而不用Lactose的缘故。谢谢您指出这一点。

昨天看到一个autoinduction的培养基配方，

TB培养基＋1 ％Glycerol，不加IPTG。

我的理解是Tryptone诱导表达，不知道对不对？请大家指教。

ps: TB reciepe (Without glycerol): for 1 L

12 g Bacto-tryptone
24 g yeast extract
2.31 g KH2PO4
12.54 g K2HPO4
作者: 雪原    时间: 2013-4-19 13:47


最近正在做世界上最愚蠢的工作---optimization，想死………………
作者: ukonptp    时间: 2013-4-19 13:48

我也很怕做这些，在文章里最后就是一句话，但过程太漫长了。。。
作者: 04906    时间: 2013-4-19 13:48

请问一下
你的阴性对照（未诱导？空载体？没有转化的菌？）也有条带表达，你怀疑是乳糖诱导的，
那你为什么不用空载体或者没有转化任何载体的BL21做个阴性呢？那样的话，就算存在乳糖的问题，或者象你分析的那样，葡萄糖关闭了乳糖操纵子，使得不需要IPTG诱导就可以表达出目的蛋白。我觉得你的设计虽然巧妙，但好象有点画蛇添足之感。

另外，你提的第一个问题相当好，我从来就没注意过这个问题，我一直都是下午大约4点半左右接种，第二天早晨9点左右再扩大诱导的，我想如果真的存在你所说的那种情况，对我来说是个很好的改进的地方。
不过，我在做TA克隆的时候，也是这么做的，从来没遇到过什么质粒丢失的问题，（测序都已经证明我的结果），要么就是克隆菌和表达菌有差异。所以我还是有点怀疑你这个说法。你能拿出更有力的事实来证明你的结论（没有表达是因为摇菌时间太长质粒丢失而诱导了没有质粒的菌）吗？

另外问个弱点的问题，你用构建好的载体质粒去转化BL21,PCR筛出阳性后，再要筛一遍，看哪些有表达哪些没表达，（有些克隆虽然质粒已经转进去但仍然没有表达，克隆之间有差异，好象是有这么个说法），你这一步做了几个克隆？“表达阳性”率高么？

还有，你是怎么判断你的蛋白是毒性蛋白的？是已知蛋白么？
作者: ukonptp    时间: 2013-4-19 13:49

请问一下
你的阴性对照（未诱导？空载体？没有转化的菌？）也有条带表达，你怀疑是乳糖诱导的，
那你为什么不用空载体或者没有转化任何载体的BL21做个阴性呢？那样的话，就算存在乳糖的问题，或者象你分析的那样，葡萄糖关闭了乳糖操纵子，使得不需要IPTG诱导就可以表达出目的蛋白。我觉得你的设计虽然巧妙，但好象有点画蛇添足之感。

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非常感谢您参与讨论。谢谢批评。有不同的声音才有进步

第一个问题在前面已经检讨过了

无他，我舍不得做一个空的和转载体的而已。但最开始做转化的时候的确没有想到做个空载体和不含载体的对照，心想未诱导的阴性对照就OK了。其实这也是广泛接受的方法吧。如果结果可疑的话再做完善一些的对照去说明问题。做了这个试验以后发现结果可疑，但又不想等空载体转化的时间，所以就想到用glucose去做个对照。而且我认为这个对照还是有一定说服力的。当然如果最开始空载体的事情就不用这么费劲了。所以这个试验完全不是最开始“有意“的设计。但是换种思路也许能看到不同的方面，对吧？

要说明一下，整个试验并不是为了这个帖子有说服力，目的也不是为了要证明培养基里面有乳糖；这只是我做表达中的一点体会，如此而已。并不是先想到发帖子再做试验，而是拿到结果后一点体会贴出来，呵呵。得到蛋白之后有很多更有意义的事情，很多难题摆在我面前。这些结果只是供我分析用的。结果就是这样，不是为了发paper，估计不会补试验了，如果其它战友有兴趣，可以验证一下。
作者: ukonptp    时间: 2013-4-19 13:50

另外，你提的第一个问题相当好，我从来就没注意过这个问题，我一直都是下午大约4点半左右接种，第二天早晨9点左右再扩大诱导的，我想如果真的存在你所说的那种情况，对我来说是个很好的改进的地方。
不过，我在做TA克隆的时候，也是这么做的，从来没遇到过什么质粒丢失的问题，（测序都已经证明我的结果），要么就是克隆菌和表达菌有差异。所以我还是有点怀疑你这个说法。你能拿出更有力的事实来证明你的结论（没有表达是因为摇菌时间太长质粒丢失而诱导了没有质粒的菌）吗？

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需要指出的是，我并没有下结论。只是在分析可能的原因。

引自第一贴：
这两种推测都只是推测，但我觉得第一种情况应该引起我们的重视。在使用Amp抗性的时候要格外注意。

要证明这一点，可以设置不同的摇菌时间，不同的转接比例来进行试验。
不知道您的TA克隆是怎么回事。即使培养液中只有10 ％的带质粒的菌，还是可以提到质粒进行测序的。而且我想你用来提质粒的菌是不转接的。

要说明的是，”在使用Amp抗性的时候要注意这一点“，是因为这样做导致没抗性的菌比例会增加，而且可能导致培养基中仅有极少量的带质粒的菌，从而导致失败。但不是100 ％会失败。我还见过提质粒时培养基中不加抗生素的，照样提出来了。当我感到惊讶的时候，他说，我经常这样做啊。。。
作者: ukonptp    时间: 2013-4-19 13:50

另外问个弱点的问题，你用构建好的载体质粒去转化BL21,PCR筛出阳性后，再要筛一遍，看哪些有表达哪些没表达，（有些克隆虽然质粒已经转进去但仍然没有表达，克隆之间有差异，好象是有这么个说法），你这一步做了几个克隆？“表达阳性”率高么？

===========================================================================

就我做的而言，都有表达。我前后挑过8个。其实挑不同克隆做，也是in case而已（我认为）。
作者: ukonptp    时间: 2013-4-19 13:50

还有，你是怎么判断你的蛋白是毒性蛋白的？是已知蛋白么？

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您可能没有仔细看前面的帖子。该目的蛋白对E. Coli没有毒性。

至于如何判断，很多帖子，偶就不添足了

再次谢谢您的思考和讨论！
作者: 04906    时间: 2013-4-19 13:51


谢谢你的耐心解答
我还想把这个问题讨论的深入一点:

我做原核表达用的是invitrogen的pRSET载体，说明书上有这么一些话：

Before proceeding with the expression streak out the BL21(DE3)pLysS transformant containing the recombinant plasmid on LB containing 35ug/ml chloramphenicol and 50ug/ml ampicillin.Chloramphenicol selects for maintenance of the pLysS plasmid required for T7 lysozyme expression and ampicillin selects for the pLysS plasmid.It is important to maintain BL21(DE3)pLysS strains on LB and chloramphenicol as loss of the plasmid will increase basal levels of transcription.
另外，在后面的pilot expression的说明中，关于第一天摇菌后第二天扩大诱导的时候
有这么一句话，特地用括号圈出来的：
the next day.inoculate 25ml of SOB(It is not neccessary to include antibiotics for expression)to an OD600 of 0.1 with the overnight culture.

我对这些地方还感到有些疑惑，不明白streak out的意思。另外我也从来没用过氯霉素摇菌，而且我用的菌也不是这种pLysS的，而只是一般的BL21,不知道氯霉素是针对这种菌的还是……，总之我不太理解，关于质粒丢失这个问题，还希望把这个问题提出来大家讨论讨论。
作者: ukonptp    时间: 2013-4-19 13:51


Streak out: 就是划线培养。

Cam是维持PlysS质粒的。这个菌株就是带了这个质粒，其编码的产物，T7 Lysozyme可以降低在T7 promoter控制下的基因的表达。表达毒性蛋白就是用这种菌株，因为可以更严格地控制本底表达。这个质粒的拷贝数很低。可以和表达载体兼容。为了防止PlysS质粒丢失，菌要在Cam选择压力下培养。一般的Cam用25 ug/ml。这里用35 ug/ml 是不是造成更大的选择压力？

如果你不用这个菌株，用的普通DE3，就不用Cam。

至于括号里那句话我也不知道为什么。是针对BL21 DE3 PlysS来的吧？
作者: 04906    时间: 2013-4-19 13:52


我这两天又看了一点资料
谈一点关于质粒丢失的心得:
对于amp抗性来说,在培养基大约开始浑浊的时候,amp就已经开始分解了。当OD600值到达0.6的时候，amp抗性就已经分解的差不多了，再往后没有携带质粒的菌生长就开始占优势了。
按照pRSET说明书的说法，在cam和amp中培养过夜，就可以防止质粒丢失，也就不需要按照pET mannul所说的，譬如摇菌到0.4~0.6，4度保存过夜，第二天早晨离心弃上清，再加新鲜培养基稀释，接种。
针对（It is not neccessary to include antibiotics for expression）这句话，如果cam可以保证转化的质粒的量的话，那么在诱导的时候，一般我们都是将菌摇到0.6开始加入IPTG的，如果接种的菌液都可以保证最大比例的质粒含量的话，在OD0.6之前，就不存在amp分解造成杂菌生长的问题了。
这是我个人的理解，不太确定。希望得到讨论。
作者: ukonptp    时间: 2013-4-19 13:52


“按照pET mannul所说的，譬如摇菌到0.4~0.6，4度保存过夜，第二天早晨离心弃上清，再加新鲜培养基稀释，接种。”

我认为不用保存过夜吧，接新鲜的菌液不是更好？不知道这一步的目的是什么？

检测菌是不是失去抗性，我认为可以取菌液进行稀释，然后分别涂LB平板和LB＋Amp平板。然后看两者数目的区别。
作者: orangecake    时间: 2013-4-19 14:02


谢谢楼主，的确值得学习！最后一块胶的电压是多少？谢谢！
作者: zzzz    时间: 2013-4-19 17:30


我觉得转接比例不是很重要吧？我们实验室纯化蛋白都是1：8转接的，也能纯化出来。
作者: ukonptp    时间: 2013-4-19 17:31

谢谢楼主，的确值得学习！最后一块胶的电压是多少？谢谢！

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电压120 v
What is the problem?
作者: yes4    时间: 2013-4-19 17:32


我想问楼主的一个问题是，第二天转接，是不是培养基里就不必加葡萄糖了，因为我感觉没意义，但别的科室加，不明白为什么．
作者: yes4    时间: 2013-4-19 17:33


我想问的是第二天转接的时候，还用加葡萄糖吗？我认为意义不大，但许多科室都加，不知是什么原因．哪位帮我解释一下，谢谢！
作者: ukonptp    时间: 2013-4-19 17:34



QUOTE:
原帖由 yes4 于 2013-4-19 17:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我想问的是第二天转接的时候，还用加葡萄糖吗？我认为意义不大，但许多科室都加，不知是什么原因．哪位帮我解释一下，谢谢！

如果蛋白没有毒性，是不必要加的（LB或者DYT培养基）。
作者: gogo    时间: 2013-4-19 17:39

谢谢楼主，的确值得学习！最后一块胶的电压是多少？谢谢！

电压120 v
What is the problem?

谢谢楼主，我最近在诱导一个45kDa的蛋白，一直电泳不成功，拖带，成片，我用的稳流15mA，3.5h。感觉刚接触蛋白就这么麻烦，怎么继续下去做单抗呢？希望指点一下哦~~~还有每个加样孔加的蛋白样品量不一样，会产生影响吗？
作者: 831226    时间: 2013-4-19 17:41

我想问的是lactose 真的就可以诱导表达吗?好象真正的诱导物是allolactose吧
IPTG是allolactose而非lactose的类似物,但只有lac operon wild type 才可以将
lactose转变为allolatose 从而实现诱导表达,而很多表达strain 尤其是克隆strain 中的lac operon 被破坏掉了,所以应该不会有本底水平的表达.不然别人工业生产怎么不用Lactose 而用IPTG啊,IPTG 比起来贵多了.
作者: ukonptp    时间: 2013-4-19 17:44

谢谢楼主，我最近在诱导一个45kDa的蛋白，一直电泳不成功，拖带，成片，我用的稳流15mA，3.5h。感觉刚接触蛋白就这么麻烦，怎么继续下去做单抗呢？希望指点一下哦~~~还有每个加样孔加的蛋白样品量不一样，会产生影响吗？

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您能把图片贴上来，把protocol描述一下吗？样品里面除了SDS还有没有别的detergent？相信如果把详细信息贴上来后会有人提供有价值的建议的
作者: ukonptp    时间: 2013-4-19 17:47

现在我在做内皮抑素基因的表达，我用的菌株是BL21(DE3),质粒是pET-28a(+)，酶切成功，测序也没有问题，我也查了很多文献，质粒和菌株都应该没有问题，而且别人的表达量都很高。我只是想纯化出来和我们实验室的其他药物做个对照。可现在很郁闷。我尝试过不同的温度25.28.30.37，不同的IPTG浓度，但就是没有表达，我也过了一次ni柱，但没有我想要的目的条带。老板建议我在T7启动子的基础上再加一个sp6启动子，我也不知道是否有用，希望搂主在百忙之中给与指点。

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建议仔细检查：
1 虽然您说测序没问题，不知道您仔细看了是否有移框？
2 有没有rare codon？您是完全follow文献上的protocol（菌株）吗？
3 有没有试过高OD，短诱导的条件？

仅供参考，其它高手继续
作者: ukonptp    时间: 2013-4-19 17:47

我想问的是lactose 真的就可以诱导表达吗?好象真正的诱导物是allolactose吧
IPTG是allolactose而非lactose的类似物,但只有lac operon wild type 才可以将
lactose转变为allolatose 从而实现诱导表达,而很多表达strain 尤其是克隆strain 中的lac operon 被破坏掉了,所以应该不会有本底水平的表达.不然别人工业生产怎么不用Lactose 而用IPTG啊,IPTG 比起来贵多了.

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为什么用IPTG而不用lactose？因为后者发生诱导效应的同时也被细菌代谢。因此培养基中的lactose会持续下降。但IPTG就不同了，它既能诱导又不能被降解，所以能保持恒定的浓度。这也是为什么我们叫它做“安慰性诱导物”。
作者: wmp1234    时间: 2013-4-19 17:47


好,我是新手上路,试验从转化开始(如果不自己做感受态细胞的话).看了以上的讨论,受益匪浅啊.希望以后试验中遇到问题能得到各位的帮助.
作者: one    时间: 2013-4-19 17:48


好经验多谢指导。
我开始做包涵体原核表达不久，有两个问题相请教：
1、用菌体沉淀点SDS很困难，勉强点入仅有大分子量的跑出来了，胶面多数区域考马斯兰脱掉了但仍有一大片还在。什么原因呢
2、用亲和层析柱复性纯化后收峰体积相对大，也就是说蛋白含量太低，有什么办法检测哪个是目的峰？又怎么浓缩才能不再次变性？我用过冻干的方法又成沉淀了，着急死了。
作者: ukonptp    时间: 2013-4-19 17:49


第一个问题，菌体要破碎好，否则是不太好点；

第二个问题，能否贴一个chromatography上来给大家看看？您是说峰面积吧？检测目的峰就是SDS－PAGE了。

您的蛋白在亲和层析的时候已经复性了对吧？那如果用浓缩管应该不会沉淀；

个人的一点浅见，请其他有经验的战友继续讨论
作者: tie8    时间: 2013-4-19 17:50

我在做有关单链抗体的表达，我的构建的载体是pCANTAB 5E，原核表达 ;想请教搂住几个问题。
1.原核表达需要大量筛选不同的克隆么？做了菌落PCR鉴定有很亮的阳性带是否就能判断为重组子。
2.诱导表达的时间是否为影响蛋白表达部位的因素呐？有文献说过夜培养目的蛋白就渗漏到上清中，短期培养就在周质腔，这种说法可靠么？我试过表达过夜，但是在上清中检测不到目的蛋白。
3.表达目的蛋白除了过柱，还有别的好的纯化方法么？

谢谢楼主！
作者: zzzz    时间: 2013-4-19 17:50

因为很多人都用菌体点样作为跟破碎后、洗涤后、复性纯化后的对比，我也想做的。
至于复性峰的面积就很大，这样回收的液体就很多了，相对蛋白被稀释的倍数就太多了，我用的是普通的s200凝胶柱（检测出来有可能买专门的亲和柱），杂峰有多，我用过冻干法浓缩，蛋白又变性了成沉淀状。SDS电泳做过银离子染色，带太浅，看不清。有办法在蛋白浓度低的情况下检测出哪个才是目的峰么？
作者: zzzz    时间: 2013-4-19 17:53


版主，浓缩管是什么呢？
作者: ukonptp    时间: 2013-4-19 17:53

我在做有关单链抗体的表达，我的构建的载体是pCANTAB 5E，原核表达 ;想请教搂住几个问题。
1.原核表达需要大量筛选不同的克隆么？做了菌落PCR鉴定有很亮的阳性带是否就能判断为重组子。
2.诱导表达的时间是否为影响蛋白表达部位的因素呐？有文献说过夜培养目的蛋白就渗漏到上清中，短期培养就在周质腔，这种说法可靠么？我试过表达过夜，但是在上清中检测不到目的蛋白。
3.表达目的蛋白除了过柱，还有别的好的纯化方法么？

谢谢楼主！

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就我所知道的发表一下看法，供您参考：
1. 为了优化表达，有用不同单克隆进行表达，筛选最强者进行表达的；菌落PCR阳性判断重组子，是构建时候的事情。当然还要进行测序。转到表达菌株后，再进行菌落PCR，只是确认一下。
2. 文献说过夜培养目的蛋白渗透到上清？我认为只是针对该文献中的蛋白，或者某些蛋白而言的。不同蛋白特性不一样，表达部位也不一样。比如膜蛋白就可能跟Membrane结合在一起；要验证还是要靠实验。如果你表达过夜没有在上清里面，那说明你这个蛋白就是这样。
3. 据我所知就是过柱，分级沉淀，密度剃度离心了。过柱应该是最好的了
作者: ukonptp    时间: 2013-4-19 17:54

版主，浓缩管是什么呢？

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浓缩管，就是一种膜，能透过小于某特定分子量的分子。在离心的作用下，buffer逐渐排出，蛋白即得以浓缩。

google一下centricon，microcon的image就可以看到实物图片。
作者: ukonptp    时间: 2013-4-19 17:54

谢谢你的回复版主：）
因为很多人都用菌体点样作为跟破碎后、洗涤后、复性纯化后的对比，我也想做的。
至于复性峰的面积就很大，这样回收的液体就很多了，相对蛋白被稀释的倍数就太多了，我用的是普通的s200凝胶柱（检测出来有可能买专门的亲和柱），杂峰有多，我用过冻干法浓缩，蛋白又变性了成沉淀状。SDS电泳做过银离子染色，带太浅，看不清。有办法在蛋白浓度低的情况下检测出哪个才是目的峰么？

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还是不太明白您的问题，
样品直接过分子筛杂峰肯定多吧，我想。可否先跑离子交换？
峰太大？是不是取的peak收集？不用把整个峰收集到一块然后一起跑吧？如果想鉴定某个峰是不是您的蛋白，取peak的中间部分就好了。
在蛋白浓度低的情况，我想如果是生物活性法配合高灵敏度的仪器检测应该还是有可能的（但前提是这个生物活性本身很灵敏，比如产生荧光物质等）。
另外跑分子筛的话上样体积要小哈
作者: wmp1234    时间: 2013-4-19 17:54


我的确收了整个峰，下次只收峰最高的部分，谢谢你的建议。
检测目的峰我的东西可能不敏感，我在想想。非常感谢！
作者: sunshine039    时间: 2013-4-20 09:11

我诱导表达一个16KD左右的蛋白,在OD600=0.6-0.8时加入诱导剂.然后诱导4-6个小时.不知道为什么会出现以下两种情况:
1.诱导组和非诱导组比较,多出两条带.其中有一条与我要的大小相近,但是量并不大,另一条在30KD的地方.
2.与我目的带大小相近的带与MARKER最下面带的位置相比好象显的稍微大了一点,MARKER最后一条14.4KD的带要比目的蛋白16KD的带低很多,并且与说明书上面给的图片相比,MARKER最后一条带(最下面)与倒数第二条带的距离也相对大了一些.有没有人遇到过和我一样的情况呢?MARKER的位置可以完全说明问题吗?
作者: ukonptp    时间: 2013-4-20 09:11



QUOTE:
原帖由 sunshine039 于 2013-4-20 09:11 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我诱导表达一个16KD左右的蛋白,在OD600=0.6-0.8时加入诱导剂.然后诱导4-6个小时.不知道为什么会出现以下两种情况:
1.诱导组和非诱导组比较,多出两条带.其中有一条与我要的大小相近,但是量并不大,另一条在30KD的地方. ...


1. SDS-PAGE检测分子量只是一个大概。如果要用SDS-PAGE准确地检测分子量（表观），Bio-Rad有一种更精确的分子量检测产品，不过我也没用过

2. 30 kD的带是不是二聚体？能否做Western检测一下。

3. 如果可能，可以用低分子量范围的marker，跑15%的胶。如果要与公司提供的图片进行比较，注意胶浓度，胶类型，running buffer的组成是否一致。

4. 可以用Plot的方法，Lg MW为纵坐标，迁移率为横坐标，算出目的蛋白的分子量。不过这也是比较粗放的。

5. 由于你的蛋白本身就比较小，所以“大概16 kD”，最好是算出准确的分子量。根据氨基酸序列来算，而不是笼统地根据氨基酸数目来算。

个人意见，供讨论
作者: yychen    时间: 2013-4-20 09:12


最近我也在做原和表达，一直不顺，想和大家交流一下：
1 菌液OD值如何测得？需要一个control，我不知道该用LB还是用水。再，如何调节那个浓度旋钮。
2 拍page时，胶膜打卷，lz如何处理的？
3 我的菌液是1：10稀释，amp 100ug/ml。摇菌过夜后用的。200转/min，37度。试问，lz的转速和温度？
4 我的蛋白100KD。做PAGE时是将1ml菌液离心，弃上清。
再在沉淀内加入loading buffer（含SDS）震荡后煮沸使用。
5 加样前离心，Ep管上层为一种粘性物质，不易吸出也不易加入胶槽中。而如果这种物质跑出来的PAGE 就像是兰粉笔在胶面上划了一道，根本没有目的条带！lz把包涵体处理过么？
6 我做过一次wb（DAB显色），结果control（空载体）显色，而应该显色的却都没有显色。很奇怪。又做质粒酶切鉴定，正确。
作者: ukonptp    时间: 2013-4-20 09:14



QUOTE:
原帖由 yychen 于 2013-4-20 09:12 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

最近我也在做原和表达，一直不顺，想和大家交流一下：
1 菌液OD值如何测得？需要一个control，我不知道该用LB还是用水。再，如何调节那个浓度旋钮。
2 拍page时，胶膜打卷，lz如何处理的？
3 我的菌液是1：10稀释，amp 100ug/ml。摇菌过夜 ...

1. OD是扣除培养基空白。
2. 胶膜打卷？没明白。我是扫描仪扫的。
3. 我在180 rpm 37度诱导。不同的蛋白，在表达条件的优化上可以试试温度，时间等条件。
4. 1 mL菌液我认为偏多。而且不知道您取的菌生长到什么浓度。200 uL菌足够了。（当然可能您煮1 mL菌但是电样时仅点小量）
5. lz没有对样品进行特殊处理，就是煮样。“而如果这种物质跑出来的PAGE 就像是兰粉笔在胶面上划了一道，根本没有目的条带！”没有目的条带，是总是没有还是在这种情况下没有？没有目的条带，其它条带有没有？
6. 做WB的膜是用有目的条带的胶转的吗？

我认为1：10稀释不妥，你可以将最后的菌液和转接前的一起调到同一个浓度，然后铺LB＋Amp看看单菌落数有没有显著差异。

个人意见
作者: yychen    时间: 2013-4-20 09:17


谢谢

1 扣除培养基空白，就是说调空白时的浓度为 0
2 我是用bio-Rad来扫胶的。用扫描仪扫胶是个好办法，下次试试~~
3 摸条件的前提是诱导成功，所以当务之急是wb出结果！
4 你是把200ul菌液离心，是不是太弱了？这周我再做一次，把图传上来。
5 一条带也没有，什么也没有。就是一个块。明显和其他的上清液跑出来的band不一样。（以前做的page没留图，曾经拍过一个，效果很差。）
6 wb时，我转的膜很大，应该不会有错。再做一次吧。

关于稀释的问题，为什么1：10不行？1：500太少了吧？！在16h内可以让OD600达到0.5这个水平么？1ml：500ml，太稀了吧？！如果在相当时间内达不到一个理想水平，是不是菌的活性不好？

其实，这里面有个操作问题我一直没搞懂，就是标准的测菌液浓度。

下午已经把菌摇上了，明天再试试！
作者: ukonptp    时间: 2013-4-20 09:18

测OD，要扣除培养基的本底（值）。

为什么我认为1:10不好，前面的帖子有讨论。事实上后来看到很多文献也提到了，不过没留心记下来是什么文献。

关于摸条件，在表达不出来的时候可能也要摸索不同条件。如果电泳跑得不好，你拿空白的菌（就是什么也不转的）跑个电泳看看你的整个过程有没有问题。如果电泳没问题，要看看是不是稀有密码子比较多；再有就看看蛋白是不是有毒性。

供参考，祝实验顺利。
作者: yychen    时间: 2013-4-20 09:34

我刚刚找到一个不错的网站
搜索基因中的稀有密码子：
cuturl('http://molbiol.edu.ru/eng/scripts/01_11.html')
挺不错的，正好借花献佛帖在这里。

查询结果：
< 2.0的只有一个“agg ”密码子，出现了7次；
还有最后的一个终止密码子uag，=0.2。
其他基本都是>5.0
这个大于、小于应该就是指稀有程度吧。

可是没找到关于如何确定蛋白毒性的。lz是如何查的？
作者: ukonptp    时间: 2013-4-20 09:34


请问楼主：您的蛋白在哪里测序的？我在北京大学测序三次也未测出，每次原因都是N端封闭，而且是按照他们的建议制备的样品再测的。
作者: standbyme    时间: 2013-4-20 09:39


你好,我遇到一个奇怪的问题:
我想纯化的是可溶蛋白,第一次纯化的时候蛋白在洗脱液elute buffer里(蛋白浓度高的几管里)出现了白色的絮状沉淀,跑了大胶准备割胶的,但是染色出来量不够,不知道什么原因,我又摇了一升菌准备再重复一次,但是纯化时又在柱子的上方形成了白色的絮状物,柱子堵得根本过不下来,过柱之前我用了12000转离了50分钟,然后又用0.45微米的滤器过滤,我想不应该是里面的渣滓太多的原因,请高手能帮我分析下原因吧,万分感谢!!!
作者: ukonptp    时间: 2013-4-20 09:40

我刚刚找到一个不错的网站
搜索基因中的稀有密码子：
cuturl('http://molbiol.edu.ru/eng/scripts/01_11.html')
挺不错的，正好借花献佛帖在这里。

查询结果：
< 2.0的只有一个“agg ”密码子，出现了7次；
还有最后的一个终止密码子uag，=0.2。
其他基本都是>5.0
这个大于、小于应该就是指稀有程度吧。

可是没找到关于如何确定蛋白毒性的。lz是如何查的？

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AGG编码Arg，该密码子是影响比较大的。
还有AUA, CUA, CCC也要注意。

另外，稀有密码子出现的位置也很重要，如果出现N端的cluster，可能导致不能表达。您可以查查相关文献。

是否毒性，可以通过在平板上比较克隆大小（与空载体对照比以及加或不加IPTG的进行比较）；也可以通过做生长曲线（处理同上）来进行比较。

Just to discuss
作者: ukonptp    时间: 2013-4-20 09:40

请问楼主：您的蛋白在哪里测序的？我在北京大学测序三次也未测出，每次原因都是N端封闭，而且是按照他们的建议制备的样品再测的。

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我只做了protein identification，没做N- sequencing
作者: ukonptp    时间: 2013-4-20 09:40

你好,我遇到一个奇怪的问题:
我想纯化的是可溶蛋白,第一次纯化的时候蛋白在洗脱液elute buffer里(蛋白浓度高的几管里)出现了白色的絮状沉淀,跑了大胶准备割胶的,但是染色出来量不够,不知道什么原因,我又摇了一升菌准备再重复一次,但是纯化时又在柱子的上方形成了白色的絮状物,柱子堵得根本过不下来,过柱之前我用了12000转离了50分钟,然后又用0.45微米的滤器过滤,我想不应该是里面的渣滓太多的原因,请高手能帮我分析下原因吧,万分感谢!!!

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您好，
关于您这个问题我想需要更多的detail，包括蛋白的pI和你用的buffer pH；什么column，column干不干净，elution buffer是什么成分等。也许我没办法给您建议，但相信会有人能给您有用的信息
作者: 831226    时间: 2013-4-20 09:52


你好!非常感谢你的回复!
我的目的蛋白的Theoretical pI是6.50,我用的是Novagen的His-Tag融和蛋白亲和纯化的柱子,所有的Buffer的PH都调到了7.9,其中Elute Buffer的成分是:4M 咪唑; 2M 氯化钠; 80mM Tris-Hcl,PH也调到了7.9.
关于我的柱子,一是用的新的,二是用前都已平衡好了,我想应该不是柱子的问题,也问过其它实验室做蛋白的,有的说蛋白可能变性了,有的说蛋白太多可能沉淀了,都没遇到这样的情况也不能肯定,希望能得到大家的指点,谢谢!!!
作者: moonlight45    时间: 2013-4-20 09:53


lz你好，我是个新手，看到了有关OD600的空白我想说下我的试验：我用空杯子和LB(1ml＋100ul甘油，甘油用于防止细菌在测OD值的过程中沉淀而引起误差)做了对照，同样我的样品也用1ml菌液＋100ul甘油，通常情况下，空杯子做对照的时候值反而高约0.01左右。不知用那种方法准一些，请高手指点
作者: moonlight45    时间: 2013-4-20 09:55


另外，我还想问下：
我也在做原核表达，选用的BL21(DE3)菌珠，pGEX-4T3载体，amp抗性。蛋白表达量一直不高，而且我过夜培养（37度，180rpm）菌液抽提质粒时（博大泰克试剂盒）质粒浓度通常在100ug/ml，我把菌液诱导（37度，220rpm）到约OD＝0.4－0.6后，加氯霉素至终浓度85ug/ml，诱导过夜（37度，180rpm）后（OD=1.0）抽提质粒，浓度也只有160ug/ml，我在考虑是不是像lz所说，amp抗性的消失，造成了菌种选择压力的改变，致使无质粒的菌生长速度加快，而使质粒丢失造成的此现象，而质粒的拷贝数偏低，无质粒的菌存在又进一步影响了我的蛋白表达？
作者: ukonptp    时间: 2013-4-20 09:55

你好!非常感谢你的回复!
我的目的蛋白的Theoretical pI是6.50,我用的是Novagen的His-Tag融和蛋白亲和纯化的柱子,所有的Buffer的PH都调到了7.9,其中Elute Buffer的成分是:4M 咪唑; 2M 氯化钠; 80mM Tris-Hcl,PH也调到了7.9.
关于我的柱子,一是用的新的,二是用前都已平衡好了,我想应该不是柱子的问题,也问过其它实验室做蛋白的,有的说蛋白可能变性了,有的说蛋白太多可能沉淀了,都没遇到这样的情况也不能肯定,希望能得到大家的指点,谢谢!!!

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其它不好说，我觉得4M 咪唑应该高了点，虽然可能不是造成沉淀的原因；另外，2M NaCl是不是也高了些？请有经验的战友解答一下。

关于是否是变性的蛋白，可以用沉淀跑SDS-PAGE看看。
作者: ukonptp    时间: 2013-4-20 09:56

lz你好，我是个新手，看到了有关OD600的空白我想说下我的试验：我用空杯子和LB(1ml＋100ul甘油，甘油用于防止细菌在测OD值的过程中沉淀而引起误差)做了对照，同样我的样品也用1ml菌液＋100ul甘油，通常情况下，空杯子做对照的时候值反而高约0.01左右。不知用那种方法准一些，请高手指点

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您好，
“通常情况下，空杯子做对照的时候值反而高约0.01左右。”没太懂这个问题。不过不管怎么样，我认为0.01 的误差不要紧的；

另外，加了甘油菌液就稀释了。从培养基里面取出菌液马上测，我认为菌体沉淀的问题可以忽略。加上每次你都是用一样的条件；而且对于菌液浓度来说，OD值并不需要非常精确。比如0.6-0.8，那么0.82或者0.84之间影响不大。
作者: utt0989    时间: 2013-4-20 09:56

受教!
也在做表达,很繁琐,经过两个月,摸爬滚打,好不容易做出了条带,但是还是在沉淀当中,上清中有但条带很淡,请教,高手如何提供可溶性表达.
作者: utt0989    时间: 2013-4-20 09:58


另外我们通常用1:100稀释,效果不错,感时间的时候也用1:50.如果觉得培养时间长,重用培养基悬浮沉淀,可以去内酰氨酶
作者: 831226    时间: 2013-4-20 09:58


我一共配了5种Buffer,分别是Charge Buffer，Binding Buffer，Wash Buffer，Elute Buffer，Strip Buffer，ph都调到了7.9,也想到可能是ph的问题,但不知如何调节,更多的师兄师姐都说他们的ph7.9都做的很好,可能我的Buffer配错了,于是我干脆用别人的Buffer重复了一次,结果跟上次一样,细胞是在1*Binding Buffer里超声打碎的,然后离心取上清过柱子,样品在上清里面清澈透明挺好的,但是一加到柱子上方就出现很多白色絮状物,堵在柱床表面,样品滴的超慢,差不多1分半左右一滴,等的急死人了,柱子也是用1*Binding Buffer平衡好了的呀,如果是ph的问题的话,为什么不上柱子时挺好,而加到柱子上就出问题呢,谢谢各位的指点!!!
作者: vcve    时间: 2013-4-20 09:59


另外，我还想问下：
我也在做原核表达，选用的BL21(DE3)菌珠，pGEX-4T3载体，amp抗性。蛋白表达量一直不高，而且我过夜培养（37度，180rpm）菌液抽提质粒时（博大泰克试剂盒）质粒浓度通常在100ug/ml，我把菌液诱导（37度，220rpm）到约OD＝0.4－0.6后，加氯霉素至终浓度85ug/ml，诱导过夜（37度，180rpm）后（OD=1.0）抽提质粒，浓度也只有160ug/ml，我在考虑是不是像lz所说，amp抗性的消失，造成了菌种选择压力的改变，致使无质粒的菌生长速度加快，而使质粒丢失造成的此现象，而质粒的拷贝数偏低，无质粒的菌存在又进一步影响了我的蛋白表达？

困惑ing...
作者: vcve    时间: 2013-4-20 10:00


关于空白对照的问题，我个人认为，样品液和空白组差别除了目的物（菌OR、dna、ran等）外，应相同，这样才有可比性。关于甘油，我觉得还是看试验需求，如果一次测量多个样品，可以加，这样就损失了小部分但弥补了因菌沉淀而造成的误差，如果样品数量少或在测量前充分的重悬菌，就可以不加。
作者: dongdongqiang    时间: 2013-4-20 10:02


我想请教一下我连接后pet-22b-h-2kd比pet-22b跑的还快时怎么回事啊想请各位指点一下多谢了
作者: 49888    时间: 2013-4-20 10:02

你好!非常感谢你的回复!
我的目的蛋白的Theoretical pI是6.50,我用的是Novagen的His-Tag融和蛋白亲和纯化的柱子,所有的Buffer的PH都调到了7.9,其中Elute Buffer的成分是:4M 咪唑; 2M 氯化钠; 80mM Tris-Hcl,PH也调到了7.9.
关于我的柱子,一是用的新的,二是用前都已平衡好了,我想应该不是柱子的问题,也问过其它实验室做蛋白的,有的说蛋白可能变性了,有的说蛋白太多可能沉淀了,都没遇到这样的情况也不能肯定,希望能得到大家的指点,谢谢!!!

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根据你所说的情况，可以判断的是目标蛋白变性了。浓度高是一个原因，最主要的是缓冲体系的变化，这在蛋白表达后的下游处理中经常出现。建议你摸一下缓冲体系，pH适当调高，盐的浓度降低一些，并且加入一些表面活性剂，如0.1% tween20或TritonX100等，另外你的纯化是具有富集作用的，可以考虑适当稀释上样的样品浓度。good luck!
作者: tangxin_80    时间: 2013-4-20 10:04

我有一个问题想向各位高手请教：我的蛋白表达了，但是测序公司给我的结果是第151位的碱基确实，其余碱基都对。我想知道PCR过程能导致移吗突变吗？再说移码了开放阅读框也不可能终止啊！请各位大侠赐教！
作者: ukonptp    时间: 2013-4-20 10:08

我有一个问题想向各位高手请教：我的蛋白表达了，但是测序公司给我的结果是第151位的碱基确实，其余碱基都对。我想知道PCR过程能导致移吗突变吗？再说移码了开放阅读框也不可能终止啊！请各位大侠赐教！

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PCR过程能导致碱基缺失；
移码了，如果导致正常（非突变）情况下之前的TAA，TGA或者TAG in frame了，就会造成提前终止。

当然测序也可能有错误。

建议您
1. 检查测序公司给你的峰图；
2. 检查是不是造成提前终止，如果终止了是否不能得到你现在的结果（也就是可能得到一个截短蛋白（要能根据分子量判断））；
3. 是不是两头测序的？
4. 重新做克隆。
作者: windy+++    时间: 2013-4-20 10:09

我有个问题想请教一下，我原核表达一个蛋白，带his标签，分子量应该45kd左右，发现上清中似乎有差不多大小的蛋白，但沉淀中有大量30kd左右的蛋白，请问大家认为是降解掉了，还是没翻译完全？
作者: yychen    时间: 2013-4-20 10:09


节前做的wb和sds ，结果很郁闷
图是拿相机拍得
大家帮忙分析啊

用的protein marker 最上面的是98kd
我的目的蛋白是103kd+-

wb上的结果很奇怪，排除样品溢出。
page用的是wb胶的另外一半，所以没有marker，但是位置很高。大概就在胶破了的位置上。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15759

作者: zsxan1990    时间: 2013-4-20 10:14


最近做绿色荧光蛋白（GFP）的表达和纯化，我的载体是经过改造的PET-15b(在多克隆位点加上了SmalI位点,因为我们这里大多做平端克隆），表达菌株是 BL21（DE3）。接种后37度至OD0.6-0.8后，加IPTG，37度诱导4小时。

电泳后有表达（上清和沉淀都有），但不是很大。但是纯化总是挂不上拄
作者: wood533    时间: 2013-4-20 10:14

我有个问题想请教一下，我原核表达一个蛋白，带his标签，分子量应该45kd左右，发现上清中似乎有差不多大小的蛋白，但沉淀中有大量30kd左右的蛋白，请问大家认为是降解掉了，还是没翻译完全？

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即使不带任何质粒的BL21 DE3，沉淀中也是有蛋白的，所以还是要有对照
作者: orangecake    时间: 2013-4-20 10:18


刚开始做，有个问题，SDS loading buffer裂解全菌，超声10min，然后煮沸5min，离心后发现有大量不溶物，上清上样跑SDS-PAGE，用anti-His抗体做westernblot ，结果发现未经IPTG诱导就有很强的条带，分子量是make sense的，但是IPTG诱导后反而条带消失了，这是怎么回事？是不是蛋白在沉淀里呢？这个不溶于SDS的沉淀该怎么处理来上样跑胶阿？！ 谢谢！

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作者: ritou1985    时间: 2013-4-20 10:18

大侠，你好

我现在做大肠杆菌的正交优化表达，发现经过单因子实验得到的水平数正交实验后，有些培养基根本不表达，跑电泳都没有目的条带，请问这是什么原因啊

谢谢
作者: lgm    时间: 2013-4-20 10:19


版主，您好！
我最近在原核表达一种蛋白，用的是novagen公司的pet-32a(+)载体，LB培养基，BL21表达菌。空载体能诱导出蛋白来，可是重组好的怎么也诱导不出来，我摸过温度25-37度，诱导时间6h-12h,IPTG浓度0.01-10mM 还有诱导前菌液的OD600值，可是就是不出目的蛋白，快急死我了！！
难道与我的目的蛋白有关吗？还是其他什么因素？我怎么才能知道我的目的蛋白有毒性或是培养基里需要某种成分有助于它表达呢？
急切盼望版主的指点迷津！
作者: ukonptp    时间: 2013-4-20 10:20

空载体有蛋白，诱导系统应该没有问题；
我认为需要check的东西有，
1. 稀有密码子的问题，
2. 是否有毒性，你可以划一个有IPTG的板子，看看生长情况即可，当然也可一通过OD来看，不过前者更简单直接；
3. “诱导不出来”是一个结论。您是如何得出这个结论的，写详细一些可能更能得到有效的应助。
个人意见，供您参考。
Bless
作者: Ao7    时间: 2013-4-20 10:23


多谢版主的指点，我核对了一下我的目的蛋白的序列长约860Bp，发现共有十四个稀有密码子，第一个就是稀有密码子ATA，是不是这会有影响？我的目的蛋白里PCR时没合成起始密码子，和载体的N端标签融合只要不发生移码不需要起始码也可以吗？
我所说的“没诱导出来”是相对未诱导对照菌（没加IPTG）来说的
还有假如我的蛋白有毒性加入IPTG后划盘子是不是不长菌？
作者: Ao7    时间: 2013-4-20 10:23


太好了，您在呢，版主
还有我的目的蛋白是外分泌蛋白，为了防止它分泌到培养基里不好收蛋白，所以我在PCR时没有合成它的信号肽序列，以前我师姐曾作过它的含有信号肽的但在培养基里也没有收到蛋白
“加入后划盘子”应是 "划含有IPTG的平板"
作者: ukonptp    时间: 2013-4-20 10:24


860 bp....不是3的倍数呢，呵呵，笔误吧

200多个氨基酸里有14个是稀有密码子编码的，建议换菌株。特别是N端如果有较多的稀有密码子很可能影响表达。

关于毒性蛋白的程度，可以通过与正常平板来比较。毒性很强的是根本就不长，毒性较小的可以长的，但菌落很少/小。

个人意见。供您参考。
作者: Ao7    时间: 2013-4-20 10:25


不好意思，是861Bp,当时写错了，谢谢版主指点。我用GST标签的pGEX-4T-1-OPN载体诱导能够少量表达，His的换了菌株还是不表达
作者: ukonptp    时间: 2013-4-20 10:25

不同诱导条件，培养基，菌株，载体。。。

我现在同样存在这样的困惑

实在不行再换表达系统，是真核蛋白吗？
作者: Ao7    时间: 2013-4-20 10:25


不是真核的，我想用原核表达系统表达蛋白，最后决定就用GST标签融合表达，不用His标签了，多谢版主一直以来的帮助，以后有问题再请教
作者: INK    时间: 2013-4-20 10:26


刚开始做原核蛋白表达，提一个菜问题：离心收了细菌后，用sonication buffer 把沉淀resuspend起来吗？sonication buffer 的pH对目的蛋白会不会有很大影响？

谢谢各位。
作者: ukonptp    时间: 2013-4-20 10:26


sonication 用的buffer，其主要性质应该与后来的working buffer相似。pH的选择，应该避免选择pI附近。
作者: 987789    时间: 2013-4-20 10:26


我刚开始做蛋白质的原核表达,整个编码框编码一个282aa的蛋白,我利用的表达载体是pET32,表达菌株为Rosetta(DE3)plys.
转化产物在涂布IPTG的平板上完全没有长菌落,而没有加IPTG的则生长很正常!
请问接下来应该有什么可以改进的,我表达蛋白是为了做纯化,一方面去做抗体,另一方面打算做一些互作方面的研究的!
新手上路,请多多指教!
作者: 00无名指00    时间: 2013-4-20 10:27


如果蛋白毒性比较大，推荐试试C41和C43或者它们的pLys。

cuturl('http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6WK7-45MG2WN-8S&_user=10&_coverDate=07%2F19%2F1996&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_sort=d&view=c&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=f337c04ef0aa11ed9f72e5d9541b6425')

Over-production of Proteins inEscherichia coli: Mutant Hosts that Allow Synthesis of some Membrane Proteins and Globular Proteins at High Levels

Bruno Miroux and John E. Walkerf1
The Medical Research Council Laboratory of Molecular Biology, Hills Road, Cambridge, CB2 2QH, UK
Received 14 February 1996; revised 27 April 1996; accepted 6 May 1996. Available online 19 April 2002.

这个通讯作者是1997年获得诺贝尔奖的老大，呵呵
作者: 00无名指00    时间: 2013-4-20 10:27


这个基因预测为一个转录因子.
我做过瞬时表达的,定位在细胞核内.应该和跨膜蛋白没有关系吧!
作者: qianqin1977    时间: 2013-4-20 10:28


这两个菌株不一定只针对跨膜蛋白.
作者: mimili_901    时间: 2013-4-20 10:28


我想问问各位大侠，如果表达的是分泌性的蛋白，是不是蛋白应该存在于菌液离心后的上清中呀？那样的话又怎么来电泳呢？
作者: mimili_901    时间: 2013-4-20 10:28


我构建的融合蛋白在PET32a上，构建好的蛋白只表达一部分，中间没有终止子，后来听说我们学校里的一个老师和我遇到了同样的问题，她把载体换成PET28a就好了，于是我也把载体换成PET28a，但是这次更糟糕，什么都诱导不出来，请问我是不是还应该换载体呀，要是换的话，换成什么载体呢？

多谢指教！
作者: ukonptp    时间: 2013-4-20 10:29


人家的经验不一定能直接用，实验的东西，像是小马过河，呵呵

不知道您在pET32a载体里遇到了什么问题？有没有仔细比较过两个载体的差别？
作者: xyw5    时间: 2013-4-20 10:29


各位大侠：
你们好，我现在遇到一个非常棘手的问题，我做的是水貂生长激素的原核表达，我用的载体是PET28a，目的片断是人工合成的，载体和目的片断双酶切、连接、转化，测序结果都正确，已经证明是阳性重组质粒，但是我从年后开始就一直在做表达，硬是做不出来，我也多方面查资料，换了很多方法，对我的目的蛋白的表达就是不起任何作用。前几天我看到一篇外文，作的也是水貂生长激素的表达，资料说需要对密码子进行突变，蛋白才能表达，但我的目的片断是人工合成的，这样如何是好？请大家帮帮忙吧，谢谢阿，我都没辙了，现在。
作者: ukonptp    时间: 2013-4-20 10:30


是不是有稀有密码子？资料是不是把密码子进行突变成E.coli里常用的密码子？请搜索一下园子里，有关于rare codon的帖子。

如果方便可以把文献链接贴上来看看

至于突变，你可以选择点突变试剂盒，

您说基因就是人工合成的，那可以再合成一遍啊。
作者: INK    时间: 2013-4-20 10:34


还想问个问题，就是对一个基因的稀有密码子的预测多用哪个软件分析比较好呢？
新手上路，望多多指教，谢谢
作者: bling    时间: 2013-4-20 10:35


问个弱弱的问题：怎么知道我要表达的蛋白是否为毒性蛋白呢？谢谢赐教
作者: huifeng0516    时间: 2013-4-20 10:35


看了大家在前面的讨论，受益匪浅。我也在做原核表达，目前遇到了一个问题，令我很困惑：我要表达的目的蛋白是一种单链抗体，约48Kda，在BL21(DE3)中的表达量很低，见图1。于是换了一种表达菌Rosseta(DE3)，表达量虽然有增加，可是与蛋白Marker比对，位置却不一样了。这是为什么，有哪位高手遇到过这种情况吗？

图1 BL21（DE3）

图片附件: 32512283.jpg (2013-4-20 10:35, 14.71 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15761

作者: huifeng0516    时间: 2013-4-20 10:36


图2 Rosseta(DE3)

图片附件: 32512283.jpg (2013-4-20 10:36, 14.71 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15762

作者: mysmdbl    时间: 2013-4-20 10:36


如果你能将上述两次的表达产物在一块胶上跑，判断就很明显了！
我认为：两次的表达产物位置差不多，SDSpage不准的
很可能由于表达量高了，挤压了下面的带，你下次上样减少体积，最终使你第二次表达的条带和第一次的粗细相当
作者: yapuyapu    时间: 2013-4-20 10:37

有没有包涵体表达纯化的贴？变性，复性，纯化相关内容的
作者: zhenxin    时间: 2013-4-20 10:37


最近一直在做原核表达，不过没有结果，很郁闷！今天看到大家的精彩讨论，受益匪浅，好像找到我的蛋白没有表达的原因啦！谢谢大家！
作者: qianqin1977    时间: 2013-4-20 10:37


看到文献说，如果表达毒性蛋白，特别是可以水解细胞壁的蛋白，可以低温（4度冰箱）放置，即加IPTG诱导大约2小时后冰箱放置过夜。不知有没有做过相似实验的战友啊？
作者: plaa    时间: 2013-4-20 10:38


相关疾病：
头痛
我最近也在做原核表达，实验的重复性很差，很头疼，想楼主把自己做原核表达的详细步骤给我讲一下。我用的是PET30载体和BL21感受态细胞。谢谢！
作者: plaa    时间: 2013-4-20 10:39


我一直在做一种毒性蛋白的表达，构建的质粒经测序是正确的，在BL21,rosetta,C43中都没有表达。是不是与载体也有关系呢？



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