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标题: 【求助】诱导表达蛋白western鉴定不对 [打印本页]

作者: pengke1983 时间: 2013-4-27 16:38 标题: 【求助】诱导表达蛋白western鉴定不对

现构建pet28a+目的片段原核表达载体，目的片段带TAG终止密码子（重组质粒测序正确），IPTG诱导蛋白表达后理论蛋白大小约为19KD，现诱导后跑SDS-PAGE在20KD大小处出现目的蛋白！但用6*HIS tag标签抗体做western blot发现出现目的条带的确是14KD左右的蛋白！见图！这是为什么呢？将14KD蛋白切下做质谱鉴定并非所需目的蛋白！
望大侠们赐教！

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作者: zhenxin 时间: 2013-4-27 16:38

基本可以断定20KD是目的条带，14KD也许是载体上的一段产物
20KD条带用His抗体检测不到？
直接切20KD条带上质谱，以质谱结果为准

作者: pengke1983 时间: 2013-4-27 16:39 标题: 回复 #2 zhenxin 的帖子

可是20KD处western blot检测不到！难道要换载体？

作者: pengke1983 时间: 2013-4-27 16:39 标题: 回复 #2 zhenxin 的帖子

因为我后面要过镍柱纯化此蛋白！所以就算蛋白鉴定是对的，它不带His tag的话，该蛋白我也得不到啊！
是原使用的载体有问题吗？？求助！求助！

作者: hold住 时间: 2013-4-27 16:40

测序验证下翻译后是否还带有his标签，一定看好阅读框，包括his的阅读框。个人认为蛋白是表达出来了，抗体检测不到可能是由于表达的蛋白没有his标签。his标签的阅读框与蛋白的不一致。

作者: pengke1983 时间: 2013-4-27 16:40

重组载体已经测过序，阅读框也没有问题啊！his的阅读框也是对的！为什么SDS-PAGE跑出来再14KD的地方会出现含量这么高的蛋白，且空载体上也有！还带his标签？是原载体的原因？

作者: hold住 时间: 2013-4-27 16:40

QUOTE:

原帖由 pengke1983 于 2013-4-27 16:40 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

重组载体已经测过序，阅读框也没有问题啊！his的阅读框也是对的！为什么SDS-PAGE跑出来再14KD的地方会出现含量这么高的蛋白，且空载体上也有！还带his标签？是原载体的原因？ ...

哪个地方蛋白含量高应该很容易解释，因为没有诱导的也有很高的表达量。如果阅读框没有错，应该不会有这种情况阿。。。能够贴出从atg开始那部分序列？

作者: hold住 时间: 2013-4-27 16:41

看似一切都很正确。。。28a+里面有两个his，难道是翻译不是从第一个m开始，是从后面某一个开始，而后面那个his在同样的阅读框里面？？

作者: pengke1983 时间: 2013-4-27 16:41

第一个m是？引物加了终止密码子后面一个his应该不会表达啊？

作者: hold住 时间: 2013-4-27 16:42

QUOTE:

原帖由 pengke1983 于 2013-4-27 16:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
第一个m是？引物加了终止密码子后面一个his应该不会表达啊？

也对，搞不明白。。。
marker位置应该没有问题吧。。

作者: BOSS2011 时间: 2013-4-27 16:42 标题: 回复 #10 hold住的帖子

质谱鉴定下那个20kda的蛋白，看看到底是什么东西？也许一切都是巧合。。。也许你的序列有毒性。。。

作者: pengke1983 时间: 2013-4-27 16:43

质谱鉴定下那个20kda的蛋白，看看到底是什么东西？也许一切都是巧合。。。也许你的序列有毒性。。。

作者: pengke1983 时间: 2013-4-27 16:43

如果鉴定是目的蛋白那如何提出蛋白呢？如果序列有毒性，又该怎么处理呢？

作者: moonlight45 时间: 2013-4-27 16:45

请问楼主是否尝试纯化？结果如何？——
你的western结果是什么样的呢？

作者: pengke1983 时间: 2013-4-27 16:46

我原本是打算western做出来了再纯化的，先纯化再western有什么不同吗？

作者: pengke1983 时间: 2013-4-27 16:46

western的结果是在14KD的地方出现条带

作者: BOSS2011 时间: 2013-4-27 16:46

QUOTE:

原帖由 pengke1983 于 2013-4-27 16:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
如果鉴定是目的蛋白那如何提出蛋白呢？如果序列有毒性，又该怎么处理呢？

如果是目的蛋白，说明标签在表达过程中已经丢失，或载体构件的不对。

如果序列有毒性，处理起来比较麻烦，可以尝试降低温度，用其他的细胞表达，更换载体。。。

如果鉴定不是太难，建议先鉴定，找出问题所在。。

作者: glass 时间: 2013-4-27 16:48

估计你是N端测序的吧，那你应该没看下C端是不是含有14KD左右的目的基因，不知你所说的空载体是否确定是空载体，如果都没问题，那载体没问题啊，我们一般空载体不会出现这么明显的条带啊在14KD的位置。
载体没问题的话，不知你用的什么表达菌株，普通的BL21的话，应该没啥问题，现在好多公司推出新的产品，表达菌株，里面本身带有质粒的，用来表达毒蛋白，或者分子伴侣来提高目的蛋白的可溶性的；但这些的表达量也不会有这么高啊，而且是以包涵体形式表达啊。
个人感觉是载体的问题可能性比较大些，实在不行，换个表达载体啊，也很快的，祝好运！！

作者: wmp1234 时间: 2013-4-27 17:02

我严重怀疑你的细菌污染了，重新挑单克隆吧。
找出原因来回个贴啊

作者: yjf1026 时间: 2013-4-27 17:02

目的蛋白表达出来比估计的大一点很正常，可能有修饰什么的。

his tag没检测到可能是被降解了，降解片段在western中落在14kD也是有可能的吧

作者: gmjghh 时间: 2013-4-27 17:03

个人觉得还是表达成功了，建议做个小规模纯化看看

作者: wood533 时间: 2013-4-27 17:03

是吗？表达成功？做纯化，是过镍柱纯化吗？可是his tag没有啊！

作者: summerxx 时间: 2013-4-27 17:03

从胶图上看蛋白确实是表达了，就是D列中20 KD的那条带。至于western结果中14 KD砸出了条带说明那个蛋白中某个序列还有较高的His。你应该看出你的蛋白表达出来是以包涵体的形式出现的，说明蛋白表达过多过快，蛋白没有正确的折叠，或许只会跑胶的时候SDS也没有将蛋白C端的His-tag暴露出来，这也就是western鉴定不出条带的原因吧。

作者: pengke1983 时间: 2013-4-27 17:04

从胶图上看蛋白确实是表达了，就是D列中20 KD的那条带。至于western结果中14 KD砸出了条带说明那个蛋白中某个序列还有较高的His。你应该看出你的蛋白表达出来是以包涵体的形式出现的，说明蛋白表达过多过快，蛋白没有正确的折叠，或许只会跑胶的时候SDS也没有将蛋白C端的His-tag暴露出来，这也就是western鉴定不出条带的原因吧。

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重新做了几次实验后，可以确定的是菌未污染，20KD处应该是目的蛋白，14KD处是BL21（DE3）菌体本身存在的蛋白(如图)，WB在14KD处检测到条带应该是非特异性结合，也许是如“shangguannamao”所说在14KD处蛋白可能含较高His!20KD处WB未做出来可能是his tag没暴露出来！请问各位战友，我要怎么让his tag暴露出来呢？用尿素溶解包涵体变性后过镍柱纯化，再做WB？求教！！！有必要优化诱导温度和IPTG溶度，使可溶性蛋白增多吗？

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15882

作者: www.1 时间: 2013-4-27 17:05

请问你表达的条件是什么？IPTG浓度，诱导时间，温度？学习中

作者: pengke1983 时间: 2013-4-27 17:06

IPTG是1mM,诱导温度37度，时间4小时！未做温度梯度和浓度摸索！

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