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标题: 【求助】WB实验，大分子量蛋白的内参、MARKER、... [打印本页]

作者: Ao7 时间: 2013-4-27 15:36 标题: 【求助】WB实验，大分子量蛋白的内参、MARKER、...

请教各位蛋白版高手，我最近准备做一个分子量为600多KD的大蛋白的WB实验，因该分子较大，内参选择、MARKER、转膜条件出现疑问。

因为平时大家常用的主要为B-actin，B-tubulin及GAPDH，但以上这3种分子量都不大，都在30－50KD左右，且我的待测蛋白可以和actin相互作用而不能选用actin。byd123版曾说过选择以上3种可能出现内参蛋白跑出去了而我的目的蛋白还没跑出来。所以请教大家，对于600多KD的大蛋白，B-tubulin及GAPDH能否选用？如可以选用，WB实验需要注意什么问题，可能出现哪些难处理的情况？如不可选用，应选用何种内参合适？另外，我的一抗为多克隆抗体，内参选择是选择单抗好还是多抗好？与一抗为多抗有没有关系和影响？

问题较多，请了解或做过大蛋白检测的高手给予指点，十分感谢各位的帮助！！！

marker的选择和转膜条件又是如何？请有大分子蛋白western经验的高手指教！谢谢！

作者: birdfish 时间: 2013-4-27 15:36

我做过3000KD titin，700KD nebulin以及427KD的dystrophin
titin用3%~10%梯度胶，beta-actin做内参
700KD及427KD，用8%胶
电泳槽采用六一 DYCZ-24E
我认为其他两种内参都可以选择
拟做的是骨架蛋白吧
有兴趣可以继续交流
我有详细的实验方法
包括蛋白的提取

作者: birdfish 时间: 2013-4-27 15:37

内参用santa cruz的鼠单抗都不错
我一直在用
我们公司的兔多抗，b-actin做人细胞组织的也不错
供你参考
santa cruz的一抗我有详细的稀释比例及预实验稀释度的摸索

作者: Ao7 时间: 2013-4-27 15:37

santa cruz的一抗好像蛮贵的，我买的目的蛋白的一抗便是santa cruz的，2000多，不知兄台买的是不是actin做内参，我做的是骨架蛋白，可以和微丝actin和微管结合和相互作用的，考虑actin和tubulin做内参可能都会影响结果，但国外权威cell文献都是用tubulin，故我也打算选择tubulin来做内参，兄台买的santa cruz的一抗花费多少？如你用的actin，是否与tubulin的详细稀释比例和预试验稀释度都会有所不同？
另外，大分子蛋白在梯度胶等选择配制上是否有讲究？听我们科一实验高手称如此大蛋白WB做起来恐怕难度比较大。不知可否多点分享兄台的成熟经验？
与兄台都是做骨架蛋白方面实验，也算有缘。可否分享兄台关于大分子骨架蛋白详细的实验方法，包括蛋白的提取。非常感谢！

作者: Ao7 时间: 2013-4-27 15:38

兄台用多大电流转膜?比如做700KDnebulin时？
我知道一般50KD左右的蛋白，50mA，1.5h，但大分子量的蛋白就不清楚了。

作者: birdfish 时间: 2013-4-27 15:38

santa 的一抗都在2800左右
GAPDH，beta-tubulin，beta-actin内参我都有
有兴趣可以匀一些给你
以前做nebulin与titin时只有beta-actin
所以就用它做内参
现在这三种内参都有了
不同的抗体稀释比例都不同
在相同的组织中用不同的提取方法做出来的效果都不一样
nebulin转膜条件：25mM tris，192mM glycine，0.1% SDS，20% methanol
湿转
300mA，2h30min左右

作者: birdfish 时间: 2013-4-27 15:40

nebulin胶浓度是7.5%
等我下班后看了记录再告诉你一些详细信息

作者: Ao7 时间: 2013-4-27 15:43

你用marker用的是那种？咱俩做的蛋白分子量都是超大，而一般marker最大值也就200多KD，如何选择合适的marker？用最大值200多的好像不好说明问题吧？
一开始打算做时信心满满的，现在听了好几个人都说这么大蛋白很难做WB，跑胶和转膜时可能出现困难，不知兄台在做的过程中是否遇到过此类问题？如何解决？今天一个专帮人做WB的公司本来还兴致勃勃的向我推销他们做得多好多好，结果一听我的分子量，都不敢接我的单了！说难度较大，有可能做不出来，真晕，对于我这个WB新手来说，年前想做完WB预试验确定该蛋白有没有意义看来难度很大啊！等我国外一抗过来可以开始可能离过年也就10多天了！着急啊！

作者: fei1226com 时间: 2013-4-27 15:43

不是打击你，难度太大了。
解决内参跑出去的问题，倒梯度胶。
转膜最好转过夜。
抗体没你想像的那么夸张，只要特异性够，随便都可以的。

作者: birdfish 时间: 2013-4-27 15:44

Marker就只有那么大了
你有多少样？
需要做多少张膜？
每张膜8个样
我可以接你的活
你只需要提供你的目的蛋白的抗体
内参与二抗我可以提供（不过内参的一抗要单独收取费用）
我就是用梯度胶做的
另外你要告诉我具体蛋白名称

作者: birdfish 时间: 2013-4-27 15:44

用分离胶3%~10%梯度胶，浓缩胶3%
内参你可以随便选哪一种
另外我还可以帮你把图片的数据都处理了
有兴趣可以和我联系（**）
做的是肌肉组织的吗？
你在北京吗？

作者: birdfish 时间: 2013-4-27 15:50

10天抗体能到的话应该就可以搞定了

作者: Ao7 时间: 2013-4-27 15:50

Marker就只有那么大了
你有多少样？
需要做多少张膜？
每张膜8个样
我可以接你的活
你只需要提供你的目的蛋白的抗体
内参与二抗我可以提供（不过内参的一抗要单独收取费用）
我就是用梯度胶做的
另外你要告诉我具体蛋白名称

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我看到有公司有卖600多KD的MARKER，不知兄台觉得有没有必要？普通MARKER能否说明问题？因为我看几篇做大蛋白的大牌杂志文章都是只选用最大200多的。
我有16个样，两张膜能够了吧？不过还得做MARKER，实在不行就少做一个样。
我在广州，现在只是预试验，接下去还要做不少WB。
我做的是肿瘤细胞，做的蛋白为MACF1。
一抗这两天马上到了，所以这几天还得请兄台多多指导哈！可惜不在同城无法当面感谢啊！还请版主多多加分！改天兄台过来广州可别忘了说一声。

作者: birdfish 时间: 2013-4-27 15:51

GE有一种Native-PAGE 的高分子量Marker
最大有600K
不适合SDS-PAGE
不过可以先确认一下条带的大概位置
祝你好运

作者: birdfish 时间: 2013-4-27 15:51

最好用梯度胶
可以保留内参

作者: Ao7 时间: 2013-4-27 15:52

一抗今晚到了，还算顺利，就看接下来的实验了。
附上一张cell文章的WB图，作者用的便是200多的marker，文章没给出，但我考虑可能是用了梯度胶。ACF7即我要检测的大蛋白。

图片附件: 24214739.jpg (2013-4-27 15:52, 22.25 KB) / 该附件被下载次数 16
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15876

作者: Ao7 时间: 2013-4-27 15:52

明天开始准备试剂，跟着师姐先看一遍，后天正式开工。内参使用实验室有的GAPDH，marker使用200多KD的试试先，梯度胶配制采用方兄的独家秘方，转膜条件参考方兄方法。
janlont战友说的一抗问题不用太过考虑，但我这个一抗比较特殊，有几点让我信心不是很足。它为santa公司的兔多抗，其他santa一抗说明书均会附WB图，但该抗体不知为何没有，此为其一；其二，该商业一抗目前仍未有文章使用过，总共10篇左右文章全部自己制备，我实在没这个精力时间去自行配制，毕竟只是预试验，不一定能出结果。而全世界只有这个蛋白一抗能满足我的实验条件，只能选它。所以我所担心的更多的是其非特异性而不是特异性，多抗毕竟特异性会高些，但非特异性就不好说了啊，弄不好出来N条带，到时可能影响实验结果判读。此外，也不知这个蛋白的表达情况，说不定条带太浅都可能，这个估计要自己摸一抗的浓度了。

谢谢方兄和其他战友的指点！我将随时反馈我的实验过程和结果！

作者: hot_hot_hot 时间: 2013-4-27 15:53

这么大的蛋白我也没做过，一抗为santa公司的兔多抗，santa公司的抗体出厂不做检验，质量如何还不好确定，而且还是多抗，估计会遇到一些困难。

建议：看到附上一张cell文章的WB图，作者用的便是200多的marker，
你也可照此办理，200多的marker，梯度胶

fangweibin119战友做过大蛋白，可参考他的实验条件。

蛋白先跑个PAGE，梯度胶，顺带200多的marker，看下大致位置有无条带

cell文章的WB条件可以重点参考，目的蛋白和你的一样，抗体你看下在哪买的，也可问下购买。

作者: birdfish 时间: 2013-4-27 15:54

梯度胶在转膜的时候要小心
3%的很软
自己多试试吧
把邮箱发给我
我把我们做的资料发给你

作者: bs4665 时间: 2013-4-27 15:54

我也在做大蛋白的WB，分子量约280KD，想用梯度胶来跑，一直未找到好的配方和条件，能否将你的资料发给我学习一下呢？

作者: jrwyyplt 时间: 2013-4-27 15:55

准备做260KD和310KD的蛋白，本来没什么信心的，看到楼上各位高手更大的都做出来了，鼓励鼓励，只是我的是分泌蛋白，不知道可以用什么做内参，愁啊！

作者: 白杨常成 时间: 2013-5-6 23:42 标题: 请教

请教各位高手，我也是面临同样的问题，不过我的蛋280，如何配胶呢，需要配梯度胶吗

作者: 小驴的理想 时间: 2014-12-26 14:58 标题: 回复 #2 birdfish 的帖子

麻烦问一下，您有膜蛋白的裂解液的配方吗？我最近做的dystrophin，但一直跑不出来。

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