分析测试百科

标题: 【求助】内毒素去除的新方法 [打印本页]

作者: wood533 时间: 2013-4-29 16:43 标题: 【求助】内毒素去除的新方法

通常去除内毒素的方法大多是过离子交换柱或者用萃取的方法,当然也有用亲和柱子的,可是都存在一个问题那就是处理的量小或者效果不好，我要介绍的方法是：
我们把去内毒素的亲和填料直接加到样品中，在室温或冷室中震荡，每隔6个小时检测上清的内毒素，直到合格为止，这样的好处是处理量大，操作简单，而且可以很方便检测，我觉得非常好用，下面是具体的方法：
实验步骤：
1．  将去内毒素琼脂糖凝胶FF在滤器中先用1－2倍凝胶体积的Buffer A抽洗，再用3－5倍凝胶体积的Buffer A将凝胶充分混匀，保持10min，用50－100倍凝胶体积的注射水分10－20次抽洗。
2．  根据样品溶液中内毒素的含量加入一定量经上述处理的去内毒素琼脂糖凝胶FF，于三角瓶中4℃、150rpm振荡48h。
3．  将以上样品无菌过滤，测内毒素含量。

作者: hustwb 时间: 2013-4-29 16:43

你的内毒素亲和填料是什么样的?是买的现成的吗?什么型号?
谢谢!

作者: wood533 时间: 2013-4-29 16:44 标题: 回复 #2 hustwb 的帖子

就是琼脂糖亲和凝胶,配基是小分子的,是现成的产品

作者: ukonptp 时间: 2013-4-29 16:45

请问去内毒素琼脂糖凝胶可以反复使用吗？还有如果样品是带负电的酸性多糖，该凝胶在吸附内毒素的同时是否也损耗样品？

作者: wood533 时间: 2013-4-29 16:46

可以反复用的,我们的实验就用去除带负电荷的样品,它很特异去除内毒素,不是靠离子交换的作用,因此样品损失很小,我们做的不到5%.

作者: zhezhe 时间: 2013-4-29 16:46

紧急：请问你们这种填料取出内毒素的效果如何？去除前后内毒素的含量各是多少Eu/ml？？谢谢！

作者: wood533 时间: 2013-4-29 16:47

效果不错,有药厂就在用,我们也用这个方法和填料去除病毒,核酸,和蛋白中的内毒素,没有处理前是几千EU/ml,处理后可以小于10EU,而样品回收率在95%左右.

作者: BOSS2011 时间: 2013-4-29 16:48

请问这种内毒素琼脂糖凝胶FF是不是DEAE Sepharose Fast Flow？

作者: BOSS2011 时间: 2013-4-29 16:49

和活性炭吸附效果相比怎么样？

作者: wood533 时间: 2013-4-29 16:50

请问这种内毒素琼脂糖凝胶FF是不是DEAE Sepharose Fast Flow？

==============================================================================================================

不是，这种填料只吸附内毒素，对别的物质没有影响，DEAE在内毒素含量很高或样品和她带一样电荷的情况下没有办法去除，和活性炭比它的效率更高，同时活性炭对样品也吸附很厉害，回收率不高。我们做过活性炭去除质粒中的内毒素，只能做到100-200EU,而样品回收率小，而用这种填料回收率高，去内毒素高的可以做到小于5EU/mg

作者: wu11998866 时间: 2013-4-29 16:50

我使用过PIERECE的去热原胶，效果挺好的，包装也不错，使用方法与楼主的方法相仿，包括BATCH法和层析法。
一般去热源步骤主要是用于制药上，请问楼主所提供的胶是否符合GMP的要求啊。在成本上是否与PIERECE的胶有竞争力啊。

作者: wood533 时间: 2013-4-29 16:58

价格肯定是比进口便宜，性能一样，有专门检测报告，符合GMP的要求是肯定的，现在就有药厂在用，不用它很难达到要求。

作者: wood533 时间: 2013-4-29 17:03

紧急：请问你们这种填料取出内毒素的效果如何？去除前后内毒素的含量各是多少Eu/ml？？谢谢！

=======================

效果不错，5000Eu左右/ml

作者: DDD 时间: 2013-4-29 17:07

提供另外一种方法 ——Triton X-114相分离技术，效果好，成本低。该方法我在多种重组蛋白的规模化生产的过程中实践过，要求是重组蛋白不能过于温度敏感以及高浓度下聚集沉淀。我有一片有关的文章准备发表，以下摘录部分文字内容贴上，但愿杂志编审不视作一稿两投。

在蛋白粗提液中加入1.0% Triton X-114，4℃磁力搅拌1小时，充分混溶；30℃水浴中放置40min，不时搅拌；25℃ 15000g离心15min，小心移出上层水相。
抽提进行两个循环；抽提过程中所用的玻璃器皿220℃烘烤2小时以上，塑料离心管用0.5M的NaOH浸泡1小时然后用三蒸水洗涮干净。

两轮抽提过程中，内毒素含量降低的幅度都在98%以上。这一结果表明，Triton X-114相分离法去除内毒素的效果，显然与蛋白溶液中内毒素的含量、Triton X-114的加入量都有关系。实际上，在本研究进行的过程中，我们也实验证实了在一定的浓度范围内，Triton X-114 的加入量与内毒素的去除效果呈正相关（结果未显示）。我们选择1%的Triton X-114加入量，是基于内毒素去除效果和蛋白回收率两方面的综合考虑。因为在抽提过程中，蛋白溶液的浓度基本不会变化，但蛋白溶液的体积会减少，而且减少的幅度与Triton X-114的加入量成正比。本研究所采用的Triton X-114相分离抽提方法，蛋白收率在85%以上。

两轮抽提过程中，内毒素含量降低的幅度都在98%以上。这一结果表明，Triton X-114相分离法去除内毒素的效果，显然与蛋白溶液中内毒素的含量、Triton X-114的加入量都有关系。实际上，在本研究进行的过程中，我们也实验证实了在一定的浓度范围内，Triton X-114 的加入量与内毒素的去除效果呈正相关（结果未显示）。我们选择1%的Triton X-114加入量，是基于内毒素去除效果和蛋白回收率两方面的综合考虑。因为在抽提过程中，蛋白溶液的浓度基本不会变化，但蛋白溶液的体积会减少，而且减少的幅度与Triton X-114的加入量成正比。本研究所采用的Triton X-114相分离抽提方法，蛋白收率在85%以上。

参考文献
[1] Aida Y, Pabst MJ. Removal of endotoxin from protein solutions by phase separation using Triton X-114. J. Immunol Meth , 1990, 132: 191-195
[2] Liu SG, Tobias R。 Removal of endotoxin from recombinant protein preparations. Clinical Biochem, 1997, 30: 455-463

作者: DDD 时间: 2013-4-29 17:08

补充一点：
采用相分离法去除内毒素，上层水相蛋白溶液中总会残留有极少量或者微量的Triton X-114。这些Triton X-114残留，是否会严重地干扰鲎试剂法测定内毒素的试验结果？本研究设计了一项试验，验证Triton X-114对鲎试剂灵敏度的影响，结果表明，0.01% 和0.1% 的Triton X-114，使得鲎试剂的灵敏度降低了一倍，从0.2-0.3EU/ml分别下降至0.6-0.7EU/ml和0.7-0.8EU/ml。。
0.01% 和0.1%的 Triton X-114使鲎试剂的灵敏度降低了2~4倍，而Triton X-114抽提前后内毒素水平则相差20倍至50倍（95%—98%）；测定抽提以后蛋白溶液内毒素含量，样品需要做数十至数万倍的稀释，其最终测定液中的Triton X-114浓度远远地低于0.01%。由此可以得出结论，虽然Triton X-114对鲎试剂的灵敏度的有一定的影响，但Triton X-114抽提去除细菌内毒素的效果是不容置疑的。

作者: wood533 时间: 2013-4-29 17:08

萃取的方法也是不错的选择,只是在制药过程中也许会要求检测Triton X-114在样品中的残留,不知道有什么办法解决这个问题.

作者: ritou1985 时间: 2013-4-29 17:25

相关疾病：
超敏反应
Triton X-114抽提，是在纯化之前进行，理论上看，抽提后蛋白溶液中残留的Triton X-114能够很容易地经过离子交换去除。
我还真地没有测定过最终样品中的 Triton X-114残留量，但是尝试过用0.5%Triton X-114溶液分别在小鼠、豚鼠和家兔上做了异常毒性、过敏和热源试验，结果都没有问题。

作者: dongdongqiang 时间: 2013-4-29 17:25

请问楼上，如果在纯化之前用triton x114抽提除内毒，怎么保证纯化过程中不会带入内毒素，最终蛋白溶液中内毒素水平是否能达标呢

作者: 831226 时间: 2013-4-29 17:26

回复楼上：去内毒素的相关器材都是经过处理的，就好了

作者: youyou99 时间: 2013-4-29 17:26

用polymyxin b Agarose应该很好吧？

作者: 969 时间: 2013-4-29 17:27

通常去除内毒素的方法大多是过离子交换柱或者用萃取的方法,当然也有用亲和柱子的,可是都存在一个问题那就是处理的量小或者效果不好，我要介绍的方法是：
我们把去内毒素的亲和填料直接加到样品中，在室温或冷室中震荡，每隔6个小时检测上清的内毒素，直到合格为止，这样的好处是处理量大，操作简单，而且可以很方便检测，我觉得非常好用，下面是具体的方法：
实验步骤：
1．将去内毒素琼脂糖凝胶FF在滤器中先用1－2倍凝胶体积的Buffer A抽洗，再用3－5倍凝胶体积的Buffer A将凝胶充分混匀，保持10min，用50－100倍凝胶体积的注射水分10－20次抽洗。
2．根据样品溶液中内毒素的含量加入一定量经上述处理的去内毒素琼脂糖凝胶FF，于三角瓶中4℃、150rpm振荡48h。
3．将以上样品无菌过滤，测内毒素含量。

=============================================================================================================

先道歉又翻出老帖子咨询楼主！
如果在变性的状况下，用植物油之类的萃取内毒素，然后用活性炭或者您说的亲和柱料吸附植物油里面的内毒素“再生”，这种方式以您的经验判断可行么！？

作者: wood533 时间: 2013-4-29 17:28

先道歉又翻出老帖子咨询楼主！
如果在变性的状况下，用植物油之类的萃取内毒素，然后用活性炭或者您说的亲和柱料吸附植物油里面的内毒素“再生”，这种方式以您的经验判断可行么！？

==============================================================================================================

如果是变性的蛋白，那你可直接选择亲和填料去，或用常规的阴离子柱去，还可triton萃取，萃取完的东西何必再生呢，何况怕也再生不了，还增加成本。

作者: 969 时间: 2013-4-29 17:29

如果是变性的蛋白，那你可直接选择亲和填料去，或用常规的阴离子柱去，还可triton萃取，萃取完的东西何必再生呢，何况怕也再生不了，还增加成本。

===============================================================================================================

感谢版主回复！想来您还记得我自己搞的那点东西，现在正琢磨着把整个原核蛋白的生产工艺捏出个自己的线路来。内毒素这东西是越不过去的坎，去除的好坏直接牵涉到产品的未来。对于去除内毒素方面仍然是菜鸟里面的菜鸟。倘若问出犯二的问题，您随便笑，没关系！
再生也是觉得活性炭毕竟比萃取液便宜的多，联想到汽车行业里面的奸商用活性炭再生废机油的事情，还有地沟油，……才有此一问。

作者: wood533 时间: 2013-4-29 17:30

感谢版主回复！想来您还记得我自己搞的那点东西，现在正琢磨着把整个原核蛋白的生产工艺捏出个自己的线路来。内毒素这东西是越不过去的坎，去除的好坏直接牵涉到产品的未来。对于去除内毒素方面仍然是菜鸟里面的菜鸟。倘若问出犯二的问题，您随便笑，没关系！
再生也是觉得活性炭毕竟比萃取液便宜的多，联想到汽车行业里面的奸商用活性炭再生废机油的事情，还有地沟油，……才有此一问。

=====================================================

笑倒不会，如果这样倒也可试试。因为我没用过萃取所以不清楚。

作者: 969 时间: 2013-4-29 17:30

还有一个问题，在包涵体状态下，如果浸泡于“萃取液”里面，内毒素会被全泡出来么？？包涵体应该是非常稳定的状态，在萃取液里面泡着不会出啥幺蛾子吧！？

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)