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标题: 【讨论帖】每升菌液的包涵体产量问题 [打印本页]

作者: zwsyrt 时间: 2013-4-25 13:32 标题: 【讨论帖】每升菌液的包涵体产量问题

最近要购买质粒表达包涵体，与某公司的技术人员交流。对方直接说能达到每升菌液几十克包涵体的水准。这点确实让我不敢相信。之前做表达的时候一般顶多也就是一克左右的样子，也许是在下人品太糟糕。
请问诸位，您做表达时能达到何种水平？

作者: S6044 时间: 2013-4-25 13:33

和表达蛋白，诱导条件什么的都有关系。
公司的人说的肯定是最理想状态，表达在这个量并不稀奇。

作者: zwsyrt 时间: 2013-4-25 13:33

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原帖由 S6044 于 2013-4-25 13:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

和表达蛋白，诱导条件什么的都有关系。
公司的人说的肯定是最理想状态，表达在这个量并不稀奇。

您做表达的时候，最后的干燥包涵体能达到几十克的水准么？？这确实对我是个好消息，非常感谢

作者: zwsyrt 时间: 2013-4-25 13:34

这就牵扯到一个很糟糕的问题，我找的是EGF包涵体的表达质粒。目前EGF蛋白的国内某厂最高产量貌似是每年300克左右。而一个简单的200升发酵罐，一次产量就可以达到公斤级别。这得啥样的低效的复性效率才能出现这种情况呢！？这确实没法让我相信。

作者: S6044 时间: 2013-4-25 13:34

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这就牵扯到一个很糟糕的问题，我找的是EGF包涵体的表达质粒。目前EGF蛋白的国内某厂最高产量貌似是每年300克左右。而一个简单的200升发酵罐，一次产量就可以达到公斤级别。这得啥样的低效的复性效率才能出现这种情况呢！？ ...

我自己也没表达出过这么高的产量。

我的意思是您表达一个EGF和表达一个GFP的量绝对可能差1-2个数量级以上。你不如去问问厂家是拿什么条件表达什么蛋白得到的数据。

作者: vivian4123 时间: 2013-4-25 13:35

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1L菌高密度发酵拿个几十克包涵体，是没问题的，但是一般说的是湿包涵体，您说的干包涵体，没做过，一般不会让包涵体干燥了去做下一步的试验的。

另外EGF包涵体复性，效果不好，活性也差很多，为什么不用酵母呢？

我们用酵母分泌表达的EGF，活性高，产量也非常不错，稳定性好，而且纯化工艺简单，这个也是目前很多人在用的工艺！只是现在EGF没什么市场，做起来也没有意义了！

作者: zwsyrt 时间: 2013-4-25 13:35

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原帖由 vivian4123 于 2013-4-25 13:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

1L菌高密度发酵拿个几十克包涵体，是没问题的，但是一般说的是湿包涵体，您说的干包涵体，没做过，一般不会让包涵体干燥了去做下一步的试验的。

另外EGF包涵体复性，效果不好，活性也差很多，为什么不用酵母呢？

我们用酵母分泌表 ...

我就是做包涵体复性研发的，对酵母途径没兴趣。
另外好奇的问一句，您所做的酵母途径能达到何种表达程度。如果涉及商业机密就算了。非常感谢！
干包涵体也是正常情况下很自然要获得的，用无水乙醇去除内毒素之后，稍微晾一下自然也就是干包涵体了吧！

作者: zwsyrt 时间: 2013-4-25 13:36

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原帖由 S6044 于 2013-4-25 13:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我自己也没表达出过这么高的产量。

我的意思是您表达一个EGF和表达一个GFP的量绝对可能差1-2个数量级以上。你不如去问问厂家是拿什么条件表达什么蛋白得到的数据。 ...

非常感谢您的信息！
也问了销售商，可能是我最初的表现太过于明显，人家的自尊有些受伤吧！人家干脆不怎么搭理我了！！人品问题，人品问题！！呵呵

作者: zwsyrt 时间: 2013-4-25 13:36

EGF烟台康达尔每年340克的产量就称王称霸，每克现在的售价大约能到60万。这个市场只能说是还没有真正的王者，并不是没有人去认识。

作者: vivian4123 时间: 2013-4-25 13:36

EGF烟台康达尔每年340克的产量就称王称霸，。这个市场只能说是还没有真正的王者，并不是没有人去认识。

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每克能到60万?

作者: zwsyrt 时间: 2013-4-25 13:37

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原帖由 vivian4123 于 2013-4-25 13:36 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
EGF烟台康达尔每年340克的产量就称王称霸，。这个市场只能说是还没有真正的王者，并不是没有人去认识。

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每克能到60万?

我要大肠杆菌包涵体的高表达质粒，您能提供么？市场的事情自然有人做，我只管技术。

作者: zwsyrt 时间: 2013-4-25 13:37

另外信号肽这种夹带的东西您后续切除了么？是干净的EGF 的 53个氨基酸？

作者: vivian4123 时间: 2013-4-25 13:37

53个氨基酸，跟天然EGF完全一样！

作者: zwsyrt 时间: 2013-4-25 13:38

您能做到多少银子一克？方便就说，不方便也理解。

作者: is2011 时间: 2013-4-25 13:38

普通挡板摇瓶，增加溶氧；优化后LB培养基，增加营养。菌株使用公司一般菌株即可，全菌湿重在20g/L左右，拿包涵体的话湿重在10g/L左右。因为我们一般情况都做可溶性的蛋白，包涵体了解较少。但是如果还要求菌量的话，可以将摇瓶换为发酵罐。个人感觉，做包涵体不怎么需要特殊质粒。

作者: is2011 时间: 2013-4-25 13:39

以上说的得率是在16℃过夜条件下的数据，37℃诱导包涵体3小时数据暂无。

作者: bling 时间: 2013-4-25 13:39

摇瓶37度过夜的上限大约是30g/L湿菌体，洗净的包涵体一般10g/L左右. 发酵罐能达到这个数字的两倍是正常的.

和质粒确实没什么关系，T7-DE3表达系统目前还没有改进的必要。

作者: zwsyrt 时间: 2013-4-25 13:39

普通挡板摇瓶，增加溶氧；优化后LB培养基，增加营养。菌株使用公司一般菌株即可，全菌湿重在20g/L左右，拿包涵体的话湿重在10g/L左右。因为我们一般情况都做可溶性的蛋白，包涵体了解较少。但是如果还要求菌量的话，可以将摇瓶换为发酵罐。个人感觉，做包涵体不怎么需要特殊质粒。

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非常感谢！
包涵体通常是表达极力避免的，主要是后面还得面临复性大关。能直接表达可溶的蛋白还是省事。

作者: zwsyrt 时间: 2013-4-25 13:40

摇瓶37度过夜的上限大约是30g/L湿菌体，洗净的包涵体一般10g/L左右. 发酵罐能达到这个数字的两倍是正常的.

和质粒确实没什么关系，T7-DE3表达系统目前还没有改进的必要。

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兄台信息价值非常，甚为感激！
过夜表达，IPTG分次加入还是一次性达到浓度？方便稍微谈一下细节么？？

作者: bling 时间: 2013-4-25 13:40

兄台信息价值非常，甚为感激！
过夜表达，IPTG分次加入还是一次性达到浓度？方便稍微谈一下细节么？？

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摇瓶收包涵体用自诱导培养基如ZYM-5052，省事省心。可溶表达的话，摇瓶里IPTG一次加到最终浓度，大罐用乳糖诱导则可以根据耗氧量的变化多次添加。

Amp抗性的质粒可能有一个问题就是beta内酰胺酶是分泌表达的，菌密度不高的时候培养基里已经没有抗生素了，诱导后很容易丢质粒。补加也会马上消耗掉，唯一的办法是停止培养，把菌液抽出来离心用PBS洗净换新培养基。Kan抗性的载体更适合工艺的放大。

作者: zwsyrt 时间: 2013-4-25 13:41

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原帖由 bling 于 2013-4-25 13:40 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
兄台信息价值非常，甚为感激！
过夜表达，IPTG分次加入还是一次性达到浓度？方便稍微谈一下细节么？？

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摇瓶 ...

再次感谢！质粒是外购，目前也只能将就着用，以后有条件再自己改装一下。先期探路的实验随意性还是得忍了。

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