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标题: 【求助】有用过Pierce膜蛋白提取试剂盒的群友请进 [打印本页]

作者: superboy 时间: 2013-4-27 16:05 标题: 【求助】有用过Pierce膜蛋白提取试剂盒的群友请进

小弟现在做一个膜蛋白的vwestern，分子量为50多，之前用RIPA的裂解液，还可以看到目的条带，但是很淡，为了更好的效果，小弟又专门订了Pierce膜蛋白提取试剂盒，结果很奇怪的就是按照它的提供的步骤，在最后一步时我始终看不到疏水相（目的蛋白所在层）与亲水相的分层，无法提取出目的蛋白，有用过Pierce膜蛋白提取试剂盒的战友请进来指点下什么原因，纠集中！万分感谢！！！

作者: yonger 时间: 2013-4-27 16:05

没用过，不是说现在默克出了个提膜蛋白的试剂盒还不错，不过我也没用过，不好意思

作者: woshituzhu 时间: 2013-4-27 16:06

我最近也在用Pierce膜蛋白提取试剂盒，我能清楚地看到疏水相与亲水相的分层，但是疏水相中加了loading buffer煮沸后，发现二者互溶不均匀，而且液体呈粘稠状，很难上样。

作者: qqq111 时间: 2013-4-27 16:06

我也正在用Pierce的盒子提膜蛋白其他都还好就是觉得浓度有点低你的疏水相不能直接加Loading,要先用他们盒子里面的试剂B稀释你的膜蛋白样品，然后才能上样，具体步骤：先将试剂B稀释4倍（用双蒸水），然后用稀释的B去稀释你的疏水相样品（稀释2到5倍），最后才加Loading。

作者: yonger 时间: 2013-4-27 16:06

各位战友好！我是提膜蛋白的新手。最近用Pierce的膜蛋白提取试剂盒，发现疏水相与亲水相是有分层，而且疏水相和亲水相体积差不多，得到的体积还是很大的，这样蛋白浓度不是很低吗？如果上样时再用bufferB稀释，岂不浓度更低？组织里提的膜蛋白加了loading buffer后，也是要煮沸才上样吗？有些说膜蛋白可以不用煮沸就上样。我昨天拿去跑SDS-PAGE,发现什么带也看不到，我是直接加loading上样，没有稀释，也没有煮沸，是因为这个原因还是蛋白浓度太低？

作者: xingyi08 时间: 2013-4-27 16:07

我用Pierce的 M-PER®Mammalian Protein Extraction Reagent 盒子提总蛋白，按照说明书离心完了之后没看见细胞碎片什么的沉淀，也没见到疏水层和亲水层的分层~液体也不粘稠~用碧云天BCA蛋白测定试剂盒检测，有蛋白存在，请问这样测出来的蛋白准确吗？园里有人用过这个试剂盒吗？恳请指教，谢谢~

作者: kuaizige 时间: 2013-4-27 16:07

Do not exceed 10 samples in one extraction procedure because rapid resolubilization of the hydrophobic phase into the
hydrophilic phase occurs at room temperature.
这是试剂盒里的一句话

作者: bs4665 时间: 2013-4-27 16:07

我们都很严格的按照说明书操作：用的是25ml的培养瓶来提蛋白，先用PBS冲洗2遍，然后用400UL的提取液，轻摇5MIN，然后吸取提取液，14000转5分种没分层，转10分钟也没分层。。。到底怎么回事呢？

作者: superboy 时间: 2013-4-27 16:08

Do not exceed 10 samples in one extraction procedure because rapid resolubilization of the hydrophobic phase into the
hydrophilic phase occurs at room temperature.
这是试剂盒里的一句话

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难道是要加入提取液5分钟之后，马上移入离心管，马上离心吗？

作者: lgm 时间: 2013-4-27 16:08

难道是要加入提取液5分钟之后，马上移入离心管，马上离心吗？

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这句话可能是指你在离心后如果没有及时将疏水层吸出，2者还会混起来。

作者: lgm 时间: 2013-4-27 16:09

我知道这个试剂盒的原理了：
在4℃时所有的蛋白质均可都溶于抽提Buffer，但在37℃时，抽提Buffer分为水相和去污相；此时亲水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污剂相中，根椐该性质分离出膜蛋白。
所以，离心之前的温度很重要，而且离心机应该是常温下的。

作者: superboy 时间: 2013-4-27 16:10

我知道这个试剂盒的原理了：
在4℃时所有的蛋白质均可都溶于抽提Buffer，但在37℃时，抽提Buffer分为水相和去污相；此时亲水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污剂相中，根椐该性质分离出膜蛋白。
所以，离心之前的温度很重要，而且离心机应该是常温下的。

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我是在常温下离心的，而且离心之后拿出来一看就是没有分层的。然后我分装了蛋白，用碧云天的BCA试剂盒测蛋白，有蛋白~所以我疑惑的是为什么一点沉淀物都没有的呢……

作者: lgm 时间: 2013-4-27 16:11

你做的试剂盒和楼主的不一样吧，那个分层只针对膜蛋白试剂盒，我没看普通蛋白的提取试剂盒

作者: cwcwcww 时间: 2013-4-27 16:12

这个试剂盒应该就是根据Triton X-114的提取原理来做的吧？我不用试剂盒，自己配试剂来做也做不出来分层，为啥啊？求大虾指点啊！！！

作者: greenbee 时间: 2013-4-27 16:12

我用Pierce的 M-PER®Mammalian Protein Extraction Reagent 盒子提总蛋白，按照说明书离心完了之后没看见细胞碎片什么的沉淀，也没见到疏水层和亲水层的分层~液体也不粘稠~用碧云天BCA蛋白测定试剂盒检测，有蛋白存在，请问这样测出来的蛋白准确吗？园里有人用过这个试剂盒吗？恳请指教，谢谢~

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你好我最近也在用这个试剂盒，但是蛋白浓度很低，可以交流交流吗

作者: 3648755 时间: 2013-4-27 16:13

我也正在用Pierce的盒子提膜蛋白其他都还好就是觉得浓度有点低你的疏水相不能直接加Loading,要先用他们盒子里面的试剂B稀释你的膜蛋白样品，然后才能上样，具体步骤：先将试剂B稀释4倍（用双蒸水），然后用稀释的B去稀释你的疏水相样品（稀释2到5倍），最后才加Loading。

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您好！请问您说的这个稀释B液的上样方法您尝试过吗？能看到目的带吗？

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