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标题: 【讨论帖】生物制药产业化及膜分离技术,下游纯化 [打印本页]

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 15:30     标题: 【讨论帖】生物制药产业化及膜分离技术,下游纯化

受Biosepq斑竹邀请,很高兴到这个版来和大家一起讨论有关制药的一些问题。
我起的标题可能有些大,我自己虽不能解决,好在有这么多的专家,希望到我这个专题下和大家一起解决问题。您的问题,我的提高。
原来很想在这个版设个专题帖子,但是发现师兄是这里的领军人物,他是Chromatography的专家,从他回帖的数目就足见。于是我把专题帖子开在医药综合版,但是那里的斑竹可能太忙,我只好搬家到制剂版,不只是因为我最早的专业是制剂,还因为制剂的人员确实很需要我们讨论相关的问题,还有我还有不少年的制药实践。在那里,我还是受到比较好的欢迎。我感谢制剂版那些曾经给我支持和鼓励的人。
楼主从事医药工作共18年,比较擅长生物制药,对化学制药,天然药物也有一定的经历和浓厚的兴趣,对下游膜分离技术及纯化技术爱好有加,从事的工作总在不断的教我成长,现在开辟这一专题,希望大家把遇到的问题在这里交流,不论您是R&D,或者中试,还是生产,这里都欢迎您,我会尽我所知,和大家交流和共勉。
工作的关系,有幸和很多专家及药厂有联系,我会把经验和大家分享。
希望大家提宝贵问题。
以下帖子是我在制剂版的一些介绍,大家有空时候可以去逛逛。
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=115&id=2469234&sty=0')

同时也请关注产业化讨论其他子贴:

生物制品中试放大技术讨论专帖
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=4450483&sty=1&tpg=1&age=0')

生物制品内毒素去除及质检讨论帖
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=4450505&sty=2')

新药报批讨论帖
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=4450535&sty=2')

作者: 9900    时间: 2013-4-25 15:30

层析柱前的第一步就是过滤澄清。

一般的澄清过滤工艺可以是以下几种选择:
1,逐级死端过滤
2,高速离心 - 0.45u
3,切向流

其中,切向流可以选择板式或中空纤维微滤。

作者: wood533    时间: 2013-4-25 15:31


您给的条件不是很全面,比如切向流的孔径?
考虑是澄清,所以一定是微滤,在切向流的具体产品上,可能震动膜和陶瓷膜要更好一些,既能够产业化,寿命也很长,成本也不高。而一般的平板膜,不是很好。因为寿命不会很长。中空纤维,也会因为这个原因寿命大大缩短。
在死端过滤的产品,尤以滤板为好,不但过滤效果好,而且湿强度高,作的好的板子还可以反复使用。大规模也完全可能,还有就是板框。
除了以上的一般考虑,吸附是必须考虑的。要看您用的膜是哪家供应商了?是否孔径与标示的一致?这个很难说。

作者: zzzz    时间: 2013-4-25 15:31


去除细胞,可以选择离心或着0.45微米的膜分离.
亲和柱离子柱分子筛然后超滤出热源.

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 15:32

您的问题分析得很透彻。看得出来,您是个很专业,而且有很多实践的人。
AG的柱子应该不错。但是寿命似乎也不是很久。我所接触的一个厂家,他们曾经用这个产品,效果不错。但是有2个问题,在大生产的时候,该产品的寿命是一个问题,他们厂大约用6批,就得更换。当然他们用的是100K的TFF。还有,就是偶尔有断丝现象。

还有,根据您提供的情况, 可能陶瓷膜是最好的工艺.
而死端过滤,我说的不是普通的滤芯方法,大饼滤器.

作者: caihong    时间: 2013-4-25 15:32

您说的很有道理,谢谢!

您说的陶瓷膜一般用哪家的产品呢?价格,CIP,能否autoclave,吸附情况能不能再介绍一些呢?

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 15:33


我想问您,您的目标蛋白是用什么方法检测?回收率如何确定?
关于陶瓷膜(Membralox)的资料,我会在适当的时候上传。明天准备回老家,得等周3才能够答复您。
不过需要说明的是,您所说的全部具备。适合生物制药要求。卫生级。

作者: caihong    时间: 2013-4-25 15:33


我的目的蛋白浓度是用Elisa测定,然后根据体积算出收率。
呵呵,等待您的答复。

作者: caihong    时间: 2013-4-25 15:35

请问国产的卫生级隔膜压力表哪里有卖呢?
大概多少钱?

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 15:36



QUOTE:
原帖由 caihong 于 2013-4-25 15:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我的目的蛋白浓度是用Elisa测定,然后根据体积算出收率。
呵呵,等待您的答复。

我的笔记本故障了,不能来这里,借来老机器用,是 98系统,很不舒服.没有ABC,不习惯.
希望没有干涉您检测的 杂蛋白. 这样的话,很有可能就是过滤膜的问题了.还有,您的 目标蛋白不会聚合吧?您试试我说的 方法,看看结果如何,我们再讨论,如何?
再次致歉迟复.

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 15:36



QUOTE:
原帖由 caihong 于 2013-4-25 15:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请问国产的卫生级隔膜压力表哪里有卖呢?
大概多少钱?

抱歉我不是很清楚.
需要说明的是:在选择压力表时候,以下几个问题需要考虑:
1,压力表的量程;
2,压力表的刻度是否满足您的 要求;
3,单位, Mpa? Kg/cm2? PSI? Bar? 它们之间的 换算?大约: 1KG/cm2=1Bar=0.1Mpa=14.5PSI;
4, 耐受温度?
5,使用接口大小?
6,往深处讨论,还有准确度及稳定性等问题.
进口卫生级隔膜压力表的 价格大约RMB1200~2000/PCS, 耐受145度, 1Mpa, 量程1Mpa.需要的话,可以PM我.
当然,国产会便宜很多. 猜想不过500块.

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 15:37

连续Diafiltration不影响浓度,始终在一个蛋白浓度下操作,对于蛋白娇嫩, 易于受浓度影响的产品好,但是时间相对长,且需要更高配置的设备.
不连续Diafiltration则与以上相反.

陶瓷膜, 最好的上标名称是Membralox.是法国的Exzakia公司产品,最初浓宿金由元素的 设备.
因为是无机材料, 所以耐酸,耐碱,还耐高温. 清洗比较彻底, 寿命极长,3~5年没有问题!可进行CIP和 SIP. 关于价格, 还是比较高,但是因为长时间不换,所以成本还是很低.

作者: caihong    时间: 2013-4-25 15:37


谢谢您的回复,很受启发。

国庆后我会再根据您的建议进行试验,有问题再讨论。

您说的压力表两边是不是TC接口呢?

作者: lxh031    时间: 2013-4-25 15:37


我想做小鼠骨髓的western blot 哪位高手做过,可否赐教如何提取细胞总蛋白.十万分感谢.

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 15:38



QUOTE:
原帖由 lxh031 于 2013-4-25 15:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我想做小鼠骨髓的western blot 哪位高手做过,可否赐教如何提取细胞总蛋白.十万分感谢.

当然是TC接口,这是GMP的要求。
欢迎问题。

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 15:38


遗憾我的电脑在国庆节前2天出故障,而且是硬盘的问题。可惜了,我的那些日夜奋战的数据啊!
IBM的电脑本不该这样,而且是03年8月份的新产品,建议大家一定备份文件——题外话。

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 15:38



QUOTE:
原帖由 lxh031 于 2013-4-25 15:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我想做小鼠骨髓的western blot 哪位高手做过,可否赐教如何提取细胞总蛋白.十万分感谢.

您将足够量的骨髓加上缓冲液匀浆,然后用5~10um的滤器过滤,再用0。2um滤器过滤,取澄清液用1K的膜进行超滤浓缩,达到需要的浓度后再进行印迹。当然印迹前需要对样品进行必要的处理。
如果您想分段印迹的话,可以取合适的分子量进行分段,然后再印迹。

作者: is2011    时间: 2013-4-25 15:41

请问国产的卫生级隔膜压力表哪里有卖呢?
大概多少钱?

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我所知道的有上海日泰公司生产这种卫生级隔膜阀,316L不锈钢材质,两端的TC口与压力表隔膜阀接口都与国际标准一样,皆可用卡箍直接连接。

我就曾用其公司生产的隔膜阀代替Amershama公司生产的隔膜阀,效果基本一样,可是价格却差了几十倍。

日泰产的压力表大约几百元人民币,Amershama公司产的要上万元人民币。

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 15:42

我所知道的有上海日泰公司生产这种卫生级隔膜阀,316L不锈钢材质,两端的TC口与压力表隔膜阀接口都与国际标准一样,皆可用卡箍直接连接。

我就曾用其公司生产的隔膜阀代替Amershama公司生产的隔膜阀,效果基本一样,可是价格却差了几十倍。

日泰产的压力表大约几百元人民币,Amershama公司产的要上万元人民币。

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以下几点做个说明:
1,Biosepq问的是隔膜压力表,不是隔膜阀,二者有差异。压力表是为了观察气体或者液体压力的一个部件,阀门是控制开关或者流量大小的一个部件。压力表价格比阀门要便宜。
2,Amershama公司不生产压力表。应该是OEM的。

3,有些国产表或者阀门应该是可以用的,但是需要认真选择。价格的差异,可能没有那么大,一个原则,国产产品和进口产品差价基本上就相当于美金Versus人民币,或者欧元对人民币,这是价格原则,以后买进口产品注意了,别让人蒙了。
4,隔膜阀门最好的是德国盖米的产品,对于一个1‘接口的阀门,价格大概为3500~4000元人民币,对于3/8寸的接口阀门,价格大概为3000~3500元。另外还有Sanders阀门也是很好的。用了很多年都很好。有一些合资的产品,也可以用,但是我在实践中发现,还是有一些问题,所以我不轻易推荐。
5,隔膜压力表国外的比较多,价格1000~2000元,甚至更高。但是一般还是阀门价格高些。

6,上海日泰做的不错,但是要是达到国际标准,那还是有相当的距离。不信您叫他们那标准来,或者您问他们执行的标准,就知道差距了。
以上愚见,仅供参考。

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 15:43

您的管直径是多大?要是实验用,不见得一定要卫生级。
作者: is2011    时间: 2013-4-25 15:43


我现在用的是好像是盖米的

还有就是切向流用于澄清过滤时个人理解:流速不能太慢,如果慢到不能将膜表面滤饼冲走,那也就失去了切向流的意义;但是是不是越快越好呢? 会不会流速过快时,使得flux开始的时候较快,这样膜堵得更快呢,这样导致整个过程中flux没有长期的稳定在一个较为满意的值,使得平均通量下降?
我怎么系统的优化,如何选定一个流速后,通过此次试验的flux~ permeate vol 曲线 就知道这个流速是高还是低呢?

如果对于不同批次的培养液,固体含量不是完全一致,能不能根据已有试验的数据,对新的培养液(颗粒更多或更少)时,可以对于流速的调整作出大致判断呢?

作者: is2011    时间: 2013-4-25 15:44

您的管直径是多大?要是实验用,不见得一定要卫生级。

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卫生级可能目前也不是特别重要,但是布莱迪要1500/个,而且他们做不了,要专门定做,让我觉得他们的技术不过关。
作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 15:44


您很专业,说得很有道理。不过有一点我需要说明,TFF用来做澄清,用膜包似乎不是很好的选择,但是最初不知道是谁先推荐该方法。在大规模以及黏度很大的产品,可以考虑用震动膜(VMF)或者陶瓷膜(Membralox)来实现。最关键的是常规TFF产品用来澄清寿命不是很长。
合适的TMP同时有合适的回流速度是很重要的——这个需要寻找最佳值。而流速与响应的配置如泵的流量有关,同时也与TMP有关。您说的很对。不过回流速度快,怎么就导致膜堵的快?我不明白。
我怎么系统的优化,如何选定一个流速后,通过此次试验的flux~ permeate vol 曲线 就知道这个流速是高还是低呢?
先看看TMP的增加到什么程度时候,透过速度不做相应增加而出现弯头?就选择那个TMP好了。然后观察是否在该TMP下,随着时间推移,透过速率没有多大变化,也就说明不堵。这是简单的寻找优化过程。
如果对于不同批次的培养液,固体含量不是完全一致,能不能根据已有试验的数据,对新的培养液(颗粒更多或更少)时,可以对于流速的调整作出大致判断呢?
还有,TMP太低可能flux较低, 但是TMP过高,那么膜表面的滤饼可能会被压缩,这样过滤阻力反而会增加,抵消掉TMP增加的效果,没准儿flux也不会有所升高吧?
确实。您的看法完全正确!
一般的过程是恒TMP还是恒切向流速?我觉得flux肯定是越来越慢,壁较好控制的是泵速,那么如果泵速一定,切向流速就是越来越快的了?
尽量保持透过速率变化不大下的TMP升高有限,这是合适的参数。

作者: is2011    时间: 2013-4-25 15:44


您说的陶瓷膜是不是Pall有啊?
一般的细胞培养液的flux是多少呢,价格?我想看一下处理同样体积的培养液,成本相差多少?好像无机膜用的还是不如有机膜多,不知道是不是无机膜的技术不容易实现,所以昂贵?
陶瓷膜也是切向流方式的吧?

最近太忙了,过一段时间忙过去了一定详细讨教!

作者: zhezhe    时间: 2013-4-25 15:45


这位师傅,我也即将进行有关微生物在抗真菌药物方面应用的研究,我对着方面还不是很了解, 请问您能给我介绍一些关于这方面的书或文章吗?不胜感谢!!!

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 15:48

这位师傅,我也即将进行有关微生物在抗真菌药物方面应用的研究,我对着方面还不是很了解, 请问您能给我介绍一些关于这方面的书或文章吗?不胜感谢!!!

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是问我吗?不敢称师傅。
您问的太笼统,具体一些好吗?您想要做什么?更多的,您把您想要我或者大家为您做的说清楚明白,否则我的答复您不见得有用。

作者: yonger    时间: 2013-4-25 15:48


坦白的讲,诸位讨论的都是比较原始的工艺研究开发!需要新的知识加以完善!

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 15:49



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坦白的讲,诸位讨论的都是比较原始的工艺研究开发!需要新的知识加以完善!

还有,期待您在弹壳龙抗体方面的指教!
作者: is2011    时间: 2013-4-25 15:50



QUOTE:
原帖由 fsdd817 于 2013-4-25 15:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


还有,期待您在弹壳龙抗体方面的指教!


尤其是治疗用单克隆抗体方面。
谢谢

作者: yes4    时间: 2013-4-25 15:51


请问前辈,能用SDS-PAGE检测分子量为3500Da的蛋白吗?如果可以的话,应该如何配胶呢?我想对发酵液中的NISIN检测和定量,这么做能作到吗?期待回复!

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 15:56

请问前辈,能用SDS-PAGE检测分子量为3500Da的蛋白吗?如果可以的话,应该如何配胶呢?我想对发酵液中的NISIN检测和定量,这么做能作到吗?期待回复!

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基本上不可能。
分子量太小,非常容易在电泳过程中走掉。染色时候看不到,灵敏度不够。您可以尝试银染。但只能检测,定量肯定不可以。还是上面所描述的原因,容易走失。
对于这么大小的多肽,我曾经在无数次的操作中,有那么几次获得理想的结果(考染,我用过很多种染色剂),当年我做SDS-PAGE还是国产非常简单的仪器,我也曾成功做过银染。我的认识是:很难,但是不是绝对不可以。
既然您是定量,可以考虑用RP-HPLC,我认为是最好的办法。
关于NISAN,我想多说几句。据说该分子容易聚合,是否确实,什么条件,我没有经验。要是聚合的产品,那就复杂了。
RP-HPLC是最好的办法。定性,定量等。

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 15:56

您说的陶瓷膜是不是Pall有啊?
一般的细胞培养液的flux是多少呢,价格?我想看一下处理同样体积的培养液,成本相差多少?好像无机膜用的还是不如有机膜多,不知道是不是无机膜的技术不容易实现,所以昂贵?
陶瓷膜也是切向流方式的吧?

最近太忙了,过一段时间忙过去了一定详细讨教!

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陶瓷膜是无机膜,有很多优点,也是近几年才开始为大家重新认识的。
全球有很多生产商,尤以法国的EXEKIA的产品最好,商品名Membralox,教科书上就是用该名字命名之。其主要在通量和背压上比同类产品优势,当然价格也贵。还有德国书马赫,其它还有几个品牌。

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 15:57

您说的陶瓷膜是不是Pall有啊?
一般的细胞培养液的flux是多少呢,价格?我想看一下处理同样体积的培养液,成本相差多少?好像无机膜用的还是不如有机膜多,不知道是不是无机膜的技术不容易实现,所以昂贵?
陶瓷膜也是切向流方式的吧?

最近太忙了,过一段时间忙过去了一定详细讨教!

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Flux对于不同的料液,数字不一样。需要实验给予。大约100~200LMH。
但是该产品往往是大规模应用时更好。小设备价格高,实验室一般不会买。无机膜有很多优势,而且恰是有机膜不能实现时候的最好选择。比如在处理有机溶剂时候,无机膜是更好的选择。
同样,它属于TFF。对于年黏度大的产品很实用,最显著的特点是寿命长。因为他耐酸碱及高温,可以在极端条件下使用和清洗,恢复极好!

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 16:02


100L可能是比较好处理的。
说明一下,陶瓷膜分2部分——所有的TFF设备都是这样——设备和膜。膜是实现功能的核心部件,而合理地设计设备也是很重要的,尤其是大量处理,如每天处理上百吨料液的工厂。
您可以买一个膜,然后选择一个工程公司给加工设备。这样可能便宜一些。但是要是您使用频率不高,就不建议购买了。

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 16:02

要是是考虑品质的话,可以考虑3L进行实验。或者考虑死端过滤,用深层滤器。当然,选择哪种方式,最好把产业化的的成本考虑进去,选择合适方式。如果要获得工艺参数,需要进一步放大。
作者: 04906    时间: 2013-4-25 16:03


各位高手,大家手头又没有关于发酵或者纯化工艺放大方面的综述性资料啊,我正做着方面的工作,想大致了解一下,过几天的seminar也可以用来做PPT。谢谢各位了。

作者: wu11998866    时间: 2013-4-25 16:03


我想请教一个问题,新霉素在提取纯化过程中,能否分开 B与C组分

作者: 04906    时间: 2013-4-25 16:04

我说的也是隔膜压力表,当时因太着急了没有注意到输入错误。
其次,我想补充的是,我上述说的压力表的价格确实没错(包括连接压力表的三通),总共14000元(人民币)左右,并且每年都会以10-20%的速度递增(这是他们公司的成文规定)。关于压力表不是原产于安玛西亚公司,888君说的对,但是因为我这边的成套的层析设备都是从他们公司进的,这是从购货单上查到的价格。
再次,上海日泰生产的隔膜压力表,我感觉还是不错的,至少已经能够符合GMP要求了(也是316L不锈钢材质,且无卫生死角),并且从那位仁兄的需求来看,求接口完全可以用卡箍快捷接上的。但是,作为隔膜压力表的特性,一般的是需要三通来跟管路连接而不像螺丝接口型的那么方便。我这边是要求严格的生物制品GMP车间,用日泰生产的压力表代替从安玛西亚购进的压力表完全符合生产情况,并且在价格上相差又很大,所以我还是推荐使用国产的。


作者: 04906    时间: 2013-4-25 16:04


我想再补充几点意见,

1。如果用膜过滤法处理的话(特别是用无机膜),在收率方面就会损失比较大,正象888君所说的那样,除了膜包外,还需要装载膜包的加持器、连接管道等。
2。对于CHO表达的目的产物,为什么不尝试用STRIMLINE(扩张柱床)层析呢?它的优点(亦即卖点)就是直接从真核或细胞(原核外泌型的也可)表达产物中直接将目的产物提取出来,并且得到比较高的纯化目的。它的原理就是将真核或细胞培养上清从层析柱下面往上反向穿过层析柱,凝胶在流动液体的带动下,呈现均一的分布,目的产物被凝胶吸附,而杂质以及细胞碎片穿过层析柱流出;洗脱时正向洗脱,目的产物被浓缩到收集液中。这样样品不但被浓缩,而且进行了一定程度的提纯。
如果仅仅就这几次使用,可以向安玛西亚公司(北京、上海或广州办事处)申请一下,先免费试用(不时使用)一段时间他们的产品,并可让他们的技术人员帮忙进行实验设计。如果实验效果比较好后,可以再考虑购买。
3。如果就是想用膜过滤法操作,可参考赛多利斯的块状膜堆,可用0.5m2即可,虽然不如无机膜性能好,但是他不用其它辅助设备,只要有一个泵,和一根泵管,接上就可以直接使用,很方便,且死体积非常少,价格也比较便宜,大约几千元一块。如果实验体积增大,则可以直接将两块、三块或更多的并联接在一起就ok了,很方便的。可以试一试。

作者: is2011    时间: 2013-4-25 16:04

顺便说一声,TFF有很多很有趣的技术.不是一言两语说的清楚的.而且具体应用也有很多实践.
作者: ending    时间: 2013-4-25 16:05


超滤一般是用来浓缩和脱盐,但是我想用超滤法将我的蛋白(分子量为 5-10 kd ) 从蛋白粗提液中初步分离出来,即尽量去除大分子量的蛋白质。

我该如何选择超滤管(的截留值)??怎么操作?

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 16:05



QUOTE:
原帖由 ending 于 2013-4-25 16:05 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

超滤一般是用来浓缩和脱盐,但是我想用超滤法将我的蛋白(分子量为 5-10 kd ) 从蛋白粗提液中初步分离出来,即尽量去除大分子量的蛋白质。

我该如何选择超滤管(的截留值)??怎么操作? ...

你可以用1KD进行Desalting and concentration; 用30KD或者50KD进行Fractionation。后者回收会高一些。
具体问题,需要具体讨论。

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 16:06


理论和实际总是有一些不完全一致。但是趋势是明确的。再者,在选择膜的分子量方面,是需要考察最佳选择,这样,可能会好一些。
另外,需要说明的是,您所描述的不叫浓缩。浓缩,目标蛋白是留在回流液里面的。您哪个叫做去除大分子杂蛋白。在这样情况下,选择大于目标蛋白6倍的分子量是必要的。膜分离是有其独特的特征的。不同的应用,有不同的效果。

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 16:07


我的经验是,您还是用过滤的方法,而不是切向流的方法来去除碎片。先用公称精度1um,然后用绝对精度0,2um的滤器。获得上清上样。您会说会堵塞,不会了,1um公称精度的要选择好。应该可以。在表面的沉积不影响过滤,我推荐用该方法除去细胞碎片效果不错。

作者: daod    时间: 2013-4-25 16:08

我想用超滤方法来分离分子量分别是3300 Da和20000 Da左右的蛋白,目的要得到3300的蛋白,但不能含有一丁点的20000蛋白.已知原始料液中,20000的蛋白已经很少.大概比3300少10~50倍.请问如何选择超滤膜?(包括滤膜截留分子量大小,超滤方式,选择的设备和膜的厂家品牌等等,先谢谢了.
作者: damingxia0904    时间: 2013-4-25 16:09


请教楼主一个问题,和超滤有关的,因为自己的数学知识生疏了,特张贴求解!望不吝赐教!
我有1000ml 蛋白溶液要超滤换液,去除其中的3M 尿素,换成PBS。超滤膜截留分子量是10kD,泵的流速是30ml/min,滤出的速度是10 ml/min。装样品的瓶子保持密封状态,滤出多少体积同时就自动的补充多少体积的PBS,即样品的体积保持1000ml。问题是我要多少体积的PBS才能很完全地置换出样品中的尿素(容许残留20000分之一)?
我知道这需要用到微积分方程才可以解答,可是我把所学的一点高数早就全还给老师了。望楼主能告诉我答案和方法!如别的朋友知道也请指点!

作者: damingxia0904    时间: 2013-4-25 16:11


请教楼主一个问题,和超滤有关的,因为自己的数学知识生疏了,特张贴求解!望不吝赐教!
我有1000ml 蛋白溶液要超滤换液,去除其中的3M 尿素,换成PBS。超滤膜截留分子量是10kD,泵的流速是30ml/min,滤出的速度是10 ml/min。装样品的瓶子保持密封状态,滤出多少体积同时就自动的补充多少体积的PBS,即样品的体积保持1000ml。问题是我要多少体积的PBS才能很完全地置换出样品中的尿素(容许残留20000分之一)?
我知道这需要用到微积分方程才可以解答,可是我把所学的一点高数早就全还给老师了。望楼主能告诉我答案和方法!如别的朋友知道也请指点!

作者: kuaizige    时间: 2013-4-25 16:13

各位有没有用羟基磷灰石作为填料纯化蛋白质的?纯化的示哪种蛋白质?
作者: kuaizige    时间: 2013-4-25 16:13

我想用超滤方法来分离分子量分别是3300 Da和20000 Da左右的蛋白,目的要得到3300的蛋白,但不能含有一丁点的20000蛋白.已知原始料液中,20000的蛋白已经很少.大概比3300少10~50倍.请问如何选择超滤膜?(包括滤膜截留分子量大小,超滤方式,选择的设备和膜的厂家品牌等等,先谢谢了.

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要得到3300D的蛋白穿出,则需要至少为10-15kD的膜,而要想截流20000D的蛋白,则膜最大不应该超过5kD的膜。所以,如果要达到在3300 D的样品中没有一丁点的20000 D的蛋白,那就必须以牺牲3300D的蛋白收率为代价,可以选择10kD的膜,降低超滤的透过压,让3300D的蛋白在低压下透过膜。至于厂家,板块式膜堆厂家有Millipore公司和沙多利斯等,中空纤维式的有AmershamPharmacia公司等。特别是AmershamPharma公司,最近新设计了一套超滤科研系统,充分揉和了AKTA设备的功能,有利于进行超滤条件的选择和优化。
我建议你可以试一试其他的层析技术,例如可以先通过离子交换层析进行浓缩和初步纯化,再进行分子筛层析,即可很容易的达到分离目的。

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 16:14

我想用超滤方法来分离分子量分别是3300 Da和20000 Da左右的蛋白,目的要得到3300的蛋白,但不能含有一丁点的20000蛋白.已知原始料液中,20000的蛋白已经很少.大概比3300少10~50倍.请问如何选择超滤膜?(包括滤膜截留分子量大小,超滤方式,选择的设备和膜的厂家品牌等等,先谢谢了.

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我的建议是,你可以考虑5KD的膜,或者6KD的膜。通过延长操作时间,可能会达到您的目的。这样可以保证20KD不透过。
还有,如果以上方法因为您的蛋白是线形而不易去除的话,您也可以考虑其他方法,先去除大蛋白。
TFF方式比较适合大规模。
5KD有Membrane cassette方式,6KD有hollow fiber 方式,均能够得到理想结果。选择的设备厂家除了上面提供的之外,现在在国内乃至全球广泛使用的PALL公司产品,您也可以考虑。
如果您在北京,不妨可以联系我,看看我是否能够帮助您进行实验,开拓工艺。
还有,除了以上的,TFF之外的,我也很希望和您一道探讨。
任何问题,欢迎提问。

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 16:15

请教楼主一个问题,和超滤有关的,因为自己的数学知识生疏了,特张贴求解!望不吝赐教!
我有1000ml 蛋白溶液要超滤换液,去除其中的3M 尿素,换成PBS。超滤膜截留分子量是10kD,泵的流速是30ml/min,滤出的速度是10 ml/min。装样品的瓶子保持密封状态,滤出多少体积同时就自动的补充多少体积的PBS,即样品的体积保持1000ml。问题是我要多少体积的PBS才能很完全地置换出样品中的尿素(容许残留20000分之一)?
我知道这需要用到微积分方程才可以解答,可是我把所学的一点高数早就全还给老师了。望楼主能告诉我答案和方法!如别的朋友知道也请指点!

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大体上,可以有7个体积达到99,9%去除,也即1/1000保留,要是达到1/20000,那体积是了不得的大啊
作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 16:15

各位有没有用羟基磷灰石作为填料纯化蛋白质的?纯化的示哪种蛋白质?

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个人觉得,它作为填料纯化蛋白的文献很多,但是真正的应用于生产的比较罕见。刘国诠先生在《生物大分子分离与纯化》中有过介绍,引用文献也很多。

作者: is2011    时间: 2013-4-25 16:15

请教楼主一个问题,和超滤有关的,因为自己的数学知识生疏了,特张贴求解!望不吝赐教!
我有1000ml 蛋白溶液要超滤换液,去除其中的3M 尿素,换成PBS。超滤膜截留分子量是10kD,泵的流速是30ml/min,滤出的速度是10 ml/min。装样品的瓶子保持密封状态,滤出多少体积同时就自动的补充多少体积的PBS,即样品的体积保持1000ml。问题是我要多少体积的PBS才能很完全地置换出样品中的尿素(容许残留20000分之一)?
我知道这需要用到微积分方程才可以解答,可是我把所学的一点高数早就全还给老师了。望楼主能告诉我答案和方法!如别的朋友知道也请指点!

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我也觉得1/20000需要的体积太大了
作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 16:16

要得到3300D的蛋白穿出,则需要至少为10-15kD的膜,而要想截流20000D的蛋白,则膜最大不应该超过5kD的膜。所以,如果要达到在3300 D的样品中没有一丁点的20000 D的蛋白,那就必须以牺牲3300D的蛋白收率为代价,可以选择10kD的膜,降低超滤的透过压,让3300D的蛋白在低压下透过膜。至于厂家,板块式膜堆厂家有Millipore公司和沙多利斯等,中空纤维式的有AmershamPharmacia公司等。特别是AmershamPharma公司,最近新设计了一套超滤科研系统,充分揉和了AKTA设备的功能,有利于进行超滤条件的选择和优化。
我建议你可以试一试其他的层析技术,例如可以先通过离子交换层析进行浓缩和初步纯化,再进行分子筛层析,即可很容易的达到分离目的。

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您的回复正是我想说的,但是我觉得有以下值得商量的地方:
1,“...截流20000D的蛋白,则膜最大不应该超过5kD的膜..."
我在实际工作中遇到的有与您不完全与您说的一致的例子.比如对于形状比较规则的球形蛋白就可以.建议这样的情况最好用实验结果更能说明问题.
2,"...可以选择10kD的膜,降低超滤的透过压,让3300D的蛋白在低压下透过膜..."
TMP是过膜压力,它是取进出口压力之和的一半,减去透过口压力.是过膜压力的平均值,也就是您说的超滤的透过压,它只是近似描述TFF特征的一个参数,实际的情况是,无论您怎么降低,在进口的地方,有最大的TMP, 而在出口处,有最小的TMP,所以您很难降低压力到用10K的膜保证20K的蛋白绝对不透过. 而降低压力意味着牺牲效率,您需要很大的膜面积或者很长的时间去超滤. 在孔径与TMP这对矛盾中,膜的空径的影响可能更大.
3,"...可以先通过离子交换层析进行浓缩和初步纯化.."
要是20KD和3300Da等电点差异很大, 而且小肽容易吸附的话,那用IEC,可能一步就能够达到目的.层析应该是精细纯化,成本也高很多. 我到更觉得用分子筛即Size Exclusion更能够的达到目的.不过需要注意的是,这样的花费可能要大很多.
最简便的办法是,要是小肽耐热,用加热去除大蛋白,可能是最简单最经济的办法.

作者: 阿司匹林    时间: 2013-4-25 16:16


我想请问一下,我的20kd的目的蛋白,要摸最佳的IPTG浓度,诱导时间&诱导温度,想跑page电泳后来根据浓度分析,不知道行不行,行的话应该用什么软件分析条带的浓度呢?
万分的感谢!

作者: is2011    时间: 2013-4-25 16:17



QUOTE:
原帖由 阿司匹林 于 2013-4-25 16:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我想请问一下,我的20kd的目的蛋白,要摸最佳的IPTG浓度,诱导时间&诱导温度,想跑page电泳后来根据浓度分析,不知道行不行,行的话应该用什么软件分析条带的浓度呢?
万分的感谢! ...

膜分离技术以外的问题请到外面发贴,谢谢
作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 16:18



QUOTE:
原帖由 阿司匹林 于 2013-4-25 16:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我想请问一下,我的20kd的目的蛋白,要摸最佳的IPTG浓度,诱导时间&诱导温度,想跑page电泳后来根据浓度分析,不知道行不行,行的话应该用什么软件分析条带的浓度呢?
万分的感谢! ...


抱歉,我确实不能够回答您的问题。
您可以将之提交到分子生物学哪个版块或者上游版块去讨论。
这里讨论的是下游技术。

作者: DONT    时间: 2013-4-25 16:19

版主和各位蛋白质技术的高手,我是一位蛋白质研究的新手,碰到了一个难题,想向各位请教,我的目标蛋白是19kD,是胞内表达的干扰素alpha-2b,以前的时候都是用ELISA进行活性检测的,只是用Lowry法测总蛋白,但是现在发现,一些变异的干扰素,包括氧化的产物等,竟然仍有活性,所以仅仅依靠ELISA法来监控含量已经不够,所以我想开发一个RP-HPLC的方法,想直接检测菌体中的干扰素含量,但是不知道那么杂的样品进样,分离度怎么样,所以想请教一下各位,我是想,先试一下,如果不行,再想别的办法,还有不知道超滤对样品的要求高不高?就是说菌体的提取物能不能直接用超滤来除去大部分的杂蛋白?而对我的目标蛋白的量不会造成损失呢。
还望各位大侠赐教。

作者: is2011    时间: 2013-4-25 16:21


ELisa来说并不是一个测活的方法,这一点要明确。
确定有些变体有没有活性,应进行相应的生物活性检测。与天然状态不同的变体不仅要证明有活性,还有证明对人体没有副作用。

RPC可能会与一部分的失活有关联,但也不能完全说明问题。你可以查一下罗永章的文章,可能会有所启发,但应该还是没有一个普遍的方法,因蛋白而异的。

样品太杂作RPC效果肯定不好,要是有血清培养就更复杂了。
以上是个人意见。
超滤的问题就等wym前辈来回答吧

作者: zhenxin    时间: 2013-4-25 16:22

搂主提到的ELISA测定活性指的是体外活性,我的一种蛋白由细胞培养得到的,在纯化前要对培养液进行体外活性测定,这样可以计算最后纯化后的收率,而且Lowry法测定蛋白含量的干扰因素太多,一般得到纯品后才用该方法测定含量!
再有楼主提到用RP-HPLC测定,虽然正如版主所说可能会使样品失活,看你的目的了,如果只监测含量变化,还是可行的,用一纯品作为标准,外标法,但是非常值得注意的是,你的样品成分很复杂,在进样前务必要过滤,尽管这样对你的柱子的寿命还是有影响,最好可以把一些大分子,核酸之类去掉或在进样之前,有一定的预处理对你的样品。

作者: is2011    时间: 2013-4-25 16:23


Elisa只能说明一定的抗原决定簇,不能说明是否有活性。失去活性必须的三维结构的失活蛋白,仍有可能被Elisa检测到。
做纯化每一步取样分析计算收率是可以的,但是不能保证Elisa测出来的一定都是有活性的。

ELisa assay不等于活性检测。

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 16:23

版主和各位蛋白质技术的高手,我是一位蛋白质研究的新手,碰到了一个难题,想向各位请教,我的目标蛋白是19kD,是胞内表达的干扰素alpha-2b,以前的时候都是用ELISA进行活性检测的,只是用Lowry法测总蛋白,但是现在发现,一些变异的干扰素,包括氧化的产物等,竟然仍有活性,所以仅仅依靠ELISA法来监控含量已经不够,所以我想开发一个RP-HPLC的方法,想直接检测菌体中的干扰素含量,但是不知道那么杂的样品进样,分离度怎么样,所以想请教一下各位,我是想,先试一下,如果不行,再想别的办法,还有不知道超滤对样品的要求高不高?就是说菌体的提取物能不能直接用超滤来除去大部分的杂蛋白?而对我的目标蛋白的量不会造成损失呢。
还望各位大侠赐教。

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我的理解是,您要寻找测定有活性的a-2b IFN的含量的方法?
目标蛋白是胞内表达的蛋白,很可能是包含体?
你的问题是:
1,是否可以用RP-HPLC定量?
2, 如果用,样品如何处理?
我的看法是:
A,如果您用RP-HPLC法,测定含量的方法属于化学方法,也就是通过面积积分,外标法或者内标法定量。但是对于有活性的蛋白,生物学测定才是唯一最信服的测定方法。当然,干扰素的生物活性测定方法很复杂。因为蛋白有比活性的问题,所以峰面积不能绝对说明问题。当然您把它作为比较方法之一也是可以考虑的。
B,如果用HPLC, 那么您的蛋白会因为氧化或者其他结构的变化会导致极性的差异,在进行分离时候会与目标峰分开,您首先需要定性确认峰 的归属,然后再定量。在用RP-HPLC时候,因为使用有机溶剂做流动相,对于脆弱的蛋白说来,环境比较恶劣,所以小心操作为妙!避免蛋白迅速变性堵塞柱子。而且样品需要好好处理。有机溶剂的浓度慎重选择,不能太高,梯度的化,不能太快!
C,样品处理:如果是包含体,则需要溶解后切向流去除小分子溶解剂兼浓缩,建议选择3K或者5K膜包更换缓冲液。然后用大分子膜包除去大分子杂蛋白,建议用100K膜包。
如果不是包含体,则溶解复性的步骤就省了。
D, 建议稍微进行处理,比如过滤去除杂质,再超滤,以保护膜包的寿命。

作者: 阿司匹林    时间: 2013-4-25 16:24

我想解释一下,我的蛋白因为非大肠杆菌表达,无包涵体,所以相对来说处理简单一点,只是里面的杂蛋白可能比较多。而且欧洲药典对干扰素相关蛋白检测是用的RP-HPLC法(可以将干扰素降解产物与干扰素主峰有效分离),而且纯度检测也是用RP-HPLC与SDA-PAGE共同来说明,所以这个方法对干扰素纯品的正确三维结构是可以专一的定性的,我现在就是想用同样的方法来进行纯化中控和菌体质量检测,所以样品处理最好是能够简单方便,并且去除杂蛋白效果又比较好的一种方法。
另外,我说的ELISA作为免疫活性检测,是因为细胞培养法(生物活性检测)不但误差大,而且周期长,所以仅用ELISA法,但现在发现ELISA法不能有效监控菌体和中控产品的质量。
所以RP-HPLC法应该是检测正确三维结构的干扰素和其降解产物量的最有前途的方法,因为现有的活性测定方法无法做到这一点。
但只是样品处理可能比较难。
我现在只能边试边看了,因为还没有想到一个我上边提到的那么一个好办法

作者: 阿司匹林    时间: 2013-4-25 16:24


还有一个有关超滤的问题要请教各位:我买了安捷伦的300A的柱子要做上边的分析定量,昨天安捷伦的产品工程师告诉我说,对于比较杂的样品,分子量大于100KD就可能堵塞300A的柱子,就是说对于分子量小于100KD的蛋白质通过改变流动相梯度都能得到有效分离。所以我考虑将我的样品粗提物通过超滤去除其中的大分子蛋白质,我的目标蛋白是19KD,想请问各位大侠我该选择多大孔径的超滤膜,可以将其中的大分子蛋白尽可能去除,而对我的目标蛋白没有什么损失?如果选用Millipore的超滤膜的话。

作者: is2011    时间: 2013-4-25 16:24


我觉得最简单的方法就是用预柱,100kDa以下的蛋白也不一定不沉淀在柱里。

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 16:25

我想解释一下,我的蛋白因为非大肠杆菌表达,无包涵体,所以相对来说处理简单一点,只是里面的杂蛋白可能比较多。而且欧洲药典对干扰素相关蛋白检测是用的RP-HPLC法(可以将干扰素降解产物与干扰素主峰有效分离),而且纯度检测也是用RP-HPLC与SDA-PAGE共同来说明,所以这个方法对干扰素纯品的正确三维结构是可以专一的定性的,我现在就是想用同样的方法来进行纯化中控和菌体质量检测,所以样品处理最好是能够简单方便,并且去除杂蛋白效果又比较好的一种方法。
另外,我说的ELISA作为免疫活性检测,是因为细胞培养法(生物活性检测)不但误差大,而且周期长,所以仅用ELISA法,但现在发现ELISA法不能有效监控菌体和中控产品的质量。
所以RP-HPLC法应该是检测正确三维结构的干扰素和其降解产物量的最有前途的方法,因为现有的活性测定方法无法做到这一点。
但只是样品处理可能比较难。
我现在只能边试边看了,因为还没有想到一个我上边提到的那么一个好办法

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基本理解您的目的。
同意您的方法。但是操作要十分小心!流动相的有机溶剂浓度要十分注意!在做蛋白的时候,不小心,很容易毁坏柱子。
有一点我觉得您的提法有待商榷。RP-HPLC检测蛋白的三维结构?我觉得该说法不合适。即便失活性的蛋白,和没有失去活性的蛋白,您用RP-HPLC是很难分开的。而蛋白质的三维结构更是不可能检测的。只能说确认三维结构的构象,那也不是HPLC所能够的。HPLC的最大特点和功能就是分离!

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 16:25

还有一个有关超滤的问题要请教各位:我买了安捷伦的300A的柱子要做上边的分析定量,昨天安捷伦的产品工程师告诉我说,对于比较杂的样品,分子量大于100KD就可能堵塞300A的柱子,就是说对于分子量小于100KD的蛋白质通过改变流动相梯度都能得到有效分离。所以我考虑将我的样品粗提物通过超滤去除其中的大分子蛋白质,我的目标蛋白是19KD,想请问各位大侠我该选择多大孔径的超滤膜,可以将其中的大分子蛋白尽可能去除,而对我的目标蛋白没有什么损失?如果选用Millipore的超滤膜的话。

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我只能告诉您:如果用PALL的膜,100K是可以的,19K应该有比较好的回收,甚至达到99,9%,或者几乎100%,而大分子蛋白透过的可能性很小。
至于Millipore的膜包,我没有发言权。不过,有一点可以肯定,两者材料不一样,分子截留大小不一样,透过效率不一样,至于它是多少,抱歉,我不能胡言乱语。
还有,我觉得堵塞柱子更可怕的是RP-HPLC用到的有机溶剂,这个要比蛋白本身对柱子的影响好的多。而且本来TFF之后的样品,大蛋白含量是非常低的,基本没有。

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 16:26

我觉得最简单的方法就是用预柱,100kDa以下的蛋白也不一定不沉淀在柱里。

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预柱也要小心。蛋白是娇嫩的,脆弱的,也是神奇的!很重要的一点是寻找合适的流动相浓度。个人觉得要是用剃度的话,变化一定要缓慢,连续剃度优于不连续剃度,否则柱子容易受伤。

作者: 阿司匹林    时间: 2013-4-25 16:26

预柱我是买了的,但安捷伦工程师说,如果有100K以上的大蛋白的话,还是不太好的,所以想要用超滤除一下大的蛋白。


作者: 阿司匹林    时间: 2013-4-25 16:27

你说PALL的膜可以,是装在超滤器里的那种膜呢?还是用离心超滤管也可以呢?
还有我说要用HPLC测三维结构,这个说法确实不准确,其实我的意思是,有着正确三维结构的干扰素蛋白与其降解产物或者异构体由于疏水性的不同,而可以在HPLC上得到分离,我们可以保证HPLC检测到的干扰素主峰是有正确的三维结构的。

作者: 阿司匹林    时间: 2013-4-25 16:28

现在我对超滤充满了期望,但是昨天问了一下,听说装在超滤器上的那种超滤膜很贵,所以想买个离心超滤管算了,不知到能不能解决问题呢?
作者: 阿司匹林    时间: 2013-4-25 16:28

我的师兄刚刚又告诉我说那种离心超滤管只能用于浓缩 脱盐 对于分离它很差 不好用。
所以现在不知道还有什么又简单、方便,又比较便宜的方法可以处理我做液相之前的样品了

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 16:29

是用离心管还是稍大些的超滤器,取决于您的量和目的。对于很小量,比如几毫升,那只能用离心管,适当操作也可以达到您的目的。而要是用大的膜,面积50cm2,需要的量大约10~几十毫升。该膜价格大约1600~1800RMB。
别着急,有问题,我们可以交流。好事多磨!

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 16:29

请问前辈,能用SDS-PAGE检测分子量为3500Da的蛋白吗?如果可以的话,应该如何配胶呢?我想对发酵液中的NISIN检测和定量,这么做能作到吗?期待回复!

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可以检测的,用Tricine胶就可以了,专门用来跑小肽的。
我的电脑出问题了,现在用的是别人的电脑,所以不能把配方给你。
自己找找看吧,配方很多地方都有的

作者: is2011    时间: 2013-4-25 16:30

楼上说的对,我上文所说的就是用Tricine作为配胶成分。
需要提醒的是,我文中描述的问题仍旧存在。就是小分子多肽的扩散问题。

作者: is2011    时间: 2013-4-25 16:30


请教前辈,
一般的折叠膜滤器,亲水纤维素过滤蛋白溶液(浓度较高,应该吸附损失不会很大)

一般的收率应该在多少?

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 16:31

您的分析很有道理。
这就需要我们做一些实验来考虑用什么样的膜,以及多大的膜来做。
高浓度蛋白过滤时候的吸附往往要比低浓度蛋白过滤时候的吸附要高。不是说到了饱和就不在吸附了。尤其在堵塞的情况下,就更没法估计损失了!所以过滤时候的膜选择,包括面积,材质,过滤时候压力差,都需要考虑。
另外纤维素膜对蛋白的吸附,可能比较大。最好用改性很好的PVDF,一定会好。

另外,建议过滤前用您的缓冲体系润湿您的过滤膜。

作者: is2011    时间: 2013-4-25 16:31


Pall 有这方面的产品么?
因为我的体积不是很大,希望滤芯的死体积不要太大。
PVDF是不错,想知道价格,还有,能不能灭菌重复使用。

作者: tangxin_80    时间: 2013-4-25 16:32

楼主你好!
适才看了二位的高见,很是受益匪浅,我现在刚开始做纯化,想用膜分离技术,但是我们实验室只有一套溶剂过滤器,用的是0.45和0.22的膜,是用来过滤上HPLC的流动相的,我在想有没有一种可以和溶剂过滤器兼容的膜可以用来分离蛋白。我知道这个想法可能很幼稚,而且两位提到的膜肯定需要特殊的装置,但是我是刚接触这一方面,所以希望楼主不要见笑!如果能有这方面的资料让我看看,那更是感激不尽了!

作者: kulee    时间: 2013-4-25 16:32


超滤现在的发展很快,既可以脱盐,可以浓缩,可以置换缓冲体系,也可以纯化。

但是孔径和膜的选择很重要,要高精度的截流,要绝对的低吸附

最近在做超滤,用的是 millipore的超滤系统,想问个问题
pes和纤维素的膜,物理强度,哪个好????
看过millipore的介绍,化学稳定性是差不多的。

另外说一下,去内毒素的方法,除了活性炭,膜过滤,还有亲和层析的方法,效果也不错的。

说到扩张床amersham streamline,没有宣传的那么好,实际使用起来,效果并不理想,主要是回收率和清洗重复性,尤其是对于样品组分复杂的。

至于羟基磷灰石,现在是Bio-rad公司主推的产品,它其实是HIC和IEC的结合,可以用来纯化很多东西

作者: is2011    时间: 2013-4-25 16:33


PES应该比纤维素的化学稳定性好吧
物理强度应该和膜的形式有关吧,不同的厂家的产品可能不完全一样,888前辈能否详细介绍一下?
羟基磷灰石作用机理比较复杂。

作者: is2011    时间: 2013-4-25 16:33

楼主你好!
适才看了二位的高见,很是受益匪浅,我现在刚开始做纯化,想用膜分离技术,但是我们实验室只有一套溶剂过滤器,用的是0.45和0.22的膜,是用来过滤上HPLC的流动相的,我在想有没有一种可以和溶剂过滤器兼容的膜可以用来分离蛋白。我知道这个想法可能很幼稚,而且两位提到的膜肯定需要特殊的装置,但是我是刚接触这一方面,所以希望楼主不要见笑!如果能有这方面的资料让我看看,那更是感激不尽了!

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你说的溶剂过滤器是抽真空的吧
那只能最大提供 1atm的压差,这样的压力太小,不适于超滤。
即使压差够大,没办法切向流的话,可能效率不会高,很容易形成凝胶层。
好像有那种正压的,是不是要加震动装置才会有改善阿
888君来详细说明一下吧,学习中...

作者: moonlight45    时间: 2013-4-25 16:34


因为我处理的单个样品量不多,但是不同样品的批次多,所以要求这个膜进行清洗防止交叉污染后,能重复使用,所以需要这个膜物理化学稳定性好一点,简单的说,就是不大容易破

作者: yonger    时间: 2013-4-25 16:35


谢谢楼主赐教!我想如果真的不行的话,那我就只有上sephadex G-50 or 100了,我想再问一下楼主,现在分离蛋白除了那些常规的思路:离子交换柱,G-50等,还有一些什么新的分离思路or技术啊!请问能不能赐教?

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 16:35

楼主你好!
适才看了二位的高见,很是受益匪浅,我现在刚开始做纯化,想用膜分离技术,但是我们实验室只有一套溶剂过滤器,用的是0.45和0.22的膜,是用来过滤上HPLC的流动相的,我在想有没有一种可以和溶剂过滤器兼容的膜可以用来分离蛋白。我知道这个想法可能很幼稚,而且两位提到的膜肯定需要特殊的装置,但是我是刚接触这一方面,所以希望楼主不要见笑!如果能有这方面的资料让我看看,那更是感激不尽了!

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谢谢您的问题。
首先说明一下,在这里开辟栏目,就是希望大家在这里交流,互相受益,所以请不必拘束,我和这里的朋友诚挚欢迎您来这里做客,任何问题,不管因个人的水平有限而能否给予您满意的答复,我都会尽力的。
下游纯化是很具挑战性也因此是很有意思的一个工作。我喜欢。
您的流动相用该法处理,当然十分正确。至少保证您的填料在流动相洗脱过程中受到的污染减少,增加寿命,减少成本。而且纯化的目标蛋白受到杂质的影响也降低。
您这里用的所谓溶剂过滤器,考虑可能是过滤有机溶剂的膜。在HPLC上用于反相HPLC,过滤甲醇,乙氰的是不是?除此而外,也有过滤水性溶剂的膜,用于处理亲水性流动相的。
用膜来分离蛋白,当然是很好的方法,就是我在前文讨论过的切向流,简称TFF,英文Tangential Flow Filtration。原理是利用膜的孔径大小切分分子量差异比较大的蛋白,同时该方法也可以用于蛋白浓缩,脱盐,更换缓冲体系。实际产品除了膜包,还有中空纤维,震动膜,陶瓷膜等。在全球制药的大规模产业化实现起了决定性的作用。
关于该方面的知识,如果需要,可以私下交流探讨。
再次欢迎!

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 16:36

超滤现在的发展很快,既可以脱盐,可以浓缩,可以置换缓冲体系,也可以纯化。
非常正确!
但是孔径和膜的选择很重要,要高精度的截流,要绝对的低吸附
非常正确!但是不容易,需要实际实验优化,历史的经验告诉我,应该有办法。但是不见得是吸附,甚至“绝对”——不知道什么意思?——是不可能的。
最近在做超滤,用的是 millipore的超滤系统,想问个问题
pes和纤维素的膜,物理强度,哪个好????
对于特定公司的产品,不方便妄言。
结合您下文的说明,您的意思是考虑清洗是否导致膜的损坏,是吗?我的看法是,一般说来,首先要考虑膜的抗污染能力,如果容易污染的话,就不好清洗,再者,膜的孔径大小与标示分子量的差异十分重要。一般纤维素膜可能易于吸附蛋白,导致清洗不好。还有,可能是技术层面的因素,也许你从那里只可以得到1K的纤维素膜,但是您不能得到其它材质的膜,所以仍旧有缺憾。在这个时候,您需要考虑寻找新的供应商。
还有,膜做成的产品结构也很重要,比如膜包一般不会坏,更不会因为清洗导致损坏,除非您想看他是否比技术还厉害;而如果厂商简化工艺,作成卷式膜,可能就有问题,不但不好清洗,而且容易损坏。
所以问题的角度有很多,看您怎么思考。
看过millipore的介绍,化学稳定性是差不多的。

另外说一下,去内毒素的方法,除了活性炭,膜过滤,还有亲和层析的方法,效果也不错的。
当然,所有的方法都有应用。而且这些方法互补。
说到扩张床amersham streamline,没有宣传的那么好,实际使用起来,效果并不理想,主要是回收率和清洗重复性,尤其是对于样品组分复杂的。
仁者见仁,智者见智。可能不适合所有的产品,但是成功的应用应该是有的。

至于羟基磷灰石,现在是Bio-rad公司主推的产品,它其实是HIC和IEC的结合,可以用来纯化很多东西
HIC和IEC的结合?是否可以详细说明一下?先谢过!

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 16:36

因为我处理的单个样品量不多,但是不同样品的批次多,所以要求这个膜进行清洗防止交叉污染后,能重复使用,所以需要这个膜物理化学稳定性好一点,简单的说,就是不大容易破

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您大可不必担心。用碱清洗,0,1~0,5M;温度不超过50度,必要时加次氯酸钠,放心吧!——您说的是上文说的超滤膜吧?当然,卷式膜我心里没底。
作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 16:36

谢谢楼主赐教!我想如果真的不行的话,那我就只有上sephadex G-50 or 100了,我想再问一下楼主,现在分离蛋白除了那些常规的思路:离子交换柱,G-50等,还有一些什么新的分离思路or技术啊!请问能不能赐教?

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您可以用切向流!
当然层析没有问题,可能价格高一些,操作时间长一些,洗脱出来的体积很大。
整体生产过程:
1,澄清;
2,切向流超滤;——可反复多次,达到浓缩,脱盐,分级分离等
3,层析——多重组合,当然越少步骤越好!降低成本!获得半成品;
4,配制剂型;
5,除菌过滤,罐装,包装。
前3步是纯化方法和思路。有时候需要反复交叉操作。比如上离子交换层析柱前的脱盐就需要用超滤的方法,好极!

作者: duoduo    时间: 2013-4-25 16:37


呵呵,多谢楼主的回复

我再说点
1,应该说象PVDF的基质是最低吸附的,当然我的“绝对”也许是过分了一点,不过我只不过是想表达这种程度,就象millipore自己的说明书上说他的0.22针头式滤器
2,millipore的超滤系统,其实主要是膜,分为纤维素和聚醚枫2种,化学稳定性似乎差不多,对于某几种特定的化学试剂可能各有千秋,但总体上差不多,所以我说他们的化学稳定性差不多,呵呵

为什么楼主不能对PES和纤维素两种膜的物理机械强度,给我一个参考呢,因为象这样的数据只有楼主这样的专家通过长期的使用经验才有可信度,甚至millipore上海办事处的人,也不能给个明确的说法,他们只是说,放心使用,呵呵。我不是担心它的清洗性(因为我本来的组分就比较干净),我是担心因为重复使用,在操作上,会经常去触碰,所以想问问这个物理强度差异

3羟基磷灰石填料,就是Ca10(PO4)(OH)2,所以填料上的基团一看就明了。说到机理,其实现在还是在不断发展中的,一些细微的地方也不是太明确,只是原理上讲分为:
ca主要对于酸性蛋白,带COO-的吸附;PO4主要对与碱性蛋白为主,主要是吸附NH2,同时存在疏水和离子交换。

可以纯化的样品也比较多,蛋白质,DNA,病毒,内毒素等

作者: xingyi08    时间: 2013-4-25 16:38


两位真是高人!我想问一下楼主如果要使用切向流的话,我需要购买什么仪器,大概得多少money?谢谢!!!

作者: remenb    时间: 2013-4-25 16:39


楼主你好,我现在准备组建一条生产线,主要用于发酵液的除菌和浓缩,想用切向滤,用陶瓷膜过滤是否现实?过滤除去发酵液中的菌体会不会很快造成膜很快堵塞?我们一周生产量在40T左右,大约需用多少平米的膜?还有,在浓缩过程中,蛋白质损失有多少?我的蛋白质75KD,有没有人做过相关的数据?过滤和浓缩是否需要两套设备,还是在一套设备内就可以搞定?

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 16:39

两位真是高人!我想问一下楼主如果要使用切向流的话,我需要购买什么仪器,大概得多少money?谢谢!!!

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根据您的处理量选择相应的产品。
如果是实验室规模,若干毫升至几十升料液可选择0,1~0,5M2的超滤器,价格几万块人民币。
要是中试规模,可选择0,5~2,5M2的超滤器,价格一万美金左右。
不过要是您想做什么的话,最好和专业人员交流一下,包括选择型号及规格。
您也可以和我联系。

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 16:41

楼主你好,我现在准备组建一条生产线,主要用于发酵液的除菌和浓缩,想用切向滤,用陶瓷膜过滤是否现实?过滤除去发酵液中的菌体会不会很快造成膜很快堵塞?我们一周生产量在40T左右,大约需用多少平米的膜?还有,在浓缩过程中,蛋白质损失有多少?我的蛋白质75KD,有没有人做过相关的数据?过滤和浓缩是否需要两套设备,还是在一套设备内就可以搞定?

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您所说的正是我最感兴趣的。是否在北京?方便的话,您可以和我联系,我们交流一下相关的问题,会给您一个满意的方法。
对于发酵液的澄清,如果料液比较粘稠的话,选择陶瓷膜当然是很好的选择,同时也可以考虑震动膜。当然要看您的发酵液的具体情况。还有就是您的发酵液是什么类型,是原料药?抗生素?最好能够具体一些,那么回答您的问题要好一些。
方便的话,请与我联系,或者PM我。
过滤和浓缩当然是2套设备,问题是您是否一定需要过滤还要浓缩?需要具体讨论。

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 16:42

呵呵,多谢楼主的回复

我再说点
1,应该说象PVDF的基质是最低吸附的,当然我的“绝对”也许是过分了一点,不过我只不过是想表达这种程度,就象millipore自己的说明书上说他的0.22针头式滤器
2,millipore的超滤系统,其实主要是膜,分为纤维素和聚醚枫2种,化学稳定性似乎差不多,对于某几种特定的化学试剂可能各有千秋,但总体上差不多,所以我说他们的化学稳定性差不多,呵呵

为什么楼主不能对PES和纤维素两种膜的物理机械强度,给我一个参考呢,因为象这样的数据只有楼主这样的专家通过长期的使用经验才有可信度,甚至millipore上海办事处的人,也不能给个明确的说法,他们只是说,放心使用,呵呵。我不是担心它的清洗性(因为我本来的组分就比较干净),我是担心因为重复使用,在操作上,会经常去触碰,所以想问问这个物理强度差异

3羟基磷灰石填料,就是Ca10(PO4)(OH)2,所以填料上的基团一看就明了。说到机理,其实现在还是在不断发展中的,一些细微的地方也不是太明确,只是原理上讲分为:
ca主要对于酸性蛋白,带COO-的吸附;PO4主要对与碱性蛋白为主,主要是吸附NH2,同时存在疏水和离子交换。

可以纯化的样品也比较多,蛋白质,DNA,病毒,内毒素等

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由于晶面的存在,有离子交换的作用,可以和特定pH值下的蛋白吸附,然后进行色谱分离,书上是这样说的。至于疏水相互作用,HIC, 我还是不能够理解。
在HIC和IEC之间是有很多互相矛盾彼此不能兼容的地方,比如,IEC用的洗脱方式是盐,尤其NaCl的浓度剃度达到洗脱的目的,或者用改变pH值的办法。而疏水相互作用,HIC,是利用蛋白在高浓度吸附,低浓度解析的原理,所使用的盐经常是硫酸铵,是浓度从高到低的过程,不知道如果用磷灰石,如果用您所说的综合HIC和IEC,那么我又该如何理解?
请赐教,谢谢!

作者: u234    时间: 2013-4-25 16:42


呵呵,实际上为什么说羟基磷灰石现在还在发展和成熟中,就是因为他的一些机理还是在探索中的,尚不是很很明了。很多适用的领域正在被探索

其实IEC和HIC是不矛盾的,因为基团的吸附能力不一样,可以找到各自的洗脱盐离子浓度的,因为羟基磷灰石的特殊基团的吸附特性有些理论上和实际上是有很大差别的,就比如说DNA的吸附

HIC好象是应该增加溶液的盐离子浓度,突出体系里的疏水性,才吸附蛋白的,而且不同的疏水集团,吸附能力也是不一样的,有些吸附性强的集团和疏水蛋白,不一定用纯水就能洗下来,还要加些甘油和土温什么的。

这些你应该问你的师兄chromatography才对呀,呵呵,我也是只知道一点皮毛,赐教什么的根本谈不上的,呵呵

互相学习,互相进步

PS:
2,millipore的超滤系统,其实主要是膜,分为纤维素和聚醚枫2种,化学稳定性似乎差不多,对于某几种特定的化学试剂可能各有千秋,但总体上差不多,所以我说他们的化学稳定性差不多,呵呵

为什么楼主不能对PES和纤维素两种膜的物理机械强度,给我一个参考呢,因为象这样的数据只有楼主这样的专家通过长期的使用经验才有可信度,甚至millipore上海办事处的人,也不能给个明确的说法,他们只是说,放心使用,呵呵。我不是担心它的清洗性(因为我本来的组分就比较干净),我是担心因为重复使用,在操作上,会经常去触碰,所以想问问这个物理强度差异

作者: vera+    时间: 2013-4-25 16:43

我现在是四川,是做饲用酶制剂,我们新鲜的发酵液不粘稠,工艺主要要求没有固形物存在.后期一定要浓缩.震动膜有些什么特点?现在正处于收集陶瓷膜相关的资料,从理论到应用方面,还有它有些什么不能解决的问题!
作者: is2011    时间: 2013-4-25 16:43


羟基磷灰石分离蛋白的机理并不是百分之百清楚。
一般认为,酸性蛋白和Ca++发生螯合作用,这比一般的离子交换静电作用要强很多倍;碱性蛋白带正电,和PO4-3作用,这应该主要是离子交换作用,这种吸附对于离子强度是很敏感的。
但是前面的作用占主导的时候,甚至有时1.5M NaCl也洗不下来,必须用高浓度的磷酸钠才能洗脱。
此外还存在有排斥作用,是一个综合的作用,此外还可能有别的机理。

印象中有几篇综述,上述机理也不能完全解释一些现象,有的时候只能根据经验尝试,不同的蛋白也是不一样的。

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 16:46

我现在是四川,是做饲用酶制剂,我们新鲜的发酵液不粘稠,工艺主要要求没有固形物存在.后期一定要浓缩.震动膜有些什么特点?现在正处于收集陶瓷膜相关的资料,从理论到应用方面,还有它有些什么不能解决的问题!

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根据您说的,加上我对工艺的了解,您的情况我大体知道。下面是我的看法。
1, 您首先需要澄清。发酵液的澄清,有2种方法可以考虑:1),TFF切向流方法,即震动膜或者陶瓷膜;2),德国SEITZ的滤板或者压滤机。
2,澄清的料液的浓缩,根据您的蛋白分子量的大小,确定浓缩的膜的分子量。还有,膜面积的大小,需要您实验获得相关的参数决定面
积。
作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 16:46

呵呵,实际上为什么说羟基磷灰石现在还在发展和成熟中,就是因为他的一些机理还是在探索中的,尚不是很很明了。很多适用的领域正在被探索

其实IEC和HIC是不矛盾的,因为基团的吸附能力不一样,可以找到各自的洗脱盐离子浓度的,因为羟基磷灰石的特殊基团的吸附特性有些理论上和实际上是有很大差别的,就比如说DNA的吸附

HIC好象是应该增加溶液的盐离子浓度,突出体系里的疏水性,才吸附蛋白的,而且不同的疏水集团,吸附能力也是不一样的,有些吸附性强的集团和疏水蛋白,不一定用纯水就能洗下来,还要加些甘油和土温什么的。

这些你应该问你的师兄chromatography才对呀,呵呵,我也是只知道一点皮毛,赐教什么的根本谈不上的,呵呵
谢谢您的建议。
互相学习,互相进步

PS:
2,millipore的超滤系统,其实主要是膜,分为纤维素和聚醚枫2种,化学稳定性似乎差不多,对于某几种特定的化学试剂可能各有千秋,但总体上差不多,所以我说他们的化学稳定性差不多,呵呵

为什么楼主不能对PES和纤维素两种膜的物理机械强度,给我一个参考呢,因为象这样的数据只有楼主这样的专家通过长期的使用经验才有可信度,甚至millipore上海办事处的人,也不能给个明确的说法,他们只是说,放心使用,呵呵。我不是担心它的清洗性(因为我本来的组分就比较干净),我是担心因为重复使用,在操作上,会经常去触碰,所以想问问这个物理强度差异

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我不太了解该公司的膜,也没有用过,所以不能给您任何建议。在我的手头,只用改性的PES膜,和您不是同一供应商,所以无法给予意见,请谅解。
不过,我不明白的是,您怎么会经常“触碰”膜?一般,Membrane cassette装上去之后,很少拆的。即便重复使用也很少拆。

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 16:47


Ceramic membrane definition

Description:

The Membralox® ceramic membrane is an asymmetric membrane composed of a porous support and a filtering layer.

The support is the most porous part of the membrane. It is produced by sintering high purity alumina particles, which creates a highly permeable yet very strong macroporous structure.

The active layer is composed of ceramic particles (alumina, zircona or titania depending of the type of layer) with a perfectly defined size to create a filtering layer with a well defined pore size. It lines the inside surface of the filtration channels and is in direct contact with the fluid to be treated.
Of minute thickness, this active layer is usually bedded on an intermediate layer by high temperature sintering to produce an exceptionally robust structure. It lends the asymmetric membrane its selectivity and separation efficiency.

The liquid being filtered flows within each of the channels according to the principles of crossflow filtration and the filtrate passes through the active layer and then through the porous support between the channels before reaching the outside lateral surface, as shown in Figure 2.

As the Membralox® support material is exceptionally permeable, the pressure drop caused by the filtrate passing through the support can generally be considered negligible compared to the pressure drop of the filtrate passing through the active layer.

The liquid being filtered flows within each of the channels according to the principles of crossflow filtration and the filtrate passes through the active layer and then through the porous support between the channels before reaching the outside lateral surface, as shown in Figure 2.

As the Membralox® support material is exceptionally permeable, the pressure drop caused by the filtrate passing through the support can generally be considered negligible compared to the pressure drop of the filtrate passing through the active layer.
In the Membralox® line of ceramic membrane products, the high purity ceramic material of the support and the microfiltration active layer is alumina (> 99.97%). Active layers in the ultrafiltration pore size range are made of zirconia or titania respectively. All these materials are extremely resistant to a wide range of pH values, temperatures, pressures and chemicals. Nevertheless, some chemicals, e.g. phosphoric or hydrofluoric acids could react with ceramic membranes. In case of doubt, please contact our Scientific and Laboratory Services.

Special modifications obtained by coating each of the ceramic particles of the membrane structure can be offered. These modifications change the surface characteristics of the membrane, and may improve performance in specific applications. For example, the B modification provides increased resistance to phosphoric acid. Table 1 summarises the Membralox® range of ceramic membrane pore sizes.

Note: in the early 1980s , Membralox® ultrafiltration membranes with active layer made of gamma alumina were also available, but since this form of alumina has limited chemical resistance and lower permeability, it is now only available for some specific applications.

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 16:49


Characteristics of Membralox ceramic membranes

Description:
Membralox® ceramic membranes are available in various flow channel diameters, cross-sectional shapes and different end-sealing. They range from a simple tube (single distribution channel) often used for feasibility testing to an element with several channels forming a robust monolithic configuration.

Membralox® membranes have a hexagonal cross-section.

An alternate line of Membralox® products named "round shoulder", is hexagonal in cross-section, but the ends where the element seals into the filter housing are rounded to accommodate a special moulded gasket while the original hexagonal-end ceramics uses a machined one.
Standard Membralox® membranes are 1020 mm long, although the old range of 850 mm membranes is available on request.
Membralox® multi-channel membranes are available with flow channel diameters of 3, 4 or 6 mm, to match the specific needs of the target application (e.g. high/low viscosity, concentration of suspended matter, etc.)
The standard single tube for feasibility testing is 250 mm long and has a channel diameter of 7 mm.

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 16:52


Membralox ceramic membrane applications in biopharm

Description:
Biopharmaceuticals  

ü  Biomass recycling
ü  Clarification of fermentation broth for the production of antibiotics, enzymes, vitamins
ü  Purification of vitamin, enzyme solutions
ü  Production of pharmaceutical grade water
ü Perfume decolorization
ü  Separation in the liposome production process
ü Effluent treatment

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 16:53


Membralox ceramic membrane applications

Description:

Biopharmaceuticals  

ü  Biomass recycling
ü  Clarification of fermentation broth for the production of antibiotics, enzymes, vitamins
ü  Purification of vitamin, enzyme solutions
ü  Production of pharmaceutical grade water
ü Perfume decolorization
ü  Separation in the liposome production process
ü Effluent treatment

Chemicals

ü  Pigment, hydroxide and catalyst recovery
ü  Latex concentration
ü  Solvent recovery
ü  Oil/water separation
ü  Reverse osmosis pretreatment
ü  Refinery effluent treatment
ü  Hydrochloric acid clarification
ü  Effluent treatment

Electronics
  
ü  Particle removal from ultrapure gases
    ü  Ultrapure water polishing
    ü  CMP process sludge recovery
    ü  TMAH solutions recovery / clean up
    ü  Dicing saw cooling water clean up
    ü  Wafers

Food & Beverage

u  Sugars, sweeteners and derivatives

ü  Saccharification liquor clarification
ü  Clarification of fermentation broths in the production of aminoacids, organic acids, polyols
ü  Clarification in sugar cane refining

u  Drinking milk and cheese production

ü  Bacteria removal for extended shelf life (ESL) milk
ü  Bacteria removal from milk for cheese processing and baby food
ü  Concentration of fresh cheese
ü  Milk protein concentration
ü  Milk casein standardization
ü  Bacteria removal in whey processing
ü  Whey defatting
ü  Whey protein isolates (WPI) concentration

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 16:58

u  Beverages

ü  Beer recovery from yeast
ü  Clarification of spirits, ciders, fruit juices
ü  Bacteria and/or iron removal, drinking water production

u  Food ingredients and additives

ü  Clarification and/or concentration of gelatin, arabic gum
ü  Bacteria removal
ü  Protein concentration and fractionation
ü  By-product protein recovery
ü  Tank bottom recovery
ü  Used cooking oil recovery
ü  Fractionation, dewaxing and fat retention
ü  Clarification of vinegar

u  Waste streams

Miscellaneous

u  Pulp and paper - printing

ü  Pigment and ink recovery
ü  Dewaxing
ü  Effluent treatment

u  Textiles

ü  Printing dye and pigment recovery
ü  Effluent treatment

u  Nuclear industry

ü  Radioactive mud concentration
ü  Washing wastewater decontamination
ü  Effluent treatment

u  Mechanicals and metal treatment

ü  Degreasing baths recovery (oil/water separation)
ü  Cutting fluid recovery
ü  Clarification of precision part rinse water
ü  Vehicle wash-water recycling
ü  Bilge water treatment
ü  Effluent treatment (oil/water separation, COD reduction)

u  Others

ü  Oxygenation, gas diffusion
ü  Cryogenic fluid sterilization
ü  Solvent separation

Effluents

u  Removal of suspended solids

u  COD, BOD and suspended solids reduction by membrane bioreactor

u  Industrial laundry wash-water recycling

u  Oil/water separation

u  Brine recycling

u  Cleaning in place (CIP) chemicals clarification for recycling

u  Solvent recovery

u  Tank bottom recovery

u  Effluent treatment for recycling in zero-waste plant

u  Waste water
作者: remenb    时间: 2013-4-25 16:59

我不太了解该公司的膜,也没有用过,所以不能给您任何建议。在我的手头,只用改性的PES膜,和您不是同一供应商,所以无法给予意见,请谅解。
不过,我不明白的是,您怎么会经常“触碰”膜?一般,Membrane cassette装上去之后,很少拆的。即便重复使用也很少拆。

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呵呵,因为我上面说了,我得单个样品要浓缩得量 不多得,所以要经常从超滤杯上把膜取下来清洗,防止交叉污染
其实我个人也觉得,膜不取下来也可以和超滤杯一起清洗,但millipore得得销售代表说是取下来清洗

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 17:00

呵呵,因为我上面说了,我得单个样品要浓缩得量 不多得,所以要经常从超滤杯上把膜取下来清洗,防止交叉污染
其实我个人也觉得,膜不取下来也可以和超滤杯一起清洗,但millipore得得销售代表说是取下来清洗

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原来您用的是小膜片。
建议一个膜不要用于不同产品,您无法验证,或者您会花费很大的成本,大到比买新膜花费更高——去验证清洗,是否干净。
我一直以为您用的是Membrane cassette的膜。
再者,那种方法,不是很适合做切向流。与实际生产完全不一样。

作者: tianmei001    时间: 2013-4-25 17:01

就是直径是44。5mm的PES膜,我的样品组分是很干净的,是纯化后产品,主要是起一个浓缩的作用。

我想只要膜不堵,应该可以重复用的吧
它的切向流是通过膜上的一个磁力搅拌子形成的,而且我的样品浓度也不高

作者: 8princess8    时间: 2013-4-25 17:01

根据您说的,加上我对工艺的了解,您的情况我大体知道。下面是我的看法。
1, 您首先需要澄清。发酵液的澄清,有2种方法可以考虑:1),TFF切向流方法,即震动膜或者陶瓷膜;2),德国SEITZ的滤板或者压滤机。
2,澄清的料液的浓缩,根据您的蛋白分子量的大小,确定浓缩的膜的分子量。还有,膜面积的大小,需要您实验获得相关的参数决定面积。

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谢谢楼主的帮助,另外我还想知道在工厂化生产过程中,陶瓷膜使用主要会出现些什么问题?主要要考虑些什么问题?
作者: H2O    时间: 2013-4-25 17:01

我们利用超滤的方法从鸡的脏器里提取一种小肽,截留分子量为5kd,结果发现膜堵的厉害,基本上5000ml就堵的差不多了。清洗的话也不太好清洗。超滤柱是北京旭邦的,材料是聚砜膜,中空纤维柱,我们清洗方法是0.5m碱泡,0.5m酸泡,效果不好,请问有没有好的清洗方法或建议?谢谢
作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 17:02



QUOTE:
原帖由 H2O 于 2013-4-25 17:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我们利用超滤的方法从鸡的脏器里提取一种小肽,截留分子量为5kd,结果发现膜堵的厉害,基本上5000ml就堵的差不多了。清洗的话也不太好清洗。超滤柱是北京旭邦的,材料是聚砜膜,中空纤维柱,我们清洗方法是0.5m碱泡,0.5m酸泡,效果 ...

您使用的是多少切割分子量的膜?5KD?
我不太了解该厂家的膜,本身的性能可能也是一方面。要是堵死的话,清洗也不是很容易,你试试用0,1~0,5M的NaOH清洗,加热到50度清洗。条件是该膜能够耐受——你要和供应商确认。要是清洗不了,那只好更换了。
您要浓缩那么小分子量的膜,需要选择性能可靠的膜,用这样的膜,可能选择性很差,基本上不可能达到您的要求。建议更换好的膜。否则,我的经验,您基本上难以做好。

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 17:02



QUOTE:
原帖由 8princess8 于 2013-4-25 17:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
根据您说的,加上我对工艺的了解,您的情况我大体知道。下面是我的看法。
1, 您首先需要澄清。发酵液的澄清,有2种方法可以考虑:1),TFF切向流方法,即震动膜或者陶瓷膜;2),德国SEITZ的滤板或者压滤机。
2,澄清的料液的浓缩,根据您的蛋 ...

最大的缺点是使用的第一次投资比较高。但是运行成本很低,所以总体比较成本还是低。
还有就是它对蛋白有一点剪切力,不是所有的蛋白适合。而化工产品是比较好的,有机溶剂也是很棒!

作者: 04906    时间: 2013-4-25 17:03

我用的是截留5kd的膜。请问一般性能可靠的膜有哪些以及厂家信息?能否给提些建议??非常感谢!
作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 17:06

我用的是截留5kd的膜。请问一般性能可靠的膜有哪些以及厂家信息?能否给提些建议??非常感谢888wym无私的帮助!

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你可能要找世界上比较好的供应商生产的膜,但是价格比较贵。目前国内生产的膜还难以达到良好性能,基于价格的考虑,很多使用者还是使用廉价性能也西哪个应不好的膜。
我早先在读研究生的时候,条件也不是很好,尽管创造不少条件,还是差很多。现在回过头来一想,中国学者确实不简单,我们用很简单的设施完成很多工作,但是换个思维,如果我们的设施很好的话,可能我们的学者取得的成绩会大得多的多。
有好几个供应商,你不至于要我在这里为他们做广告吧?

作者: flower-201    时间: 2013-4-25 17:07


举贤不避亲嘛,呵呵

能够获取最好的产品,不多走弯路,少缴学费,对于大家都是好事,888兄多滤了,只要是实事求是,肯定不会有什么异议

作者: redbutterfly    时间: 2013-4-25 17:08


我想请问一下楼主,我们现在在做100L的酵母分泌发酵生产,目的蛋白存在于培养基上清,发酵结束后有菌体重100g/L.我想知道有没有这样的过滤系统在较短的时间内获得培养基上清,培养基到最后还可以稀释一倍,使电导达到纯化要求.

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 17:08


有这样的设备。但是价格相对较高。
用的是振动膜,VMF-PS10。面积1M2,自动化程度高。可以扩大到产业化规模,可装40M2或者100M2的膜。
由于用的是切向流技术,所以可以在分离后反复Diafiltration,提高回收率的同时,稀释上清液,有利于后面的进一步分离纯化。

作者: redbutterfly    时间: 2013-4-25 17:08

如果扩大到产业化规模,那大致的价位是多少呢,后续费用有如何?还有就是处理速度?
作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 17:09

如果扩大到产业化规模,那大致的价位是多少呢,后续费用有如何?还有就是处理速度?

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40M2,价位大约USD300,000。基本无换膜费用,寿命3年。速度大约500~1000L/Hr。
作者: tuuu2    时间: 2013-4-25 17:10

您好!我刚刚从事生物制药工作,对蛋白、多肽等都知之甚少,希望能在这里迅速成长。我现在从事基因工程的多肽制备,在这里想请问一下关于多肽纯化的问题,我们研究的多肽有30多个残基,分子量3600多,用HPLC纯化时目标多肽与杂质很难分离,请问以您的经验我下一步应该怎么办?多谢!
作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 17:10



QUOTE:
原帖由 tuuu2 于 2013-4-25 17:10 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
您好!我刚刚从事生物制药工作,对蛋白、多肽等都知之甚少,希望能在这里迅速成长。我现在从事基因工程的多肽制备,在这里想请问一下关于多肽纯化的问题,我们研究的多肽有30多个残基,分子量3600多,用HPLC纯化时目标多肽与杂 ...

您是要制备还是仅分析?
这么小的多肽,RP-HPLC可能更好一些。至于杂质很多,需要您对样品进行合适的预处理。我以前做多肽,有一定难度,和大分子行为不一样,需要多想办法。不过小分子多肽的饿活性保持比较容易。

作者: tuuu2    时间: 2013-4-25 17:11     标题: 回复 #120 fsdd817 的帖子

非常感谢您的回复,我现在是利用RP-HPLC制备,纯度只能达到90%,也使用过离子色谱,效果也不好.主要是和主峰保留时间非常接近的杂质难以分离,不知用什么预处理方法,请您指教.多谢!
作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 17:11



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非常感谢您的回复,我现在是利用RP-HPLC制备,纯度只能达到90%,也使用过离子色谱,效果也不好.主要是和主峰保留时间非常接近的杂质难以分离,不知用什么预处理方法,请您指教.多谢! ...


IEC-HPLC不是很好操作,条件控制比较难,相对来说,RP-HPLC会好些。
样品的预处理,当然有很多。比如脱盐,根据你的量选择合适的方法超滤手段脱盐。比如去除大分子蛋白,你也可以选择超滤。要是浓度不够,可以用超滤浓缩。
另外,RP-HPLC的梯度选择比较重要,在选择好柱子后,然后考虑合适的梯度去完成实验,到底什么样的梯度最好,需要你去优化。
洗脱剂的选择也是很重要的,不同洗脱剂效果是不一样的。比如乙氰和甲醇是不一样的。

作者: 2541    时间: 2013-4-25 17:13

初学者请问:
我们用miliipore的板式膜包纯化蛋白,目的蛋白的分子量是11kd,选择的膜包的分子量是30kd,没有压力表,靠流速来控制压力,逐级PBS洗滤,在不同 时间分别取截留和透过液,进行SDS-PAGE电泳,结果发现大部分的目的蛋白还在截留中,透过了不到五分之一,而且透过液中的杂蛋白不少,分子量大于30kd的也有,超滤的效果很差。我们的样品上样前经过了0.22um的膜过滤。膜用的是新膜。
后来,我们又换了50kd的膜包。发现结果和30kd的膜包差不多,大部分的目的蛋白被截留了,这是什么原因呀?难道是样品过0.22um的膜后进行超滤,膜包在很短的时间又被堵了吗?
还有,我做过的另一个试验,处理的样品是培养的上清,我们离心收集上清后,过膜上样,用30kd的膜包的进行分离,得到的结果也不理想,收集的上清液进行SDS-PAGE电泳,条代模糊,感觉好像盐离子浓度很高,难道是把培养基的成分也截留了?
希望楼主能帮帮忙!

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 17:13



QUOTE:
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初学者请问:
我们用miliipore的板式膜包纯化蛋白,目的蛋白的分子量是11kd,选择的膜包的分子量是30kd,没有压力表,靠流速来控制压力,逐级PBS洗滤,在不同 时间分别取截留和透过液,进行SDS-PAGE电泳,结果发现大部分的目的蛋白还在 ...

您提的问题很好。谢谢您的问题!
正好就您的这个问题,我把膜包的选择原则说明一下,好供大家参考。
一般地,在没有任何实验或者经验的基础上,选择膜包以3~6倍为经验值。
举例:您的11K目标蛋白,如果选择与大分子蛋白分离的话,则选择33~66K标示量的膜包,商品膜包为50K或者100K的比较好。根据您所描述,30K肯定是不合适的。但是50K则不应该这样。
如果您的目的是脱盐,或者更换缓冲液的话,那么选择11K/3~6=2~3K,商品有3K和1K的。一般说来3K可以满足的话,就不选择1K,因为通量3K比1K大。
再者,有极端的情况,就是目标蛋白是线性分子,那么这个时候选择的系数要大一些,比如选择6。另外PH值 影响蛋白存在状态。
还有,提醒一下,如果A家产品实验效果不好的话,可以考虑B家,不同的厂商膜的透过曲线是不一样的,甚至差别很大的。需要您把具体的情况和比较专业的人员交流,共同解决。
另外膜包的材质要考虑,有些材质对于蛋白的吸附是比较厉害的,不适合蛋白的应用。
正确操作下,膜不应该那么容易堵塞,即便堵塞,2种膜的动力学过程也不是一样的。还有,上游的盐浓度不应该很高,或者您超滤的时间短导致,或者操作有问题。您是怎么判断盐浓度的高低?
用超滤膜脱盐得到样品液上离子交换柱,或者SDS-PAGE是超滤经常的应用之一。
细节问题,可和我进一步交流。PM或者电话给我。
祝成功

作者: DNA    时间: 2013-4-25 17:17

非常感谢楼主这么快时间内就回复了!
我们用milipore的膜包不行的情况下,重新选择了另一家外国公司的产品,这次我们定的是20ml的超滤离心管(30kd)。SDS-PAGE的电泳结果提示超滤的效果非常不错:大部分的目标蛋白被透过了,杂蛋白的量也不是很多。
我们从一开始就选择的是低蛋白吸附性的膜,milipproe定的是再生纤维素的,离心管定的是聚醚砜的,两家公司都说是低蛋白吸附性的。
想和你进一步的请教。

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 17:18



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非常感谢楼主这么快时间内就回复了!
我们用milipore的膜包不行的情况下,重新选择了另一家外国公司的产品,这次我们定的是20ml的超滤离心管(30kd)。SDS-PAGE的电泳结果提示超滤的效果非常不错:大部分的目标蛋白被透过了,杂蛋 ...

首先恭喜你成功完成实验!
一般地,再生纤维素的膜可以做到很小乃至1K,3K的商品化膜,但是蛋白吸附比其他滤材肯定要高。
离心管可以定性地看结果,但是真正模拟生产的话,还是需要用平板膜去摸索条件,包括TMP,Flux,膜的清洗等。当然,你做的仅仅是R&D的话,则不需要考虑放大的事情。

作者: zhezhe    时间: 2013-4-25 17:20


多谢老师回复,我也一直在摸索实验条件,只是经验太少事倍功半.我们做的是一种多肽,我负责纯化这块,用的4*30cm的 C18柱可以纯化样品,但是制备量太小,成本也比较高,如果上生产的话是不能满足产量的.所以不能满足现状,要探索能够满足生产,每次制备量达到克级的制备方法或制备柱.不知老师有何指教?

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 17:21



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原帖由 zhezhe 于 2013-4-25 17:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

多谢老师回复,我也一直在摸索实验条件,只是经验太少事倍功半.我们做的是一种多肽,我负责纯化这块,用的4*30cm的 C18柱可以纯化样品,但是制备量太小,成本也比较高,如果上生产的话是不能满足产量的.所以不能满足现状, ...


这个柱子(40*300mm?)也不小。对于您的多肽,最大载量多少?如果载量可以容纳的话,您尽量多上样,足够的载量之后,再行洗脱,得到尽量多的产品。
在上样的时候,您选择的条件要尽量使得小肽容易吸附,也就是:创造合适的条件,满足多肽与填料的结合动力学常数较大的条件。比如介电常数,温度,PH值等。具体需要您去摸索。还有,上样时候,流速不能太快。或者反复循环上样。

作者: owanaka    时间: 2013-4-25 17:21


如何从鲜酵母中提取、纯化辅酶A、辅酶1、谷光甘肽、ATP、核苷酸?在这里先谢谢各位前辈、大虾!

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 17:22



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如何从鲜酵母中提取、纯化辅酶A、辅酶1、谷光甘肽、ATP、核苷酸?在这里先谢谢各位前辈、大虾!

除了核苷酸之外,全部是小分子成分。
首先澄清,获得上清液。
然后依据小分子各自的特性,去进行分离。比如核酸,您要确认是DNA还是RNA,再依据特性进行沉淀或者分离。
先进行实验计划设计,然后根据需要制定方案。
具体的,还需要您自己给出,我只能说这些。

作者: tangxin_80    时间: 2013-4-25 17:23


请教楼主PES和PVDF膜对蛋白的吸附有什么差异?差异有多大?

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 17:23



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原帖由 tangxin_80 于 2013-4-25 17:23 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请教楼主PES和PVDF膜对蛋白的吸附有什么差异?差异有多大?

不可以一概而论。
1,PES既有亲水性,也有疏水性。所以用它的时候,需要足够的时间湿润,甚至在最完整性测试的时候,为了结果的准确,要求足够的湿润时间。
2,PVDF天然为疏水性,所以在PTFE还不能广泛应用的时候,空气过滤器基本上就是天然的PVDF材质。现在仍旧广泛使用。
3,因为PVDF有其独特的优点,比如耐受性强,耐高温,所以在经过长时间的研发之后,终于发现PVDF可以经过改性,达到亲水性的性能,于是诞生了过滤水星溶剂的PVDF过滤器,它具有较强的高温灭菌寿命。
4,由于改性的工艺不同,有不同的产品问世,有的是全面的改性,有的只能在表面改性。主要因为生产膜的厂家不同,技术不一样,产品也不一样。自己生产的膜,在获得合适的工艺后,可以考虑自己全面改性;而在市面上购买别的厂家生产的滤膜进行改性时候,只能进行表面改性。
5,蛋白的低吸附一直是该行业大家追求的目标,那么工艺的不一样,导致产品的性能差异,即蛋白吸附的高低。基本上好的厂家以上2者都可以做到满足低蛋白吸附的要求,不同的厂家的滤膜不见得有可比性。目前市面上有做得很好的低蛋白吸附PVDF膜,是经过全面改性的产品,您可以考虑。
6,那么你依据怎么判断蛋白吸附高低呢?很简单,不管是谁向您推荐,您要求供应商给您提供官方认可的验证文件,以证明其低蛋白吸附性。这样就不会受骗。
愿您找到合适的产品满足您的要求。

作者: one    时间: 2013-4-25 17:24


你好,我的产品分子量为5000,想找一种合适的膜和设备,去掉分子量小于5000的杂质。设备的处理量要小些,不能超过2 L。
我知道超滤杯可能行,但需要氮气,比较麻烦,有没有其他的设备,麻烦你了:)

作者: eric930    时间: 2013-4-25 17:24

我可以推荐一个有意的话可以PM我。实验处理量小于800ML,就可以了!!
作者: H2O    时间: 2013-4-25 17:26


求教,我们哺乳动物细胞培养收获液需要澄清过滤,我们希望用深层过滤器预过滤,虽然供应商的说明上可以10次蒸汽灭菌,但是不知道深层过滤器是否可以清洗干净,如果用一次就仍也太浪费了吧。另外“即开即用”型(塑料外壳,拆开直接蒸汽灭菌)的可蒸汽灭菌的滤器说明书上可3次蒸汽灭菌,但是同样有一个清洗的问题,是不是用一次就仍啊?谢谢各位前辈!!

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 17:27

你好,我的产品分子量为5000,想找一种合适的膜和设备,去掉分子量小于5000的杂质。设备的处理量要小些,不能超过2 L。
我知道超滤杯可能行,但需要氮气,比较麻烦,有没有其他的设备,麻烦你了:)
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您需要一个小型超滤器。最小工作体积大约100ml,大可以到几千ml。要是考虑减小损失的话,最好选择1K的膜包,如果不特别在意主要成分的损失,可以选择3K的膜包。
系统配置及技术规格:
1 ,膜包夹持器:
316L不锈钢材质, 内外表面镜面抛光20RA(美制),进、出、回流液接口均为1/2’’卫生级卡箍连接。
2, 膜包:   
低蛋白吸附, 高通量, 有效膜面积1ft2/块, 应可提供完整的验证报告。可提供FDA认可的VALIDATION文本,超滤膜包在使用中采取平板膜叠加方式,所有流道均为并联,从而保证了每块膜的切向流和过滤压力相同。在减少产品残留的同时,更便于超滤膜包的清洗及反复使用。
3,蠕动泵:
符合制药级标准的MASTERFLEX蠕动泵,电压:220V-240V,50Hz,配有
15#制药级硅胶管,转速6-600rpm, 连续可调。
4,阀门:Alfa Laval或其它厂家同等质量隔膜阀。材质:316L
不锈钢支架:304不锈钢制造,上述超滤系统的各个组件均被装置在此支架上,
支架表面均经打磨抛光。支架占地尺寸约为:400mmx300mm
5,胶管:   ID4,8mm。
6,压力表:Ashcroft 或其它厂家同等质量隔膜压力表。
7,系统配套附件:
Ashcroft制药级316L不锈钢隔膜压力表2只(分别安装在进口和回流口)
Saunders制药级316L不锈钢隔膜阀2个(分别安装在回流和透过液管线上)
接口管件均为316L不锈钢材质,内外表面镜面抛光,管道连接均为1/2”卫生
卡箍。

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 17:27


以上系统可以进行很多的实验,比如浓缩,脱盐,缓冲液更换,蛋白质的分级分离。
稍微小的系统也可以满足您的需求,但是要特别注意,用很小切割分子量的膜,本身Flux速度很慢,处理量要求不能用太小面积的膜。用超滤杯,我个人认为不是合适选择。

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 17:28

求教,我们哺乳动物细胞培养收获液需要澄清过滤,我们希望用深层过滤器预过滤,虽然供应商的说明上可以10次蒸汽灭菌,但是不知道深层过滤器是否可以清洗干净,如果用一次就仍也太浪费了吧。另外“即开即用”型(塑料外壳,拆开直接蒸汽灭菌)的可蒸汽灭菌的滤器说明书上可3次蒸汽灭菌,但是同样有一个清洗的问题,是不是用一次就仍啊?谢谢各位前辈!!!

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谢谢您的好问题!
在国外,一般深层滤器是一次性使用,但是他们的批处理量很大,所以使用得总量也是相当大,基本上不需再处理使用。一次性就是避免清洗及其随后的清洁验证问题,因为验证的花费要比滤器本身的花费更大。
在国内,本着节约的原则,很少购买一次性的产品。对于深层滤器而言,清洗问题不大,能够耐收多大程度的灭菌循环,你需要供应商提供相应的文件。还有一点比较重要。深层滤器的湿强度,可能是非常重要的因素,第二次就没有强度了,其他就没有意义。
对于即开即用的滤器,一般是经过消毒了的产品。基本上是一次性使用。你所说的不属于“即开即用”滤器,因为还没有消毒,它也可以清洗干净,但是我前面说过,是否清洗干净,需要你验证。真正验证的费用,可能不会少,甚至比买新的价格更高。

作者: any333    时间: 2013-4-25 17:28

我们打算多次使用深层滤器,但它是纤维结构,怎样才能清洗干净啊?过滤后应该有很多细胞和碎片吧.另外"即开即用"的塑料外壳的滤器也要灭菌的,如果想清洗一般如何洗才好?万分感谢!
作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 17:28



QUOTE:
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我们打算多次使用深层滤器,但它是纤维结构,怎样才能清洗干净啊?过滤后应该有很多细胞和碎片吧.另外"即开即用"的塑料外壳的滤器也要灭菌的,如果想清洗一般如何洗才好?万分感谢! ...

如果您一定要清洗再用,那么我给点意见。
1,您的滤器是哪个厂家?是以什么形式存在?比如板式(Sheet),圆盘式(Disc)?不同的厂家湿强度不一样,据我所知,能够反复使用切湿强度好的供应商可能全球仅有那么一家。如果湿强度大雨200可以反复用;小于200则难以反复使用,因为变形的缘故。
2,深层滤器的材质是复杂的,是多种材质的复合,比如硅藻土,纤维等,不同厂家的成分也不一样,所以你需要弄清楚,而该产品到底能否反复使用及使用程度,如何清洗,您最好让供应商提供您技术文件,而不是靠“嘴”来说。
3,简单的清洗方法是先用碱液清洗,然后用水清洗。不过您最好还是先弄清楚到底该产品是否适合?我再次强调:不同厂家产品不一样。
4,您所说的“即开即用”可能是囊式滤器。即开即用是不需要灭菌的就可以直接使用的,因为已经Co60照射灭菌。如果开了之后还要灭菌,那怎么能叫“即用”——除菌过滤?
5,在做过滤之前,您需要和供应商讨论,根据您的使用目的,过滤量等条件,选择合适的规格及产品做您的实验,这样有很多好处。那种随意的推荐和没有技术考虑的建议是不负责任的。
6,对于这样产品的清洗,您还是需要和供应商交流,了解起特点选择清洗的方法。如果耐受碱性强的话,您可以考虑碱液清洗后水洗。碱液的浓度大约0,1~0,5M。
7,再次建议,您在选择滤器前需要多考虑待处理料液的情况。

作者: any333    时间: 2013-4-25 17:33


万分感谢您的建议!!!我们打算用 Millipore的,希望能反复使用.

作者: wsll    时间: 2013-4-25 17:34

请问震动膜,陶瓷膜和扩张床似乎都可以澄清料液,我想知道他们的优缺点,在什么情况下选则合适,迷惑中。。。谢谢各位高手了
作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 17:34

请问震动膜,陶瓷膜和扩张床似乎都可以澄清料液,我想知道他们的优缺点,在什么情况下选则合适,迷惑中。。。谢谢各位高手了

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最大的缺点是:所有产品造价都不低;
1,寿命长,震动膜,陶瓷膜都不需要再生。前者1~2年,后者3~5年。比较保守的数据。
2,经过清洗后不留污染,易于验证。
3,处理量可以很大,对于陶瓷膜可以无限制的大。
4,再者,固形物含量可以很高,处理黏度很大的料液,是很棒的。陶瓷膜有50%固形物仍旧可以运行。

5,扩张床我不是专家,不是很了解,但是把它单纯用作澄清料液,是不是有些可惜了?

作者: kuohao17    时间: 2013-4-25 17:35


请教高处胜寒老师, 我的细胞培养上清需要进行超滤浓缩, 超滤柱是PS膜组件,想请问老师,这种膜材料容易吸附蛋白吗?一般浓缩多少倍比较合适呀,我上次浓缩了20倍,即10L上清变成500ml,发现有相当的蛋白沉淀,有没有什么方法可以解决问题呀?
谢谢老师@

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 17:36



QUOTE:
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请教高处胜寒老师, 我的细胞培养上清需要进行超滤浓缩, 超滤柱是PS膜组件,想请问老师,这种膜材料容易吸附蛋白吗?一般浓缩多少倍比较合适呀,我上次浓缩了20倍,即10L上清变成500ml,发现有相当的蛋白沉淀,有没有什么方 ...

1,澄清---超滤浓缩是细胞培养液的常规处理工艺。
2,澄清根据不同的产品及量有不同的选择方式,比如微滤,切向流微滤等。需要考虑蛋白吸附问题。尽量选择蛋白损失小的工艺。
3,超滤浓缩得到合适的浓度。在这里,正如题主所言,工艺是很重要的,您不能浓缩到蛋白已经沉淀时候才停止。那么到底什么浓度是合适的浓度?各种产品工艺不一样,一般在未知产品性质的时候,建议浓缩倍数不要超过10倍。或者蛋白浓度不要高于5%。
4,至于PS膜组件的蛋白吸附问题,这对于不同的供应商,肯定不一样,我们不能单纯看材质,这是我以前已经说过的。你需要实验来获得你的数据,尽管你得到数据了,也不能说明该材质不好,不同的供应商产品性能是有很大差异的。
5,已经沉淀的蛋白,想重新溶解的话,看你的蛋白是否经得起折腾了,您可以用特殊的条件溶解它,比如高浓度的脲,然后马上更换缓冲液,看能否复性。要是能够复性,是您的运气了。不是所有的蛋白都使用。对于脆嫩的蛋白,可能早无活性了。
一点建议,供参考。

作者: 04906    时间: 2013-4-25 17:36


想请教老师,我们如果要灭活内毒素有哪些方法?如果是实验室膜设备上的内毒素如何除干净呢?

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 17:37



QUOTE:
原帖由 04906 于 2013-4-25 17:36 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

想请教老师,我们如果要灭活内毒素有哪些方法?如果是实验室膜设备上的内毒素如何除干净呢?

药剂学的教科书上对内毒素有稍微详细的介绍,不妨回忆一下:
1,内毒素是细菌细胞壁上的脂多糖。在正常PH值条件下,一般以负电荷形式存在。
2,其特点:
1)不耐强酸碱; 2)不耐受氧化剂(比如高锰酸钾);3)可滤过性(一般滤膜不能去除);4)对超声波也不耐受。
3,但是在料液中去除内毒素到合适的水平,则需要考虑料液本身比如主要活性成分的保护,料液的性质等。大体上,目前去除内毒素的方法:
1)切向流超滤:适用于小分子的活性成分的操作,比如中药注射剂。笔者曾经成 功 地在一家药厂解决一个很好的中药注射剂的热源问题,乃至今日,仍旧生产良好。
2)活性炭吸附:适合主药不是很贵重的制剂。该法是很好的除热源方法在于其成本低,效率较高。美中不足是后处理麻烦,甚至增大成本很厉害。还有就是对主药的吸附。
3)带正电荷的膜吸附:适合于纯化水及某些特殊的情况下的应用;
4)层析:适合于生物制品。但是特意性还有待考虑,成本也很高。
5)其他方法:一些特殊的产品,比如Mustung等。

已经污染的内毒素,比如膜上,试着用NaOH清洗,必要时候家氧化剂。
您的这个问题有些奇怪,我记得是有这样的例子,至于详细的情形,还需要进一步深入。

作者: 66+77    时间: 2013-4-25 17:38


请教一个关于超滤浓缩疫苗(病毒)的问题,目标病毒是20~22nm,但是超滤膜是以kd表示的,不知道nm和kd对应关系如何,我应该选用多大截留分子量的膜包合适 啊.谢谢前辈指导.

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 17:38



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原帖由 66+77 于 2013-4-25 17:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请教一个关于超滤浓缩疫苗(病毒)的问题,目标病毒是20~22nm,但是超滤膜是以kd表示的,不知道nm和kd对应关系如何,我应该选用多大截留分子量的膜包合适 啊.谢谢前辈指导. ...


一般地,浓缩疫苗,选择的原则是100KD和300KD为多。更大的500KD和900KD也有用,但是很少。
至于换算,粗略的是1nm对应9~11KD。但是您最好是以实验为准。

作者: 987789    时间: 2013-4-25 17:38


楼主好,我是医药制剂技术的外行,本来只是在实验室纯化了一个蛋白,老板想将其做药物开发,所以现在得硬着头皮钻研制剂技术。时间短任务重,好急!长话短说,我纯化的这个蛋白,按一般实验室做基础研究的实验要求纯度还不错,现在要做一些样品检测其内毒素和热源,我应该注意些什么问题呢,有这方面的入门书籍吗?
我的纯化工艺是这样的,大肠杆菌表达得到目的蛋白的包涵体,经稀释复性后过一个肝素亲和层析,然后用超滤离心管换溶液体系并浓缩,最后冻干保存。这样的纯化工艺对去除内毒素是不是过于简单了?是否还需加一些分子筛等步骤。我应该在哪一步开始对仪器和试剂进行特殊处理呢,一般法玛西亚的柱料有内毒素污染吗?还有,老板说我应该用注射用水进行实验,哪里能买到这种水啊?问题可能太初级了,还请版主不吝赐教,拜谢拜谢!

作者: is2011    时间: 2013-4-25 17:39


分子筛去除内毒素并不是特别有效。
如果是短期目标,先拿到些合格的产品再说,完全可以过一下内毒素亲和胶,你可以pm chromatography。
所用的buffer和水以及整个操作过程要控制热源,WFI可以看一下你们的超纯水仪说明书可不可以制备无热源水。
瓶子要180C烘烤,或是1N NaOH浸泡处理。

一般的填料都有SIP的方法,依照说明书做就是了。

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 17:39

楼主好,我是医药制剂技术的外行,本来只是在实验室纯化了一个蛋白,老板想将其做药物开发,所以现在得硬着头皮钻研制剂技术。时间短任务重,好急!长话短说,我纯化的这个蛋白,按一般实验室做基础研究的实验要求纯度还不错,现在要做一些样品检测其内毒素和热源,我应该注意些什么问题呢,有这方面的入门书籍吗?
我的纯化工艺是这样的,大肠杆菌表达得到目的蛋白的包涵体,经稀释复性后过一个肝素亲和层析,然后用超滤离心管换溶液体系并浓缩,最后冻干保存。这样的纯化工艺对去除内毒素是不是过于简单了?是否还需加一些分子筛等步骤。我应该在哪一步开始对仪器和试剂进行特殊处理呢,一般法玛西亚的柱料有内毒素污染吗?还有,老板说我应该用注射用水进行实验,哪里能买到这种水啊?问题可能太初级了,还请版主不吝赐教,拜谢拜谢!!!

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你的问题就是内毒素的去除问题。
一般地,内毒素确实是制药行业的一个非常重要的问题。
去除内毒素的方法有很多,你可以在这里查找,我就这个专题就和大家交流很多,也发表很多看法,包括各种不同体系情况下的去除方法,希望你动手在这里查找一下。本来我可以直接粘贴或者连接给你,但是我觉得你自己检索一下可能会有更多的发现。要是检索有什么问题,你告诉我,我们再交流。
包含体的纯化,需要什么注意内毒素的引入,你知道,破菌就是破坏细菌的细胞壁,很多细胞壁的成分都会释放,这些恰恰是内毒素的源泉之一。
在所有的过程中,要注意避免引入内毒素。那么操作要小心,所有的器皿的内毒素去除也是一个挑战。具体怎么做,对于不同的器具,药典有明确的规定。
单纯靠亲和能否去除内毒素,这个不能简单去判定,需要你随时分析跟踪,就是用特定的方法,比如鲎试剂去判断。
填料是否会引入,你也可以用空白实验去检查。不是填料本身的问题,是你在填料使用后经如何处理,这样的处理是否能够彻底去除内毒素,需要验证。因为你知道,填料都不是一次性的,而是反复再生使用的,那么再次使用的污染问题,就需要验证去解决。
分子筛去除内毒素?可能不是很有效,相对说来,离子交换可能更有效。
至于注射用水的购买,一般药厂都有,但是他们是不是卖,就不好说了。注射用水是纯化水经过多效蒸馏得到的。实验室也可以自制。
任何问题,欢迎提出。

作者: kuohao17    时间: 2013-4-25 17:40


血清培养细胞,一蛋白由35kd的轻链和40kd的重链组成的二条异源性二聚体,由多个二硫键连接。等电点介于pH4.5~pH5.5。请教应该采用何种方法分离纯化?

作者: is2011    时间: 2013-4-25 17:41

血清培养细胞,一蛋白由35kd的轻链和40kd的重链组成的二条异源性二聚体,由多个二硫键连接。等电点介于pH4.5~pH5.5。请教应该采用何种方法分离纯化?

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含血清的培养,会受血清中多种杂蛋白影响,纯化难度较大。不知道你的表达量有多少,血清百分之几?
可以考虑阴离子capture,但是注意phenol red, 核酸以及多种杂蛋白都会binding,所以要先建立比较灵敏的assay方法,如Elisa,用于监测纯化整个过程。
目标蛋白等电点和BSA相差不多,第一步很可能分不开,后面可以考虑用HIC进行精纯。

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 17:41

我的建议是先得到澄清液体,然后用切向流去除小分子杂质,然后层析分离。为保证二聚体不解离,二硫键不断裂,建议整个过程考虑pH值,还有还原剂。
作者: 98776langtao    时间: 2013-4-25 17:42

请教一个关于超滤浓缩疫苗(病毒)的问题,目标病毒是20~22nm,但是超滤膜是以kd表示的,不知道nm和kd对应关系如何,我应该选用多大截留分子量的膜包合适 啊.谢谢前辈指导.

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你可以考虑用截流分子量为100kDa的超滤膜,对于疫苗应该没问题。另外,还应该看杂质的种类和大小。
作者: lixi559    时间: 2013-4-25 17:42

血清培养细胞,一蛋白由35kd的轻链和40kd的重链组成的二条异源性二聚体,由多个二硫键连接。等电点介于pH4.5~pH5.5。请教应该采用何种方法分离纯化?

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对于血清培养细胞,可以先考虑用盐析沉淀进行粗提后,再用凝胶过滤和阴离子交换柱,如Q Sepharose FF或DEAE Sepharose FF进行分离
作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 17:43

你可以考虑用截流分子量为100kDa的超滤膜,对于疫苗应该没问题。另外,还应该看杂质的种类和大小。

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一般的疫苗用100K应该没有问题。
但是对于这么小的病毒,用100K,可能会影响回收率。建议实验后决定孔径选择。

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 17:43

对于血清培养细胞,可以先考虑用盐析沉淀进行粗提后,再用凝胶过滤和阴离子交换柱,如Q Sepharose FF或DEAE Sepharose FF进行分离。

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这样做肯定没有问题。
但是下游纯化是生物技术的主要成本所在(90%?,95%?更多?)。如何使填料的寿命延长以减少成本,是我们工艺选择时候考虑的。有些时候,多个步骤可能会更有利于获得理想结果。
如果要是实验室研究, 那是另外一回事。
盐析要考虑条件。别把目标蛋白一起去了。
是与否,请参考。

作者: wood533    时间: 2013-4-25 17:43


我们用PVDF 0.22um的滤芯过滤培养液,用后总是清洗不干净,听说不能用碱洗,
我们又打算反复使用,希望大家给一个过滤器清洗建议吧. 我们的产品是蛋白或者抗生素.

作者: jujuba    时间: 2013-4-25 17:45

羟丙甲纤维素药液过滤问题:我们曾尝试1微米和5微米预过滤器的过滤,结果很快就堵住了,过不了,急啊。各位前辈能给点建议吗,非常感谢!!!

0.5%羟丙甲纤维素、0.5%氯化钠.
动力黏度(用平氏黏度计测)范围为10—32mpa

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 17:45

我们用PVDF 0.22um的滤芯过滤培养液,用后总是清洗不干净,听说不能用碱洗,
我们又打算反复使用,希望大家给一个过滤器清洗建议吧. 我们的产品是蛋白或者抗生素.

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可以15min 用碱(0.2M)清洗。然后迅速用水洗干净。
作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 17:46

羟丙甲纤维素药液过滤问题:我们曾尝试1微米和5微米预过滤器的过滤,结果很快就堵住了,过不了,急啊。各位前辈能给点建议吗,非常感谢!!!

0.5%羟丙甲纤维素、0.5%氯化钠.
动力黏度(用平氏黏度计测)范围为10—32mpa

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以下几点建议:
1,选择合适的过滤器;
2,根据过滤器的使用条件选择合适的压力。
3,欲速则不达。粘度很大的料液,不能要求太快,或者加大使用面积。

作者: 98776langtao    时间: 2013-4-25 17:46


我们用碱清洗后,发现PVDF滤膜过料液变得很慢.

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 17:47

我们用碱清洗后,发现PVDF滤膜过料液变得很慢.

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你描述还是很简单.
过滤器除了滤膜的材质之外,还有支撑层,保护支架,尖头,封口等.
各部位的材质是不一样的.
如果用碱清洗-------大多数是这么处理的. 不能长时间浸泡.
不同的厂家生产得产品是不一样的.所以不能一概而论.
你还是需要详细得说明.

作者: 3N4G    时间: 2013-4-25 17:47

我在毕赤酵母里分泌表达的一个融合蛋白存在降解 , 加PMSF和EDTA都不能抑制降解 ,而且上清存放-20一段时间仍会继续降解,在做纯化过程中也会出现一系列降解的连续条带,实在太郁闷了,有人遇到过类似情况吗?大家有什么应付降解的良策吗?希望大家给些建议。谢谢!
作者: qianqin1977    时间: 2013-4-25 17:48

我在毕赤酵母里分泌表达的一个融合蛋白存在降解 , 加PMSF和EDTA都不能抑制降解 ,而且上清存放-20一段时间仍会继续降解,在做纯化过程中也会出现一系列降解的连续条带,实在太郁闷了,有人遇到过类似情况吗?大家有什么应付降解的良策吗?希望大家给些建议。谢谢!

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立刻上柱,去掉杂质。
作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 17:48

立刻上柱,去掉杂质。

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您最好描述详细一些.
上柱.什么柱?分子筛? 去掉的是什么杂质?
我建议最好先了解该融合蛋白的特征.什么条件下容易降解?降解动力学如何?受影响的因素主要是什么?把影响降解的关键因素弄明白后,然后有条件的解决 ,可能更好!

作者: zsxan1990    时间: 2013-4-25 17:49

对这个蛋白(由35kd的轻链和40kd的重链组成的二条异源性二聚体,由多个二硫键连接。等电点介于pH4.5~pH5.5)现在我们还是不考虑血清培养细胞了,采用无血清培养,用的是北京的SAF和一个进口的SFM培养基,现在表达量在12ug左右,不是很理想,不知道还有没有其它的培养基?
对现在有人采用将培养上清液进行阳离子后再用阴离子。用阳离子时pH高于等电点,接着用阴离子时用等电点附近的pH缓冲液去杂蛋白再洗脱得目的物。不知道前辈认为如何?
考虑成本和操作简单以及回收率问题,前辈有何好的思路,还请多赐教,现在买了AKATA prime纯化仪器。因为我是新手,纯化好多都不懂,前辈能否给一些相关得学习资料和思路。非常感谢!

作者: abc816    时间: 2013-4-25 17:49


老师好,我有个问题:在用切向流过滤时,可以选择膜包或者是中空纤维的滤柱,我想知道在什么条件下选择那种滤器比较好.谢谢了!

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 17:50

对这个蛋白(由35kd的轻链和40kd的重链组成的二条异源性二聚体,由多个二硫键连接。等电点介于pH4.5~pH5.5)现在我们还是不考虑血清培养细胞了,采用无血清培养,用的是北京的SAF和一个进口的SFM培养基,现在表达量在12ug左右,不是很理想,不知道还有没有其它的培养基?
对现在有人采用将培养上清液进行阳离子后再用阴离子。用阳离子时pH高于等电点,接着用阴离子时用等电点附近的pH缓冲液去杂蛋白再洗脱得目的物。不知道前辈认为如何?
考虑成本和操作简单以及回收率问题,前辈有何好的思路,还请多赐教,现在买了AKATA prime纯化仪器。因为我是新手,纯化好多都不懂,前辈能否给一些相关得学习资料和思路。非常感谢!

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表达量的问题,属于上游的问题,你还是好好摸索条件,我不能给出太多的建议.
所有原料的来源好质量你再好好检查.
下游的问题,回来再和你聊.


pH高于PI,目标蛋白主要以阴离子状态存在,用阳离子目的是什么?请确认。
我认为,您首先要考虑尽可能在上游想办法,获得高得表达量。在此基础上,可以选择合适的方法获得好的回收率。
合适的方法不是千篇一律。既然您有AKTA,那么怎么做久很容易摸索出来。
有几点提醒:
1,离子交换之前,需要脱盐。可以用超滤方法。
2,分子筛层析之前,建议浓缩。超滤是好的方法。
3,离子交换之前,需要考虑合适的pH选择。洗脱的合适条件。

作者: fsdd817    时间: 2013-4-25 17:51

老师好,我有个问题:在用切向流过滤时,可以选择膜包或者是中空纤维的滤柱,我想知道在什么条件下选择那种滤器比较好.谢谢了!

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1,待处理料液的体积大小:大,建议用Hollow fiber,HF,小,建议用Membrane cassette,MC;
2,在意死体积大小,用MC;不在意的话,用HF;
3,分子量选择方面:MC可以大范围选择,HF选择范围小;
4,成本造价:MC花费大,HF花费小;
5,寿命:一般地,MC长;HF短;
6,应用:不同的应用选择不同的产品。需要具体问题具体对待。
有兴趣的话,可以说明情况,我给您建议。

作者: 8princess8    时间: 2013-4-25 17:51


请教楼主:我现在要经常用超滤浓缩,但现在用的超滤杯实在是太慢了,250mL要费时七八个小时,受不了!能否推荐几款经济好用的小型超滤装置?

作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 10:36



QUOTE:
原帖由 8princess8 于 2013-4-25 17:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请教楼主:我现在要经常用超滤浓缩,但现在用的超滤杯实在是太慢了,250mL要费时七八个小时,受不了!能否推荐几款经济好用的小型超滤装置?

你用多大分子量的膜?
如果分子量小的话, 可顶很慢.
我建议你用2种方案:
A) 用50CM2的膜包;
用930CM2的膜包.
可能将之间控制在1hr之内.
具体你可以电话和我交流

作者: 8princess8    时间: 2013-4-26 10:42


多谢楼主!我用的是10K的膜,不知道是不是膜的使用时间太长了还是怎么的,反正特别慢.也可能是超滤杯式的方式不够好吧.所以想买台好用的超滤设备.现在网上看Sartorius公司有一种Vivaflow 50,不知道好不好用.不知楼主对这个设备是否熟悉,或者帮我推荐一种经济的设备?

作者: bgf5    时间: 2013-4-26 10:42

大家好,我是新手,以前没有做过抗体,现在主要做抗体纯化的,当前遇到一个问题就是,细胞收获液过亲和柱后,用BCA和ELISA两种方法检测抗体含量,结果相差近一倍,且都是ELISA结果高于BCA结果,这是什么原因呀?
还有我想请教一下抗体含量一般用什么方法来测?再就是老板让我建立一种HPLC快速检测抗体含量的方法,有资料说是用protein A来检测抗体含量,但没有具体方法,我以前主要做纯化的,没有做过定量方面的研究,用protein A来纯化抗体与用protein A进行抗体纯化到底有什么区别,还请各位指点一下,谢谢!

作者: bgf5    时间: 2013-4-26 10:42


想请教fsdd817前辈,我们用MUSTANG Q柱纯化一种腺病毒,由于想节约成本,我们的柱子是重复使用的,因此我们想在后续纯品中检测有没有MUSTANG Q集团脱落,请问有没有合适的检测方法?

作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 10:44



QUOTE:
原帖由 bgf5 于 2013-4-26 10:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

想请教fsdd817前辈,我们用MUSTANG Q柱纯化一种腺病毒,由于想节约成本,我们的柱子是重复使用的,因此我们想在后续纯品中检测有没有MUSTANG Q集团脱落,请问有没有合适的检测方法? ...

Mustang一般是一次性使用的。
根本原因,不在于Q基团的脱落,而是因为避免清洗验证等。要知道在国外,清洗验证是比产品本身花费更多的。
至于基团的脱落,可能性不是很大。毕竟在纯化时候,基团的脱落是绝对不允许的,这样的产品许可上市才怪。
你要想检查基团脱落,简单的办法是就是坎载量的变化。检查洗脱液中的基团是困难的。

作者: bgf5    时间: 2013-4-26 10:44     标题: 回复 #178 fsdd817 的帖子

我还想再多问一句,如果我们要进行清洗验证一般该怎样做?
再就是非常 对不起,主要是我对发帖没有经验,还以为自己发错地方了,以后我会注意的。谢谢您!以后还要请您多多指点。
作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 10:45



QUOTE:
原帖由 bgf5 于 2013-4-26 10:44 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我还想再多问一句,如果我们要进行清洗验证一般该怎样做?
再就是非常 对不起,主要是我对发帖没有经验,还以为自己发错地方了,以后我会注意的。谢谢您!以后还要请您多多指点。 ...

不必客气。如果能理解我说的话,那么很感谢了!
首先和你讨论一下验证的问题。
关于验证,就要说很多。由于篇幅,我不能一一解释,做个简单的介绍。
首先要做验证计划。目的?所谓验证设计(DQ)。关于这个有很多的内容,你可以查查文献,或者找药厂的资深人士咨询。
然后做方案。方案要科学,完整,经得起考验,把复杂的情况都要考虑进去。
再次,做安装认证(IQ)。在药厂设备部分,这是必不可少的。
第三,是操作认证(OQ)。这是验证的核心。
最后,是性能认证(PQ)。这是对OQ的进一步。
做完验证工作后,最重要的一点是,文件要归档。
所有的验证基本上是以上的步骤。视验证的具体情况做些微调整是可以的。
在产品工艺改变后,还要就改变的工艺做再验证。
在长时间的生产后,适当时候需要做回顾性(Review)验证。
安徽华源欣佛事件的一个主要原因,就是再改变工艺后,没有很好的验证。
验证再中国,诞生不过几年。这样的思想还不未大多数认接受。
验证是一个费时,耗力,耗钱的工作。所以国内药厂很多不愿意花钱实施。
至于清洗验证,可以套用以上的步骤。
需要说明的是,不同的清洗,目的不一样。
比如,对于填料的清洗,你需要弄清楚目的,需要验证蛋白的洗脱干净没有?是否有蛋白或者杂蛋白还在填料上?是否有微生物污染?是否生物安全?
等等。
我上文所说的做方案。
如果你在药厂工作,而那个药厂是真正的实施GMP的话,您就有很深刻的了解。

作者: ero11    时间: 2013-4-26 10:46

你好!我想请教你几个问题,
1.我们用盐酸胍溶解包涵体,想去除盐酸胍,现在我们使用的是透析的 方法,可是放大到生产是不可取的,还有别的方法可用吗,比如说中空纤维超滤或膜过滤等,具体怎么操作.
2.HPLC纯化后的样品中含有乙腈,我们使用旋转蒸发去除,用膜过滤的方法是否更好?
请给于指导.谢谢你

作者: windy+++    时间: 2013-4-26 10:46

你好,不知道你们用的是什么仪器,我有HPLC和FPLC 的清洗验证,不知道是不是可以对你有帮助,我们是制药企业.如果对你有帮助请回帖,我会给你发到你的邮箱里.
作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 10:47

你好!我想请教你几个问题,
1.我们用盐酸胍溶解包涵体,想去除盐酸胍,现在我们使用的是透析的 方法,可是放大到生产是不可取的,还有别的方法可用吗,比如说中空纤维超滤或膜过滤等,具体怎么操作.
2.HPLC纯化后的样品中含有乙腈,我们使用旋转蒸发去除,用膜过滤的方法是否更好?
请给于指导.谢谢你

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很高兴收到您的问题。
1,用膜去除盐酸胍,不论是量,还是时间,都要优越很多。你就尽快解决吧。
2,同样,除去不多的乙腈,该方法同样适用。但是需要注意切割分子量的选择.

作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 10:48

你好,不知道你们用的是什么仪器,我有HPLC和FPLC 的清洗验证,不知道是不是可以对你有帮助,我们是制药企业.如果对你有帮助请回帖,我会给你发到你的邮箱里.

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他的和你的不一样。
他用的不是仪器,是一次性产品,不需要验证,这是他的产品的最大优点,现在他想重复使用,那么需要验证,我给了他这个概念,他就追问有关验证的事情,所以给简单的解释。
您的资料我到是敢兴趣,不妨到发到我邮箱,地址见上楼。
谢谢!

作者: windy+++    时间: 2013-4-26 10:49

谢谢你的回答,但是我还是对膜很模糊,你能给我点资料或者产品目录什么的吗.
多谢了,我会把清洗验证的资料给你发到你的信箱,请查收.

作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 10:50



QUOTE:
原帖由 windy+++ 于 2013-4-26 10:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
谢谢你的回答,但是我还是对膜很模糊,你能给我点资料或者产品目录什么的吗.
多谢了,我会把清洗验证的资料给你发到你的信箱,请查收.

没有问题。我的其他帖子您最好一并看了,可能对切向流就了解深刻了。
作者: windy+++    时间: 2013-4-26 10:50

你好,我已经联系到pall 公司的销售人员了,他会尽快找到合适的方式给我们解决问题,还是非常的感谢你的帮助.我现在初步有了一些了解,以后会向你多多学习的.
作者: douding66    时间: 2013-4-26 10:51

我们在做一个毕赤酵母分泌表达的重组蛋白,分子量在6000Da,高密度发酵得到的,发酵液40%左右是菌体,在上柱前以前是用离心的方法来澄清,效率很低,而且上清液并不很澄清。如果要产业化是否最好用TFF来澄清呢?板框过滤是否对菌丝体效果好而对类似酵母的菌体不适用呢?

我看您介绍的陶瓷膜切向流过滤技术,是否原理也象超滤膜包那样,也存在截留分子量及是否存在非特异性吸附的问题?象我这种情况,要保证滤出液澄清,又要保证6KDa目的蛋白的收率,在选择陶瓷膜时,要不要考虑膜孔径问题?

新手问题太多,写的也没什么逻辑,fsdd817老师多多包涵

作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 10:51



QUOTE:
原帖由 douding66 于 2013-4-26 10:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我们在做一个毕赤酵母分泌表达的重组蛋白,分子量在6000Da,高密度发酵得到的,发酵液40%左右是菌体,在上柱前以前是用离心的方法来澄清,效率很低,而且上清液并不很澄清。如果要产业化是否最好用TFF来澄清呢?板框过滤是否对菌丝 ...

您的这个属于很麻烦的一个操作,我载工作中遇到不是头一回。
好的设备价格离谱,差的设备不能解决问题。就这么简单。
用TFF应该是不错的选择。具体袄什么产品,及多大的分子量,需要考虑。

作者: finger    时间: 2013-4-26 10:51

前一阵子,公司里和一家厦門的厂联系了一台设备,他给寄过来让我们试用一下,设备样子就象一个放大的中空纤维切向流过滤,过滤用的中空管是光滑陶瓷,酵母发酵液4倍稀释后过滤,滤出液很澄清,但HPLC检测却发现,6kDa目的蛋白在滤渣里含量很高0.5g/L,滤出液里只有0.1g/L,而且在操作过程中,设备发热量很高,滤出液温度有40度左右。我想这个陶瓷膜对目的蛋白还是有一定截留,或是有一定吸附。我就想请教888wym 老师,差的设备效果真的不行么?公司给的经费有限,您说的进口设备买不起,还希望您再多给提一些意见。
作者: mickeylin    时间: 2013-4-26 10:52


您好,我现在准备作亲和膜来纯化抗体,但是以前没有一点经验,请您给我点帮助和参考,我现在有很多问题:
1:一般用什么膜,我手上有NC和PVDF膜,
2:膜的组件怎么作?一般用什么形式的组件。
3: 怎样把配体偶联到膜上,一般能洗脱多少次。
等等,总之问题很多,希望您能够不吝赐教,另外,是否知道哪家公司有比较成熟的亲和膜的产品。谢谢

作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 10:52

前一阵子,公司里和一家厦門的厂联系了一台设备,他给寄过来让我们试用一下,设备样子就象一个放大的中空纤维切向流过滤,过滤用的中空管是光滑陶瓷,酵母发酵液4倍稀释后过滤,滤出液很澄清,但HPLC检测却发现,6kDa目的蛋白在滤渣里含量很高0.5g/L,滤出液里只有0.1g/L,而且在操作过程中,设备发热量很高,滤出液温度有40度左右。我想这个陶瓷膜对目的蛋白还是有一定截留,或是有一定吸附。我就想请教888wym 老师,差的设备效果真的不行么?公司给的经费有限,您说的进口设备买不起,还希望您再多给提一些意见。

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您选择的膜MWCO可能不是很适合。
或者该膜的性能不是很好。
实验结果是最好的说明。
您的境遇我很理解。老板经常让员工化最少的票子,做很高难度的工作。这是我们 的难处。我们只能想办法,但是最终花费的是时间。不知道中国人的时间是不是真的不值钱。
我的建议是以后在设备考虑的时候,重要的是膜,而不是组件。把重要的考虑进去,结果会好的。
他们帮助您调试了吗?

作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 10:53


相关疾病:
头痛

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您好,我现在准备作亲和膜来纯化抗体,但是以前没有一点经验,请您给我点帮助和参考,我现在有很多问题:
1:一般用什么膜,我手上有NC和PVDF膜,
2:膜的组件怎么作?一般用什么形式的组件。
3: 怎样把配体偶联到膜上,一般能洗脱多少次。
等等,总之问题很多,希望您能够不吝赐教,另外,是否知道哪家公司有比较成熟的亲和膜的产品。谢谢

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您做的是很有趣的事情。
膜和层析结合起来,科学家很早就有这方面的考虑,并且现在市面上已经有成熟的的商品。但是限于各方面的原因,目前只有离子交换基团结合的产品。
---------不管那种膜,关键是膜的惰性,蛋白吸附,化学兼容性,介质脱落,孔隙率,流动性,等等物理化学性能。适当的时候膜的改性很重要。
---------膜的组件不是很难的,根据条件进行考虑。您可以照工程公司给予制作。
---------配体偶联到膜上,不是那么容易的事情,可能还要考虑空间位阻,所以合适的Spacer arm 是必要的,还有就是结合动力学,还有结合化学常数,也就是稳定性的问题。不能今天结合的膜,明天就脱落,结合完后如何处理,比如钝化,封闭等。
很麻烦的问题还在于,您用这样的亲和膜取纯化分离产品,您怎么保证介质脱落?这对于一般的亲和都是很头疼的问题,更不要说膜了。所以这可能是改课题的最大麻烦。
对您的创意表示敬意。

作者: finger    时间: 2013-4-26 10:53

昨天膜公司的人来了,之前的膜孔径是0.4微米,这次他带了一个0.8微米的,今天再实验一次,看一下目的蛋白的透过率。他们是这么解释的,0.4微米孔径酵母细胞及碎片不易堵膜,0.8微米堵膜效应会大一些,造成通量小一些,看一下今天的结果再请教您
作者: kulee    时间: 2013-4-26 10:57


能用SDS-PAGE检测分子量为3500Da的蛋白吗?如果可以的话,应该如何配胶呢?

我想能用15%浓度的胶来检测,因为我跑过胰岛素的(分子量约5300),那时是染料带跑到分离胶2/3偏下一点我就停下银染了。3500的我没有跑过,但你可以试一下染料带跑到分离胶2/3偏上时停止再进行染色,看看是否可以的。

作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 10:58



QUOTE:
原帖由 kulee 于 2013-4-26 10:57 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

能用SDS-PAGE检测分子量为3500Da的蛋白吗?如果可以的话,应该如何配胶呢?

我想能用15%浓度的胶来检测,因为我跑过胰岛素的(分子量约5300),那时是染料带跑到分离胶2/3偏下一点我就停下银染了。3500的我没有跑过,但你可以试一 ...

我的意见是,不好做!
小分子多肽很容易扩散,是不能捕捉的根本原因。
采用高灵敏度的银染色法,可能部分解决。我在学校尝试过,但是重现性不是很好。
不能Tris,而需要用Tricine体系,可能会好些。
好象我曾经回复过这样的帖子。

作者: ququer787    时间: 2013-4-26 10:58


最近做增强完整性测试,有时候泡点合格但是扩散流不合格,有时候是扩散流流合格,但是泡点又不合格.不知道这两种情况是什么原因造成的,该如何解决呢?谢谢先!!!

作者: taoshengyijiu    时间: 2013-4-26 10:59


我要把一个蛋白用蛋白酶消化成小肽然后回收3000Da左右的片段, 技术成熟后可能还有大规模生产,楼主能否根据您的经验给一些建议!谢谢了!

作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 10:59



QUOTE:
原帖由 ququer787 于 2013-4-26 10:58 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

最近做增强完整性测试,有时候泡点合格但是扩散流不合格,有时候是扩散流流合格,但是泡点又不合格.不知道这两种情况是什么原因造成的,该如何解决呢?谢谢先!!! ...

要看您的测试对象是什么。
对于大面积的滤芯,用扩散流(Forward flow)更准确。
而对于小面积的Disc膜片,用泡点法(Bulb point)更可取。

作者: 小糖块    时间: 2013-4-26 11:00

fsdd817老师,我用的是10'' PVDF滤芯, 采用完整性测试仪,有时候泡点合格但是扩散流不合格,有时候是扩散流流合格,但是泡点又不合格.不知道这两种情况是什么原因造成的,该如何解决呢?
作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 11:01

我用的是10'' PVDF滤芯, 采用完整性测试仪,有时候泡点合格但是扩散流不合格,有时候是扩散流流合格,但是泡点又不合格.不知道这两种情况是什么原因造成的,该如何解决呢?

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严格操作规范.再试试/
用扩散流方法.
泡点不准确.
润湿要彻底,溶剂要规范.如果用有机溶剂和水的混合液,比例要求准确.
测试温度要注意.22+/-5

作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 11:02



QUOTE:
原帖由 kent 于 2013-4-26 11:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我们在做一个毕赤酵母分泌表达的重组蛋白,分子量在6000Da,高密度发酵得到的,发酵液40%左右是菌体,在上柱前以前是用离心的方法来澄清,效率很低,而且上清液并不很澄清。如果要产业化是否最好用TFF来澄清呢?板框过滤是否对菌丝 ...

您说的有一定的道理。
离心适合小规模的产品。大量的产品,离心是有问题的,即便连续流也是问题。还有问题的关键是固形物含量太多。所以离心有问题。
实际工作中,遇到不少这样的例子。也请有经验的老师给予好的方式或者提醒。

作者: windy+++    时间: 2013-4-26 11:02

多谢指教,我们产品现在是中试水平, 现在做的准备是为了以后上生产.
作者: windy+++    时间: 2013-4-26 11:04

"切向流的方式可以做的很快,也就是浓度变化剧烈,当然更可以做得很慢。"
我们的产品在盐酸胍不存在时程沉淀状态,所以还没有想到别的溶剂更换.可能会堵塞膜.

作者: windy+++    时间: 2013-4-26 11:04

"我们做过20升盐酸胍蛋白变性溶液对200升复性溶液的透析复性。有些蛋白复性".不知道您是怎么实现的,可否赐教.我们现在用的是透析膜.每次的量是500ml对10L的透析液.如果象你说的每次200L的复性液不是很浪费水嘛.有办法再利用吗?
作者: jude    时间: 2013-4-26 11:05

您说的有一定的道理。
离心适合小规模的产品。大量的产品,离心是有问题的,即便连续流也是问题。还有问题的关键是固形物含量太多。所以离心有问题。
实际工作中,遇到不少这样的例子。也请有经验的老师给予好的方式或者提醒。

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这里说的“规模”,我是针对楼上站友所说的“基因工程重组蛋白”生产。我了解到国内生物制药行业中基因工程这一领域中,产业化操作的规模都不是很大。我们原先750L的发酵罐,是采用的连续流收集菌体。专业背景和阅历的限制,至于生物制药行业中的其它领域,我了解不多。
作者: jude    时间: 2013-4-26 11:05



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"我们做过20升盐酸胍蛋白变性溶液对200升复性溶液的透析复性。有些蛋白复性".不知道您是怎么实现的,可否赐教.我们现在用的是透析膜.每次的量是500ml对10L的透析液.如果象你说的每次200L的复性液不是很浪费水嘛.有办 ...

重组蛋白的下游工艺,主要是复性和纯化。
重组蛋白的复性,大多会产生沉淀,沉淀产生量和速度,与复性的工艺有关。即使采用透析的方法,变性剂浓度变化(下降)缓慢,仍然会有沉淀产生。为保护设备和提高工艺的稳定性及重现性,最好是复性步骤解决问题,排除沉淀对纯化的干扰。举例:用尿素变性,稀释复性,复性液中保留1~2M脲,有些蛋白并不发生沉淀,此时也可以直接上柱,但是更换无脲的溶液洗涤洗脱,则有沉淀淀积在层析胶中,对胶有伤害而且洗涤洗脱条件批次间难以稳定。再,多数蛋白复性大多对温度有所要求,尽可能保持低温操作。
如果要尽量控制复性操作规模,可以摸索尝试提高复性蛋白浓度。教科书上都是说最佳复性浓度为每毫升100微克左右,但不同蛋白间差别很大,我们就做过一种蛋白在每毫升5-8毫克的浓度下成功复性。
至于“20升盐酸胍蛋白变性溶液对200升复性溶液的透析复性”,就是把20升变性液装在透析袋中在200升复性液中透析,没有什么操作诀窍,多剪些袋子,弄两个大桶,不过这在一般的研究用实验室确实可能有点施展不开,我们是在车间的冷室进行的,搅拌用上置式。至于浪费水或溶剂,有时候是没有办法的事情。
产业化工艺的设计,工艺成本、工艺稳定性、因地制宜的可操作性,都要考虑。

作者: ending    时间: 2013-4-26 11:06

我们实验室准备购置一套用于实验分析和小量制备的膜分离装置,用来分离发酵液中蛋白,现在对这方面的信息不是很了解,想请教大家,像这样的装置一般多少money?如果有这方面的资料或者是书籍,希望各位大虾不吝赐教,我这里先拜过了!
作者: finger    时间: 2013-4-26 11:06

我们要生产的规模是3吨罐,发酵液下来有2.1吨,高密度发酵50%是菌体.在中试时是100L罐,采用的是设备是连续离心,不断补加发酵液,清液流出收集,待菌体沉淀一定量时手工挖去菌体,放大后由于菌浓过高,处理效率过低,此外上清液不够澄清.佩服XD_laurel 的见解,888老师说得很有道理.
现在用的厦门一家的陶瓷膜,0.8微米,澄清效果很好,目的蛋白透过率还可以,但就是料液稀释量过大,目前也没有好的解决办法,希望和大家多多交流学习.

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我还有一个难缠的问题,还请各位指教,我就把在微生物版板发的贴贴过来了:

各位专家:
我们公司在做一个酵母表达的蛋白品种,准备中试生产,在中间设备选型上碰到些问题,请专家们指教.酵母分泌表达的蛋白(6000Da)经柱层析纯化后,调pH至等点电沉淀目的蛋白后,实验过程中用小型高速离心机离心去除上清后得沉淀,但放大后,处理液体量过大,公司工程部的意见是选用带滤袋的低速离心机来富集沉淀,但在滤布选择上,我们试过小至5微米孔径的(厂家说的)对沉淀也几乎没有截留效果,这样看来,是不是这种方案行不通.也不知蛋白沉淀类产品生产中是如何富集,还请专家指点.

作者: finger    时间: 2013-4-26 11:07

有位国外专家跟我谈起,他们是用卧式离心机进行固液分离。

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我查了一下,卧式离心机也是需要有滤袋进行截留的,我这个蛋白沉淀没有合适的滤布可以截留.如果选择连续离心的话,成本就太高,还有就是我的样品液体量较大,而沉淀固体量相对较小.
领导的意思是想用过滤的方法来收集沉淀,G4的砂芯滤器又太易堵,中速滤纸及滤膜可以截留住沉淀,但处理速度上可能过慢,我又不清楚在工业生产都是采用什么样的方法来富集蛋白沉淀.
如传统生化方法提取的猪胰岛素,提到过多次锌盐沉淀,再过滤或是抽滤,我很想知道这在工业生产上是如何来实现的.还请各位专家指点.车间建设中,急啊!

作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 11:07

我们实验室准备购置一套用于实验分析和小量制备的膜分离装置,用来分离发酵液中蛋白,现在对这方面的信息不是很了解,想请教大家,像这样的装置一般多少money?如果有这方面的资料或者是书籍,希望各位大虾不吝赐教,我这里先拜过了!

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多少银子,不好一概而论。要看您的配置。
泵:从1000~10000不等;
Hold+管道+连接件+压力表:从5000~50000不等。不过我不建议您用太便宜的。一定要卫生级;
还要膜,很重要的。大约5000元
还有硅胶管。大约几百块。

作者: wu11998866    时间: 2013-4-26 11:08


请教:
我正做一色素,从植物中提取得到的,属花色苷类,单体分子量大约只有几百,但都以聚合体存在。对提取液,我试验用膜来初步纯化,结果是:0.02微米的陶瓷膜完全通过,而5000d的有机膜完全截留,有几点想法,不知是否可行,请提供帮助:
1、采用孔径小于0.02微米,而大于5000d的膜,截留除去更多的杂质,而让色素完全通过,是否可行?(由于我手头没有在这之间的膜,没有试验)
2、通常,一种植物的茎叶部分,分子大小在0.02微米与5000d之间,是否有很多的杂质(花色苷以外的成分),换名话说:草本植物的茎叶部分,在0.02微米与5000d之间,是否有更多的成分分布?

作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 11:08

您的试验,我需要确证一下几个问题
1,聚合体分子量到底多大 ?
2,您用的膜,虽然标示5KD和0.02um,实际情况怎么样 ?您需要用标准品去作标准曲线 ,确认分子量的可信度。
3,据我所知,0。02um的陶瓷膜,基本上不准确。
4,您的 色素成分,在膜上有吸附吗?
5,讨论叶子的成分分子量分布,基本上不可能。我 敢肯定的说,各种分子量均存在。有植物色素,蛋白质,核酸,叶绿素,多糖,脂类物质,应有尽有。毕竟它已经是高度进化的生物。
我建议:
1,确认聚合体的解离条件,在合适的条件下——尽可能让它解离时作试验。
2,如果作不到,就尽量试验用合适的分子量膜分离。选择的膜的分离“S”形曲线要尽量陡峭。不好的膜无法给出合适的结果,这样的话,你给出的结果只能把别人带到歧路。
等到有准确的结果后,再给你分析。
可以用常规的方法去除蛋白质和杂质,然后进一步分离。
仅供参考。

作者: wu11998866    时间: 2013-4-26 11:09



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您的试验,我需要确证一下几个问题
1,聚合体分子量到底多大 ?
2,您用的膜,虽然标示5KD和0.02um,实际情况怎么样 ?您需要用标准品去作标准曲线 ,确认分子量的可信度。
3,据我所知,0。02um的陶瓷膜,基本上不准确。
4,您的 色素成分,在 ...

非常感谢你为我解答!
1、聚合体分子量到底多大,我真是不清楚,因为它们之间主要以分子间作用力结合;
2、以前也用过膜,主要是中药注射剂除菌,但用膜来进行工艺研究还是第一次。我有疑问的是:买回来的膜都需要用标准品去验证吗?那岂不是将厂家应该做的工作让我们来做了?我的感觉是,正规的产品应该都是有出厂检验的,说到这里,我想到与膜生产厂家联系一下,毕竟,我的膜可都是上万元1支买回来的。
话再说回来,如果是用标准品验证的话,老兄有哪些这方面的经验,比如:常用的标准品、浓度、操作方法等,望指教。
3、如何简单快捷地检验膜是否有吸附?(膜可是装在套子里,看不见)
4、膜分离的“S”形曲线是什么意思?这主要是由膜自身决定的吗?
5、我手头没有万级分子量的膜,我想再买几支小一点的来试一试。
6、等有时间了,我想做几种植物的成分分子量分布,用不同孔径的膜分段截留,干燥每一段,称重,计算百分比,你认为可行否?
再次表示感谢!

作者: PCR    时间: 2013-4-26 11:09


1、测试膜截留分子量超滤一般采用相对应分子量的聚乙二醇溶液,看截留率来考察的,这些都应该是膜生产厂家来做的,一般的话,都不会相差太远了,除非膜本身有问题!!2、检验膜有没有吸附,要以收率来计算,就是过膜前后的色素总量的变化;3、对了想请教888wym 老师:膜分离的“S”形曲线是什么意思?4、如果需要万级分子量的膜,可以PM我!!

作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 11:09



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非常感谢你为我解答!
1、聚合体分子量到底多大,我真是不清楚,因为它们之间主要以分子间作用力结合;
2、以前也用过膜,主要是中药注射剂除菌,但用膜来进行工艺研究还是第一次。我有疑问的是:买回来的膜都需要用标准品去验 ...

我担心我的有些提法把您引导到不合适的途径。
归根到底,我们要用最简单的方法,最小的花费达到您想得到的结果。
之所以要您用标准品检验,那是因为 我拿不准您的膜到底有没有标准,来源如何?
如果有,而且很可靠,您就不必这样做。
您的分子量大小,很简单的办法是用标准品作色谱,一针就见分晓。
“S“形曲线,是指膜的截流是一个相对的概念。不是说10KD的膜,就是10KD以下全部透过,以上全部截流。把截流分子量的百分比和分子量大小做图得到的曲线,就是”S“形曲线。衡量这个标准就是”S“形曲线。
兼解答想卖膜的那位。不过我奇怪的是,你既然卖膜,不会不知道”S“形曲线吧?

作者: PCR    时间: 2013-4-26 11:10

大家都是代理国外膜的同行,一起交流讨论,不懂就请教!!只是“S”曲线这个说法比较少听说而已。谢谢fsdd817老师的指教!!还有想请问fsdd817老师一下,你的膜就比较标准吗?
作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 11:18



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非常感谢你为我解答!
1、聚合体分子量到底多大,我真是不清楚,因为它们之间主要以分子间作用力结合;
2、以前也用过膜,主要是中药注射剂除菌,但用膜来进行工艺研究还是第一次。我有疑问的是:买回来的膜都需要用标准品去验 ...

便的话,打电话给我。详细了解您的情况后,再给您建议。
我担心我的有些提法把您引导到不合适的途径。
归根到底,我们要用最简单的方法,最小的花费达到您想得到的结果。
之所以要您用标准品检验,那是因为 我拿不准您的膜到底有没有标准,来源如何?
如果有,而且很可靠,您就不必这样做。
您的分子量大小,很简单的办法是用标准品作色谱,一针就见分晓。
“S“形曲线,是指膜的截流是一个相对的概念。不是说10KD的膜,就是10KD以下全部透过,以上全部截流。把截流分子量的百分比和分子量大小做图得到的曲线,就是”S“形曲线。衡量这个标准就是”S“形曲线。
兼解答想卖膜的那位。不过我奇怪的是,你既然卖膜,不会不知道”S“形曲线吧?

作者: fox_79    时间: 2013-4-26 11:19

问个层析仪的问题
1,进口的层析仪除了AKTA 和Bio-rad外还有什么牌子的?实验室规模的,带UV,conductance,可连电脑. pH可带可不带.
2,用的是什么类型的泵,耐多少压.
3,大概多少价格
这里有知道这方面信息的么?谢谢回答

作者: one    时间: 2013-4-26 11:19


Waters有制备系统,泵耐压较高,更多用于制备反相,中低压用的较少,因为没有必要。PrepLC 300 ml价格估计要2~3万美金,连上检测器一共估计得5万美金。

好像Pall也有中低压层析系统。你可以打听一下

作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 11:20

问个层析仪的问题
1,进口的层析仪除了AKTA 和Bio-rad外还有什么牌子的?实验室规模的,带UV,conductance,可连电脑. pH可带可不带.
2,用的是什么类型的泵,耐多少压.
3,大概多少价格
这里有知道这方面信息的么?谢谢回答

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1,法国的BIOSEPR,也带PH
2,我说不上泵的名字,很古怪的泵,不大,但是很奇妙.如果一定要知道,我再帮您找答案.
3,大小价格不一样; 成交的价格大约: 1~100ml/min系统,60KUSD; 10~1000ml/min,90KUSD.
有兴趣的话,我再给您找资料.

作者: yes4    时间: 2013-4-26 11:20


请教:抗血清经硫酸氨沉淀以后,需去除其中的硫酸铵盐,透析相对繁琐。我想采用超滤的方法以达到透析的效果,由此就需要购买一套超滤设备。我对超滤设备所知不多,请帮忙推荐一下,包括泵的选择(应该会用到的吧)、超滤器的选择、膜的选择。需超滤的溶液体积为10L以内,目标蛋白是抗体,IgG的分子量应该是150kd。谢谢!

作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 11:20



QUOTE:
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请教:抗血清经硫酸氨沉淀以后,需去除其中的硫酸铵盐,透析相对繁琐。我想采用超滤的方法以达到透析的效果,由此就需要购买一套超滤设备。我对超滤设备所知不多,请帮忙推荐一下,包括泵的选择(应该会用到的吧)、超滤器的选择、 ...

选择10KD,或者30KD的膜。
小型0,1M2*2PCS
系统包括泵。

作者: fox_79    时间: 2013-4-26 11:26

Waters有制备系统,泵耐压较高,更多用于制备反相,中低压用的较少,因为没有必要。PrepLC 300 ml价格估计要2~3万美金,连上检测器一共估计得5万美金。

好像Pall也有中低压层析系统。你可以打听一下

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记得你也是做抗体方面的专家了
不知道你有私下的联系方式么,想私下交流一下,可以pm么?

作者: ROSE李    时间: 2013-4-26 11:27


仁兄好,我有一问题想向您请教,我的样品时经过制备HPLC制得的,样品浓度很低,主要含有乙腈、水和0.1%的TFA,我想请教一下,这样的溶液可以直接进行超滤,去除TFA浓缩样品吗?对了,我的样品大概是小分子的多肽,分子量比较小,1000d以上吧。如果直接超滤不行得话,将TFA转化成盐后再进行超滤能够达到去除盐、浓缩多肽的效果吗?如果可以的话应该用什么样的柱子?

我是这方面的新手,对于超滤一点也不懂,提得问题可能有些可笑,请仁兄包涵,并不吝赐教。

作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 11:27



QUOTE:
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仁兄好,我有一问题想向您请教,我的样品时经过制备HPLC制得的,样品浓度很低,主要含有乙腈、水和0.1%的TFA,我想请教一下,这样的溶液可以直接进行超滤,去除TFA浓缩样品吗?对了,我的样品大概是小分子的多肽,分子量比较小,1000d以上 ...

不是超滤的问题,是您的产品分子量太小,无法选择合适的膜来进行操作。用1kD对于膜的选择性,比较麻烦,虽然超滤脱盐是经常用到的。或者用1KD的膜,您的多肽损失很大。
作者: utt0989    时间: 2013-4-26 11:28

弱弱的问一下,17kD与我们平常使用的单位g/mol怎么换算
作者: utt0989    时间: 2013-4-26 11:29


我将一个螯合剂与单抗相连,螯合剂的分子量大约500,单抗的分子量是170000,连接以后有什么好的方法可以将它们分开呢?
因为我的单抗很少,一次实验只能投零点几mg,很怕损失,请各位老师给点建议,谢谢

作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 11:30

弱弱的问一下,17kD与我们平常使用的单位g/mol怎么换算

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17KD 是分子量的单位。g/mol是浓度单位。
根据您下面描述的,我的理解是您想知道:1摩尔17kd的单抗合多少克,是不是?
很简单,1摩尔17KD的单抗应该是17,000克。
这样,几毫克的单抗合多少毫摩尔,您可以计算一下。

作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 11:30

我将一个螯合剂与单抗相连,螯合剂的分子量大约500,单抗的分子量是170000,连接以后有什么好的方法可以将它们分开呢?
因为我的单抗很少,一次实验只能投零点几mg,很怕损失,请各位老师给点建议,谢谢

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从复合物中去除游离的鳌合剂,比较简单,直接用3K膜包切向流就可以了。
但是不能去除游离的单抗。
我的建议是:用高浓度的鳌合剂,加上贵重的单抗,反应结束后 超滤分离。

作者: fox_79    时间: 2013-4-26 11:33

抱歉。答应您尽快给你资料,但是一直没有。
该产品价格不菲,性能不错。

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非常感谢fsdd817兄,这个机器我貌似看到过的,第一次看见这个机器的样子时有点意外,一点都不象传统意义上的机器,不知道888兄能不能简单讲讲这个机器有什么过人之处.

另外价格大概要多少?

作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 11:34

我将一个螯合剂与单抗相连,螯合剂的分子量大约500,单抗的分子量是170000,连接以后有什么好的方法可以将它们分开呢?
因为我的单抗很少,一次实验只能投零点几mg,很怕损失,请各位老师给点建议,谢谢

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除此而外,您还可以用色谱的方法。分子筛或者亲和或者离子交换?根据您的条件,应该有不少色谱方法去做。
作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 11:34

这个机器我貌似看到过的,第一次看见这个机器的样子时有点意外,一点都不象传统意义上的机器,不知道888兄能不能简单讲讲这个机器有什么过人之处.
另外价格大概要多少?

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这里变成交易场所可不使我所希望的。所以我申明,我希望技术先导。商务不是这里主要考虑的。所以只能供参考。
基本上和阿ACTA差不多。
检测器很全面;
泵比较神奇
体积小;
流量大;1~100ml/min + 10~1000ml/min 2种
价格也不菲:USD80K, USD110K
不是为特殊研究用的话,不建议您买。

作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 11:35


中国生物化学泰斗邹承鲁逝世
  讣告:中国***优秀党员、九三学社社员、国际著名生物化学家、近代中国生物化学的奠基人之一、中国科学院院士、发展中国家(原第三世界)科学院院士、中国人民政治协商会议全国委员会第五、六、七届委员,八届常务委员,中国科学院生物物理研究所研究员邹承鲁先生于二零零六年十一月二十三日五时二十二分在北大医院因病逝世,享年八十三岁。
邹承鲁出生于1923年,上世纪40年代毕业于西南联大化学系,后到英国伦敦剑桥大学,师从凯林教授研究生物化学,获得剑桥大学博士学位。1951年回国后,在上海生化所从事酶的研究。
  他对呼吸链酶系的研究工作为我国酶学研究奠定了基础。50年代后期,他参加了中国胰岛素人工合成工作,在三个小组中负责A链和B链的拆合,从而确定了合成路线。他建立了蛋白质必需基团的化学修饰和活性丧失的定量关系公式和作图法,被称为邹氏公式和邹式作图法,被收入一些教科书。他的学术成果曾经多次荣获国家自然科学奖一、二、三等奖。1992年获得第三世界科学院生物学奖。

  ·2001年 在“核酸风波”中,公开指责生化学会专门委员会副秘书长为某核酸营养品作商业宣传。

  ·2002年 公开抨击徐荣祥“5年克隆人体器官206种”之说为伪科学。

  ·2003年 批评中国院士选举最大的毛病就是不透明。

  ·2004年 总结中国科技界7宗罪“一是伪造学历,伪造工作经历;伪造或篡改原始实验数据;抄袭、剽窃他人成果;贬低前人成果,自我夸张宣传;一稿两投甚至多投;在自己并无贡献的论文上署名;为商业广告作不符合实际的宣传。”


[ 本帖最后由 fsdd817 于 2013-4-26 11:36 编辑 ]
作者: is2011    时间: 2013-4-26 11:36

我想向您请教关于复性的问题,我通过原核表达生产了一个18个AA的小肽,它分子内有6个半胱氨酸,这个肽的天然结构是分子内有三对完全交叉的二硫键。
我现在是从几丁质亲和层析中纯化出这个小肽,可是我不知道下一步复性怎么做好。我得到这个小肽溶液中,有20mMTris,500mM氯化钠,1mMEDTA,少于50mM的DTT,我想用透析的方法除去这些杂质,可是找不到合适的透析袋,我的目的蛋白分子量为2KD,听说透析袋截留物质的大小应为目的蛋白的十分之一才合适,按照这个说法透析的方法就不适合了。请您给指点一下我下一步该怎样复性及除去杂质,先谢谢您了

作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 11:39

去除杂质的过程,也是小分子多肽损失的过程,这样小的肽,完全不损失不容易。
可以用超滤的方法,选择1000分子量的膜,减小TFF.也许可以。
PS:不是10倍, 是3~6倍。

作者: kswl870    时间: 2013-4-26 11:39

去除杂质的过程,也是小分子多肽损失的过程,这样小的肽,完全不损失不容易。
可以用超滤的方法,选择1000分子量的膜,减小TFF.也许可以。
PS:不是10倍, 是3~6倍。

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老师你好:
我有4个问题想向您请教:
1 TFF是什么东西呢,超滤是不是很贵呢?我查一次些资料说是超滤适合大规模生产操作,我现在只是实验阶段,用它是不是不适合呢?
2 我用透析可以么,透析袋有截留分子量为1000,也有500的,我要是只考虑除去DTT和盐是不是用截留分子量为500的就可以呢?
3 您知道哪个公司的透析袋质量即好又便宜?
4 我想用GSH/GSSG做复性体系,不除就活性测定,这样可以么

作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 11:40

老师你好:
我有4个问题想向您请教:
1 TFF是什么东西呢,超滤是不是很贵呢?我查一次些资料说是超滤适合大规模生产操作,我现在只是实验阶段,用它是不是不适合呢?
2 我用透析可以么,透析袋有截留分子量为1000,也有500的,我要是只考虑除去DTT和盐是不是用截留分子量为500的就可以呢?
3 您知道哪个公司的透析袋质量即好又便宜?
4 我想用GSH/GSSG做复性体系,不除就活性测定,这样可以么

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1,向您道歉。我把TMP写成TFF了。
前者是过膜压力, 计算公式:TMP=1/2(Pin+Pout)-Pperm
后者是切向流的简写。
TFF有从实验室到生产的所有产品。价格不是很低。大约几千美金到几万美金不等。
2,TFF不能解决的问题,透析基本上无望。两者基本上无差异。所谓500Da,那是标示,实际上有出入。可能1000,甚至更大。
3,这个我没有经验。记得当年试验用透析袋,基本上没有理想的结果。
4,看您的多肽在该条件下是否有活性了。若氧化态和还原态均有活性,那当然没有问题。否则就必须转换成有活性的分子状态。
仅供参考。

作者: 98776langtao    时间: 2013-4-26 11:41


知道 我看见了生物制药产业化的帖子有多高兴么?

面临课题选择的痛苦抉择:是坚持生物制药 还是随波逐流跟什么导师学什么.
当然我希望的是前者.
简单问一个问题.
为什么我看到药典上对蛋白质类药物没有详细说明其规格?含量要求?
基因公司生产的纯化了的蛋白规格为250IU,500IU售价高达几千
但是市面上出售的注射液产品理应是稀释了很多倍的却标明 规格3000IU,4000IU而且售价不足前者的十分之一

作者: yychen    时间: 2013-4-26 11:42


哪位大哥提供一些 离子交换层析技术 方面的资料 小弟急用

作者: nut6694    时间: 2013-4-26 11:42

我想把抗血清脱色,尽可能的保持抗体少损失,用什么树脂好呢?谢谢各位!
作者: TAT    时间: 2013-4-26 11:43

知道 我看见了生物制药产业化的帖子有多高兴么?

面临课题选择的痛苦抉择:是坚持生物制药 还是随波逐流跟什么导师学什么.
当然我希望的是前者.
简单问一个问题.
为什么我看到药典上对蛋白质类药物没有详细说明其规格?含量要求?
基因公司生产的纯化了的蛋白规格为250IU,500IU售价高达几千
但是市面上出售的注射液产品理应是稀释了很多倍的却标明 规格3000IU,4000IU而且售价不足前者的十分之一

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首先明确这是不一样的产品,治疗用蛋白与试剂蛋白配方是不一样的。治疗用蛋白是以剂型形式存在的,除了蛋白以外还有制剂配方存在,这种产品是复合成分。而好的试剂蛋白成分应该是单一的,举例说,如果考察细胞因子效果,这样的添加试验数据才有说服力。另外国内的蛋白虽然标明的单位很高,但往往是体外活性高,体内活性实际很低。
作者: sunnyB    时间: 2013-4-26 11:44

方便的话,打电话给我。详细了解您的情况后,再给您建议。
我担心我的有些提法把您引导到不合适的途径。
归根到底,我们要用最简单的方法,最小的花费达到您想得到的结果。
之所以要您用标准品检验,那是因为 我拿不准您的膜到底有没有标准,来源如何?
如果有,而且很可靠,您就不必这样做。
您的分子量大小,很简单的办法是用标准品作色谱,一针就见分晓。
“S“形曲线,是指膜的截流是一个相对的概念。不是说10KD的膜,就是10KD以下全部透过,以上全部截流。把截流分子量的百分比和分子量大小做图得到的曲线,就是”S“形曲线。衡量这个标准就是”S“形曲线。
兼解答想卖膜的那位。不过我奇怪的是,你既然卖膜,不会不知道”S“形曲线吧?

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请问fsdd817老师:选择膜包通常根据标称的截流分子量(MWCO),但不同厂家的标称同一MWCO值的膜包,”S“形曲线的区别还是挺大的吧?所以我如果想选择具有陡一点”S“形曲线的膜包,一般的膜包公司会提供”S“形曲线这一性能参数么?不过,感觉很多膜包的销售人员都不太懂这个.谢谢!

回答您的问题并给所有的朋友致歉。
近来由于个人的工作生活等事务,少有时间来此与大家参与,是我很遗憾的事情。以后争取多花一点时间。
您说得很好,确实陡的曲线当然好,但是我们要是不知道的话,就无法找供应商要求,合格的厂家是应该可以提供的。因为他们需要做验证,那验证需要有关于截流的数据,不管它是“陡”的还是“缓”的。
在这一行做了一些年头,知道个中的滋味。您说得没错,很多时候,需要我们自己懂。如今这个年头,忽悠的人不少,而销售可能比例更高,所以我们需要多了解情况,以免损失。


[ 本帖最后由 sunnyB 于 2013-4-26 11:45 编辑 ]
作者: utt0989    时间: 2013-4-26 12:10


请问,分子量在100万-200万之间的糖蛋白,比较粘,如果要使用膜过滤除杂的话,那几种膜可以使用的?可以用什么方法降低粘度?

作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 12:11



QUOTE:
原帖由 utt0989 于 2013-4-26 12:10 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请问,分子量在100万-200万之间的糖蛋白,比较粘,如果要使用膜过滤除杂的话,那几种膜可以使用的?可以用什么方法降低粘度?


请详细描述您的去除杂质是什么程度。如果仅仅是微米级别的,有聚丙烯滤器,聚醚风,等材质。还有深层滤器。
提高温度可以降低黏度,不过仅仅为去除杂质,则可以寻找滤器解决。

作者: tangxin_80    时间: 2013-4-26 12:12

您好,我现在对纯化后的样品做HPLC-SEC测纯度时候,用溶解纯化后的样品的缓冲液做对照也做HPLC-SEC。现在问题是我的样品的杂峰刚好合对照缓冲液的杂峰一样(出峰时间合出峰高度都一样)。请问我的样品怎么来确定纯度?如果抵消掉缓冲液的杂峰,样品的纯度就很高。可能是我纯化时用的缓冲液质量不好,如果这样的产品去报药的话,他们对缓冲液里面的峰怎么界定?谢谢!附两张对照图如下:


图片附件: 57090613.snap.jpg (2013-4-26 12:12, 23.55 KB) / 该附件被下载次数 12
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15862


作者: yychen    时间: 2013-4-26 12:13

不知楼主有没有微滤超和滤优化详细方式方法的资料?我是这方面的新手,目前用的是GE的中空纤维柱和膜包,虽然得到公司技术支持的当面指导,但是使用起来还是不能得心应手。
作者: JK.jon    时间: 2013-4-26 12:14

老师,你好,
我现在准备做两种偶联抗原的纯化,一种是牛血清白蛋白(BSA)偶联上一种农药小分子,因为偶联反应时肯定有BSA残留,还有其他杂质,我想问下我该怎么纯化出我想要的这种物质(BSA-农药小分子)呢?具体如何操作呢?
另一种是卵清蛋白(OVA)偶联同上农药小分子.要求也同上.

作者: JK.jon    时间: 2013-4-26 12:14


我如果用葡聚糖凝胶G-25过柱,pbs做洗脱剂,pbs会留在柱子里,还是一起留下来?
如果一起洗下来,我应该怎么处理,能去掉PBS的盐成分呢?因为我想尽量得到纯点的蛋白

作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 12:15

不知楼主有没有微滤超和滤优化详细方式方法的资料?我是这方面的新手,目前用的是GE的中空纤维柱和膜包,虽然得到公司技术支持的当面指导,但是使用起来还是不能得心应手。

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抱歉没有具体的资料。这个光看资料是很难 理解的。需要更进一步的交流---应用---交流---使用。。。。。。
我希望可以和您一起分享使用的问题。您可以联系我在您需要帮助的时候。

作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 12:15

老师,你好,
我现在准备做两种偶联抗原的纯化,一种是牛血清白蛋白(BSA)偶联上一种农药小分子,因为偶联反应时肯定有BSA残留,还有其他杂质,我想问下我该怎么纯化出我想要的这种物质(BSA-农药小分子)呢?具体如何操作呢?
另一种是卵清蛋白(OVA)偶联同上农药小分子.要求也同上.

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由于您从偶联复合物中去除蛋白,而蛋白的分子量占主要部分,所以常规的分子筛,超滤膜基本上对于2种成分没有分离度。建议您排除这样的考虑。除非您目的是去除小分子的药物。
您可能需要做2次考虑。首先去除小分子药物,用分子筛或者超滤均可以。在去除完全后再考虑去除BSA。这时候可以考虑药物的特殊性去考虑,比如亲和层析,金属鳌合类非特异性亲和层析等。
OVA一样。
需要补充说明的是,您的药物最好和蛋白有一定的结合常数,不能在结合后又重新脱落,那样的话会2比较麻烦。

作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 12:15

我如果用葡聚糖凝胶G-25过柱,pbs做洗脱剂,pbs会留在柱子里,还是一起留下来?
如果一起洗下来,我应该怎么处理,能去掉PBS的盐成分呢?因为我想尽量得到纯点的蛋白

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PBS一起下来。还有,您需要另外加上一种盐,比如NaCl,降低非特异性吸附,不然您的蛋白洗脱规律会有变化。
如果为了后面的 离子交换层析,您需要除盐。简单的办法是超滤更换缓冲溶液,用水去操作,结果会很好。
其他的操作,未必要求完全除盐,所以您需要了解条件。

作者: duoduo    时间: 2013-4-26 12:16


前辈,您好,我现在纯化一种带有二硫键的蛋白遇到一些问题。这个蛋白在大肠杆菌中表达复性后的活性形式是二聚体的,但是通过超滤浓缩和换体系后总是出现大量的四聚体甚至更高的多聚体形式,致使活性丧失。我想请教一下有什么方法能在超滤浓缩过程中避免这种高聚体的形成吗?多谢了。

作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 12:18



QUOTE:
原帖由 duoduo 于 2013-4-26 12:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

前辈,您好,我现在纯化一种带有二硫键的蛋白遇到一些问题。这个蛋白在大肠杆菌中表达复性后的活性形式是二聚体的,但是通过超滤浓缩和换体系后总是出现大量的四聚体甚至更高的多聚体形式,致使活性丧失。我想请教一下有什 ...

我想你遇到麻烦了.
以下几个你可以参考.
1.你试图找到可以保持2聚提的条件,包括离子强度,蛋白浓度,料液的环境条件,pH值
2,在形成多聚体之后,试图用还原剂还原,看能否恢复活性.
3,超率浓缩的前提条件是蛋白的活性,所以你一定要找一个跟踪蛋白活性的方法,每一个步骤都要紧跟.哪个步骤对蛋白活性造成影响,则赶紧停下来,找合适的方法.
4,更换的缓冲体系需要对你的蛋白稳定,你需要找这样的体系.
5,避免浓缩速度过快,导致浓缩问题出现. 蛋白聚合,活性丧失.
6,请把前后的工艺告诉我,也许可以给你一点建议.比如你更换缓冲体系的目的?

作者: duoduo    时间: 2013-4-26 12:18



QUOTE:
原帖由 fsdd817 于 2013-4-26 12:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


我想你遇到麻烦了.
以下几个你可以参考.
1.你试图找到可以保持2聚提的条件,包括离子强度,蛋白浓度,料液的环境条件,pH值
2,在形成多聚体之后,试图用还原剂还原,看能否恢复活性.
3,超率浓缩的前提条件是蛋白的活性, ...

非常感谢前辈的指点,我一定认真考虑您提出的这些建议。
是这样的,我的这个蛋白经表达复性后,使用了一步亲和纯化,通过盐梯度能够把单体和二聚体分开,但是此步得到的二聚体也不是很纯,会有少量高聚体混杂在里面,应该是在复性的时候就出现了高聚体吧。因为纯化后的溶液里面含有4M尿素,所以必须经更换体系将其除去。而且我这个蛋白水溶解性不好,如果没有尿素的存在需要在偏酸的环境下才能溶解。所以pH值在更换体系前后的变化也比较大,在纯化原液中为8,使用的是Tris,更换后使用的是Mes,pH值为5。在溶液中没有添加其他添加剂。最近我也看到一些文献说加一些一元醇或多元醇可以防止蛋白的聚集,我想在整个的超滤过程中加些甘油试试,可是又看到甘油的加入会在超滤过程中造成膜孔的堵塞,因为还没有试验,不知是不是这种情况。大体的情况就是这样,前辈还有什么好的建议吗?非常感谢!!!

作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 12:19



QUOTE:
原帖由 duoduo 于 2013-4-26 12:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
非常感谢前辈的指点,我一定认真考虑您提出的这些建议。
是这样的,我的这个蛋白经表达复性后,使用了一步亲和纯化,通过盐梯度能够把单体和二聚体分开,但是此步得到的二聚体也不是很纯,会有少量高聚体混杂在里面,应该是在复 ...

我们经常用的还原剂就是巯基乙醇.甘油也是还原剂.甘油的用量是比较小的,堵塞膜孔的说法似乎孔穴来风,您尽管用.
作者: 小野花    时间: 2013-4-26 12:19


小小建议,能不能在回复标题里标明一下阐述的内容啊,这样看起来有些头大,没有针对性

作者: zhezhe    时间: 2013-4-26 12:20

最近我们准备采用陶瓷膜微虑澄清发酵样品。目前有关陶瓷膜用于药品生产的工艺的非常少,大部分是在食品行业中。如果我们要采用这套工艺,为了今后的生产认证中需要了解那些方面的材料。谢谢
作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 12:20



QUOTE:
原帖由 zhezhe 于 2013-4-26 12:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
最近我们准备采用陶瓷膜微虑澄清发酵样品。目前有关陶瓷膜用于药品生产的工艺的非常少,大部分是在食品行业中。如果我们要采用这套工艺,为了今后的生产认证中需要了解那些方面的材料。谢谢 ...

如果你们用陶瓷膜,供应商会给您相应的技术支持和服务,您不必担心.当然需要正规的公司技术力量会好一些.
您所提到的内容,比较多,不是一二句就说完.您自己心理要清楚,和切向流有关的内容都要求考虑.包括工艺验证,工艺参数,清洗,膜本身的参数,回复率.等等

作者: ha111    时间: 2013-4-26 12:20

我用毕赤酵母来分泌表达mIL12,现在要从上清中分离纯化mIL12,不知该用什么方法,第一次接触蛋白质的纯化,无从下手呀,请您指教,谢谢。
作者: gogo    时间: 2013-4-26 12:21


各位蛋白纯化的高手,小弟有个难题请教:
1、先讲一下我要分离的蛋白,是大肠杆菌表达,形成了包含体,复性,用镍柱纯化,制剂,可见异物不合格,现在怀疑是某种不稳定的构象引起的,或者说复性不完全的蛋白聚合引起的。(该蛋白为碱性蛋白。)
2、HPLC反相柱分析,是单一峰,但用CHT(羟基磷灰石II型,20微米)的柱子却分出好多峰,条件越细化,峰越多。分析有几种可能:甲硫氨酸不均一表达;复性不完全,构象不同。

在用CHT纯化时,是用10mM-200mM磷酸盐梯度洗脱的,蛋白在分离过程中,构象是不是会改变?这样是不是就失去了分离不同构象的意义了。
我分了几个峰,然后拿去做质谱了。用浓缩管离心浓缩的时候是不是也容易引起构象变化,或者说变性?
我还拿几年前的样品分离了一下,发现峰的个数和洗脱的位置都差不多,就是有一个峰变大了,另一个峰变小了,是不是说明随着时间的延长,一个构象转换为另一个了?变多的构象应该是稳定的才对阿,不稳定的物质有转换为稳定构象的趋势吧,同时该构象也应该是活性差的吧,这样也就是说活性差的构象,反而是稳定的结构,这又和我们的出发点矛盾了,分离的目的是为了去除不稳定的结构阿,防止可见异物不合格。有点迷糊了,高手来解释一下。
另外,有没有更好的办法来分离或者找到可见异物不合格的原因?
哪里有卖羟基磷灰石 HPLC分析柱的?

作者: 雪花子    时间: 2013-4-26 12:21

有个难题请教:关于菌体碎片的分离方法。
我做的是大肠杆菌表达的一个酶,发酵后用管式离心机分离菌体,将菌体配成30%的菌悬液,高压均质机破菌,目的酶在液体里,需要分离出去菌体残渣,我用管式离心机不行,小试时用高速台式离心机能分离出来。但大生产时没有一万转的大离心机。请问那位有经验用过什么方法分离除去菌体碎片,上清液澄清。多谢!

作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 12:22



QUOTE:
原帖由 ha111 于 2013-4-26 12:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我用毕赤酵母来分泌表达mIL12,现在要从上清中分离纯化mIL12,不知该用什么方法,第一次接触蛋白质的纯化,无从下手呀,请您指教,谢谢。


1,澄清。固液分离。把上清分出来后,再进行下步分离 。
2,浓缩。将上清用合适大小的膜浓缩。注意分子量选择。
3,上层析分离。具体的可以摸索条件。各种层析方法的结合需要专业化设计。
抱歉晚复

作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 12:22



QUOTE:
原帖由 雪花子 于 2013-4-26 12:21 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
有个难题请教:关于菌体碎片的分离方法。
我做的是大肠杆菌表达的一个酶,发酵后用管式离心机分离菌体,将菌体配成30%的菌悬液,高压均质机破菌,目的酶在液体里,需要分离出去菌体残渣,我用管式离心机不行,小试时用高速台式离心机 ...

1,有很贵的离心机可以解决。比如阿法拉法的205离心机。
2,看您的固体量多大。如果太多则不适宜过滤分离,但是可以考虑滤板滤器。

作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 12:23


卫生级膜 总揽。
包括反渗透,纳滤,超滤还有微滤

作者: 66+77    时间: 2013-4-26 12:23

现在在公司工作,公司有套大型的膜过滤系统,每小时处理大概3立方的发酵液,现在清洗经常用酸和碱,但是总是无法除去超滤和纳虑膜上的油脂,不知道各位有没有这方面的经验,请赐教!
作者: ququer787    时间: 2013-4-26 12:24

我是新手,刚接触蛋白纯化及测序这块。我分得一小于1000分子量的肽,想要测序,但用Q-TOF-MS打出碎片离子,和空白溶剂峰的碎片差不多,没有样品的离子碎片,太奇怪了?这是困惑一!
只能试试氨基酸测序仪,但由于我的肽不是很纯,要用PVDF膜纯化,那请教fsdd817老师,我需要必备什么仪器什么材料,可以自己完成PVDF膜纯化?这是困惑二!需要 凝胶电泳吗?还是有膜有染色剂就行呢?
如果染色出现几条色带,那我如何判断哪条色带是我的目标肽呢?通过分子量吗?为什么?
紧急求助,感激不尽!!

作者: hulu呼噜    时间: 2013-4-26 12:24

看得出来您有丰富的专业经验,故借贵宝地发贴向您请教一下游纯化问题:我们有一细菌发酵所产蛋白,在柱层析、超滤、静置过程中,时不时会出现乳光想象(后面发现应该是蛋白析出的沉淀,而且只要出现这种想象,就算是静置在那里,溶液的乳光也会越来越明显,至最后有明显絮状沉淀析出,跟盐析析出状态类似)。样品超滤浓了是必定出现,首先想到的肯定怀疑蛋白质浓度高了,但在很稀的发酵液、层析后样品中也会出现;然后可能会考虑样品不纯,其它杂质干扰导致出现这种想象,但纯化后的纯品不论浓度大小一样也会出现。而且不同PH、离子强度都考察了,貌似跟它们都没什么关系。到底是什么原因导致这种想象发生的?请您帮忙分析分析。
作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 12:24



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原帖由 hulu呼噜 于 2013-4-26 12:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
看得出来您有丰富的专业经验,故借贵宝地发贴向您请教一下游纯化问题:我们有一细菌发酵所产蛋白,在柱层析、超滤、静置过程中,时不时会出现乳光想象(后面发现应该是蛋白析出的沉淀,而且只要出现这种想象,就算是静置在那里,溶液 ...


我建议您考虑一下聚合的问题。是不是有-s-s-键?你需要找到稳定的因素,如果聚合,电泳很容易分辨或者HPLC鉴别。还有您要考虑缓冲溶液的体系问题。没有具体的深入,不好下太多的结论。

作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 12:25

我是新手,刚接触蛋白纯化及测序这块。我分得一小于1000分子量的肽,想要测序,但用Q-TOF-MS打出碎片离子,和空白溶剂峰的碎片差不多,没有样品的离子碎片,太奇怪了?这是困惑一!
只能试试氨基酸测序仪,但由于我的肽不是很纯,要用PVDF膜纯化,那请教888wym老师,我需要必备什么仪器什么材料,可以自己完成PVDF膜纯化?这是困惑二!需要 凝胶电泳吗?还是有膜有染色剂就行呢?
如果染色出现几条色带,那我如何判断哪条色带是我的目标肽呢?通过分子量吗?为什么?
紧急求助,感激不尽!!

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可能是您的量不够。纯度不高的话,至少也有碎片离子峰。
不纯的样品去做飞行质谱,本身也有问题。如此小的肽片断,无法电泳。
您有标准品吗?否则您无法判断您的目标太。
这样小的分子,扩散能力很强,基本上电泳无望,染色无望,分离的话,我建议用RP-HPLC,因为这么小的分子,它已经和普通小分子的特性差别不大,此时建议您的思路不要和生物大分子研究思路一样。因为它就是小分子。
PVDF膜纯化也是要有原理的。主要借助吸附?
您的课题不是很容易。需要借助现代科技的手段。加上自己的智慧。

作者: mysmdbl    时间: 2013-4-26 12:43

向大侠请教:
我现在要分离生物活性肽,欲得到分子量在1500以下的小肽,我的分离思路是先过3000的超滤膜,然后用葡聚糖凝胶层析,之后用RP-HPLC分析。我想得到肽的氨基酸序列,不知以后该怎么做?还请楼主提些建议,谢谢!!

作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 12:47



QUOTE:
原帖由 mysmdbl 于 2013-4-26 12:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
向大侠请教:
我现在要分离生物活性肽,欲得到分子量在1500以下的小肽,我的分离思路是先过3000的超滤膜,然后用葡聚糖凝胶层析,之后用RP-HPLC分析。我想得到肽的氨基酸序列,不知以后该怎么做?还请楼主提些建议,谢谢!! ...

我建议您直接RP-HPLC-MS。除非您的体系有很多大分子蛋白。如果那样,您可以直接煮沸取出杂蛋白,比用3k的超滤要好很多。
在RP-HPLC得到需要的小肽之后,在进行氨基酸分析。古老的方法可以(末端氨基酸分析),新的技术也可以(MS)。
注意您的小肽不过1500小,大约10个左右的残基。应该比较好分析。不要太受干扰,它已经不是大分子物质了,而是类似于生物活性小分子。比如天然药物成分,也许您用天然药物研究思路更好一些。
供参考。

作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 12:55



QUOTE:
原帖由 mysmdbl 于 2013-4-26 12:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
向大侠请教:
我现在要分离生物活性肽,欲得到分子量在1500以下的小肽,我的分离思路是先过3000的超滤膜,然后用葡聚糖凝胶层析,之后用RP-HPLC分析。我想得到肽的氨基酸序列,不知以后该怎么做?还请楼主提些建议,谢谢!! ...

您用凝胶层析分离没有意义。
作者: 33号    时间: 2013-4-26 12:59

请教:抗血清经硫酸氨沉淀以后,需去除其中的硫酸铵盐,透析相对繁琐。我想采用超滤的方法以达到透析的效果,由此就需要购买一套超滤设备。我对超滤设备所知不多,请帮忙推荐一下,包括泵的选择(应该会用到的吧)、超滤器的选择、膜的选择。需超滤的溶液体积为10L以内,目标蛋白是抗体,IgG的分子量应该是150kd。谢谢!

选择10KD,或者30KD的膜。
小型0,1M2*2PCS
系统包括泵。

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请问为什么是选择10KD,或者30KD的膜呢?目的蛋白分子量不是有150kd吗?不可以选大一点的膜吗?那如果浓缩40kd的蛋白呢?
作者: jkobn    时间: 2013-4-26 13:00

请问前辈,我最近也在做IL-11的微滤条件的优化,在泵速恒定的情况下,进口压与flux一直在变,没有比较稳定,不知是什么缘故,我都不知该如何继续下去了
作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 13:00



QUOTE:
原帖由 33号 于 2013-4-26 12:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请教:抗血清经硫酸氨沉淀以后,需去除其中的硫酸铵盐,透析相对繁琐。我想采用超滤的方法以达到透析的效果,由此就需要购买一套超滤设备。我对超滤设备所知不多,请帮忙推荐一下,包括泵的选择(应该会用到的吧)、超滤器的选择、膜 ...


用30KD或者50KD均可.但是50KD需要小心丢失蛋白.
一般地,选择分子量差距为3~6倍.

作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 13:01



QUOTE:
原帖由 jkobn 于 2013-4-26 13:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请问前辈,我最近也在做IL-11的微滤条件的优化,在泵速恒定的情况下,进口压与flux一直在变,没有比较稳定,不知是什么缘故,我都不知该如何继续下去了 ...


一直在变化是正确的.如果不变化,那是不可能的.变化的趋势是压力越来越大,而透过流量越来越小.
您需要优化过膜压力和透过流量的关系.

作者: yueban-1147    时间: 2013-4-26 13:02

请教您:滤芯的起泡点在线测试怎么做,要不要用药液作?
作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 13:02



QUOTE:
原帖由 yueban-1147 于 2013-4-26 13:02 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请教您:滤芯的起泡点在线测试怎么做,要不要用药液作?

从符合FDA的要求来说,是需要用药液做的.方法在PDA26上有.
作者: IAM007    时间: 2013-4-26 13:04


楼主你好!我有一个蛋白昆虫细胞表达的,其疏水性很强,用较低的盐浓度就可以将目的蛋白沉淀,而一旦目的蛋白沉淀后只能用很高浓度的变性剂才能将目的蛋白较好溶解,目前初纯通过硫铵沉淀,再尿素溶再透析已经获得一定纯度的目的蛋白,但是在柱纯化时遇到同样的麻烦,在AKTA许多条件目的蛋白绝大多数不能挂柱,而在相同缓冲条件下过HPLC穿透中检不到目的蛋白,说明应该挂上去了,但是在用盐洗脱时应该是在柱子上发生聚集,只能用氢氧化钠才能将目的蛋白洗脱,许多条件下都是如此,后期使用尿素去洗发现洗脱效果还较佳,但是却发现尿素洗脱的纯化效果很差,推测应该是目的蛋白在聚集时共沉淀了许多杂蛋白了.....且透析后还会因沉淀损失一部分宝贵的目的蛋白。楼主认为对这种蛋白的柱纯化条件出路在何方?

作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 13:04



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楼主你好!我有一个蛋白昆虫细胞表达的,其疏水性很强,用较低的盐浓度就可以将目的蛋白沉淀,而一旦目的蛋白沉淀后只能用很高浓度的变性剂才能将目的蛋白较好溶解,目前初纯通过硫铵沉淀,再尿素溶再透析已经获得一定纯度的目 ...

这个问题我建议你找我师兄Chromatography 会更有帮助和解决办法(他在丁香园有最长的帖子).他是层析的专家,比我有办法.个人认为您的分析部分有道理,部分没有道理. AKTA和HPLC是一样的原理,不过是上样量,流动相流速等的不同,不该有不一样的结合常数.也许是检测方法的差异导致结果的差异,还有用NaOH不是洗脱,是那蛋白非特异打断成肽段,当然什么蛋白都会下来.如果疏水性很强,也可以考虑HIC啊.
作者: IAM007    时间: 2013-4-26 13:05



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这个问题我建议你找我师兄Chromatography 会更有帮助和解决办法(他在丁香园有最长的帖子).他是层析的专家,比我有办法.个人认为您的分析部分有道理,部分没有道理. AKTA和HPLC是一样的原理,不过是上样量,流动相流速 ...

嗯,多谢!NaOH洗时会那么快将蛋白打成肽段吗?我氢氧化钠洗后用WB检可检到活性,而且目的蛋白大小也基本一致,放置一段时间后蛋白才慢慢降解,我想问下氢氧化钠将蛋白洗下的瞬间是什么先使蛋白变性而使蛋白下来,还是那瞬间已经将蛋白打断了......本想上疏水的,但在样品中不不了高盐,补后目的蛋白会沉很多的,想不补盐直接上柱,你觉得这种蛋白不补盐能挂柱吗,而且除了20%乙醇,1%吐温,你是否还有其他更强的洗脱办法可以不影响活性且能透去?
作者: dog002    时间: 2013-4-26 13:05


老师您好,有个问题想请教您一下 就是说 进口的滤芯的材质有很多PVDF 聚醚砜材质等,他们各有什么特点,0.22流速又分别是什么,都适合用于什么样品,谢谢

作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 13:06



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老师您好,有个问题想请教您一下 就是说 进口的滤芯的材质有很多PVDF 聚醚砜材质等,他们各有什么特点,0.22流速又分别是什么,都适合用于什么样品,谢谢 ...

滤芯之所以有那么多的材质,当然有其存在的必要.
在实际的工作中,我们是需要知道制药工艺的具体应用是什么,然后选择合适的滤器,当然需要考虑的是材质选择,面积选择,流速选择,过滤气体还是液体,是澄清/预过滤/除菌还是病毒职员体等什么的.
至于PVDF/PES有什么特点,那多了去了,关键是要看您关注什么,比如孔隙率,耐受的灭菌温度和次数,化学兼容性等等.
我希望把您的要求说出来,我会给您适当的建议.

作者: xue258    时间: 2013-4-26 13:06

我做的是DMEM除菌,就是在培养细胞之前把DMEM过滤除菌,我问MILLIPORE 和PALL的工程师,分别告诉我用PVDF 和 PES,我就不知道该相信哪个了,所以想请问一下老师,还有我本身对滤芯材质和样品兼容性方面的 知识就很欠缺,不知道老师又什么好的建议
作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 13:07



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我做的是DMEM除菌,就是在培养细胞之前把DMEM过滤除菌,我问MILLIPORE 和PALL的工程师,分别告诉我用PVDF 和 PES,我就不知道该相信哪个了,所以想请问一下老师,还有我本身对滤芯材质和样品兼容性方面的 知识就很欠缺,不知道老师 ...

对于您这样的培养基除菌,是一个很简单的工艺.文中提及的2种材质都可以应用.但是我需要提醒您的是让对方提供您除菌的验证文件.
至于兼容性,您提到的培养基不过是普通的溶液而已,涉及不到强腐蚀性的问题,所以没有化学兼容性的问题.
当然,2者还是有一些区别的.比如开孔率,比如流速,在比如总的过滤通量等.

作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 13:07



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我做的是DMEM除菌,就是在培养细胞之前把DMEM过滤除菌,我问MILLIPORE 和PALL的工程师,分别告诉我用PVDF 和 PES,我就不知道该相信哪个了,所以想请问一下老师,还有我本身对滤芯材质和样品兼容性方面的 知识就很欠缺,不知道老师 ...


关于过滤方面的书籍,很坦白的说,少见.
个人认为这方面的知识是一个逐渐积累的过程.如果您有制药学基本知识,有GMP的认识,加上若干时间的实践,必要时候在进一步思考讨论,就会获得提高.单纯靠看一点资料是很难提高的.我的很多同事,资料不是不多,条件不是不好,在就职1年之后,仍旧专业知识不是很好,可以想见.
所以我觉得您还是把问题提出来,我们探讨,大家受益.或者您可以打我的电话我们更深入的交流.
以上愚见.

作者: xue258    时间: 2013-4-26 13:07


呵呵,准备比较试用GE,Millipore和赛多利斯及PALL的超滤系统,用来做澄清,浓缩和透析

作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 13:08



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呵呵,准备比较试用GE,Millipore和赛多利斯及PALL的超滤系统,用来做澄清,浓缩和透析

关于TFF,我已经作了一些介绍.相对说来,有更多的技术含量.
澄清/浓缩/洗滤是他们的应用.
建议做好实验设计.对结果影响很大.很重要!

作者: fsdd817    时间: 2013-4-26 13:08

我做的是DMEM除菌,就是在培养细胞之前把DMEM过滤除菌,我问MILLIPORE 和PALL的工程师,分别告诉我用PVDF 和 PES,我就不知道该相信哪个了,所以想请问一下老师,还有我本身对滤芯材质和样品兼容性方面的 知识就很欠缺,不知道老师又什么好的建议

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1,这两者都可以用。您需要注意的是选型--面积大小---价格优势---流速比较。
2,也许这个对您没有用处,因为4个月后我才看到这个。
3,很多工艺本来不是复杂的,主要是我们把它考虑的复杂了。





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