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标题: HPLC使用注意事项及HPLC柱子使用经验之谈 [打印本页]

作者: maicaixiaogu 时间: 2009-11-27 10:46 标题: HPLC使用注意事项及HPLC柱子使用经验之谈

一些很好的经验，对论坛以及自己的一些经验进行了总结，希望能对大家有所帮助。

　　HPLC使用注意事项

　　1.流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜过滤)。

　　2.流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。

　　3.不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。

　　4.使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子一小时，然后用甲醇(或甲醇水溶液)冲洗40分钟以上，以充分洗去离子。对于柱塞杆外部，做完样品后也必须用去离子水冲洗20ml以上。

　　5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水易长霉。

　　6.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。

　　7.C18柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。

　　8.堵塞导致压力太大，按预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器→单向阀检查并清洗。清洗方法;①以异丙醇作溶剂冲洗：②放在异丙醇中间用超声波清洗;⑧用10%稀硝酸清洗。

　　9.气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。

　　10.如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相的清洗。

　　11.要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。

　　12.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗，然后插入新的流动相中。更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。

　　高效液相色谱常见故障的断定及解决诊状可能的原因解决方法

　　(一)保留时间变化

　　1.柱温变化柱恒温，必要时需配置恒温箱

　　2.等度与梯度间未能充分平衡至少用10倍柱体积的流动相平衡柱

　　3.缓冲液容量不够用》25mmol/L的缓冲液

　　4.柱污染每天冲洗柱

　　5.柱内条件变化稳定进样条件,调节流动相

　　6.柱快达到寿命采用保护柱

　　(二)保留时间缩短

　　1.流速增加检查泵,重新设定流速

　　2.样品超载降低样品量

　　3.键合相流失流动相PH值保持在3"7.5检查柱的方向

　　4.流动相组成变化防止流动相蒸发或沉淀

　　5.温度增加柱恒温

　　(三)保留时间延长

　　1.流速下降管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡

　　2.硅胶柱上活性点变化用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化

　　3.键合相流失同前(二)3

　　4.流动相组成变化同前(二)4

　　5.温度降低同前(二)5

　　(四) 出现肩峰或分*

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[ 本帖最后由 maicaixiaogu 于 2009-11-27 10:48 编辑 ]

作者: maicaixiaogu 时间: 2009-11-27 10:53

　　液相色谱柱使用经验谈

　　色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同;另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。

　　1、样品的前处理：

　　a、最好使用流动相溶解样品。

　　b、使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。

　　c、使用0.45祄的过滤膜过滤除去微粒杂质。

　　2、流动相的配制：液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流

　　动相具备以下的特点：

　　a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。

　　b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。

　　c、流动相的黏度要尽量小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果;同时降低柱压降，延长液体泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。

　　d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。

　　e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。

　　f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。

　　2、流动相流速的选择：因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1ml/min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml/min为佳。当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。

　　注意：

　　a.由于甲醇廉价，对于反相柱推荐使用甲醇体系(必须使用乙腈的场合除外)。

　　b.对于正相柱推荐使用沸程为30-60℃的石油醚或提纯后的己烷作流动相，没有提纯的己烷不得使用。用水最好使用超纯水(电阻率大于18兆欧)，去离子水及双蒸水中含有酚类杂质，有可能影响分析结果。

　　c.含水流动相最*在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。最好加入叠氮化钠，防止细菌生长。

　　d.流动相要求使用0.45 祄滤膜过滤，除去微粒杂质。

　　e.使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能

　　HPLC的常用术语

　　第一部分　色谱曲线

　　1、 romatogram)：色谱柱流出物通过检测器系统时所产生的响应信号对时间或流动相流出体积的曲线图，或者通色谱图(ch过适当的方法观察到的纸色谱或薄层色谱斑点、谱带的分布图。

　　2、 (色谱)峰(chromatographic peak)：色谱柱流出组分通过检测器系统时所产生的响应信号的微分曲线。此主题相关图片如下：此主题相关图片如下：

　　3、峰底(peak base)：峰的起点与终点之间的连接的直线(图1 中的CD)。

　　4、峰高(h ，peak height)：色谱峰最大值点到峰底的距离(图1 中的BE)。

　　5、峰宽(W ，peak width)：在峰两侧拐点(图1 中的F ，G)处所作切线与峰底相交两点的距离(图 1 中的KL)。

　　6、半高峰宽(W h/2 ，peak withd at half height)：通过峰高的中点作平行于峰底的直线，此直线与峰两侧相交两点之间的距离(图1 中的HJ)。

　　7、峰面积(A ，peak area)：峰与峰底之间的面积(图1中的CHEJDC)。

　　8、拖尾峰(tailing peak)：后沿较前沿平缓的不对称的峰。

　　9、前伸峰(leading peak)：前沿较后沿平缓的不对称的峰。(又叫伸舌峰、前延峰)

　　10、假峰(ghost peak)：除组分正常产生的色谱峰外，由于仪器条件的变化等原因而在谱图上出现的色谱峰，即并非由试样所产生的峰。这种色谱峰并不代表具体某一组分，容易给定性、定量带来误差。(又叫鬼峰)

　　11、畸峰(distrorted peak)：形状不对称的色谱峰，前伸峰、拖尾峰都属于这类。

　　12、反峰(negative peak)：也称倒峰、负峰，即出峰的方向与通常的方向相反的色谱峰。

　　柱的使用和维护注意事项(推荐)

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作者: maicaixiaogu 时间: 2009-11-27 10:56

高效液相色谱仪常规分析操作步骤及规程

　　高效液相色谱仪操作步骤：

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作者: yfdihdx 时间: 2009-11-27 10:58

感谢分享！收获很大！！

作者: JJSIE--NNE 时间: 2009-11-27 11:00

总结的很好，使我收获很大，谢谢了

作者: huihuidetian112 时间: 2009-11-27 11:01

不错的资源，够实用的。。

作者: aasle 时间: 2009-11-27 11:03

十分感谢分享好文，确实很不错。

作者: lfm20091102 时间: 2009-11-27 11:18

:) :)

作者: gitde 时间: 2009-11-27 11:24

您的文章很实用！学习了。。

作者: jeirf3uwd 时间: 2009-11-27 11:26

哈哈，不错的好东西，谢谢楼主！

作者: haohaorenjia 时间: 2009-11-27 11:28

几乎每一点都能用得上。谢谢啊！

作者: MNOD 时间: 2009-11-27 14:13

好资料，谢谢分享！！

作者: uwku58h 时间: 2009-11-27 14:15

谢谢lz值得一看的东西！！

作者: ngoir 时间: 2009-11-27 15:16

呵呵，实用的资料！！

作者: DragonsABC 时间: 2009-11-28 23:21

实用资源！！谢谢！！！

作者: aspoul 时间: 2009-11-30 10:19

互勉互勉

作者: piaoliang110mei 时间: 2009-12-1 10:36

谢谢楼主！

作者: OSRCC_REE 时间: 2009-12-2 17:15

支持！很实用的好资料。。

作者: cpudaxiao 时间: 2009-12-4 11:54

效液相色谱仪常规分析操作步骤及规程

　　高效液相色谱仪操作步骤：

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作者: huangyi1981 时间: 2009-12-14 15:43

哈哈，不错的好东西，谢谢楼主

作者: guilun_001 时间: 2009-12-15 10:40 标题: 学习了

学习了，谢谢

作者: jiayuzaixian 时间: 2009-12-21 15:47

非常的好。感谢

作者: newday430 时间: 2010-1-1 02:22

henhao

:) :)

作者: HDR 时间: 2010-3-15 08:55

总结的很好，使我收获很大，谢谢了

作者: HDR 时间: 2010-3-15 08:56 标题: 回复 #2 maicaixiaogu 的帖子

总结的很好，使我收获很大，谢谢了

作者: snowing1984 时间: 2010-6-22 15:00 标题: 很好的资料

很好的资料正到处找呢多多交流

作者: wy82 时间: 2010-6-22 17:52 标题: 回复 #1 maicaixiaogu 的帖子

谢谢楼主分享，楼主辛苦了

作者: dx0750 时间: 2010-7-16 07:34 标题: 回复 #3 maicaixiaogu 的帖子

感谢提供这么好的资料。

作者: 鸭梨儿 时间: 2010-7-21 18:59 标题: 回复 #3 maicaixiaogu 的帖子

看看，学习学习，谢谢分享！

作者: lancehq 时间: 2010-7-21 20:43

支持！~

作者: 阳光墨墨 时间: 2010-8-2 16:52

哈哈，不错的好东西，谢谢！

作者: keenly 时间: 2010-8-7 10:22 标题: 学习

学习一下啊

作者: kuailedeadai 时间: 2010-8-12 09:31 标题: 回复 #1 maicaixiaogu 的帖子

菜鸟来学习学习了呵呵

作者: mengqiqi 时间: 2010-8-16 16:56

作者: cyp256 时间: 2010-8-31 07:07

很想看完，谢谢啦！

作者: nmwuran 时间: 2010-8-31 08:17

很好的材料，学习了...

作者: 梦佳儿 时间: 2010-10-22 15:35 标题: 太好了

楼主辛苦了，十分感谢!

作者: langmanzhiwang 时间: 2010-10-24 01:02

123132HAO
!

作者: ganenxifu 时间: 2010-10-25 09:33

顶顶顶顶顶顶顶顶顶顶顶顶顶

作者: langfangzjzx 时间: 2010-10-29 21:47 标题: 很好。。。谢谢分享

很好。。。谢谢分享，，，，，

作者: zhentingcai 时间: 2010-11-21 03:02

very good piece of information ty

作者: mengzi2010 时间: 2010-12-6 11:57

哈哈，不错的好东西，谢谢楼主！谢谢!!!

作者: 全于娟 时间: 2010-12-15 20:32 标题: 感谢楼主

感谢楼主

作者: 870203cp 时间: 2010-12-15 22:30

,东西很好，学到很多东西，谢谢

作者: sunyugang001 时间: 2010-12-15 23:50 标题: 恩，很好

现在急需这方面的资料，很有帮助

作者: 默蓝 时间: 2010-12-16 12:58

不错的资源，够实用的。。

作者: xiaoweima 时间: 2010-12-19 15:53

多谢楼主分享经验

作者: tgforce 时间: 2010-12-20 13:29

学习了，谢谢楼主！！！

作者: sunsea 时间: 2011-2-19 02:31

thank you very much

作者: lovedich 时间: 2011-4-5 19:56

很给力，谢谢·····

作者: wuhuixuanze 时间: 2011-4-6 17:44 标题: 回复 #2 maicaixiaogu 的帖子

太好了，收起来了，大家共同进步!非常感谢！

作者: liujinyan2007 时间: 2011-4-8 11:33

不错的资料，感谢分享

作者: asdfl1 时间: 2011-7-6 11:16

十分感谢分享好文，确实很不错。

作者: plum229 时间: 2011-7-7 10:25

看看不错谢谢分享

作者: ysxhk 时间: 2011-7-8 14:20

谢啦，对我这样的新手很有帮助

作者: ysxhk 时间: 2011-7-8 14:21

谢啦，对我这样的新手很有帮助

作者: 上传图片 时间: 2011-8-29 20:23 标题: xuexizhong

ziliaohenhao

作者: wy8611meng 时间: 2012-5-21 08:30 标题: 非常有用

进来学习一下

作者: chen朗心 时间: 2012-6-28 10:49

:) :) :) :) :) :)

作者: shui__lian 时间: 2012-8-14 16:12

不错分享了

作者: 疯狂的麦子 时间: 2014-6-13 00:12

新手菜鸟，来学习学习，谢谢大神指导

作者: 生命的意义 时间: 2014-6-13 10:29

收获很大，感谢分享！

作者: silent003 时间: 2014-6-13 15:58

流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。

作者: youcai147 时间: 2014-11-6 15:54

使我收获很大，谢谢了

作者: 土豆 时间: 2015-1-28 16:55

很不错哦

作者: zuo365838 时间: 2016-6-6 14:23

学习中，很是受用

作者: zuo365838 时间: 2016-6-6 14:25

非常受用，学习中

作者: zuo365838 时间: 2016-6-6 15:46

感谢分享，很实用，学习中

作者: zuo365838 时间: 2016-6-6 15:47

感谢分享，很实用，学习中

作者: 何舍予 时间: 2016-6-27 13:47

谢谢分享

作者: zxw5133 时间: 2016-8-4 10:23

ant_81.GIF ant_81.GIF ant_81.GIF

作者: neartree 时间: 2016-8-8 23:06 标题: 长知识了

很受益，呵呵

作者: chmm211 时间: 2016-8-22 16:29 标题: 回复 #1 maicaixiaogu 的帖子

楼主辛苦！赞一个，作为一个新手感觉很有帮助

作者: 13774250768 时间: 2016-10-10 13:01

多谢分享！学习学习

作者: 落v单 时间: 2016-11-2 16:52

谢谢，这是好东西

作者: ZHOUXIAOYUAN 时间: 2016-11-14 16:02

感谢楼主

作者: mxl0227 时间: 2017-5-19 08:15

谢谢楼主分享很有用

作者: wangying1990 时间: 2017-5-19 15:30

好全面啊，谢谢分享

作者: mxl0227 时间: 2017-5-26 15:45

感谢分享！收获很大！

作者: mxl0227 时间: 2017-5-26 15:46

很实用的总结谢谢楼主

作者: mxl0227 时间: 2017-5-26 15:47

很实用的总结谢谢楼主

作者: lzorh6003 时间: 2017-7-26 21:46

总结得好，值得学习/复习，谢谢

作者: 15295141475 时间: 2017-9-13 10:25

1111111111

作者: 13711773054 时间: 2017-12-4 23:59 标题: 回复 #1 maicaixiaogu 的帖子

好资源~学习了，谢谢楼主

作者: 袁艳秋 时间: 2017-12-20 14:42

哈哈，不错的好东西，谢谢楼主！

作者: 15355520301 时间: 2017-12-20 15:26

ODS柱
C18柱一般指本词条
ODS柱是一种常用的反相色谱柱，也叫C18柱；由于它是长链烷基键合相，有较高的碳含量和更好的疏水性，对各种类型的生物大分子有更强的适应能力，因此在生物化学分析工作中应用的最为广泛。
中文名
ODS柱
外文名
Octadecylsilyl
属性
学科术语
简称
ODS
简介
ODS柱是十八烷基硅烷键合硅胶填料（Octadecylsilyl，简称ODS）。这种填料在反相色谱中发挥着极为重要的作用，它可完成高效液相色谱70～80%的分析任务。由于C18(ODS)是长链烷基键合相，有较高的碳含量和更好的疏水性，对各种类型的生物大分子有更强的适应能力，因此在生物化学分析工作中应用的最为广泛。

近年来，为适应氨基酸、小肽等生物分子的分析任务，又发展了CH、C3、C4等短链烷基键合相和大孔硅胶（20～40μm）。
分类
按键合到基质上的官能团可分为：
⑴反相柱：填料是非极性的，官能团为烷烃，例如：C18(ODS)、C8、C4等。
⑵正相柱：填料是极性的，官能团为－CN氰基、－NH2氨基等。
⑶离子交换键合相：阳离子官能团：－SO3H磺酸基、－COOH羧基等。阴离子官能团：―R4N+季铵基、-氨基等。 ( 由于硅胶基质的键合相只能在pH=2～7.5的范围内使用，而离子交换色谱要求有更宽的pH范围，因此其基质现在仍主要使用聚苯乙烯和二乙烯苯。) 流动相：
反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度如下： H2O<甲醇<乙腈<乙醇<丙醇<异丙醇<四氢呋喃最常用的流动相组成是："甲醇-H2O"和"乙腈-H2O"，但由于乙腈具有一定的毒性，通常优先考虑"甲醇-H2O"流动相。反相色谱中，溶质按其疏水性大小进行分离，极性越大疏水性越小的溶质，越不易与非极性的固定相结合，所以先被洗脱下来。流动相的pH对样品溶质的电离状态影响很大，进而影响其疏水性，所以在分离肽类和蛋白质等生物大分子的过程中，经常要加入修饰性的离子对物质，最常用的离子对试剂是三氟乙酸（TFA），使用浓度为0.1%，使流动相的pH值为2～3，这样可以有效地抑制氨基酸上α羧基的离解，使其疏水性增加，延长洗脱时间，提高分辨率和分离效果。完全离子化的溶质，例如强酸或强碱，其在反相键合相上的保留值很低，近于死时间流出，不能进行分析。根据离子对色谱的原理将一种与样品离子电荷（A+）相反的离子（B－），称为对离子，加入到流动相中，使其与样品离子结合生成弱极性的离子对，即中性缔合物，从而增强了样品的疏水性，加大了保留值，改善了分离效果。
正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序是：正己烷<乙醚<乙酸乙酯<异丙醇其中最常用的是正已烷，虽然其价格较贵，但80%的顺、反和邻位、对位异构体仍然要用正相色谱来进行分离。流动相的选择原则是：①样品易溶，且溶解度尽可能大。②化学性质稳定，不损坏柱子。③不妨碍检测器检测，紫外波长处无吸收。④粘度低，流动性好。⑤易于从其中回收样品。⑥无毒或低毒，易于操作。⑦易于制成高纯度，即色谱纯。⑧废液易处理，不污染环境。

作者: 18360345451 时间: 2019-1-29 13:44

作者: 13693879860 时间: 2019-1-29 15:40

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作者: zwy930711 时间: 2019-3-17 12:39

有收获，谢谢

作者: zwy930711 时间: 2019-3-17 13:00 标题: 回复 #1 maicaixiaogu 的帖子

很有收获，非常感谢！

作者: 18736614975 时间: 2019-9-5 17:54 标题: 回复 #1 maicaixiaogu 的帖子

谢楼主分享，刚开始做液相色谱，就担心泵、柱子等出现问题

作者: yukilan 时间: 2019-9-6 17:28

谢谢分享。

作者: 18913308661 时间: 2020-6-5 16:31

作者: 18779578856 时间: 2020-6-12 10:35

作者: milothigle 时间: 2020-12-23 18:43 标题: 回复 #1 maicaixiaogu 的帖子

很受用，谢谢分享

作者: lujun0337 时间: 2021-3-16 20:28

内容很实用，

作者: zhangggy26 时间: 2021-10-7 11:38

！！！棒

作者: 13388291453 时间: 2022-5-16 09:35

谢谢分享

作者: 18052092072 时间: 2022-7-18 14:46

非常有用

作者: qixiang 时间: 2022-7-24 10:35

总结的很好，使我收获很大，谢谢了

作者: cmy0426 时间: 2023-2-8 17:05

感谢楼主分享，学到了

作者: yhtfyl 时间: 2023-2-22 07:34 标题: 感谢楼主分享，受教了

感谢楼主分享，受教了

作者: BIGJOEL 时间: 2023-5-29 20:04

很有用的知识

作者: BIGJOEL 时间: 2023-5-29 20:04

很有用的知识

作者: chenzhen2016 时间: 2023-7-6 16:36

在使用高效液相色谱（HPLC）技术时，以下是一些注意事项：

样品准备：样品应该准备得足够纯净，并且适当稀释或浓缩，以确保在色谱柱上的分离效果良好。样品溶剂的选择也需要考虑到与流动相的相容性。

色谱柱选择：选择适合分析目标的色谱柱，包括柱材质、柱尺寸、填充剂类型和粒径等。根据分析需求，选择反相、离子交换、凝胶过滤等不同类型的柱。

流动相准备：合理选择和配置流动相，包括溶剂的纯度、酸碱度、缓冲剂浓度等。确保流动相的质量和配比准确，避免对柱和仪器产生不良影响。

流速和压力控制：在操作中，要注意控制流速和压力，确保在柱内获得良好的分离效果。过高的流速和压力可能导致柱损坏或失去分离能力。

温度控制：某些分析需要在特定的温度下进行，因此需要注意恒温器的设置和控制。适当的温度控制可以提高分离效果和峰形。

校准和标定：在开始实验之前，对HPLC仪器进行校准和标定，以确保准确的峰识别和定量分析结果。

峰识别和峰形分析：仔细观察峰的形状和峰的位置，进行准确的峰识别，并进行峰形分析以评估分离质量和纯度。

定期维护：定期对HPLC仪器进行维护和保养，包括清洗和更换柱、检查流路和连接部件等，以确保仪器的正常运行和分离结果的稳定性。

安全操作：遵循实验室安全规范，注意有关化学品的处理和废弃物的处置。注意使用手套、护目镜等个人防护装备。

记录和分析数据：仔细记录实验参数、结果和条件，以便后续数据分析和结果的验证。

以上是HPLC使用中的一些注意事项，但具体操作应根据仪器和分析要求来确定，并遵循相关的操作手册和实验室规章。此外，在使用HPLC之前，最好接受相关培训并获得经验丰富的人员的指导和支持。

作者: 早睡早睡进行时 时间: 2023-9-20 10:30

谢谢！收获很大！

作者: 早睡早睡进行时 时间: 2023-9-20 10:31 标题: 5

谢谢！收获很大！

作者: 早睡早睡进行时 时间: 2023-9-20 10:32 标题: 23

谢谢！收获很大

作者: 早睡早睡进行时 时间: 2023-9-20 10:40 标题: 4

谢谢！收获很大

作者: Tetrahedron_90 时间: 2023-10-7 09:19 标题: 回复 #1 maicaixiaogu 的帖子

学习一下，正好最近正在用。

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