分析测试百科

标题: 【讨论帖】蛋白芯片技术答疑帖 [打印本页]

作者: dragonkilly 时间: 2013-4-24 16:38 标题: 【讨论帖】蛋白芯片技术答疑帖

蛋白质芯片技术是继基因芯片技术后发展起来的生物检测技术,是蛋白质组学研究中除了酵母双杂交、双向电泳技术、质谱技术等之外的一种重要的工具。蛋白质芯片技术具有平行、快速、自动化的优点，并且检测到的平行数据误差更小,更准确,这对于高通量的研究具有非常重要的意义。它的出现对于生物学、临床检验医学、遗传学、肿瘤学等多学科的进步具有极大的推动作用。蛋白质芯片技术根据芯片上固定的物质不同又分为抗体芯片与蛋白芯片。

近几年来，随着抗体技术的发展，抗体库的建设速度越来越快，生产了大量优质的抗体，从而推动了抗体芯片技术的发展与应用，像Full Moon、RayBiotech等公司都推出了各有特色的抗体芯片。抗体芯片技术在生物医学领域也得到了较多的应用，可用于检测生理或病理过程相关蛋白的表达丰度、筛选疾病标志物、探索药物作用机制、检测信号通路中成员的激活状态。抗体芯片的这些应用也带动了相关科技论文的发表，数量与质量均呈上升趋势。

作者: lixi559 时间: 2013-4-24 16:38

LZ：怎么保证蛋白芯片的均一性呢？点的大小？等等。谢谢扫盲

作者: dragonkilly 时间: 2013-4-24 16:40

QUOTE:

原帖由 lixi559 于 2013-4-24 16:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

LZ：怎么保证蛋白芯片的均一性呢？点的大小？等等。谢谢扫盲

蛋白芯片的均一性以及点的大小是由蛋白芯片的片基、抗体质量以及点样技术等综合决定的，好的芯片片基往往经过修饰，含有较多的官能团，对抗体的吸附能力强；抗体的质量则是指抗体具有好的特异性、亲和力；点样技术则包括常见的针点、喷点等技术以及液相蛋白芯片中的包被技术等；一款好的蛋白芯片往往是在这些方面进行不断的优化最终成型的。

同时，蛋白芯片制备质量的高低也保证了芯片杂交后片内、片间数据的重复性。

作者: orangecake 时间: 2013-4-24 16:40

按我的理解，蛋白芯片是不是更适合用于筛选啊？起原理是不是其实就是一种抗原抗体反应？

作者: dragonkilly 时间: 2013-4-24 16:41

相关疾病：
肿瘤

您的理解非常正确，现在的蛋白芯片基本上都是基于抗体抗原反应的，最常见的种类有抗体芯片（芯片上固定的是抗体，用于检测蛋白）、抗原芯片（芯片上固定的是天然蛋白、重组蛋白、多肽、细胞裂解液、组织裂解液等，用于检测抗体）。

蛋白芯片的应用根据芯片类型不同，可以用于筛选疾病标志物，肿瘤发生发展机制研究，药物作用靶点研究，蛋白新功能研究，信号通路筛选等等方面，以下提供几篇文献供有兴趣的老师同学参考。

Bernier M, Paul RK, et al.: Negative Regulation of STAT3-mediated Cellular Respiration by SirT1, Journal of Biological Chemistry 2011, JBC Papers in Press. Published on April 5, 2011 as Manuscript M110.200311.
Wang H, Brown J, et al.: Convergence of the Mammalian Target of Rapamycin Complex 1- and Glycogen Synthase Kinase 3-b–Signaling Pathways Regulates the Innate Inflammatory Response, Journal of Immunology 2011, 186:5217-5226
Kang S, Elf S, et al.: p90 Ribosomal S6 Kinase 2 Promotes Invasion and Metastasis of Human Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Cells, Journal of Clinical Investigation 2010, 120(4):1165-1177
Raharijaona M, Le Pennec S, et al.: PGC-1-Related Coactivator Modulates Mitochondrial-Nuclear Crosstalk through Endogenous Nitric Oxide in a Cellular Model of Oncocytic Thyroid Tumours. PLoS ONE 2009, 4(11):e7964
He H, Zong Y, et al.: Sensing the Insulin Signaling Pathway with an Antibody Array, Proteomics Clinical Applications 2009, 3:1440–1450
Yalcin A, Clem B, et al.: Nuclear Targeting of 6-Phosphofructo-2-Kinase (PFKFB3) Increases Proliferation via Cyclin-dependent Kinases, Journal of Biological Chemistry 2009, 284:24223-24232
Zhong D, Liu X, et al. LKB1 Is Necessary for Akt-Mediated Phosphorylation of Proapoptotic Proteins, Cancer Research 2008, 68:7270-7277
Zhong D, Li X, et al. The Glycolytic Inhibitor 2-Deoxyglucose Activates Multiple Prosurvival Pathway Through IGF1R, Journal of Biological Chemistry 2009, 284:23225-23233
SandipRay, et al. Classification and prediction of clinical Alzheimer’s diagnosis based on plasma signaling proteins Nature Medicine 2007,13, 1359

作者: qianqin1977 时间: 2013-4-24 16:41

蛋白芯片的基板最好是什么材料的？需要做哪些修饰？

作者: dragonkilly 时间: 2013-4-24 16:42

QUOTE:

原帖由 qianqin1977 于 2013-4-24 16:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

蛋白芯片的基板最好是什么材料的？需要做哪些修饰？

蛋白芯片的基板可以是玻片、NC膜、PVDF膜等等。

基板为玻片的，可以进行氨基、醛基修饰；可以在玻片上包被琼脂糖薄膜；可以在玻片上固定NC膜的；也有公司专门开发了多聚膜，这种多聚膜可以更加牢固的结合抗体或者蛋白，提高芯片信号，降低背景。

作者: moonlight45 时间: 2013-4-24 16:42

请问蛋白芯片如何实现将玻片上固定NC膜，装置如何实现？硝酸纤维素膜会不会发生渗漏？请高人指点。

作者: moonlight45 时间: 2013-4-24 16:49

国家批准上市的蛋白芯片有一种是基于NC膜的（肿瘤标志物的检测），而且使用化学发光的方法。请问NC膜在使用时需要注意些什么？膜的孔径有要求吗？（0.45、0.22）这种蛋白芯片的点样是用点样针好还是用喷膜针好？请高人指点。

作者: nut6694 时间: 2013-4-24 17:00

咨询用蛋白芯片去筛选的话，对于动植物可以做吗？有相关案例文献吗？

作者: dragonkilly 时间: 2013-4-24 17:02

我们现在常用的是抗体芯片，识别的蛋白基本上都是模式动物的，例如人、大鼠、小鼠，植物的基本没有。

而对于模式动物，在筛选蛋白质表达水平实验时，芯片一定要使用针对该物种的芯片；在检测蛋白质修饰状态，例如磷酸化水平的时候，芯片的兼容性则比较好，因为这些修饰位点往往比较保守，我们用检测蛋白磷酸化水平的芯片检测过人、大鼠、小鼠、猪、狗、猴、蛔虫等样本，结果都很不错。

作者: dragonkilly 时间: 2013-4-24 17:03

国家批准上市的蛋白芯片有一种是基于NC膜的（肿瘤标志物的检测），而且使用化学发光的方法。请问NC膜在使用时需要注意些什么？膜的孔径有要求吗？（0.45、0.22）这种蛋白芯片的点样是用点样针好还是用喷膜针好？请高人指点。

=============================================================================================================

玻片上固定NC膜，我只是使用过商业化的芯片，没有自己制备过。

我使用过0.22um的PVDF膜进行过类似实验，是使用喷点的方法，效果很不错。当然要想做好，不是仅仅喷上这么简单，要对实验条件不断的摸索优化。

作者: kuaizige 时间: 2013-4-24 17:03

1.基因芯片和蛋白质芯片的区别和联系

2.如何在检测领域推广蛋白质芯片？

作者: dragonkilly 时间: 2013-4-24 17:04

相关疾病：
循环系统疾病

=================================

1.基因芯片和蛋白质芯片的区别和联系

2.如何在检测领域推广蛋白质芯片？

==============================================================================================================

1.基因芯片上固定的是核酸探针，蛋白质芯片上固定的是抗体、抗原，这两种芯片上包含的物质是不同的；

2.这个问题我不是很明白，现有的蛋白质芯片有应用于科研领域的，例如疾病标志物筛选、肿瘤发病机制研究、药物作用机制研究等；也有应用于临床检测的，例如肿瘤标志物检测芯片、心血管疾病相关因子检测芯片等等。

作者: ero11 时间: 2013-4-24 17:05

1.基因芯片和蛋白质芯片是否可以检测同一个目标样品，其结果差异多大

2.扫描结果的设备可否通用

作者: dragonkilly 时间: 2013-4-24 17:06

1.基因芯片和蛋白质芯片是否可以检测同一个目标样品，其结果差异多大

2.扫描结果的设备可否通用

==============================================================================================================

1.基因芯片和蛋白芯片是可以检测同一样品的，区别在于检测的是该样品的核酸水平或者是蛋白质表达、修饰水平，由于是在不同的水平上进行检测的，所以结果总会有差异的，具体差异多少无法判断；

2.若是通用型的玻片芯片，都可以使用普通的芯片扫描仪进行扫描，特殊规格则要求配套仪器。

作者: dragonkilly 时间: 2013-4-24 17:06

相关疾病：
鳞状细胞癌肿瘤转移
与大家分享一篇抗体芯片的应用

抗体芯片技术应用于肿瘤侵袭机制研究（Kang S, Elf S, et al.: p90 Ribosomal S6 Kinase 2 Promotes Invasion and Metastasis of Human Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Cells, Journal of Clinical Investigation 2010, 120(4):1165-1177 ）

Emory大学的研究者通过前期实验筛选到RSK2蛋白，认为RSK2与头颈部鳞状细胞癌转移相关。研究者首先使用头颈部鳞状细胞癌细胞系、临床标本进行了RSK2表达水平的检测，继而进行了RSK2活性抑制实验，RNAi实验，以及stable knock down实验证明了RSK2与肿瘤细胞的转移相关，在此基础上，研究者将RSK2 knock out的头颈部鳞状细胞癌细胞系接种到裸鼠体内，观察到敲除后的细胞系不影响肿瘤形成，但是影响了肿瘤的转移。
那么RSK2影响肿瘤转移的机制是什么呢？Western Blot检测发现与转移相关的Erk、Akt、Stat3都没有变化，那么其他激酶呢？
研究者选择了MAPK pathway的磷酸化水平检测芯片（包括约90个磷酸化位点），发现RSK2敲除前后，取cut off为磷酸化水平下调15％，筛选到信号通路中的多个成员，大多数和细胞的侵袭、转移相关，其中包括研究较清楚的CREB，以及一种RSK2的新的底物Hsp27，并揭示了其与肿瘤转移相关的机制。

图片附件: 80918223.jpg (2013-4-24 17:06, 52.96 KB) / 该附件被下载次数 14
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15824

图片附件: 45201854.jpg (2013-4-24 17:07, 36.7 KB) / 该附件被下载次数 20
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15825

图片附件: 81024153.jpg (2013-4-24 17:07, 43.2 KB) / 该附件被下载次数 18
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15826

作者: 阿k 时间: 2013-4-24 17:07

目前接触式针点点样仪是否已经很难超越压电式喷点点样仪了呢？

另外如果在酶标板条上做芯片一般要对基质做何种处理？

谢谢

作者: dragonkilly 时间: 2013-4-24 17:08

目前接触式针点点样仪是否已经很难超越压电式喷点点样仪了呢？

另外如果在酶标板条上做芯片一般要对基质做何种处理？

谢谢

=============================================================================================================

究竟是接触式针点点样仪还是压电式喷点点样仪，哪种更优越并没有具体的定论。按照经验，还是要根据片基、样品类型、芯片阵列等因素综合考虑。没有最好的，只有最适合的：）

普通的酶标板条我没有用过，我用过底部为PVDF膜的96孔板制备蛋白芯片，效果很不错，甲醇处理后，PBS润湿即可。

作者: applebook=213 时间: 2013-4-24 17:09

我们最近购买过R&D公司的一款蛋白芯片，检测血浆中一些指标。但是结果很不理想。完全按照说明书操作，可是在对照组和样本组中并没有明显差别。其中部分指标是已经大样本临床检测过的（多数是ELISA试剂盒检测的），证实会有差异的。

打电话咨询了该公司上海总技术部，也没给回复。询问是不是敏感性比较低，所以很多指标用ELISA试剂盒能检测到的，蛋白芯片检测不到。回复是：不存在敏感性问题，但是敏感性不会比western差。

作者: dragonkilly 时间: 2013-4-24 17:10

我们最近购买过R&D公司的一款蛋白芯片，检测血浆中一些指标。但是结果很不理想。完全按照说明书操作，可是在对照组和样本组中并没有明显差别。其中部分指标是已经大样本临床检测过的（多数是ELISA试剂盒检测的），证实会有差异的。

打电话咨询了该公司上海总技术部，也没给回复。询问是不是敏感性比较低，所以很多指标用ELISA试剂盒能检测到的，蛋白芯片检测不到。回复是：不存在敏感性问题，但是敏感性不会比western差。

==============================================================================================================

R&D公司的芯片，我没有实际使用过，关于质量无法评论。

其实您遇到的问题有几个方面需要考虑：

1.关于芯片，不知道R&D的芯片的Protocol上是否有相关灵敏度的描述？检测的下限如何？

2.关于样品，样品数量有多少，与您前期ELISA方法检测的样品有重叠吗？在进行芯片检测的时候，稀释度是否合适？以前发现的差异，是如何统计的，这种统计方法是否可用于芯片产生的数据？

作者: yychen 时间: 2013-4-24 17:10

非常感兴趣有没有可能，蛋白芯片在microRNA靶基因高通量筛选中发挥作用，比如在microRNA过表达前后，检测体系中蛋白变化情况，从而发现新的具有靶向作用机制或靶向作用蛋白，从而使microRNA的研究更加快速、准确···

蛋白芯片的价钱是不是都非常贵啊，所以制约了其在其他领域的作用

作者: dragonkilly 时间: 2013-4-24 17:14

非常感兴趣有没有可能，蛋白芯片在microRNA靶基因高通量筛选中发挥作用，比如在microRNA过表达前后，检测体系中蛋白变化情况，从而发现新的具有靶向作用机制或靶向作用蛋白，从而使microRNA的研究更加快速、准确···

蛋白芯片的价钱是不是都非常贵啊，所以制约了其在其他领域的作用

==============================================================================================================

您的理解是很正确的，蛋白芯片或者说抗体芯片是可以起到您说的筛选作用的。例如，现在已有很多信号通路的抗体芯片，以信号通路为研究重点，将一条信号通路上下游的蛋白的抗体集中到一张芯片上，用于检测干预（microRNA、drug、RNAi........）前后信号通路的变化情况，从而确定效应机制。

也有将多个信号通路集成在一张芯片上的抗体芯片，用以初筛确定作用通路与位点的。

蛋白芯片从总价上看是要贵一些的，抗体的获得相对与核酸探针的合成是要复杂很多的。但是从性价比上看，比买多个抗体分别进行Western Blot实验要划算很多。

作者: bring 时间: 2013-4-24 17:15

玻片上固定NC膜，我只是使用过商业化的芯片，没有自己制备过。

我使用过0.22um的PVDF膜进行过类似实验，是使用喷点的方法，效果很不错。当然要想做好，不是仅仅喷上这么简单，要对实验条件不断的摸索优化。

=============================================================================================================

PVDF膜是疏水的呀，而抗体是溶解在水溶液中的，直接喷上能行吗？要优化什么条件啊？比如点样缓冲液什么的，要加进一些什么成分啊？

作者: cocacola 时间: 2013-4-24 17:15

初入蛋白门槛
有问题想咨询一下
我的实验目前可以拿到A+X蛋白复合体，其中X蛋白为未知蛋白，我想有什么办法可以鉴定出X蛋白，以及X蛋白的成分呢？蛋白芯片可以么？

作者: 911 时间: 2013-4-24 17:16

初入蛋白门槛
有问题想咨询一下
我的实验目前可以拿到A+X蛋白复合体，其中X蛋白为未知蛋白，我想有什么办法可以鉴定出X蛋白，以及X蛋白的成分呢？蛋白芯片可以么？

===============================================================================================================

蛋白芯片是没法鉴定未知成分的，应用质谱技术就可以，我们这对于做蛋白复合体有一套很好的技术平台，我们已经鉴定出三十多个蛋白复合体，并有很多复合体信息。

作者: dragonkilly 时间: 2013-4-24 17:16

PVDF膜是疏水的呀，而抗体是溶解在水溶液中的，直接喷上能行吗？要优化什么条件啊？比如点样缓冲液什么的，要加进一些什么成分啊？

=======================================================================

通常PVDF膜甲醇处理一下，然后使用PBS润湿就可以了，湿润状态下喷上是没有问题的。

点样缓冲液可以使用含甘油的磷酸盐缓冲液。

作者: dragonkilly 时间: 2013-4-24 17:17

初入蛋白门槛
有问题想咨询一下
我的实验目前可以拿到A+X蛋白复合体，其中X蛋白为未知蛋白，我想有什么办法可以鉴定出X蛋白，以及X蛋白的成分呢？蛋白芯片可以么？

==============================================================================================================

蛋白芯片不是很适合您的研究。您现在已经很清楚A+X了，还是IP把X拉下来，然后质谱鉴定吧。

如果要研究A有哪些相互作用蛋白，可以尝试蛋白质芯片（芯片上固定的为重组表达蛋白），通过加入A孵育，看一下究竟哪个蛋白会相互结合。

作者: yes4 时间: 2013-4-24 17:17

请问蛋白芯片如何实现将玻片上固定NC膜，装置如何实现？硝酸纤维素膜会不会发生渗漏？请高人指点。

==========================================================================================================

NC膜会渗漏的，但是在这个过程中蛋白会被膜截留在NC膜的一面，不用担心蛋白流失。固定NC膜的方法很多，小量可以使用手工的方法。

作者: eric930 时间: 2013-4-24 17:18

蛋白芯片不是很适合您的研究。您现在已经很清楚A+X了，还是IP把X拉下来，然后质谱鉴定吧。

如果要研究A有哪些相互作用蛋白，可以尝试蛋白质芯片（芯片上固定的为重组表达蛋白），通过加入A孵育，看一下究竟哪个蛋白会相互结合。

================================================================

小弟才入蛋白之门，想多问个问题

我正是通过IP拿到A+X（X是附着在A上的一个蛋白），可是您说再用IP把X拉下来

因为X是未知蛋白，怎么拉它下来呢？谢谢您的答复

作者: eric930 时间: 2013-4-24 17:18

小弟才入蛋白之门，想多问个问题

我正是通过IP拿到A+X（X是附着在A上的一个蛋白），可是您说再用IP把X拉下来

因为X是未知蛋白，怎么拉它下来呢？谢谢您的答复

==============================================================================

其实最好的方法就是IP将A+X拉下来，然后SDS-PAGE,切胶走质谱，知道这个蛋白了再去做验证。

作者: 831226 时间: 2013-4-24 17:20

有没有用于筛选疾病标志物的商业化蛋白芯片？哪儿有？谢谢

作者: dragonkilly 时间: 2013-4-24 17:21

有没有用于筛选疾病标志物的商业化蛋白芯片？哪儿有？谢谢

==============================================================================================================

用于筛疾病标志物的芯片应该说是有一些的，例如Full Moon公司的ASB600芯片，覆盖了656个蛋白质，Raybiotech公司的一系列细胞因子芯片等等。

就我所知，已经有一些研究者在使用上述芯片进行疾病标志物筛选了，而且也有些文献发表的。

您需要哪种芯片关键还是要看您的实验设计。

作者: dragonkilly 时间: 2013-4-24 17:21

小弟才入蛋白之门，想多问个问题

我正是通过IP拿到A+X（X是附着在A上的一个蛋白），可是您说再用IP把X拉下来

因为X是未知蛋白，怎么拉它下来呢？谢谢您的答复

=======================================================================================

楼上战友的回答是正确的。既然X和A有相互作用，那么IP可以将他们的复合物拉下来，然后电泳质谱鉴定了。

关于IP，我想您应该有A的抗体了吧？方法学方面就不在这赘述了，站里面搜索一下应该有很多的。

作者: sunnyB 时间: 2013-4-24 17:21

蛋白芯片确实是个好东西，理论方面很完美，多数用的是荧光标记吧，我在医院实习中用时，由于步骤较多，操作时间也长，再加上膜孔多，技术不熟练，每次都不能得到好的结果，我们用的是手工法。要做这么多个检测项目，怎么保证，每个项目灵敏性都好。

作者: dragonkilly 时间: 2013-4-24 17:22

蛋白芯片确实是个好东西，理论方面很完美，多数用的是荧光标记吧，我在医院实习中用时，由于步骤较多，操作时间也长，再加上膜孔多，技术不熟练，每次都不能得到好的结果，我们用的是手工法。要做这么多个检测项目，怎么保证，每个项目灵敏性都好。

===========================================================================

蛋白芯片现在还是用于科研的多一些，如果是用于临床，还是要开发配套仪器实现自动化才可以。

我想临床医生或者检验科的医生们是没有兴趣单个孔去加样检测的。

较成功国内产品可参考数康的C12。

作者: www.1 时间: 2013-4-24 17:22

现在知道蛋白A，也知道它在膜上的受体，但是不知道与受体作用的蛋白，筛选这些未知蛋白可用蛋白质芯片不？

作者: dragonkilly 时间: 2013-4-24 17:23

现在知道蛋白A，也知道它在膜上的受体，但是不知道与受体作用的蛋白，筛选这些未知蛋白可用蛋白质芯片不？

=============================================================================================

与受体作用的蛋白，是指受体下游的信号通路？还是类似引起离子通道改变的受体？

若筛选哪些信号通路相关，可以选择信号通路抗体芯片，筛选究竟是哪个信号通路发生调变，这个方法也比较成熟了。

若是直接引起离子通道、渗透压改变等等作用，是否用IP的方法来鉴定一下比较好呢？

作者: qhyu 时间: 2013-4-24 17:23

与受体作用的蛋白，是指受体下游的信号通路？还是类似引起离子通道改变的受体？

若筛选哪些信号通路相关，可以选择信号通路抗体芯片，筛选究竟是哪个信号通路发生调变，这个方法也比较成熟了。

若是直接引起离子通道、渗透压改变等等作用，是否用IP的方法来鉴定一下比较好呢？

===================================================================================

是信号通路的蛋白，该受体是G蛋白偶联受体，是想弄明白该受体与配体结合后下游信号分子？初步推测，

可能有多个分子参与下游信号传导。可以用蛋白芯片吗？

那个公司做的比较可靠？

作者: dragonkilly 时间: 2013-4-24 17:24

是信号通路的蛋白，该受体是G蛋白偶联受体，是想弄明白该受体与配体结合后下游信号分子？初步推测，
可能有多个分子参与下游信号传导。可以用蛋白芯片吗？

那个公司做的比较可靠？

==============================================================================================================

我们认为现在进行信号通路筛选的蛋白芯片，美国Full Moon公司的磷酸化抗体芯片系列比较可靠，该芯片的特点一个是通量高（包括1318种抗体，涉及接近600个磷酸化位点），二是这些位点均有文献报道过，三是每个位点通过芯片上的一对抗体可直接计算出该位点的磷酸化水平（一个抗体识别磷酸化状态，一个抗体识别对应非磷酸化状态）。

1楼有相关的文献下载，第一页也有一篇相关文献解析。

Full Moon授权的技术服务商是上海生物芯片有限公司，我把联系方式站内短信发送给您。

作者: xyw5 时间: 2013-4-24 17:24

有几个问题请教一下：

1 信号通路上的蛋白磷酸化位点是确定的吗？有些蛋白的磷酸化位点超过一个，都有相应的检测吗？

2 这个磷酸化程度的变化是用总蛋白来进行比较的吗？做WB的时候总是先做一个总蛋白的。

3 判断一个蛋白的磷酸化是否有变化，有一个绝对值的价值吗？就是象RT-PCR那样，的Ct值的变化要达到什么程度。

4 信号通路上有很多的蛋白，如何确定一个蛋白磷酸化变化后对通路的影响？还是通路上的每个成员都需要有变化才能够确定通路受到影响？

谢谢！

作者: 8s5g 时间: 2013-4-24 17:25

小弟才入蛋白之门，想多问个问题

我正是通过IP拿到A+X（X是附着在A上的一个蛋白），可是您说再用IP把X拉下来

因为X是未知蛋白，怎么拉它下来呢？谢谢您的答复

===============================================================================================================

我想他的意思只是想确定你的X蛋白是否通过IP拉下来而已。

就你的问题，我个人的建议是：通过IP将X拉下来，经过加热，复合体分开，所以跑SDS-PAGE理论上可以跑出两条带（我说理论，是因为实际会有很多带，所以你需要对好对照，找出新出现的条带），其中一条是已知分子，所以你可以知道大小，如果另一条的大小与已知分子不同，就可以通过手动切胶将条带切出，然后进行质谱分析，可以数据库比对打分就知道未知蛋白了。供参考。

作者: dragonkilly 时间: 2013-4-24 17:25

有几个问题请教一下：

1 信号通路上的蛋白磷酸化位点是确定的吗？有些蛋白的磷酸化位点超过一个，都有相应的检测吗？

2 这个磷酸化程度的变化是用总蛋白来进行比较的吗？做WB的时候总是先做一个总蛋白的。

3 判断一个蛋白的磷酸化是否有变化，有一个绝对值的价值吗？就是象RT-PCR那样，的Ct值的变化要达到什么程度。

4 信号通路上有很多的蛋白，如何确定一个蛋白磷酸化变化后对通路的影响？还是通路上的每个成员都需要有变化才能够确定通路受到影响？

谢谢！

============================================================================================================

非常专业的问题啊，这位老师一定对信号通路与磷酸化方面做过很多工作的！

以Full Moon公司的磷酸化水平检测芯片为例来回答您的问题：

1.芯片上的磷酸化位点都是文献报道过的；有些蛋白例如AKT确实是有多个磷酸化位点，芯片上对应着多个位点有多组特异性的抗体，也就是说通过芯片可以同时检测出一种蛋白的多个磷酸化修饰位点；

2.芯片上检测磷酸化水平，是通过同时检测该位点的磷酸化蛋白与非磷酸化蛋白来实现的，针对1个磷酸化位点，芯片上包括一对抗体，分别特异性的识别其磷酸化修饰状态与非磷酸化修饰状态，获得一对信号，然后通过公式Phos Ratio ＝ Phospho Signal / UnPhospho Signal 进行计算；

3.如2所回答的，Phos Ratio我们实际上可以理解为一个绝对值，是可以两个或者几个样本间进行比较的；

4.磷酸化变化与信号通路的关系我们是这样理解的，根据我们的经验以及发表的相关文献，一般判断一个信号通路是否发生改变，要看整个通路的调变情况，是否一个通路从上游到下游都发生了改变，用一个比喻来说，是不是大家都超一个方向跨出了一小步，这一小步则对应了细胞学或者行为上的一大步。

作者: mickeylin 时间: 2013-4-24 17:26

相关疾病：
肿瘤
我想知道，用蛋白质芯片技术筛选肿瘤标记物，来源血浆或血清的提取物，蛋白的量需要多少？

作者: dragonkilly 时间: 2013-4-24 17:27

我想知道，用蛋白质芯片技术筛选肿瘤标记物，来源血浆或血清的提取物，蛋白的量需要多少？

==============================================================================================================

血清或者血浆标本，一般来说50ul就可以了，但是具体到实际的实验，我们需要根据需要检测的芯片的数量以及是否有技术重复等等来确定最终用量。

作者: pencil菲 时间: 2013-4-24 17:29

请问，对未知蛋白的筛选，是否可以运用到蛋白芯片技术~能否有经典文章分享，非常感谢~

作者: ukonptp 时间: 2013-4-24 17:32

您这个未知蛋白是指全新蛋白，以前没有发现的蛋白吗？这个恐怕还是需要借助经典的蛋白质组学手段2D、MS等等了。

芯片更多的是对已知蛋白的高通量筛选，或者是已知功能的蛋白探索其可能的新功能。

作者: wood533 时间: 2013-4-24 17:33

跟进学习中，如果敏感性能达到western-blot，还是很受用的

作者: orangecake 时间: 2013-4-24 17:34

跟进学习中，如果敏感性能达到western-blot，还是很受用的

===============================================================================================================

根据我们做过的一些实验，芯片结果与Western blot的互相验证效果还是比较理想的，但是现在还没有统计数字，希望经过一段时间的积累可以能够提供给大家一个可供参考的比例。

作者: yjf1026 时间: 2013-4-24 17:37

根据我们做过的一些实验，芯片结果与Western blot的互相验证效果还是比较理想的，但是现在还没有统计数字，希望经过一段时间的积累可以能够提供给大家一个可供参考的比例。

====================================

芯片对于WB最大的特点就是高通量，快速

其实WB是很经典的技术

作者: junjie05 时间: 2013-4-24 17:38

请介绍下帅选akt与mapk通路方面比较好的蛋白芯片，由于标本受限，做不了wb，是否蛋白芯片筛出了相关的信号蛋白就可以了呢？
另补充问一个问题，如果用PCR帅选信号通路的分子是否可以呢？如果PCR的结果是阴性的，磷酸化的蛋白不表达，是否就可以认为蛋白最终没有表达呢？

作者: dragonkilly 时间: 2013-4-25 11:27

QUOTE:

原帖由 junjie05 于 2013-4-24 17:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请介绍下帅选akt与mapk通路方面比较好的蛋白芯片，由于标本受限，做不了wb，是否蛋白芯片筛出了相关的信号蛋白就可以了呢？
另补充问一个问题，如果用PCR帅选信号通路的分子是否可以呢？如果PCR的结果是阴性的，磷酸化的蛋白不表 ...

筛选AKT与MAPK通路有专门对应的通路芯片，具体包括的抗体信息我放在附件中了，供查阅！

正如楼上所说的，抗体芯片最大的优点在于通量高，可以同时针对多个位点进行检测，节约样品用量。

芯片检测后，您只需要对筛出的有兴趣位点进行WB验证就可以了。

PCR信号通路芯片毕竟是检测的mRNA水平的变化，而磷酸化是蛋白的一种修饰方式，我认为PCR芯片是可以检测表达水平，但无法完全代表该位点的磷酸化水平变化。

作者: flower@@ 时间: 2013-4-25 13:20

用自己纯化的兔多抗制备蛋白质芯片，如何保证芯片质量？

作者: glass 时间: 2013-4-25 13:21

有用金作为基底的吗？

作者: viviwang1987 时间: 2013-4-25 13:21

楼主您好！

想咨询下Raybiotech细胞因子芯片这种半定量的蛋白芯片，你们在国内都有哪些客户，发表过那些文章呢？

作者: dragonkilly 时间: 2013-4-25 13:22

用自己纯化的兔多抗制备蛋白质芯片，如何保证芯片质量？

============================================================================================================

芯片质量主要还是依靠抗体的特异性与亲和力，所以无论是兔多抗还是鼠单抗，在上芯片前，总是要进行大量的预实验，进行相关验证与评价。

作者: dragonkilly 时间: 2013-4-25 13:22

楼主您好！

想咨询下Raybiotech细胞因子芯片这种半定量的蛋白芯片，你们在国内都有哪些客户，发表过那些文章呢？

===============================================================================================================

RayBiotech的芯片国内现在的用户也很多了，最近几年也陆续有文章发表的。其实对于发表文章来说，关键的不是用了哪种芯片，而是芯片的结果能对我们的文章提供多少帮助。我想您如果在犹豫使用芯片的手段检测细胞因子是否可靠，我认为这个不必担心，无论是RayBiotech的体系，或者其他的一些multi的方法，例如Bio-Plex，在细胞因子检测上都比较成熟。

作者: memory 时间: 2013-4-25 13:23

蛋白芯片技术的基本原理是将各种蛋白质有序地固定于滴定板、滤膜和载玻片等各种载体上成为检测用的芯片，然后，用标记了特定荧光抗菌素体的蛋白质或其他成分与芯片作用，经漂将未能与芯片上的蛋白质互补结合的成分洗去，再利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术，测定芯片上各点的荧光强度，通过荧光强度分析蛋白质与蛋白质之间相互作用的关系，由此达到测定各种蛋白质功能的目的。

作者: eric930 时间: 2013-4-25 13:24

请问国内现在有公司做反相蛋白芯片吗，价钱贵吗，谢谢，另外细胞因子芯片是不是就是抗体芯片的一种

作者: cocacola 时间: 2013-4-25 13:24

你是要购买反相蛋白芯片还是要定制反相蛋白芯片呢？这个其实和组织芯片是一个道理，要看你想要研究的对象是什么，要根据自己的研究方案来选择和确定的。如果有问题的话还是可以继续联系的。

作者: chengraul 时间: 2014-3-24 22:00

我想问一下用NC膜做蛋白芯片如何手工点样，NC膜要怎样处理、点样体系、如何封闭等。完全摸不到头脑，求高人指点。。。

作者: chengraul 时间: 2014-3-24 22:03

我想问一下用NC膜来做蛋白芯片的具体操作步骤，比如，NC膜如何处理，如何手工点样、点样体系、封闭等。。。完全摸不着头脑，求高人指点。。。随带问一下有没有什么参考文献之类的啊？

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)