分析测试百科

标题: 【讨论帖】Blue-Native PAGE(BN-PAGE)技术讨论 [打印本页]

作者: ukonptp 时间: 2013-5-2 11:24 标题: 【讨论帖】Blue-Native PAGE(BN-PAGE)技术讨论

蓝绿温和胶(BN-PAGE)作为一种很好的电泳技术在蛋白质复合物的分离以及研究蛋白质与蛋白质相互作用中发挥着越来越重要的作用。在蛋白质组学日益发展的今天，越来越多的人用这项技术来研究蛋白质复合物以及亚基。大家可能会遇到各种各样的问题，希望大家能够对这项技术讨论。我做了两年的BN-PAGE，中间有不少弯路，也有一些经验，欢迎和大家交流。

作者: orangecake 时间: 2013-5-2 11:24

还不知道什么是BN-PAGE呢？能介绍一下，或介绍几篇文献吗？

作者: ukonptp 时间: 2013-5-2 11:25

QUOTE:

原帖由 orangecake 于 2013-5-2 11:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
还不知道什么是BN-PAGE呢？能介绍一下，或介绍几篇文献吗？

温和胶，简写为BN-PAGE，由Schägger等建立的一种电泳系统，最初被用来分离牛心脏组织中线粒体上的蛋白质复合体。由于在研究蛋白复合体上的优势，BN-PAGE被用于线粒体膜、类囊体膜、质膜等膜蛋白复合体的研究。在做植物类囊体膜的电泳时，结合叶绿素的蛋白质复合物呈绿色，而不含叶绿素的呈蓝色，因此又称之为蓝绿温和胶电泳。示意图如下：

图片附件: 12707952.snap.jpg (2013-5-2 11:25, 21.05 KB) / 该附件被下载次数 30
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15980

作者: bongte 时间: 2013-5-2 11:25

能否请楼主介绍一下自己做BN-2D的实验目的?
并且对BN-2D上分离的蛋白质该怎样分析?
又该怎么深入?
怎么确认?
怎样排除假阳性的复合物蛋白质点?
谢谢~

作者: ukonptp 时间: 2013-5-2 11:26

QUOTE:

原帖由 bongte 于 2013-5-2 11:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

能否请楼主介绍一下自己做BN-2D的实验目的?
并且对BN-2D上分离的蛋白质该怎样分析?
又该怎么深入?
怎么确认?
怎样排除假阳性的复合物蛋白质点?
谢谢~ ...

我最开始做bn的时候是用来做一个突变体，是因为这个突变体本身具有一些生理上的特性，开始只是用过来解释为什么有这样的特性。
至于对上面的点鉴定使用的是ESI-MS/MS的方法，蛋白点基本都鉴定出来了，大部分蛋白是已经研究过的，可以解释我们想要的事情，还有些是比较特殊的，要进一步深入研究，回到经典的方法上去。
至于你说的假阳性这个问题，基本质谱结果还是要做一些生物信息学的分析，如基本的分子量什么的来排除，这个可能和2d有些相似。
通过我的结果基本bn做质谱分析的话还是做串联比较好一点，普通的maldi可能结果不会很好。

作者: bongte 时间: 2013-5-2 11:27

QUOTE:

原帖由 ukonptp 于 2013-5-2 11:26 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我最开始做bn的时候是用来做一个突变体，是因为这个突变体本身具有一些生理上的特性，开始只是用过来解释为什么有这样的特性。
至于对上面的点鉴定使用的是ESI-MS/MS的方法，蛋白点基本都鉴定出来了，大部分蛋白是已经研究 ...

您老兄可能是误解我的意思了.
我是想请教,在没有实验hypothesis的情况下,
通过bn如何发现验证蛋白质复合物存在?
需要对每个蛋白质点都回到经典的方法上去研究?
似乎劳动量不少~
老兄有没有自己的一点经验和体会,
给后来人实验一点初期筛选的指导~
如4楼您贴出的mcp的paper就认为在虚线上的蛋白质点极有可能是通过对角线电泳分离的单个蛋白质点,而不是复合物上的一个组成.

还有想请问,有没有什么办法可以确认上bn前的蛋白质复合物是存在的,
也就是样品一定程度上还没有变性?
除了测酶活,还有什么办法么?
谢谢~

作者: ukonptp 时间: 2013-5-2 11:31 标题: 回复 #6 bongte 的帖子

通过实验发现新的蛋复合物，这个我想在线粒体和类囊体里面的可能性不大，至于质膜或者细胞质中的蛋白质复合物倒是有这种可能。我想要发现一个新的蛋白复合物存在的话还是要废不少精力的，要通过bn的方法发现可能首先实验的技术就很重要，michael11兄也做了一些，要把bn本身做好，一般也就是那些别人已经发现了的，要发现新的，可能在样品的制备上要下点功夫。至于在bn上发现了新的复合物再验证的话，这个方面我还没有做过，只是一些文献的参考，做一些蛋白质蛋白质相互作用来排除假阳性，或者是co-ip，或者是细胞学的定位看是不是有复合物的可能，总之工作量应该是比较大的。
我想通过bn的方法直接发现新的复合物可能比较困难，但是通过这种方法发现一些已有复合物的未知亚基（特别是一些小分子量的），还是有可能的，这些未知的亚基也还是很值得做的。
至于上样前确定复合物的存在，这个可能没有什么更好的方法，测酶活也只是确定一个已经研究的比较透的复合物存在，还是通过bn拿到结果就知道复合物是不是存在了。

作者: pengke1983 时间: 2013-5-2 11:53

最近数月一直在做BN，但一直没有跑出来比较满意的图。基本上第一向还可以，但转第二向后总是图上没几个点，最好的情况就是转出第一向上的2-3个条带。总体来说还是点比较少（和其他已发表了的文献上的图相比）。自己总结是样品处理的问题，本身BN的上样量有限，点不很多，而我的样品很可能上样前蛋白质的浓度就比较低。自己也想改进这一点，但不知道具体应该怎么办，希望各位能提供些好的意见，在此先表示感谢！

作者: ukonptp 时间: 2013-5-2 11:54

QUOTE:

原帖由 pengke1983 于 2013-5-2 11:53 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
最近数月一直在做BN，但一直没有跑出来比较满意的图。基本上第一向还可以，但转第二向后总是图上没几个点，最好的情况就是转出第一向上的2-3个条带。总体来说还是点比较少（和其他已发表了的文献上的图相比）。自己总结是样品 ...

BN对样品处理的要求还是很高的，不知道你是做什么样品的，以及你自己是怎么处理的，说出来我们好给建议。最好发出你现在做的图

作者: gogo 时间: 2013-5-2 11:54

我想请问一下, BN-PAGE实验需要特殊的仪器吗? 普通的western blot电泳设备能否用呢?

作者: ukonptp 时间: 2013-5-2 11:55

QUOTE:

原帖由 gogo 于 2013-5-2 11:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我想请问一下, BN-PAGE实验需要特殊的仪器吗? 普通的western blot电泳设备能否用呢?

不要很特殊的仪器，只要一个能灌梯度胶的梯度混合仪和一个恒流泵就可以了。

作者: yjf1026 时间: 2013-5-2 11:55

通过实验发现新的蛋复合物，这个我想在线粒体和类囊体里面的可能性不大，至于质膜或者细胞质中的蛋白质复合物倒是有这种可能。我想要发现一个新的蛋白复合物存在的话还是要废不少精力的，要通过bn的方法发现可能首先实验的技术就很重要，michael11兄也做了一些，要把bn本身做好，一般也就是那些别人已经发现了的，要发现新的，可能在样品的制备上要下点功夫。至于在bn上发现了新的复合物再验证的话，这个方面我还没有做过，只是一些文献的参考，做一些蛋白质蛋白质相互作用来排除假阳性，或者是co-ip，或者是细胞学的定位看是不是有复合物的可能，总之工作量应该是比较大的。
我想通过bn的方法直接发现新的复合物可能比较困难，但是通过这种方法发现一些已有复合物的未知亚基（特别是一些小分子量的），还是有可能的，这些未知的亚基也还是很值得做的。
至于上样前确定复合物的存在，这个可能没有什么更好的方法，测酶活也只是确定一个已经研究的比较透的复合物存在，还是通过bn拿到结果就知道复合物是不是存在了。

=================================================

我也在做BN-PAGE 您说很难找到新的复合物，不知道为什么啊

作者: moonlight45 时间: 2013-5-2 11:56

梯度混合仪和恒流泵我们都没有，想用pre-cast gels，但规格难定；
有人说电泳仪不需要特殊的，有人说小型的不行……我们有17cm和8cm的两种电泳槽，选哪种更好（目前准备订pre-cast gels）？

谢谢！

作者: zhezhe 时间: 2013-5-2 11:57

近一个月以来一直在做线粒体的bn-page ,但是感觉很难的，尤其是样品的制备方面，去垢剂和蛋白质的比例方面的，不知baiy大哥有没有好的办法。还有好的文章吗，发给我

作者: ukonptp 时间: 2013-5-2 11:57

QUOTE:

原帖由 moonlight45 于 2013-5-2 11:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
梯度混合仪和恒流泵我们都没有，想用pre-cast gels，但规格难定；
有人说电泳仪不需要特殊的，有人说小型的不行……我们有17cm和8cm的两种电泳槽，选哪种更好（目前准备订pre-cast gels）？

谢谢！ ...

我还是建议你自己买梯度混合仪和恒流泵做，那个也不是很贵，而且这个好像没有pre-cast gels，这个和一般的sds还是有点区别的。至于胶的大小，我看不能太小也不能太大，大约10左右比较好。而且最好是那种国产的简易槽，又省电极buffer，效果也好。

作者: ukonptp 时间: 2013-5-2 11:58

QUOTE:

原帖由 yjf1026 于 2013-5-2 11:55 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
通过实验发现新的蛋复合物，这个我想在线粒体和类囊体里面的可能性不大，至于质膜或者细胞质中的蛋白质复合物倒是有这种可能。我想要发现一个新的蛋白复合物存在的话还是要废不少精力的，要通过bn的方法发现可能首先实验的 ...

我是说想在别人已经做过的样品里面发现新的复合物比较困难，比如线粒体和类囊体。

作者: ukonptp 时间: 2013-5-2 11:59

QUOTE:

原帖由 zhezhe 于 2013-5-2 11:57 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
近一个月以来一直在做线粒体的bn-page ,但是感觉很难的，尤其是样品的制备方面，去垢剂和蛋白质的比例方面的，不知baiy大哥有没有好的办法。还有好的文章吗，发给我 ...

线粒体我的感觉是样品很重要，就是拿到比较纯的线粒体比较重要，另外一个方面是拿到线粒体以后的样品处理，percoll一定要去干净，这个很影响结果。至于去垢剂和蛋白质的比例方面，这个只能是你自己的样品自己做剃度，摸索好的条件了。现在我在北京，文章什么的等回去发给你，其实应该一般的文章都有吧。

作者: 8s5g 时间: 2013-5-2 11:59

请教各位,这个方法是不是针对膜蛋白的?拿来做全蛋白的话,是不是不容易分清楚?

作者: ukonptp 时间: 2013-5-2 12:06

QUOTE:

原帖由 8s5g 于 2013-5-2 11:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请教各位,这个方法是不是针对膜蛋白的?拿来做全蛋白的话,是不是不容易分清楚?

bn是用来分析蛋白质复合物及亚基的，全蛋白不是很好做。

作者: H2O 时间: 2013-5-2 12:07

真的没想到有这么多战友做bn,我也做过一阶段类囊体膜的,楼上有位所贴的protocol里的图就是我老板跑的.一直还井底之蛙的以为bn只是做叶绿体和线立体膜的
最近做松树的bn遇到点问题还想请教楼主: 最后用增溶剂增溶时总是溶不下来,跑出的条带还很淡,同样的方法做拟南芥和其他植物都没有问题.这是提取的问题还是其他的问题，望赐教!

作者: shenkunjie 时间: 2013-5-2 12:08

我想问一下，在做线粒体的bn-page 时，纯化线粒体用什么梯度比较好，纯化后的线粒体还得破碎线粒体膜吗？

作者: ukonptp 时间: 2013-5-2 12:10

真的没想到有这么多战友做bn,我也做过一阶段类囊体膜的,楼上有位所贴的protocol里的图就是我老板跑的.一直还井底之蛙的以为bn只是做叶绿体和线立体膜的
最近做松树的bn遇到点问题还想请教baiy老兄: 最后用增溶剂增溶时总是溶不下来,跑出的条带还很淡,同样的方法做拟南芥和其他植物都没有问题.这是提取的问题还是其他的问题，望赐教!

===============================================================================================================

这个可能和样品本身有关吧,不知道你做的是不是类囊体,如果是,我想可能是样品里面有些树特有的成份,那样的话最好是找树的叶绿体的提取方法.还有就是溶不下来的你再用sds跑跑看里面蛋白怎么样.
张立新老师实验室的,和我们老板是朋友啊,不知道是植物所还是兰大的,多多交流.

作者: ukonptp 时间: 2013-5-2 12:10

QUOTE:

原帖由 shenkunjie 于 2013-5-2 12:08 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我想问一下，在做线粒体的bn-page 时，纯化线粒体用什么梯度比较好，纯化后的线粒体还得破碎线粒体膜吗？

用percoll比较好一点,后面的问题protocol里面有,一定要提到好的样品才能做好.

作者: 荒漠孤驴 时间: 2013-5-2 12:13

植物percoll梯度离心剂怎么配制，还需要哪些特制的配制溶液马？

作者: 49888 时间: 2013-5-2 12:13

在做BN胶时用的bistris和SDS胶用的tris有什么区别？为什么有些抗体在BN胶上不好用啊？是什么原因吗？

作者: ukonptp 时间: 2013-5-2 12:14

bistris

图片附件: 22198396.gif (2013-5-2 12:14, 3.16 KB) / 该附件被下载次数 24
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15982

作者: ukonptp 时间: 2013-5-2 12:14

tris

图片附件: 19970421.gif (2013-5-2 12:14, 2.73 KB) / 该附件被下载次数 14
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15983

作者: ukonptp 时间: 2013-5-2 12:14

在做BN胶时用的bistris和SDS胶用的tris有什么区别？为什么有些抗体在BN胶上不好用啊？是什么原因吗？

==============================================================================================================

从结构式看起来bistris应该比tris的缓冲能力更强,这样更有利于保护复合物的完整性，这是我的理解。我也没有用tris做过bn，不知道效果怎么样。至于你说有些抗体在bn上不好用，不知道你做的什么样品，是不是在sds的时候能有好的结果，而在bn的时候出问题。这个可能是你的蛋白经过bn后量太少了。在抗体的识别上应该没有问题，大家都是经过sds变性的，蛋白都是伸展的结构。

作者: BOSS2011 时间: 2013-5-2 12:15

多谢！有些抗体不好用是你上传的做BN经典PROTOCOL中说的，还举了几个例子。“Some antibodies do not work in BN-PAGE, i.e. anti-BAP31 and anti-BAP29 antisera”。另外，蛋白应该是没有SDS变性吧，否则复合物将应该会完全打开。

作者: ukonptp 时间: 2013-5-2 12:16

bn后要经过第二向的sds啊,第二向就是一个变性的过程,中间也要经过一步平衡,平衡液里面就有sds,所以那里面说"Some antibodies do not work in BN-PAGE, i.e. anti-BAP31 and anti-BAP29 antisera, therefore, a second dimension has to be used in these cases."bn里面做不出western,我想应该就是结构的问题,复合物的存在使一些识别位点包裹在复合物的里面,所以出不了结果,这是单纯只做第一向bn的结果,经过第二向sds就不会有问题了.

作者: bongte 时间: 2013-5-2 12:16

请问膜蛋白复合体的分离还有哪些方法,
这些方法各自的优势和劣势各在哪里?
老兄在这方面应该有很多积累.
谢谢!

作者: ukonptp 时间: 2013-5-2 12:17

QUOTE:

原帖由 bongte 于 2013-5-2 12:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请问膜蛋白复合体的分离还有哪些方法,
这些方法各自的优势和劣势各在哪里?
老兄在这方面应该有很多积累.
谢谢!

不知道你说的膜蛋白蛋白质复合物是指什么意思，并没有专门分离膜蛋白复合体的方法啊，一般都是提取膜蛋白，然后从中用bn来分离里面的复合物。就像用分离得到的质膜来做质膜中的蛋白质复合物，用分离得到线粒体来做呼吸链。你说的方法是指用两相法分离质膜，用percoll或者蔗糖密度来分离线粒体吗？这里面可能没有什么可以比较的，大家一般都是用各自的方法来分离不同的亚细胞结构，比如植物组织质膜的话就是两相法，而线粒体是用percoll或者蔗糖密度来分离。最关键的是拿到比较纯的亚细胞组分，这对最后的bn分离还是很重要的。

作者: viviwang1987 时间: 2013-5-2 12:18

本人做BN/SDS-PAGE电泳已经两年有余，实验技术掌握得还不错，但是一直没有达到实验目的。我是想通过这个实验方法在细菌中获得合成一种小分子的酶系复合物，已经有很多证据暗示，参与此种小分子合成的几个重要的结构基因应该是一个Complex，有充分的体外和遗传学证据，但是没人从体内得到这个complex。首先我通过WB定位，基本上证实这个复合物是定位在细菌的细胞膜上的，所以我们就采用这个经典的分离膜蛋白复合物的方法去寻找，用的方法大致如下：破碎细胞－高速离心去除细胞碎片－高速上清超速离心（100,000g×2hr）去除上清即水溶性蛋白，留下沉淀（膜蛋白？）－用Buffer重悬沉淀，加入detergent溶膜，超速离心（200,000×2hr）去除未溶部分，进行BN/SDS-PAGE，一维时，就发现胶的整个泳道smear现象非常严重，所以在二维时，整个胶面的横纹（竖纹较少）很多，而游离的可鉴定的蛋白点很少。其中有四条横纹非常明显，而且恒定出现，为了解决这个横纹问题，尝试了很多方法，均未取得效果。不知道楼主做BN-PAGE的目的是什么，有没有遇到过这个问题？另外再请教一下，分离膜蛋白用我上述的方法是否得当？现有的资料分离膜蛋白的方法很多，超速离心的离心速度和时间也不是很统一。希望能得到楼主和其他各位同学的建议和帮助。

作者: ukonptp 时间: 2013-5-2 12:18 标题: 回复 #33 viviwang1987 的帖子

你可以把图贴上来，这样好讨论。
细菌的膜蛋白提取大约就是你这个方法了，但不知道你提到膜蛋白后是用什么样的buffer来增溶膜蛋白的。一般来说抛开你要的目的蛋白复合物不谈，应该还是能走出细菌膜蛋白复合物的漂亮的bn图。你说实验技术本身掌握的不错，不知道你走什么样的蛋白来说明这个问题的，是不是走其他样品的时候就能得到很好的结果。你说的胶的整个泳道smear现象，可能是样品里面有一些杂质，所以建议你提膜蛋白的时候多洗几次，也就是说用buffer溶好后再进行超离，然后再溶解，加入detergent，只有好的样品才能走好胶。
另外就是有可能你的目的蛋白是复合物，但就是表达量比较少，这样估计也很难得到很好的结果，其实通过co-ip的方法也能说明你要的问题啊。

作者: viviwang1987 时间: 2013-5-2 12:19

呵呵，首先谢谢楼主对我帖子作出的很快的反应，对于你最后提出的建议，作CO-IP，我已经做个这个实验了，但是因为用的是多克隆抗体，所以得到的免疫共沉淀的结果非常糟糕，条带很多，但是经过WB和取点作MS，没有得到目的蛋白以及可能与目的蛋白形成复合物的任何蛋白，如果想在CO-IP上有所进展的话，可能一是直接制备单抗，二是用抗原来纯化得到的多克隆抗体，以求得到意义上的“单抗”，此工作在进行中。关于膜蛋白的二维电泳，我用其他宿主的膜蛋白（例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌）进行BN/SDS-PAGE时，得到的二维电泳效果很好，点分布清晰，利于鉴定（我不会在这上面贴图)。而用我研究的宿主菌（链霉菌），其膜蛋白在二维电泳后，就出现我上个帖子所描述的结果。我溶膜的buffer的大致成分是：50mM bistris,750mM 6-ACA,1-3% detergent(tritonx-100 or DDM, SB3-10)。我研究的这个细菌是革兰氏阳性菌，产色素，这是与大肠杆菌和芽孢杆菌的主要两个区别。另外，这个经常出现的四条横纹我已经做过MS鉴定，是蛋白条带，属于多重跨膜的transport蛋白，查阅相关资料，的确是很重要的运载蛋白，参与宿主的初级和次级代谢，所以丰度很高，但是想不通的时，为什么在其他两株菌中，应该存在类似的transport蛋白，但没有出现横纹。等我把这个论坛上贴图的方法掌握了，我会把相应的图贴出来，以便讨论起来更容易和有针对性一些。

作者: ukonptp 时间: 2013-5-2 12:19

链霉菌的话，我想可能是膜蛋白的提取不太好办吧，毕竟和大肠杆菌和枯草芽孢杆菌这样的细菌不太一样。

作者: viviwang1987 时间: 2013-5-2 12:34

提取是没什么问题，就是溶膜方法有很多障碍，摸索了很多detergent以及不同detergent的组合，最终找到一种detergent可以把我的目的蛋白复合物溶出。下面的图是BN/SDS-PAGE的结果：右图存在明显四条带，且在不同detergent溶膜，均能在2-D gel上出现，经鉴定为四个重要的transport。

图片附件: 49305590.jpg (2013-5-2 12:34, 35.54 KB) / 该附件被下载次数 21
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15984

作者: viviwang1987 时间: 2013-5-2 12:36

另外请教一下楼主，有没有做过BN-PAGE后直接转膜做WB的实验？像这种具有大的complex的胶转膜需要注意些什么事项？我实验室只有湿转的条件。

作者: ukonptp 时间: 2013-5-2 12:37

看起来你应该bn本身走胶应该没有问题了，而且走的比较漂亮。从图上看基本还是样品的问题，也就是说你这种提膜的方法可能还要改进，就是提出的膜里面可能杂质太多，这种杂质就是链霉菌特有的了，而你即使用detergent溶解后还是会把杂质溶进去，然后走样品就会出现问题了。所以你还是再查查链霉菌膜蛋白的提取，毕竟和普通的大肠杆菌和枯草不一样，方便的话你把第一向也贴出来。
bn直接做western我没有做过，但是500kd的native－gel我还是做过的，湿转大约100v2.5h能做出来，所以我想如果很大的比如1000kd可能有问题，但是500kd的都还是能做出来的。

作者: bongte 时间: 2013-5-2 12:37

链霉菌手册中有关膜蛋白的提取方法描述较少，从事这方面研究的人也不是很多，所以很多东西都需要自己去摸索。不知道baiy兄弟说的detergent会把杂志溶进去是指的什么方面？我用detergent溶膜后，还要进行超速离心，200,000g×2hr，我想这个速度和时间，不溶的杂质应该差不多全部到沉淀里去了。下图为我跑的BN-PAGE胶。我近期可能会尝试做一下BN后的WB，尽量摸索点经验出来，到时会在这上面公布。

图片附件: 36891686.snap.jpg (2013-5-2 12:37, 18.81 KB) / 该附件被下载次数 21
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15985

作者: ukonptp 时间: 2013-5-2 12:39

因为链霉菌膜蛋白有点特别，所以我说的杂质是指那些按照你的膜蛋白提取方法提取到膜蛋白后，随着膜蛋白一起沉淀下来，也会溶进你的detergent，再超离也下不来，同时会对你的bn产生影响的物质。

作者: qqq111 时间: 2013-5-2 12:40

下面的图是转二向后做银染得到的,显影稍微显过了.从我的图上来看,点主要集中在胶的上面部分.也就是说我得到的小分子量的蛋白比较少．二向胶用的是10%的Tricine胶．我想请大家帮我分析一下问题出在哪里．谢谢！

图片附件: 17083109.snap.jpg (2013-5-2 12:40, 21.81 KB) / 该附件被下载次数 18
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15986

作者: kuaizige 时间: 2013-5-2 12:41

请问，做Blue-Native PAGE，buffer都不含有SDS，我的蛋白在14－100DK之间，用什么marker呢？

作者: ukonptp 时间: 2013-5-2 12:41

QUOTE:

原帖由 kuaizige 于 2013-5-2 12:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请问，做Blue-Native PAGE，buffer都不含有SDS，我的蛋白在14－100DK之间，用什么marker呢？

你的问题好像不是我们这个专题讨论的话题。
你要问的应该是native-page吧，这里讨论的是blue native-page.
你做native－page，应该没有什么marker这一说，只有把你的蛋白跑sds做比较才能知道分子量。

作者: memory 时间: 2013-5-2 12:42

你看我的图出现了下面的胶紧缩这种情况，还有就是上面背景很深，是什么原因造成的阿？还有高分子量的蛋白质marker在什么地方买阿？谢谢！

图片附件: 52428658.snap.jpg (2013-5-2 12:42, 27.05 KB) / 该附件被下载次数 18
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15987

作者: ukonptp 时间: 2013-5-2 12:42

这种紧缩的问题基本是因为你把第一向的胶放入第二向后，然后封胶，如果你用琼脂糖封胶，这样第一向胶左右两头就是琼脂糖，这样整个胶的上下电场强度不一致，当胶走的时候就会出现溴酚蓝走不平的现象，往往会走出一个＂哭脸＂的溴酚蓝，最后会导致胶下面紧缩．解决办法就是跑的时候电压稍小一点，以观察溴酚蓝走平为好．背景很深应该是你银染本身有问题吧．大分子量marker sigma有卖．

作者: memory 时间: 2013-5-2 12:42

sigma大分子量marker 的货号是多少？分子量范围在多大阿？

作者: ukonptp 时间: 2013-5-2 12:43

cuturl('http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search/ProductDetail/SIGMA/MWND500')
或者GE的货号17-0445-01
cuturl('http://www1.gelifesciences.com/aptrix/upp01077.nsf/Content/Products?OpenDocument&parentid=108791&moduleid=40404&zone=undefined')

作者: memory 时间: 2013-5-2 12:43

做线粒体bn-page时怎么样才能避免叶绿素的污染阿？含有叶绿素的线粒体会不会也能得到类囊体的蛋白质复合物阿？

作者: ukonptp 时间: 2013-5-2 12:43

QUOTE:

原帖由 memory 于 2013-5-2 12:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

做线粒体bn-page时怎么样才能避免叶绿素的污染阿？含有叶绿素的线粒体会不会也能得到类囊体的蛋白质复合物阿？

那就要看你提到的线粒体的纯度了

作者: memory 时间: 2013-5-2 12:44

QUOTE:

原帖由 ukonptp 于 2013-5-2 12:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

那就要看你提到的线粒体的纯度了

我走胶时用的是17*17cm型号的板，一般用多大的电压才能较好的防止第二向电泳过程中泳道弯曲的情况？我前几天试过100v电压，跑了14个小时才跑完,结果还是出现了这种情况，急啊！！！！

作者: ukonptp 时间: 2013-5-2 12:44

QUOTE:

原帖由 memory 于 2013-5-2 12:44 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我走胶时用的是17*17cm型号的板，一般用多大的电压才能较好的防止第二向电泳过程中泳道弯曲的情况？我前几天试过100v电压，跑了14个小时才跑完,结果还是出现了这种情况，急啊！！！！ ...

不知道你１７*１７是第一向还是第二向，还是都是．其实没有必要用这么大的槽，不管是第一向还是第二向．泳道弯曲和电压有点关系，但是也不完全是这样的．

作者: gogo 时间: 2013-5-2 12:48

相关疾病：
男性不育不育
我对BN-PAGE，只是从文献里知道有这么一回事，但没具体地研究过，看了上面的帖子，我有个想法不知可行吗，希望大家给与指导。我是研究植物雄性不育的，现在对雄性不育的理解大多数认为与线粒体有关，所以我觉得，能否将不育植株和可育植株的线粒体膜蛋白提取出来，跑个BN-PAGE

作者: ukonptp 时间: 2013-5-2 12:48

这个想法可以通过bn来看看，做一个比较的研究，但是bn只能来分析线粒体上那些蛋白复合物以及亚基，这些复合物是不是和你的研究相关，这个还是要通过文献来知道。另外，倒是可以通过普通的2d来看看蛋白表达的差异。

作者: gogo 时间: 2013-5-2 12:49

是的，我现在正做2d，只是觉得对bn比较感兴趣，好奇，这样我可以有一个思路

作者: wu11998866 时间: 2013-5-2 12:49

请问楼主，你看过nature protocol 上Hermann Schägger发的Tricine-SDS-PAGE没？我在这个版快上问了一个问题：第二向胶的下面部分没有很多点．但没有人回答．这几天我反复看了文献，Tricine-SDS-PAGE上有一句话似乎给了我答案．Setting the SDS/neutral detergent ratio to <10 may
result in a surprising result after staining: normally separated, large proteins may
be detected in the upper gel areas, but the lower gel areas may be completely clear　with no small proteins detectable.我第二向平衡SDS的浓度是１％．你平衡时sds的浓度是多少？这句话中所指的neutral detergent 是什么？是第一向处理样品时用的TX-100吗？望赐教．谢谢！

作者: ukonptp 时间: 2013-5-2 12:50

不知道你是想问单纯的tricine还是bn后tricine,照我的想法,如果你是单纯想看10kd以下的,那可以用tricine,如果小分子量的本身不是很多的话也sds就可以解决问题了.按照文献里的话triton是一种neutral detergent ,但是是不是SDS/neutral detergent ratio to <10 里所说的我就不知道了,因为你的样品虽然用triton处理了,但是跑过bn后triton浓度是多少就不知道了,所以你只有降低平衡时sds的浓度再试试就知道了.

作者: wu11998866 时间: 2013-5-2 12:50

谢谢楼主的回复.我是想问bn后跑tricine的情况.Setting the SDS/neutral detergent ratio to <10 may result in a surprising result after staining: normally separated, large proteins may be detected in the upper gel areas, but the lower gel areas may be completely clear　with no small proteins detectable.按照这句话的意思我觉得应该是升高平衡时sds的浓度才可以.文献上一般都是用的1%,但我试了很多次,每次总是下面没点.你觉得呢?

作者: ukonptp 时间: 2013-5-2 12:51

那你可以试试sds的浓度啊,不过如果是这样的话,你第二向可以直接做一个胶浓度大一点的sds-page,这样就可以确定样品里面有没有小分子量的了.

作者: DONT 时间: 2013-5-2 12:51

我刚刚做了依次BN-PAGE,未成功.叶绿素在胶的上面下不来,是什么问题啊,谢谢高人指点!!!

作者: ukonptp 时间: 2013-5-2 12:52

QUOTE:

原帖由 DONT 于 2013-5-2 12:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我刚刚做了依次BN-PAGE,未成功.叶绿素在胶的上面下不来,是什么问题啊,谢谢高人指点!!!

你最好把你的条件说清楚，这样不好判断。

作者: DONT 时间: 2013-5-2 12:52

QUOTE:

原帖由 ukonptp 于 2013-5-2 12:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你最好把你的条件说清楚，这样不好判断。

我用提取缓冲液(400 mM sucrose, 50 mM HEPES-KOH, pH 7.8, 10 mM
NaCl, and 2 mM MgCl)提取的类囊体膜后,用提取缓冲液悬浮,之后没有用330 mM sorbitol and 50 mM BisTris-HCl, pH 7.0 洗涤依次,而直接用 resuspension buffer (20% glycerol and 25 mMBisTris-HCl,pH 7.0)悬浮.DM增溶后上样后发现绿色下不来,一直在加样孔的低部,不知是不是没有洗涤的原因?希望指点!非常感谢!另外,我想请教一下baiy,你那有BN-PAGE做类囊体膜详细的PROTOCOL吗?如果有,能否传我一份,感激不尽!

作者: ukonptp 时间: 2013-5-2 12:52

你的样品应该用洗涤液洗涤后才行，这样就可以替换掉以前缓冲里面的成份，从而以bn的缓冲体系代替。你要的protocol传一份给你，估计你也有，就严格按照这个做就会出来了。

作者: kswl870 时间: 2013-5-2 12:53

恳请各位帮帮忙，我最近在做blue-native，在跑二维胶SDS-PAGE时发现浓缩胶凝的特别不好。具体操作如下：我将一维胶切下来之后，用1%SDS，2.5%巯基乙醇浸泡20min之后，用滤纸吸干剩余溶液，然后将胶条放在玻璃板之间，大约灌浓缩胶的位置，开始灌胶，当浓缩胶将其包埋时发现不凝。是不是残余的巯基乙醇影响的呢。请各位多提宝贵意见。

作者: DONT 时间: 2013-5-2 12:53

很高兴,最近的BN及二相SDS-PAGE终于做出来了!非常谢谢楼主！

作者: free 时间: 2013-5-2 12:54

有没有用BN胶做过核复合体的？

作者: zzzz 时间: 2013-5-2 12:54

楼主也来帮我一下啊，做blue-native需要什么特殊的仪器吗？除了做梯度胶的电泳槽不一样外，还有什么啊？英文的protocol上说的仪器设备很多啊，也看不太懂，能给俺简单的介绍一下吗？用中文的啊~~~

作者: huifeng0516 时间: 2013-5-2 12:54

请教大家，我现在在做温和电泳，实验的目的是分析施用钼元素对小麦类囊体膜蛋白复合体组分有怎样的影响？那在上样时必需要对照和处理样品的叶绿素含量相同吗

作者: PINK 时间: 2013-5-2 12:55

BN出现波浪形条带是怎么回事啊

作者: JK.jon 时间: 2013-5-2 12:55

看过操作过程，试过一次，简单的用G250+甘油处理后点样。
请问样品处理是不是也配的缓冲液，怎么配的？样品是纯化好的样品，不用再处理了吧

作者: 18702899757 时间: 2022-8-10 18:17 标题: 求解

QUOTE:

原帖由 ukonptp 于 2013-5-2 03:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
蓝绿温和胶(BN-PAGE)作为一种很好的电泳技术在蛋白质复合物的分离以及研究蛋白质与蛋白质相互作用中发挥着越来越重要的作用。在蛋白质组学日益发展的今天，越来越多的人用这项技术来研究蛋白质复合物以及亚基。大家可 ...

求解：在进行蓝绿温和电泳的过程中，前期观察到明显的条带（大概在浓缩胶阶段），但后期条带消失了是为啥呀？望联系1336617896@qq.com

作者: 18702899757 时间: 2022-8-10 18:18 标题: 求解

QUOTE:

求解：在进行蓝绿温和电泳的过程中，前期观察到明显的条带（大概在浓缩胶阶段），但后期条带消失了是为啥呀？望联系1336617896@qq.com

作者: 18702899757 时间: 2022-8-10 18:22 标题: 求解

各位大神，想请教一下，为何在BNPAGE第一向中，样品前期电泳是有条带的（在浓缩胶里），后期条带就消失了，一个也没有了（分离胶中），请问这种情况出现是为什么呀

作者: 再吃一个小丸子 时间: 2023-5-30 15:42 标题: blue native-PAGE的一些问题

大神你好，我想问一下有关blue native-PAGE的一些问题。我想做植物蛋白同源聚合物的实验，这个是个定位在叶绿体基质的蛋白（A），我想看它在WT和B蛋白突变体中的聚合状态，通过western blot。我现在需要通过western检测A蛋白和actin的量（在野生型和突变体中），我的蛋白一个酸性蛋白，一个碱性蛋白，普通native胶没办法同时做，想问问blue native-PAGE这个方法可行不？我跑完胶直接能直接做western吗？

作者: chenzhen2016 时间: 2023-7-6 16:34

蓝绿温和胶（BN-PAGE）是一种电泳技术，被广泛应用于蛋白质复合物的分离和研究蛋白质之间的相互作用。在蛋白质组学领域的快速发展中，BN-PAGE技术在研究蛋白质复合物和其亚基方面扮演着越来越重要的角色。

BN-PAGE技术具有以下几个特点：

温和条件：BN-PAGE在非变性条件下进行，避免了蛋白质的变性和聚集，有利于保持蛋白质的天然构象和功能。

蛋白质复合物分离：BN-PAGE能够有效地分离蛋白质复合物，通过限制性凝胶的孔径和电泳条件的调节，可以将蛋白质复合物分离成不同的亚基。

高分辨率：BN-PAGE具有较高的分辨率，能够分离不同大小和形状的蛋白质复合物，从而揭示复合物的组成和结构。

结合其他技术：BN-PAGE可以与其他技术如二维凝胶电泳、质谱等结合使用，进一步深入研究蛋白质复合物的组成和功能。

通过应用BN-PAGE技术，研究人员可以更好地了解蛋白质复合物的组成、相互作用以及在细胞过程中的功能。这对于揭示蛋白质相互作用网络、疾病机制等具有重要意义，并在药物研发和临床诊断中具有潜在应用前景。

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)