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标题: 【讨论帖】western 内参选择 [打印本页]

作者: quiqui008 时间: 2013-4-20 16:14 标题: 【讨论帖】western 内参选择

在western blot 实验中，内参的使用是个很重要的部分，
看到很多站友对内参的选择经常有些疑问，鉴于此，希望能在一个帖子里面综合所有相关问题，展开讨论，共同学习。

我先提几个，抛砖引玉，希望大家继续。
1。为什么一定需要内参？内参的重要性。
2。常用的几种内参。
3。不同的情况如何选择不同的内参。
4。。。。。

作者: ukonptp 时间: 2013-4-20 16:14 标题: 回复 #1 quiqui008 的帖子

支持一下！
1：用内参照是为了评价你的各个上样孔内蛋白的总量是否基本一致，通常使用一些看家蛋白，比如β-actin、GAPDH等等。这些蛋白在所有细胞中的表达量基本一致，所以用他们来作为你加样量的对照。这样western结果中你的目的蛋白经过处理后发生变化，而内参的条带基本均匀一致。这样才有说服力，表明的确是处理因素造成目的蛋白的变化而不是加样误差或是人为造成目的条带浓度的变化。严格意义上说，内参事必须做的。
2：常用的内参有：b-actin，GAPDH，近2-3 年，更详细的研究发现，β-Tubulin (球管蛋白)，被广泛应用于Western Blotting，β－Tubolin分子量为55KD左右。
3：一般我们选择内参与要检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上。因此你要知道你检测的蛋白的分子量来选择合适的内参！
个人一些见解，供参考！

作者: quiqui008 时间: 2013-4-20 16:15

内参的重要性，必要性：

要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是Western Blot。
因为Western Blot操作相对简单方便，既可以定性分析表达产物，同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。虽然，顺利的时候Western Blot做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦――做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……毕竟，作为一种有活性的生物大分子，抗体和抗原的反应毕竟不象1+1那么明确，而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物，确实是有一定的不确定性的。所以，严谨的Western Blot实验设计中要求有良好的参照体系，对实验结果分析是非常有用。特别是当实验出现问题时，借助参照体系很容易就可以查出问题所在，而不必抓耳挠腮怨天尤人。良好的参照体系通常包括分子量Marker（用来确定蛋白条带对应的分子量大小），空白载体对照（如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照），已知量标准产物的正对照；另外还有内参。可是由于经费限制或者偷懒的原因，国内的不少人做Western Blot往往省略参照，导致结果出现问题时无法分析结果――即便有结果也可能影响结果的分析。

内参是最容易被忽略的一项。我们知道，要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础。特别表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析。所以你需要内参。

内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在Western Blotting 实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。
在国外发表的文章中，Western Blotting 实验结果须进行内参校正已成为一种惯例。但是，国内仍有不少科研人员在Western Blotting实验中忽略了内参的使用，将蛋白浓度测定作为规范需相互比较的各种样品间上样量等同的唯一方法。
然而各种蛋白质浓度定量方法，都存在局限性，不能完全准确的确定各种样品的准确蛋白浓度。如UV法直接定量，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质，相对于比色法来说，操作简单，但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰；且敏感度低，要求蛋白的浓度较高。比色法测定蛋白浓度一般有BCA，Bradford，Lowry 等几种方法。BCA法与Lowry法都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。Bradford 法敏感度最高，且与一系列干扰Lowry，BCA 反应的还原剂（如DTT，巯基乙醇）相容。但是对于去污剂依然是敏感的，其最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。另外，蛋白质定量以后进行电泳时需要等量上样，此步骤也存在操作误差。在Western blotting实验时使用内参，即可简便地对定量和上样步骤产生的误差进行校正。

在Western Blotting中使用内参其实就是在WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。

作者: wood533 时间: 2013-4-20 16:21

我想问一下,内参和目的蛋白相差15kD能不能将膜上他门的位置(用预染)分别剪下来,孵育啊?还是必须得跑两张膜一个内参一个目的蛋白啊?洗膜的时候可以放在一起洗么?如果他们是同源的二抗可以放在一起孵育么?

作者: yueban-1147 时间: 2013-4-20 16:21

回答楼上的问题：完全可以剪开分别加一抗孵育，我就是这么做的；洗膜时最好分开洗涤，放在一起的话两张膜可能重叠在一起，影响洗膜效果；如果不剪膜，你两个一抗来源相同而且特异性很好（单抗）的话，可以一起孵育，不过应该注意可能存在的交叉反应，你可以尝试一下看看结果再定。

作者: dream2013 时间: 2013-4-20 16:21

本人是新手，问一个很汗的问题，原核表达也需要做内参么？做内参的蛋白在哪里找？
不甚感激

作者: avi317 时间: 2013-4-20 16:22

在Western Blotting实验过程中使用内参的方法有：
一、超级简便的标记内参使用法：只要在二抗孵育时加入HRP标记内参抗体，按照正常操作即可。
二、普通内参：当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时，可以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测。然后使用Strip缓冲液洗掉膜上的抗体，重新进行内参蛋白的抗体温育、显色检测。
三、当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下，可以在转膜后预染，根据蛋白质Marker的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分，使内参蛋白与目的蛋白分开。然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行温育，二抗温育以及显色。

常用的蛋白质内参有GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。我们实验室使用最多的是***工程有限公司与国外实验室合作开发的GAPDH，100μl一支，浓度为100μg/100μl，价格为988元人民币。虽然公司网上称稀释比达1：10000以上，至少可做100次Western mini-blots，但我们一般按照1：5000～6000稀释，不过效果确实非常好，荧光条带非常亮，而且抗体使用3～4次也没太大改变。
我们也使用过博奥森的beta-actin，200ul 480元，稀释比1：200～500。因为稀释比不高，所以价格并不便宜。更可气的是，我PC 12细胞居然有两条条带，小鼠也是两条。

作者: 菠萝喵 时间: 2013-4-20 16:22

我也同意剪开,但是别忘记一个问题.
你要确保你剪开的部位没有蛋白

作者: 菠萝喵 时间: 2013-4-20 16:23

kang chen的HRP－标记内参很好

不需要剪膜更为直观，有说服力

作者: 969 时间: 2013-4-20 16:23

各位高手,我做的是狗的GLUT-4蛋白,很多论文都没用内参,我问了中衫,说没的狗的内参,急死我了,请高手提示在那里能找到?

作者: zranqi_1 时间: 2013-4-20 16:24

我做了半年的western,就我对内参的理解如下
1.所选内参有一下:GAPDH,beta-actin,beta-tubulin等是一些细胞的基本结构蛋白或是管家蛋白,细胞表达稳定,且表达水平高,在同一种类的细胞上表达基本一致.
2.做内参可以:一,检验你的整套western装置是否正常run effectively.包括你的配液,你的胶以及电泳和转移,一抗的效价以及显色等.二检测你的样品蛋白含量是否相等.
3.选择内参要根据你的目的蛋白的性质即你的目的蛋白是胞内还是核内,你蛋白的分子量是大是小,当然还有价钱以及你的目的.
4.一般内参是比较容易作出来的,同时它也是帮助你摸索条件的,你把其做漂亮,你后面就很顺利了,只是转移的条件有点变化.其余照样或根据说明书操作.

作者: mamamiya 时间: 2013-4-20 16:24

我想请问一下如果内参和目的蛋白的差距很大，比如我的目的蛋白是一百多ＫＤ，可是常用的内参都是３０～５０ＫＤ，是不是一定要分块胶来跑呢？

作者: wsll 时间: 2013-4-20 16:24

那么，我想请教一下用过β-actin做内参的朋友，有没有遇到过β-actin抗体检测不到小鼠心肌和肌肉组织β-actin的情况？当然前提是：1，我的确提取到了心肌和肌肉组织的总蛋白，且检测到了我的目的条带。2，用此抗体可以检测到其他组织中β-actin条带。
也发现，在碧云天网站上，曾提及“本抗体不能用于成年动物心肌或骨骼肌的免疫染色”。cuturl('http://www.beyotime.com/aa128.htm') 具体什么原因造成这种情况，我也不想太麻烦去搜了，还请知道的战友指教。同时也算是给朋友们提个醒吧。

另，我曾用GAPDH抗体死活也检测不到小鼠肺组织的条带，由于这个做的时间比较早了，不知道是抗体原因还是我WB的原因还是其他原因，不得而知。仅供朋友们一个参考吧。

作者: tuuu2 时间: 2013-4-20 16:25

有个弱弱的问题想请教一下：β－actin与α－tubulin的主要区别是什么，在肌组织与上皮组织间表达是否相同？

作者: hold住 时间: 2013-4-20 16:25

请教一个问题:目的蛋白的一抗和内参的一抗能同时混合孵育PVDF膜吗?两个二抗是否也可以呢?如果可以,需要注意什么问题?谢谢!

作者: quiqui008 时间: 2013-4-20 16:25

QUOTE:

原帖由 hold住 于 2013-4-20 16:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请教一个问题:目的蛋白的一抗和内参的一抗能同时混合孵育PVDF膜吗?两个二抗是否也可以呢?如果可以,需要注意什么问题?谢谢!

会担心有影响。
保险一点，还是分别孵育。
你的目的蛋白和内参分子量相差多少呢，如果相差比较大，你可以把2者剪开，分别孵育一抗。
如果分子量太相近了，还是先孵育目的蛋白一抗，重新封闭，再孵育内参一抗。

作者: quiqui008 时间: 2013-4-20 16:26

GAPDH： glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogease （甘油醛-3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的一种关键酶。
因为GAPDH 作为管家基因在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的。在实验中，可能存在总蛋白浓度测定不准确；或者蛋白质样品在电泳前上样时产生的样品间的操作误差；这些误差需要通过测定每个样品中实际转到膜上的GAPDH的含量来进行校正，所以一般的western实验都需要进行内参设置。具体校正的方法就是将每个样品测得的目的蛋白含量与本样品的GAPDH含量相除，得到每个样品目的蛋白的相对含量。然后才进行样品与样品之间的比较。

作者: quiqui008 时间: 2013-4-20 16:27

GAPDH检测。Western Blotting(检测条带大约在36kDa，稀释比例达10，000倍)、ELISA、亲和纯化、免疫荧光及免疫组化。

图片附件: 10595159.gif (2013-4-20 16:27, 7.27 KB) / 该附件被下载次数 11
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15776

作者: quiqui008 时间: 2013-4-20 16:28

图示:抗GAPDH单抗（Cat＃KC-5G4）检测心脏组织匀浆中的GAPDH水平。A-G分别表示不同实验来源的心脏组织匀浆。抗GAPDH单抗稀释比例为1：10，000，HRP羊抗鼠二抗（Cat＃KC-MM-1302）稀释比例为1：1000。采用SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Kit试剂盒及X胶片曝光显影。

作者: fei1226com 时间: 2013-4-20 16:28

请教一个问题:目的蛋白的一抗和内参的一抗能同时混合孵育PVDF膜吗?两个二抗是否也可以呢?如果可以,需要注意什么问题?谢谢!

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也是新手，不过个人为只要目的蛋白和内参的分子量差距足够大当ECL显色时两条带就不会相互干扰，可以同时孵育，一抗二抗均可同时孵育。因为我们用的都是特异性抗体，混合孵育从技术上是没问题的。也有很多人在这样做，也有很好的结果。
从经济的角度考虑，剪膜、分开孵育，一抗4度过夜，这样一抗可以重复利用有时可重复2-3个月。

作者: guagua 时间: 2013-4-20 16:29

我也是买的博奥森的内参，总是有两条带，怎么也去不掉，当时那个博奥森的跟我说他们的这个内参很好的，打电话去问他们公司，也没有答复的，真是可气！

作者: ritou1985 时间: 2013-4-20 16:30

那么，我想请教一下用过β-actin做内参的朋友，有没有遇到过β-actin抗体检测不到小鼠心肌和肌肉组织β-actin的情况？当然前提是：1，我的确提取到了心肌和肌肉组织的总蛋白，且检测到了我的目的条带。2，用此抗体可以检测到其他组织中β-actin条带。
也发现，在碧云天网站上，曾提及“本抗体不能用于成年动物心肌或骨骼肌的免疫染色”。cuturl('http://www.beyotime.com/aa128.htm') 具体什么原因造成这种情况，我也不想太麻烦去搜了，还请知道的战友指教。同时也算是给朋友们提个醒吧。

另，我曾用GAPDH抗体死活也检测不到小鼠肺组织的条带，由于这个做的时间比较早了，不知道是抗体原因还是我WB的原因还是其他原因，不得而知。仅供朋友们一个参考吧。
我觉得：1 抗原表位有线性（氨基酸序列的不同）和构象型（空间结构的不同）两种，如果你的抗体识别的是构象型的表位，你做western时蛋白要变性，其构想结构破坏，导致抗体抗原不能识别结合，因而也会做不出结果；如果是线性表位则天然的和蛋白变性后这种表位都存在，抗体抗原可以继续结合。你要查询有关资料，排除一下是否是此原因所致。

作者: guagua 时间: 2013-4-20 16:31

我觉得：抗原表位有线性（氨基酸序列的不同）和构象型（空间结构的不同）两种，如果你的抗体识别的是构象型的表位，你做western时蛋白要变性，其构想结构破坏，导致抗体抗原不能识别结合，因而也会做不出结果；如果是线性表位则天然的和蛋白变性后这种表位都存在，抗体抗原可以继续结合。你要查询有关资料，排除一下是否是此原因所致。

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谢谢楼上指教。您说的很对，单克隆抗体的确可能存在这样的问题，但可能还不是主要原因。

查了一下actin（肌动蛋白）：“脊椎动物肌动蛋白分为α、β和γ三种类型，α型分布于心肌和横纹肌细胞中，α及γ型分布于平滑肌细胞中，β及γ型分布于非肌细胞中。”－－－－－－cuturl('http://baike.baidu.com/view/32327.htm')

β-actin抗体检测不到心肌和骨骼肌的条带，大概是这个原因吧。

作者: guagua 时间: 2013-4-20 16:32

查了一下actin（肌动蛋白）：“脊椎动物肌动蛋白分为α、β和γ三种类型，α型分布于心肌和横纹肌细胞中，α及γ型分布于平滑肌细胞中，β及γ型分布于非肌细胞中。”－－－－－－cuturl('http://baike.baidu.com/view/32327.htm')
β-actin抗体检测不到心肌和骨骼肌的条带，大概是这个原因吧。

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不同异构体表达对蛋白的检测是有很大的影响的
所以买抗体前要好好熟悉自己的目的蛋白。
很多抗体杂不出条带其实未必是抗体质量的问题。

就比如我上次买了个抗体，说明书上写着检测的smooth muscle isoform的，因为我的细胞激活后具备的就是平滑肌表型，所以就买了。
买来后一直不出条带，我纳闷了，于是提取大鼠主动脉组织作为对照，也不出条带。火了，就用了另外个细胞株做对照，条带就出来了，而且很亮，压片时能见到荧光，但是我的细胞和大鼠主动脉组织就是没有条带。
后来又做了几次，大鼠主动脉组织也出过两次条带，但是非常细非常淡，若有若无那种，提高上样量也是这样，以致于根本不能扫描，
此公司做抗体是用的是一段合成肽，我比较了两种异构体，只有6，7个AA的差异，
我自己的解释是，这个抗体应该针对的是非平滑肌isoform，但非常小的程度上也能检测到smooth muscle isoform。
目前正在与此公司交涉。

作者: ritou1985 时间: 2013-4-20 16:32

查了一下actin（肌动蛋白）：“脊椎动物肌动蛋白分为α、β和γ三种类型，α型分布于心肌和横纹肌细胞中，α及γ型分布于平滑肌细胞中，β及γ型分布于非肌细胞中。”－－－－－－cuturl('http://baike.baidu.com/view/32327.htm')
β-actin抗体检测不到心肌和骨骼肌的条带，大概是这个原因吧。
不知道你前边有做过免疫组化没有，做免疫组化，其抗体识别的是未变性的抗原表位，如果能做出结果的话也能说名一定的问题把

作者: guagua 时间: 2013-4-20 16:33

不同异构体表达对蛋白的检测是有很大的影响的
所以买抗体前要好好熟悉自己的目的蛋白。
很多抗体杂不出条带其实未必是抗体质量的问题。

就比如我上次买了个抗体，说明书上写着检测的smooth muscle isoform的，因为我的细胞激活后具备的就是平滑肌表型，所以就买了。
买来后一直不出条带，我纳闷了，于是提取大鼠主动脉组织作为对照，也不出条带。火了，就用了另外个细胞株做对照，条带就出来了，而且很亮，压片时能见到荧光，但是我的细胞和大鼠主动脉组织就是没有条带。
后来又做了几次，大鼠主动脉组织也出过两次条带，但是非常细非常淡，若有若无那种，提高上样量也是这样，以致于根本不能扫描，
此公司做抗体是用的是一段合成肽，我比较了两种异构体，只有6，7个AA的差异，
我自己的解释是，这个抗体应该针对的是非平滑肌isoform，但非常小的程度上也能检测到smooth muscle isoform。
目前正在与此公司交涉。

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是得好好跟公司说道说道了。

我也在怀疑是公司选用了不合适的抗原片段来制备β-actin抗体（或者，我选用了不合适的抗体），以至于检测产生组织特异性。因为，1，actin几种异构体的确存在组织分布特异性，β-actin分布于非肌细胞中作为骨架蛋白；2，actin几种异构体的氨基酸序列具有较高的相似性（>90%）；3，β-actin要作为内参，得首先保证是组织广泛表达的（尤其是做蛋白的组织表达谱时）。那么制备β-actin抗体的抗原应该是选用与actin其它异构体一致的氨基酸序列。

问题是我的抗体太久了，查不到是哪个公司的了。这两天有些忙，凑空我再查查公司β-actin抗体的相关信息吧。

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补充β-actin抗体的一些信息：
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肌动蛋白（actin）是一种重要的骨架蛋白，目前在动物细胞中发现至少有6种亚型存在：“Nonmuscle beta- and gamma-actin, also known as cytoplasmic actin, are predominantly expressed in nonmuscle cells, controling cell structure and motility. alpha-cardiac and alpha-skeletal actin are expressed in striated cardiac and skeletal muscles, respectively; two smooth muscle actins, alpha- and gamma-actin, are found primarily in vascular smooth muscle and enteric smooth muscle, respectively. ”
因此,理论上,特异性针对beta-actin的抗体必然在心肌和横纹肌中检测不到条带.但实际上,因为存在如下问题:
1,不同型actin之间具有较高的序列相似性(>90%).
2,公司制备抗体是选用beta-actin的某一段小短肽作为免疫原.
因此,可能会因为选取的短肽在不同型actin之间保守与否,而导致所制备抗体具有一定的组织特异性.如,选取的短肽仅在beta型存在,所得抗体就仅能检测Nonmuscle 细胞中的actin,而选取的短肽在六型中均存在,则此抗体除Nonmuscle细胞外,还可以检测cardiac,skeletal,smooth muscle细胞的actin.

实际上,公司所制备的beta-actin抗体确实存在上述情况.
1, 选用N-端Ac-Asp-Asp-Asp-Ile-Ala-Ala-Leu-Val-Ile-Asp-Asn-Gly-Ser-Gly-Lys 16aa作为抗原制备抗体(单抗和多抗).这类的抗体占大多数,主要有santa cruz(sc-69879),sigma(A1978等),ProSci(Catalog No.: 3779),Cell Signaling(#4967)，Axxora PLATFORM(BET-A300)等。这类抗体均不能检测心肌和横纹肌中的actin条带。
相关网址如下：
cuturl('http://www.cellsignal.com/products/4967.html')
cuturl('http://www.scbt.com/datasheet-69879-beta-actin-ac-15-antibody.html')
cuturl('https://www.sigmaaldrich.com/catalog/search/ProductDetail/SIGMA/A1978')
cuturl('http://www.prosci-inc.com/Antibody-TDS/3779%20B-actin.html')
cuturl('http://www.axxora.com/actin-related_products-BET-A300-491/opfa.1.1.BET-A300-491.1916.4.1.html')

2, 选用C-端16aa短肽作为抗原制备抗体。主要有Axxora PLATFORM(PSC-3777),EPITOMICS(1784-1,1854-1等).
相关网址如下:
cuturl('http://www.axxora.com/actin-related_products-PSC-3777/opfa.1.1.PSC-3777.1301.4.1.html')
cuturl('http://www.epitomics.com/products/1784-1.php')
cuturl('http://www.epitomics.com/products/1854-1.php')
这类抗体便可以在肌肉细胞中检测到actin阳性信号.

最为明显的区分可以见Cell Signaling公司和EPITOMICS公司免疫组化的结果(顺请wxq2005fw指教):
cuturl('http://www.cellsignal.com/products/4967.html')
cuturl('http://www.epitomics.com/products/1854-1.php')

作者: guagua 时间: 2013-4-20 16:34

也发现，在碧云天网站上，曾提及“本抗体不能用于成年动物心肌或骨骼肌的免疫染色”。cuturl('http://www.beyotime.com/aa128.htm') 具体什么原因造成这种情况，我也不想太麻烦去搜了，还请知道的战友指教。同时也算是给朋友们提个醒吧。

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这句话非常值得商榷。

你的这个问题还是很好解决的，
做个对照，
用平滑肌组织，骨骼肌组织，心肌组织，肝组织或其他的在同一张膜上杂一次。
看看条带出的情况如何。

作者: wood533 时间: 2013-4-20 16:36

我有个弱弱问题请教一下：分泌性的蛋白（浓缩培养基中的蛋白做WB）如何选择内参？

作者: 101010 时间: 2013-4-20 16:37

请教，原核生物的内参怎么选择啊？一片茫然感觉有点

作者: nn255 时间: 2013-4-20 16:37

用心肌组织匀浆作western blotting,
B-actin作为内参的确做不出来。
请教
那用GAPDH就一定做得出来内参了吗？

作者: kuohao17 时间: 2013-4-20 16:37

可能啊，不同的目的蛋白应该根据分子量选择内参

作者: qiangren789 时间: 2013-4-20 16:38

各位高手,我做的是狗的GLUT-4蛋白,很多论文都没用内参,我问了中衫,说没的狗的内参,急死我了,请高手提示在那里能找到?

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我也帮你搜索了一下，确实没有看到有抗狗的GLUT-4的抗体，也没有看到与狗有交叉反应的抗体，sorry。但是仍然有如下的几个方法可以试试：
1. 搜索文献，看看有没有类似的引用，这个你手里的文献可能比较多一些；
2. 抗体搜索，找到几乎所有公司的关于GLUT-4的抗体，再分析这些抗体的表位
cuturl('http://www.biocompare.com/matrix.asp?catid=3194&scid=2&s=Glut4&type=6'),69120
在NCBI上比对狗的GLUT-4的氨基酸序列与人类的差异（或者说同源性），然后看抗体针对的表位是否保守，如果这段序列正好一样或者保守，那么再没有其他选择的情况下，可以试试这些抗体的。祝好运！

作者: #甜# 时间: 2013-4-20 16:39

参与一下
个人觉得,
1.内参最好还是在目的蛋白膜上染
因为,测目的蛋白需要一个标准,那么蛋白测定是第一步,在我们电泳,上样的时候,又是关键的一步,总会有一些技术原因,你上的样量可能会不一致,所以,就需要对这张膜,选择一个标准,我觉得简单的方法就是在同一张膜上既染目的蛋白,又染内参蛋白.如果,两种蛋白分子量相差很大,可以剪开来,单独染抗体;如果相反,则可以先染目的蛋白,然后重新洗膜,封闭,染内参蛋白.
2.关于把两种二抗不同的蛋白同时加一抗,我没有试过,因为担心抗体质量问题,再加上公司不同,抗体之间会有影响,但的确有人这样做,我觉得理论上可能会有犹豫,但实践中是可行的方法.

作者: ROSE李 时间: 2013-4-20 16:39

想问下高手们：
用的抗GAPDH单抗是哪个公司的呢？
要做大鼠心肌，查了只有博奥森公司（北京）有
电话咨询了下，说他们家的GAPDH单抗主要适用于人
还劝我再用他们家的B-actin做下
现在着急得很呢
请高手指点
不胜感激！

作者: yychen 时间: 2013-4-20 16:40

一般植物蛋白做Western用什么内参好呢？因为我看到一般的内参只标明应用于动物。

作者: quiqui008 时间: 2013-4-20 16:40

你的问题我也同样遇到了，我做的是组织，提取的心肌组织的蛋白做的WB，现在发现正常大鼠的心肌组织beta-actin的条带非常浅，而病变模型的beta-actin条带很明显，开始觉得可能是自己蛋白测定或稀释的时候有问题（虽然自己觉得这种可能性很小），但是还是跑了此普通的蛋白电泳来验证自己的上样量，在普通蛋白电泳图上显示我的蛋白上样量是一致的。那现在说明beta-actin确实在病变的组织中表达量发生变化了，既然这样为什么beta-actin还能作为一个看家基因呢？是不是用GAPDH会好些？如果beta-actin、GAPDH、tublin在某种病变的组织中均发生较大改变了（这种情况有可能，虽然几率很小），那该如何选择内参呢？请教各位在行的朋友，谢谢

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这是我做的一张小鼠组织的bata-actin Western图，除心肌和骨骼肌外，在其他组织中均能检测到目的条带，平滑肌没有做。这表明我的抗体本身没有问题。

作者: quiqui008 时间: 2013-4-20 16:41

另外，我用的是santa-cruz的beta-actin

作者: cj_mondy 时间: 2013-4-20 16:41

如果我提的是细胞核内的蛋白，也可以用内参吗？有那些可以用啊？

作者: okhaha 时间: 2013-4-20 16:42

你的问题我也同样遇到了，我做的是组织，提取的心肌组织的蛋白做的WB，现在发现正常大鼠的心肌组织beta-actin的条带非常浅，而病变模型的beta-actin条带很明显，开始觉得可能是自己蛋白测定或稀释的时候有问题（虽然自己觉得这种可能性很小），但是还是跑了此普通的蛋白电泳来验证自己的上样量，在普通蛋白电泳图上显示我的蛋白上样量是一致的。那现在说明beta-actin确实在病变的组织中表达量发生变化了，既然这样为什么beta-actin还能作为一个看家基因呢？是不是用GAPDH会好些？如果beta-actin、GAPDH、tublin在某种病变的组织中均发生较大改变了（这种情况有可能，虽然几率很小），那该如何选择内参呢？请教各位在行的朋友，谢谢

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actin即肌动蛋白，是细胞的一种重要骨架蛋白。actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，包括alpha-skeletal muscle actin，alpha-cardiac muscle actin，alpha-smooth muscle actin，和gamma-smooth muscle actin；其余两种广泛分布于各种组织中，包括beta-actin(β-non-muscle)和gamma-non-muscle actin。这些不同的亚型组织分布是不一样的，在肌肉组织中的beta-actin分布就很少，心肌主要是alpha-cardiac muscle actin。因此不同的组织本来就应该选择不同的内参，不能一概而论的。你所谓的病变可能与心肌的重构有关，肌肉中的肌动蛋白很可能就发生了明显的变化。beta-actin作为内参是得到了公认的，这是针对大多数组织和细胞来说的，它广泛分布于细胞浆内，表达量非常丰富。尽管最近有一些文章已经开始质疑beta-actin作为内参的有效性（好像是对于上样量>20ug的蛋白区分能力下降，记不清楚了）但是发文章应该还是没有问题的。至于其他的内参也是可以考虑用的，GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的一种关键酶，而tubulin和actin类似是细胞骨架的组成部分，但是不是肌肉的主要成分，应该是一个代替品。三种同时发生变化的情况太少了，如果遇到的时候再具体分析，这个不好说，我认为如果是总蛋白的话可以用胞核的内参如PCNA，TATA-box bingding protein（TBP）甚至线粒体的内参来代替，当然我认为这种可能性出现的几率比我买彩票中大奖差不多。今晚回答这个问题对于我来说也是一个考验，很多基础知识都是通过网络和拚命的回忆来的，也算是对于actin这个内参的一个全面了解了，希望有所帮助。

作者: mickeylin 时间: 2013-4-20 16:42

我也想求教一个问题，有谁做β－actin内参显出92KD左右的条带吗？我用的是单抗，目的蛋白为caspase3，35KD，应该不会有这个条带。这个会是哪里出了问题，该如何解决？

作者: mickeylin 时间: 2013-4-20 16:43

好贴啊！！！感谢大家指点。
我还有个问题，我看大家说的用β－actin等内参都是用于动物组织。那么做毕赤酵母western时用什么内参比较好啊？？我查了好长时间都没有查出来。

作者: 33号 时间: 2013-4-20 16:43

补充一点选内参的原则：所选的内参与目的基因之间不能有调节关系，否则内参就不客观了，如：你是做与糖代谢相关的基因就不能选GAPDH，与细胞骨架相关的就不能选β-actin。

作者: cj_mondy 时间: 2013-4-20 16:43

我是做大鼠心肌细胞线粒体和胞浆内的蛋白,目的蛋白已经作出来了
内参作了B-actin,没有作出条带,怀疑是心肌细胞本来就没有B-actin,
后换GAPDH,结果还是没有条带.
GAPDH是用的北京博奥森公司的小鼠单抗
真的是郁闷了
据网上同志们作的实验,DAPDH在心肌细胞里是有表达的
现在的问题是
1分别提取线粒体和胞浆蛋白后,是不是就剔除了GAPDH,所以没有表达?
2 北京博奥森公司的GAPDH小鼠单抗是不是真的不行?

作者: kewanqi2011 时间: 2013-4-20 16:44

水稻根一般选的内参是什么啊
还没做过
谢谢

作者: 33号 时间: 2013-4-20 16:44

做毕赤酵母western时用什么内参比较好啊？？我查了好长时间都没有查出来。

还请大家指点！！！谢谢！！！

作者: 天蝎座 时间: 2013-4-20 16:45

线粒体蛋白一般用什么内参？

作者: 脱水萝卜 时间: 2013-4-23 15:10

我用的内参是GAPDH

作者: zhenxin 时间: 2013-4-23 15:13

我也准备做western blot，我的测试蛋白大概在40kd，选GADPH还是beta-actin作内参好点呢？最好是内参和一抗分开孵育吧？

作者: 987789 时间: 2013-4-23 15:13

做毕赤酵母western时用什么内参比较好啊？？我查了好长时间都没有查出来。

还请大家指点！！！谢谢！！！

作者: 987789 时间: 2013-4-23 15:14

请问提取的酵母总蛋白怎样保存比较好？？！！！急！！！

作者: lxh031 时间: 2013-4-23 15:14

非常好的讨论，我是新手问一个一直都没有解决的问题请问：
膜蛋白有什么内参？
急求解决！

作者: quiqui008 时间: 2013-4-23 15:15

要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是Western Blot。因为Western Blot操作相对简单方便，既可以定性分析表达产物，同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。虽然，顺利的时候Western Blot做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦――做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……毕竟，作为一种有活性的生物大分子，抗体和抗原的反应毕竟不象1+1那么明确，而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物，确实是有一定的不确定性的。所以，严谨的Western Blot实验设计中要求有良好的参照体系，对实验结果分析是非常有用。特别是当实验出现问题时，借助参照体系很容易就可以查出问题所在，而不必抓耳挠腮怨天尤人。良好的参照体系通常包括分子量Marker（用来确定蛋白条带对应的分子量大小），空白载体对照（如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照），已知量标准产物的正对照；另外还有内参。可是由于经费限制或者偷懒的原因，国内的不少人做Western Blot往往省略参照，导致结果出现问题时无法分析结果――即便有结果也可能影响结果的分析。

内参是最容易被忽略的一项。我们知道，要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础。特别表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析。所以你需要内参。

内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在Western Blotting 实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。

在国外发表的文章中，Western Blotting 实验结果须进行内参校正已成为一种惯例。但是，国内仍有不少科研人员在Western Blotting实验中忽略了内参的使用，将蛋白浓度测定作为规范需相互比较的各种样品间上样量等同的唯一方法。然而各种蛋白质浓度定量方法，都存在局限性，不能完全准确的确定各种样品的准确蛋白浓度。如UV法直接定量，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质，相对于比色法来说，操作简单，但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰；且敏感度低，要求蛋白的浓度较高。比色法测定蛋白浓度一般有BCA，Bradford，Lowry 等几种方法。BCA法与Lowry法都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。Bradford 法敏感度最高，且与一系列干扰Lowry，BCA 反应的还原剂（如DTT，巯基乙醇）相容。但是对于去污剂依然是敏感的，其最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。另外，蛋白质定量以后进行电泳时需要等量上样，此步骤也存在操作误差。在Western blotting实验时使用内参，即可简便地对定量和上样步骤产生的误差进行校正。

在Western Blotting中使用内参其实就是在WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。

实验结果分析其实很简单：如果样品蛋白量有限，只够进行一次电泳转膜实验时，分别检测样品的内参量和目的蛋白量。将各样品目的蛋白量分别除以其内参含量，得到的数值即为内参校正后的各样品中目的蛋白相对含量，再用此数值进行样品间的比较和分析，得到目的蛋白含量在不同样品间的实际变化结果。如果样品量充分，可以先检测内参，观测样品间内参显色条带是否一致，根据差异大小调整各样品的上样量重新进行Western Blotting实验，至内参量一致为止；若内参一致，即可进行不同样品间目的蛋白表达变化分析。这样虽然麻烦一点，但是可以保证结果更有说服力，更可信。毕竟我们的实验是一种严谨的工作。

作者: quiqui008 时间: 2013-4-23 15:15

在Western Blotting实验过程中使用内参的方法有：

一、超级简便的标记内参使用法：只要在二抗孵育时加入HRP标记内参抗体，按照正常操作即可。

二、普通内参：当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时，可以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测。然后使用Strip缓冲液洗掉膜上的抗体，重新进行内参蛋白的抗体温育、显色检测。

三、当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下，可以在转膜后预染，根据蛋白质Marker的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分，使内参蛋白与目的蛋白分开。然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行温育，二抗温育以及显色。

作者: quiqui008 时间: 2013-4-23 15:19

一点小资料,对刚开始做WESTERN的新手可能有用

作者: wood533 时间: 2013-4-23 15:19

内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在Western Blotting 实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。

实际上内参是最容易被忽略的一项。我们知道，要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础，特别表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析，所以需要内参。在国外发表的文章中，Western Blotting 实验结果须进行内参校正已成为一种惯例。但是，国内仍有不少科研人员在Western Blotting实验中忽略了内参的使用，将蛋白浓度测定作为规范需相互比较的各种样品间上样量等同的唯一方法。
然而各种蛋白质浓度定量方法，都存在局限性，不能完全准确的确定各种样品的蛋白浓度。如UV法直接定量，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质，相对于比色法来说，操作简单，但是容易受到平行物质如DNA的干扰，且敏感度低，要求蛋白的浓度较高。比色法测定蛋白浓度一般有BCA、Bradford、Lowry 等几种方法。BCA法与Lowry法都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。Bradford法敏感度最高，且与一系列干扰Lowry、BCA 反应的还原剂（如DTT，巯基乙醇）相容，但是对去污剂依然是敏感的，其最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。另外，蛋白质定量以后进行电泳时需要等量上样，此步骤也存在操作误差。在Western blotting实验时使用内参，即可简便地对定量和上样步骤产生的误差进行校正。

作者: wood533 时间: 2013-4-23 15:20

不同异构体表达对蛋白的检测是有很大的影响，买抗体前要好好熟悉自己的目的蛋白，很多抗体杂不出条带其实未必是抗体质量的问题。很多公司的内参抗体是用抗原片段制备的，不同的公司选择的片段不一样。以最常用的beta-actin为例，有的公司选择N-端，有的选择C－端。选用N-端Ac-Asp-Asp-Asp-Ile-Ala-Ala-Leu-Val-Ile-Asp-Asn-Gly-Ser-Gly-Lys 16aa作为抗原制备抗体(单抗和多抗)的占大多数，主要有santa cruz(Cat# sc-69879),sigma(Cat# A1978等)，ProSci(Cat# 3779),Cell Signaling(Cat#4967)，Axxora PLATFORM(BET-A300)等，这类抗体均不能检测心肌和横纹肌中的actin条带。选用C-端16aa短肽作为抗原制备抗体的主要有Axxora PLATFORM(PSC-3777)，EPITOMICS(1784-1,1854-1等)，这类抗体可以在肌肉细胞中检测到actin阳性信号。有时候在实验中检测内参时产生“组织特异性”，就是由于抗体选择不对造成的。

作者: tie8 时间: 2013-4-23 15:20

不同异构体表达对蛋白的检测是有很大的影响，买抗体前要好好熟悉自己的目的蛋白，很多抗体杂不出条带其实未必是抗体质量的问题。很多公司的内参抗体是用抗原片段制备的，不同的公司选择的片段不一样。以最常用的beta-actin为例，有的公司选择N-端，有的选择C－端。选用N-端Ac-Asp-Asp-Asp-Ile-Ala-Ala-Leu-Val-Ile-Asp-Asn-Gly-Ser-Gly-Lys 16aa作为抗原制备抗体(单抗和多抗)的占大多数，主要有santa cruz(Cat# sc-69879),sigma(Cat# A1978等)，ProSci(Cat# 3779),Cell Signaling(Cat#4967)，Axxora PLATFORM(BET-A300)等，这类抗体均不能检测心肌和横纹肌中的actin条带。选用C-端16aa短肽作为抗原制备抗体的主要有Axxora PLATFORM(PSC-3777)，EPITOMICS(1784-1,1854-1等)，这类抗体可以在肌肉细胞中检测到actin阳性信号。有时候在实验中检测内参时产生“组织特异性”，就是由于抗体选择不对造成的。

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这段东西你哪贴来得?
这不就是我和xray兄的原话么?!
你翻第一页看看

作者: tie8 时间: 2013-4-23 15:21

这段东西你哪贴来得?
这不就是我和xray兄的原话么?!
你翻第一页看看

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呵呵，是有人对咱们的讨论做了总结，发在了自己的BLOG上，感觉总结得还不错，可以看看。
cuturl('http://blog.bioon.cn/user3/23049/archives/2007/137682.shtml')

作者: baidukk 时间: 2013-4-23 15:21

我来说点不同看法
内参是western中重要的一步,但是是不是每次都要做,答案显然是否定的.只有在需要得到可发表的结果的情况下,才有必要做一个漂亮的内参.

1: western本身就是一个很粗略的定量方法,严格的说,根本不具有定量的能力,所有从werster里出来的表达量的区别(明显的“有”“没有”的区别属于定性），都是不精确的，苛刻点说，压根就是不可采信的。所以内参只是一个为了结果完整性而出现的东西，平时做western如果次次做内参，完全没有必要，也没什么太大帮助

2: 那么如何控制上样量，有很多办法，可以通过SDS-PAGE粗略判定，这个方法一点不比用内参差，那些abundant protein在胶上完全可以通过肉眼辨别条带的深浅，反倒是用western判断很困难，在western结果出来都是很黑的条带，不一定在胶上看起来就一样. 而最直接的办法是在准备sample的时候就下好功夫，取多少个细胞，最终溶解在多少sample buffer里面，是可以控制出load的时候每条lane大概有多少细胞的.

内参，尤其是werstern的内参，绝大多数情况是作为“漂亮的马后炮”出现的,当你前期控制完之后，再放上一个内参告诉别人“看，的确如我所料”.

werstern次次做内参,完全没有必要

作者: 紫烟 时间: 2013-4-23 15:22

要发文章还是要用内参更有说服力，前面的同志们在讨论的时候主要针对的是动物体系，不知生物公司的内参一抗对植物材料WB是否通用？我想请教一下；做水稻受病原菌处理后线粒体的蛋白的变化，采用什么内参比较好？一般病原菌处理植物后发生的PCD会不会影响action的表达差异性？选择GAPDH可以吗？希望针对植物蛋白和动物蛋白在WB过程中选择内参需要注意的事项进行交流讨论！

作者: Ao7 时间: 2013-4-23 15:22

可供选择的内参除了前面说过的actin和tubulin，还有Ubquitin，elgf等。但是，最重要的是一定要确定试验的处理因素不会对选择的内参蛋白表达产生影响，比如常用的tubulin，可能就不太适合用来定量有丝分裂相期的蛋白表达情况。因此，如果有条件，最好在预实验中平衡比较一下多种内参再选择最优。当然，对于我们大多数人来说，只要回顾一下本研究领域的权威参考文献，大概就可以确定哪种内参在这种实验中已经得到公认了！

作者: ritou1985 时间: 2013-4-23 15:23

请问细胞外基质蛋白(把细胞EDTA移除后剩下的部分）用什么做内参呀？

作者: DNA 时间: 2013-4-23 15:23

关于内参的应用问题，国内一直还没有形成应用的习惯，可能是有研究水平的原因，也有可能是内参的抗体大部分是国外产的，超级贵！前段时间为了一篇文章，用的内参外国人老不相信，老板一狠心买了两只chemicon内参，50ug包装，每支3000多！不过好在我们有自己做的一支很好用的内参单抗，平常的实验可以保证敞开用，国内其他大部分实验室可能就没这么好的运气了！但是老板经过此事也下决心要把这个抗体完整详细的鉴定出来，然后推出去让大家都来用提高它的可信度。目前，鉴定的工作已经差不多完成了，剩下的就是申请专利，不管最后是怎么卖出去，国产的东西应该会大大便宜于国外的，这对大家来说可能也算一个好消息吧

作者: 911 时间: 2013-4-23 15:31

最近做western blot，样品：1：鼠的肝脏组织；2－4是人的脑肿瘤细胞。但是样品1的beta-actin 总是比其他的样品表达低。请问做鼠的肝脏组织WB，是不是不能用beta-actin 做内参啊？那应该用什么呢？GAPDH可以吗？看一篇文章用的是GRB2。多谢！

作者: 911 时间: 2013-4-23 15:32

附图一张。

图片附件: 35275680.jpg (2013-4-23 15:32, 3 KB) / 该附件被下载次数 14
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15800

作者: windy+++ 时间: 2013-4-23 15:32

上面说的都是细胞的总蛋白。如果是核抽提物该用什么做内参呢？好像有用组蛋白的，不是太清楚

作者: quiqui008 时间: 2013-4-23 15:38

最近做western blot，样品：1：鼠的肝脏组织；2－4是人的脑肿瘤细胞。但是样品1的beta-actin 总是比其他的样品表达低。请问做鼠的肝脏组织WB，是不是不能用beta-actin 做内参啊？那应该用什么呢？GAPDH可以吗？看一篇文章用的是GRB2。多谢！

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你好,小鼠肝脏组织的beta-actin我做过的,完全没问题的.你的肝脏条带比较淡,可能是你提取的蛋白浓度较低或上样量较低造成,组织总蛋白的提取相对比细胞稍微困难些,你再试试其它的蛋白提取方式或裂解液?
祝好运!

作者: quiqui008 时间: 2013-4-23 15:39

核抽提物可以选用一些核内相对稳定表达的蛋白作为内参,如组蛋白,PCNA,lamin蛋白等.核内蛋白内参的选择同样要遵循细胞总蛋白内参的选择原则,即对样品的处理方式不会影响到内参的变化.比如,若检测DNA损伤因素对蛋白的影响,PCNA最好是不要用的.

作者: quiqui008 时间: 2013-4-23 15:40

我来说点不同看法
内参是western中重要的一步,但是是不是每次都要做,答案显然是否定的.只有在需要得到可发表的结果的情况下,才有必要做一个漂亮的内参.

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这么肯定的将内参的作用局限在“需要得到可发表的结果的情况下”的狭小范围内，似乎有些不妥。科研过程中，有谁能未卜先知到实验结果？没有内参的作用，我们如何得知得到的结果就是“可发表的结果”？

1: western本身就是一个很粗略的定量方法,严格的说,根本不具有定量的能力,所有从werster里出来的表达量的区别(明显的“有”“没有”的区别属于定性），都是不精确的，苛刻点说，压根就是不可采信的。所以内参只是一个为了结果完整性而出现的东西，平时做western如果次次做内参，完全没有必要，也没什么太大帮助

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western的确是一种半定量的方式，不是很精确，但这决不是因噎废食甚至是“破罐子破摔”的理由。内参的出现，就是为了在一定程度上弥补WB的不足而必须的一种实验设计，只有这样我们才有可能对每次的WB结果进行分析。请注意，内参不是完整性结果的“果”或“附属品”，而是“因”或“前提”，颠倒了两者的关系，可不是一种科学严谨的实验态度哦。
当然，如果是同一批样品，在保证上样体积一致的情况下，是可以不必次次做内参的。

作者: quiqui008 时间: 2013-4-23 15:40

2: 那么如何控制上样量，有很多办法，可以通过SDS-PAGE粗略判定，这个方法一点不比用内参差，那些abundant protein在胶上完全可以通过肉眼辨别条带的深浅，反倒是用western判断很困难，在western结果出来都是很黑的条带，不一定在胶上看起来就一样. 而最直接的办法是在准备sample的时候就下好功夫，取多少个细胞，最终溶解在多少sample buffer里面，是可以控制出load的时候每条lane大概有多少细胞的.

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WB结果出来很深的条带，那是因为曝光时间太长的缘故，可以适当减少曝光时间或通过其它有效方法来降低条带的亮度，这样之后还是能够很容易在胶片上判别的。条带的亮度与上样量并不是一直都是线形关系的，不仅WB如此，考马斯亮蓝染色也是如此。SDS-PAGE上的丰度蛋白本身就具有很多不确定性，比起已知的内参，利用其作为判定标准更在无形中增加了判断误差的风险。
比较认同您关于“准备样品时下好功夫”的观点，不仅仅是可以尽量保证总蛋白量的一致，更重要的是良好的蛋白样品会有好的电泳行为，直接影响到WB条带的质量。即便如此，每次准备样品后，内参还是要有的。

作者: quiqui008 时间: 2013-4-23 15:41

内参，尤其是werstern的内参，绝大多数情况是作为“漂亮的马后炮”出现的,当你前期控制完之后，再放上一个内参告诉别人“看，的确如我所料”.

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“漂亮的马后炮”，我们的确也常在茶余饭后这样调侃内参的作用。但在实验中，它的确是我们评价实验结果的“基石”，只有这样，我们才能理直气壮的指着内参告诉别人，“看，的确如我所料”。

作者: vvmmoy 时间: 2013-4-23 15:41

我做的是大鼠肺组织,提取的是总蛋白,转胶100V,两个小时,用B-tubilin抗体,两个公司的均未出结果,昨天换了B-actin,也没有出结果.目的条带出过,请教一下大家.

作者: 蒲公英 时间: 2013-4-23 15:41

做内参的目的是为了保证蛋白上样量相近/相等..
仔细想一下到底有多少实验需要相对精确的上样量就知道了,其实并没有太多.
1: 如果你是为了做kinetic assey之类的,那么蛋白量是需要相当的精确,靠WB的内参显然是远远不够的

2: 如果是为了detect到不同sample蛋白量的区分,那是需要并且如果想发表,结果中是必定要有内参的.但是,依然有精确度的问题. 倘若变化范围很小,光靠内参有说服力么?还是要回到更精确的蛋白定量上去;而倘若范围变化很大,例如RNAi之类的,又需要用到内参这样相对"精确"的方法么? SDSPAGE甚至sample制备的时候做的一些控制已经绰绰有余了.

3: 还有一个是顺序问题,请问有哪个人在做RNAi screening之类实验的时候,每个sample做内参的?都是挑好clone了之后想做个发表结果的图的时候才放上内参的吧.否则先不谈浪费antibody的问题,光是花掉的时间和获得的效果,有性价比么?很多人做fusion protein detection的时候甚至连SDS-PAGE都省了,直接上DOT BLOT(一般买的tag antibody质量都很好). 内参用在一些"关键性"的情况下才有意义.并且这个范围还很狭小,既不能太小(内参不够精确),也不能太大(SDSPAGE可以做到同样效果).

4: 至于LS某人提到的习惯问题,我只想说..国外好象也没听过WB次次用内参的,这个和科研水平高低毫无关系,因地制宜吧,不用这么死板.

作者: 987789 时间: 2013-4-23 15:42

嗯,受教了.在大量筛选的情况下,要求都加上内参,的确近乎苛刻.(只是不知道,不加内参的筛选,意义何在.保留意见吧,或许是我太苛刻了?呵呵)
感谢楼主的指教!

作者: yes4 时间: 2013-4-23 15:44

上面说的都是细胞的总蛋白。如果是核抽提物该用什么做内参呢？好像有用组蛋白的，不是太清楚

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我们做的是核蛋白抽提中的蛋白，用的GAPDH做内参，因为我们的目的条带与beta－actin比较接近，所以没用bata-actin，选了GAPDH，实事证明GAPDH可以用，而且好用。bata-actin因为没有自己试过，所以不敢随便说，但是决定应该是可以的。另外建议内参最好选用有标记的内参，如辣过氧根标记的GAPDH这样做起来比较方便。

作者: kulee 时间: 2013-4-23 15:46

WB常用内参及其技术参数

内参名称分子量大小适用范围
beta-actin 43kDa 胞浆和全细胞
GAPDH 30-40kDa 胞浆和全细胞
Tubulin 55kDa 胞浆和全细胞
VCDA1/Porin 31kDa 线粒体
COXIV 16kDa 线粒体
TBP 38kDa 细胞核

作者: 49888 时间: 2013-4-23 15:46

我做心肌细胞，内参可以选择B-actin吗

作者: seven7 时间: 2013-4-23 15:47

我想请教下，在线粒体中做出了ＧＡＰＤＨ，是否属于异常呢，能否作为线粒体的内参?

请高手指点，非常感谢！

作者: yysr238 时间: 2013-4-23 15:49

内参的抗体与二抗的种属重要吗?例如内参的抗体是鼠抗兔的,二抗是不是要是抗鼠的?
本人的一抗是兔抗人的,内参的抗体是鼠抗兔的,二抗是羊抗兔的,内参怎么都做不出来,但使用羊抗鼠的二抗做内参很明显,郁闷中

作者: 98776langtao 时间: 2013-4-23 15:51

相关疾病：
癫痫
我作2-D电泳筛出来的蛋白里面，actin和GAPDH都有差异表达，请问这种情况下，还能选择这两个蛋白做内参吗？（我是做的癫痫脑组织的蛋白质组学）

作者: 987789 时间: 2013-4-23 15:51

内参这种东西应该多备几种，actin，tubulin应该都要留一些。同一个比如actin最好也备用两家公司的或者找一个应用物种范围最广的。我做线虫，用sigma的beta actin抗体就啥也抗不到，结果用santacruz抗超浓一坨带。

作者: xingyi08 时间: 2013-4-23 15:53

请问，做心肌细胞膜蛋白western blotting,应该选择什么蛋白做内参？

作者: dog002 时间: 2013-4-23 15:53

那么，我想请教一下用过β-actin做内参的朋友，有没有遇到过β-actin抗体检测不到小鼠心肌和肌肉组织β-actin的情况？当然前提是：1，我的确提取到了心肌和肌肉组织的总蛋白，且检测到了我的目的条带。2，用此抗体可以检测到其他组织中β-actin条带。
也发现，在碧云天网站上，曾提及“本抗体不能用于成年动物心肌或骨骼肌的免疫染色”。cuturl('http://www.beyotime.com/aa128.htm') 具体什么原因造成这种情况，我也不想太麻烦去搜了，还请知道的战友指教。同时也算是给朋友们提个醒吧。

另，我曾用GAPDH抗体死活也检测不到小鼠肺组织的条带，由于这个做的时间比较早了，不知道是抗体原因还是我WB的原因还是其他原因，不得而知。仅供朋友们一个参考吧。

wb做了很久，也遇到了上述问题，β-actin（鼠单抗和兔多抗的）在肺组织均可检测到，而在心肌一直做不出来，在心肌目的蛋白是检测到，看到各位上面的讨论，受益匪浅，想请问一下，各位做心肌组织时选用内参相对较好的是哪一种？其是什么公司的产品编码？望请告知

作者: ukonptp 时间: 2013-4-23 15:54

目的蛋白约为100Kd,为细胞内信号蛋白,那内参选用"GAPDH"好还是"β-actin"好呢?
然后目的蛋白一抗为兔源的,内参一抗为鼠源的,这样做得到的结果对发文章有影响吗?一抗同一来源的结果更有说服力吗?除了要多买个IgG,不同的一抗来源还会有什么其他影响吗?

作者: ffaa 时间: 2013-4-23 15:55

正好要做大鼠心肌组织的WB，正巧要买内参β-actin，差点就买了 CELL SIGNALING的4967，好险！
看了xray19 大神的帖子后，决定还是好好去研究一下买哪家公司的产品了。
或许GAPDH也可以考虑一下。

作者: 冰儿0109 时间: 2013-4-23 15:55

我做心肌，提胞核内的蛋白，目的蛋白分子量57KD，有用组蛋白做内参的吗？

作者: 冰儿0109 时间: 2013-4-23 15:56

做核蛋白的有用GAPDH做内参的吗？

作者: zzzz 时间: 2013-4-23 15:56

各位高手请教一下，我做的是心，肝，脾，肺，肾，脑等组织，其目的蛋白是18KD，应选用哪种内参合适？

作者: kswl870 时间: 2013-4-23 15:57

还是用GAPDH吧，beta-catine 影响因素挺多的，虽是组成性表达，但提取组织蛋白时用的裂解液不同，破碎的时间不同等都可能会影响beta-catine提取出来的量

作者: hustwb 时间: 2013-4-23 16:00

最近做的β-actin抗体不好，想重新买个内参，用β-actin或GAPDH均可以，有什么公司的性价比高些，值得推荐的吗？谢谢啊

作者: greenbee 时间: 2013-4-23 16:00

请问高手，膜蛋白用什么内参呢？

作者: plaa 时间: 2013-4-23 16:02

那位仁兄豪姐知道 GATA-4蛋白的分子量？？？谢谢帮助

作者: kuohao17 时间: 2013-4-23 16:04

关于内参的应用问题，国内一直还没有形成应用的习惯，可能是有研究水平的原因，也有可能是内参的抗体大部分是国外产的，超级贵！前段时间为了一篇文章，用的内参外国人老不相信，老板一狠心买了两只chemicon内参，50ug包装，每支3000多！不过好在我们有自己做的一支很好用的内参单抗，平常的实验可以保证敞开用，国内其他大部分实验室可能就没这么好的运气了！但是老板经过此事也下决心要把这个抗体完整详细的鉴定出来，然后推出去让大家都来用提高它的可信度。目前，鉴定的工作已经差不多完成了，剩下的就是申请专利，不管最后是怎么卖出去，国产的东西应该会大大便宜于国外的，这对大家来说可能也算一个好消息吧

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内参单抗还可以申请专利？？

作者: 66+77 时间: 2013-4-23 16:07

请问高手，膜蛋白用什么内参呢？

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试试脂筏蛋白flotillin

作者: yes4 时间: 2013-4-23 16:08

我用的内参是GAPDH，

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你好，请问你的GAPDH一抗和二抗的浓度为多少？我一直没做出来这个

作者: wood533 时间: 2013-4-23 16:12

请问各位高手，我的一抗是160KD的，选用β-actin可以么?

作者: okhaha 时间: 2013-4-23 16:13

各位大侠：我做大鼠肝脏pxr（50-52kDr）的westren，actin做内参，加目标蛋白一抗二抗没有加内参一抗二抗去曝光显影的话，目标蛋白条带可以出来，加了actin一抗二抗去曝光，一样的时间，就只有内参的条带，没有目标条带，延长曝光显影时间，还是只有actin条带，很神奇啊。是不是actin一抗二抗影响目标蛋白的发光显影啊。
各位做过的有没有见过这种现象啊，到底会是什么原因呢？麻烦各位给分析一下。

作者: owanaka 时间: 2013-4-23 16:14

提取细胞subfraction的蛋白，有胞浆蛋白，核内可溶蛋白，染色质结合蛋白，胞膜蛋白，细胞骨架蛋白，分别应选用什么做内参？谢谢

作者: qumm1985 时间: 2013-4-23 16:15

请问各位高手我做小鼠海马组织的突触囊泡素蛋白用什么内参比较好啊
我用了TUBULIN 在上样量一定的情况下为什么内参出来的条带有深有浅，差别还有点大呢？是提蛋白的原因吗？请高手指教，谢谢啦

作者: duoduo 时间: 2013-4-23 16:16

我之前做的是大鼠的左心室组织，内参用的是abcam 的beta-actin，一直都觉得没有问题。现在做小鼠，换了cellsignalling 的，好像问题出来了。

作者: abc816 时间: 2013-4-23 16:16

如果要做blotting的蛋白是膜蛋白，所提取的蛋白样品也是膜蛋白，那么应该选择什么作为内参呢？

作者: 911 时间: 2013-4-23 16:17

我做人大肠的一抗14.4kd。用北京博奥森的β-actin内参，出现两条带，请各位帮忙分析一下，谢谢

作者: bamboo16 时间: 2013-4-23 16:17

近日，用血清样品做westernblot，内参选用的是GAPDH，做了两次，内参条带均未出现，不知为何？是不是GAPDH不会进入血清中？请有经验者指教，谢谢！

作者: mysmdbl 时间: 2013-4-23 16:18

我想在细胞培养上清液中作wb。请问用什么做内参？

作者: junhun 时间: 2013-4-23 16:19

大家好，我也是做培养液上清中蛋白的wb,请问用什么做内参啊，非常急，谢谢大家，帮帮忙

作者: viviwang1987 时间: 2013-4-23 16:20

请问各位大神，我做的是牛奶中的乳铁蛋白请问做wb的时候用什么做内参？新手求教~

作者: tuomu45 时间: 2013-4-23 16:21

大家好，看到楼楼们的讨论，颇有感触，我用b-actin先后做大鼠的脑组织，肝、胃均出带，做空肠、回肠、胰腺时条带缺失，部分出，部分不出，做骨骼肌几乎不显，查阅说明书，才知心肌、骨骼肌是不能用b-actin做内参的，空肠因我是每组5个样本，其中前三个都出，后俩不显，查阅园子里的帖子，其中有位告知说空肠是平滑肌，b-actin不显，看了此专题讨论贴，顶一下，学习中。。弱弱的还想问下，若是做骨骼肌的，应该选取什么为内参合适，另外，骨骼肌蛋白的提取方法有过来人知道否？谢谢指导！

作者: hold住 时间: 2013-4-23 16:21

各位大侠，严格意义上讲，每次western-blot都应该有内参，不然怎么能保证上样量相同。没有标准，没有参考谈何高低？本来就是半定量，再失去参考，误差就太大了。我现在国外johns hopkins hospital,每次做都加内参，的确发现几次上样误差很大。

作者: nn255 时间: 2013-4-23 16:23

这个标记一个，看看，我想选择哪种内参是否可以看看与自己要做的组织或细胞已发表的文献来作为依据之一。

作者: gogo 时间: 2013-4-23 16:24

各位好，我是新手，正准备做western，不过测的是人血浆中的某种蛋白，分子量30KD左右，看过一些文章，但提到的标本都是组织或细胞，没有涉及血浆的，不知道要选什么内参合适，请教各位了，急需，谢谢!

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