分析测试百科

标题: 【讨论帖】纯化工艺的放大 [打印本页]

作者: ffaa 时间: 2013-5-2 13:03 标题: 【讨论帖】纯化工艺的放大

论坛上很多人都很擅长于蛋白质的纯化，但是大家很少涉及与对于一个实验室的纯化方法是否可以放大成可行的纯化工艺，应用于生产，或者要求更高的话适合于GMP的种种验证。
正如GE公司所言：精心筹备的技术转化基础上建立起平稳、顺利的放大程序，将保证产品质量，节约整体成本，及时获得市场认可。
在这里我们可以举个例子说明工艺设计的重要性：例如：我们在纯化前处理时常常选择反复冻融（-20度）来破碎细胞（一般为几十毫升以下的样品），但是如果是在生产中处理几百升样品，等待样品溶化的时间成本以及在溶化过程中蛋白损失就是不可预计的，所以这种工艺是不适合放大的
例如：现在很多人使用protein A作为亲和层析配基，而在GMP中必须验证protein A的脱落是否对你的产品质量造成影响，如果你的产品是药，是否会引起病人的其它方面的副作用

现阶段正在研究纯化的工艺放大，想与在座的同志一起探讨一下：纯化工艺的放大

作者: ffaa 时间: 2013-5-2 13:03

首先介绍一下
工艺卫生的重要性：
Cleaning in place（CIP）：Test 100’s of cycles at small scale
目的：为了降低可能产生有害物质的产品的污染；延长凝胶的使用寿命，减少重装柱的次数
•  预防步骤
•  在位清洗（CIP）
•  在位消毒（SIP）
•  在位消毒 [SIP] 的目的是将微生物感染减到最低，绝大多数的微生物可用0.5-1M NaOH以该凝胶的建议流速洗约0.5-1小时消除。在位清洗 [CIP] 的目的是去除柱床内沉淀的及顽固残留的蛋白。凝胶在使用十次以后，最少做一次CIP。事实上，做CIP 时，往往已经包含了SIP，不必再重复。
•  生物活性物质的灭活

在位清洗（CIP）
•  可以避免污染物进入下一个步骤
•  延长层析柱的使用寿命
•  减少重新装柱的次数
•  每3-10循环后至少做一次CIP
•  最好使用倒流的方式

作者: ffaa 时间: 2013-5-2 13:04

首先：工艺设计考虑的因素包括：
•  原料的性质:蛋白，血浆，疫苗等
•  蛋白稳定性
•  产品特性
•  纯化的策略
•  过程优化（重要和不重要的参数）
•  可放大性和工艺稳定性
•  环境
•  专利
•  经济成本
•  文件和可行性计划
•  质量保证：分析方法和过程控制
在这里：哪些会影响产品稳定性？包括：蛋白浓度、游离蛋白、温度、促溶剂、pH、蛋白酶、辅助因子、Buffer组成

层析树脂的选择
•使用预装柱进行筛选：技术支持，可放大性，稳定供货，在NaOH中的稳定性
•选择有相应的检测方法的层析介质：载量，装柱，寿命，可重复性（验证三批连续批号的胶）这里考虑介质产家最好是能够提高符合GMP验证文件要求的产家，可以稳定供货

作者: ffaa 时间: 2013-5-2 13:04

对于层析参数的线性放大的一般原则是：
一般从小试到生产固定的参数是：相同线性流速、相同缓冲液、相同填料、相同柱高、相同的样品浓度和pH，相同的样品体积和柱床体积比例，相同梯度体积和柱床体积比例
放大的条件是：柱直径、体积流速，上样流速、上样体积、梯度体积

作者: KGZ564 时间: 2013-5-2 13:05

我说说我的了解吧。
我现在的公司就是中试规模的纯化生产，我自己也在制造部工作，从自己从事生产的体会感觉到以下几点可能是纯化工艺从实验室进入生产最为关键的：
1.工艺的稳定性。工艺稳定是必须的，因为如果从事的是药物生产，你工艺的稳定性是新药申报时很重要的一个看点。工艺不稳定，那么申报时不可能成功，而且在以后的生产过程的批记录里，每步的产量或产率都存在上下限，工艺不稳定的话，呵呵，经常要写偏差报告。
2.纯化工艺的成本。老板们都是资本家，原则上成本越低越好。所以纯化时的填料啊、试剂啊什么的越便宜越好。比如层析，能用DEAE 就不用Ni-NTA，试剂如果能用国产的就不用进口的。
3.纯化工艺的策略。就像大家都知道的一样，即使你的工艺很稳定，每步都有95%以上的收率，那么连续5步后是多少呢？77%左右，所以如何尽量减少纯化的步骤也是很重要的。
以上愚见，抛砖引玉喽，呵呵

作者: ffaa 时间: 2013-5-2 13:05

呵呵，谢谢楼上的见解

其实还有一点也很重要：就是在确定生产参数，必须是生产中可以接受的操作范围，例如缓冲液的pH，是不是非要7.4，7.3和7.2是不是也可以阿，因为在生产中大规模的缓冲液配制往往做不到特别的精确，因此在研发过程中必须要验证一个操作范围，在这个范围内纯化工艺都是可以做到。
例如以下参数范围是我们可以做的

图片附件: 62642587.jpg (2013-5-2 13:05, 56.11 KB) / 该附件被下载次数 10
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15990

作者: KGZ564 时间: 2013-5-2 13:06

是啊，一般来说生产过程中的溶液pH不会像实验规模那样容易控制。我觉得你做验证的范围可以是7.2~7.4，但是生产时的记录最好是这样控制：7.3+-0.05。这样在实际操作中用pH计完全可以做得到，而且你实际应用窄范围，验证宽范围也更符合GMP的要求。

作者: ffaa 时间: 2013-5-2 13:06

请问KGZ，对于载量的确定，你们是如何具体操作的？
我总感觉我们现在的方法不太科学

作者: ffaa 时间: 2013-5-2 13:07

在纯化放大时，常常涉及到一些基本的计算：
• Packed bed volume (L) = Column bed height (cm) * crosssectional area (cm2) * x10-3
• Settled chromatography medium volume (L) = Packed bed volume (L) * compression factor
• Slurry volume (L) = Settled chromatography medium volume (L) / (slurry concentration (%) * x*10-2)

因为我们现在用的是GE的介质，所以给大家推荐一个网站，计算就特别方便了
cuturl('http://www5.gelifesciences.com/aptrix/upp01396.nsf/Content/industrial_support~industrial_calculator~media_requirement')

图片附件: 27227480.jpg (2013-5-2 13:07, 79.91 KB) / 该附件被下载次数 14
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15991

作者: KGZ564 时间: 2013-5-2 13:07

您所说的层析用填料的载量吗？

自己来确定填料载量的确很麻烦，我们用的多得是买来的QIAGEN的Ni-NTA，它应该有载量验证文件，但我的确没有想过这个问题，也没有看过相关文件。因为我们使用时就是根据它所标称的理论载量来计算所需填料体积的。根本没有想过做这方面的验证，在药监局的检查中也没有过异议。按理说Ni-NTA再生后是应该确定载量的，这里应该有个验证，但是的确没有做过。

顺便提一句，就我使用的经验来说，进口填料的标称理论载量都略小于填料实际的载量，也就是说实际上比说明书上写的要大一些。看来老外们做事很有分寸也很严谨啊。

作者: ffaa 时间: 2013-5-2 13:07

是指填料的载量
确定载量，也是为了更好的节约成本，因为我们现在的产品附加值并不是特别高，而纯化往往也是成本最重要的部分

老外的确很严谨，曾经听别人说过，老外真的做CIP，用AKTAexplorer，做一百次，然后验证，感觉好奢侈哦，呵呵

作者: yes4 时间: 2013-5-2 13:08

请问大生产纯化过程中Tris-Hcl缓冲体系，是不是不能用于制药报药方面。

作者: KGZ564 时间: 2013-5-2 13:08

Tris-HCl可以用于制药方面，但是最好要根据产品的性质确定是否可以用，因为Tris是多氨基化合物，你至少要保证你的产品不与之反应，并且所用试剂也最好不能与Tris有反应，否则就要有相关物质的检验方法才行。因为Tris是极为常用的缓冲体系，有时这一点就容易被忽略了。而且Tris体系成本要高于磷酸盐缓冲体系，成本也要考虑。

举个不恰当的例子，以前我上学时做酶的固定化，用酶的游离氨基与固定化载体的环氧基反应，但是就是忽略了Tris的反应能力，所以采用了Tris作为缓冲液。结果Tris 与载体反应了很多，酶都没有连接上。换了磷酸盐就好了：）

作者: mimili_901 时间: 2013-5-2 13:08

Ni-NTA载量要看具体的蛋白,不同的蛋白吸附能力不一样,
纯化工艺设计按Capture, inetermediate purification,polish来设计,具体纯化时候Capture不一定用亲和,挂柱常用离子交换,楼上的举的例子是GE公司抗体药物纯化方法.

作者: mimili_901 时间: 2013-5-2 13:09

用离子交换是由于参数容易控制PH,离子强度.疏水的参数就比较难控制,样品一变化就难挂上去.

作者: ffaa 时间: 2013-5-2 13:09

QUOTE:

原帖由 mimili_901 于 2013-5-2 13:09 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
用离子交换是由于参数容易控制PH,离子强度.疏水的参数就比较难控制,样品一变化就难挂上去.

疏水层析pH：在pH5-8.5范围内疏水作用没有很大变化，pH<5.0疏水作用增加，pH>8.5疏水作用减弱
如果用上样高盐的buffer去处理样品，我做的大部分为破胞产物，所以在菌体复溶时就用上样buffer，大部分还是挺容易重复的，没遇见你所说的情况。能举例说一下吗？谢谢

作者: ffaa 时间: 2013-5-2 13:10

QUOTE:

原帖由 mimili_901 于 2013-5-2 13:08 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

Ni-NTA载量要看具体的蛋白,不同的蛋白吸附能力不一样,
纯化工艺设计按Capture, inetermediate purification,polish来设计,具体纯化时候Capture不一定用亲和,挂柱常用离子交换,楼上的举的例子是GE公司抗体药物纯化方 ...

同意，一般Capture都不会选择亲和，因为第一步的Capture毕竟杂蛋白还是比较多的

图片附件: 33491689.jpg (2013-5-2 13:10, 76.97 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15992

作者: ffaa 时间: 2013-5-2 13:10

在研发设计过程中，其实经过预装柱对填料的初选后，就要进行一些初步的计算，因为前面我们也说了：对于层析参数的线性放大的一般原则是：
一般从小试到生产固定的参数是：相同线性流速、相同缓冲液、相同填料、相同柱高、相同的样品浓度和pH，相同的样品体积和柱床体积比例，相同梯度体积和柱床体积比例
放大的条件是：柱直径、体积流速，上样流速、上样体积、梯度体积

所以在小规模必须估计你装多高的填料，放大以后使用什么样的柱子能满足你的生产要求

作者: kuaizige 时间: 2013-5-2 13:11

最近也在做蛋白纯化，感觉步骤挺繁琐，而且丢失也比较多，特别是用层析柱的方法，最后得率往往都很低，仅做实验用的蛋白有时候就要做好几次，很费时费力，再大量制备运用到实际（如临床）估计更难。所以，我也同大家一样，觉得纯化工艺要放大！还希望大家多多指教：）

作者: rxcc33 时间: 2013-5-2 13:11

在AKTA CLUB 交流时有人遇到这问题,具体目标蛋白记不得了,疏水结合的原理比离子交换复杂,不是很容易控制是正常的.

楼上建议你用大柱,不要小家子气一次做一点.

作者: ffaa 时间: 2013-5-2 13:12

我不是很赞成楼上用大柱的观点，特别是用大的预装柱

主要是从经济性方面来说这个问题吧，因为大柱子会涉及到用到很多的填料，如摸索纯化条件的时候，你往往不会用足柱子的载量，但是一般作几次循环之后你肯定要做CIP，柱子是有寿命的，做一般我们认为用的比较好的话100次CIP后你的填料也差不多了，那么实际上你是浪费了很多填料，而且在摸索过程中，大柱子以为你用更多的buffer，更多的样品，制备出来的产品也不一定合格。

一般我现在是采取三步进行放大：
1.首先用1~5ml的预装柱进行填料的初步筛选——在这里你必须确定你选用何种填料介质，大致的纯化工艺是什么（梯度洗脱？线形洗脱？每个梯度几个CV）
2.中试验证，计算你生产的处理量，如我上面所提到的计算方法，计算你想用的柱子（假如是BPSS400/200），填装的高度（假如20cm），那么我可以选用XK50的柱子装填20cm进行中试验证，就是根据你小试确定条件进行优化
3.生产，用BPSS400/200，填装的高度20cm，根据中试结果进行优化

图片附件: 16111203.jpg (2013-5-2 13:12, 56.71 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15993

作者: qiangren789 时间: 2013-5-2 13:12

我做的蛋白纯化也是要达到制药级标准，即纯度在95%以上。我按照GE的说明书进行纯化，增长了不少知识，推荐大家到GE的网站下handbook或protocols，很有帮助：）

作者: damingxia0904 时间: 2013-5-2 13:13

蛋白质的提取纯化的确很麻烦，正在做一蛋白，要求4度低温，用羧甲基-琼脂糖凝胶层析分离。这个条件实验室还是可以的，工业化生产可行吗？
尤其是羧甲基-琼脂糖凝胶是很贵的。
不知道各位，怎么对待这个问题的。
一般用什么柱子来分离？

作者: KGZ564 时间: 2013-5-2 13:13

实验室可以买个层析柜来保持4度的温度，但是生产时肯定不好处理。如果是药品的话，车间温度4度的低温车间好像没听说过，空调能耗太大了，如果用大的层析柜，那一个层析柜的验证也要烦死了。
至于凝胶是不是能用，这个可以做个小试，看看多少批次后凝胶的分离效果不能满足要求。然后核算一下。一般做高附加值产品的，基本上成本的大头不在层析填料上。其实再贵的填料只要生产商在生产，那肯定是有人用，只是你的产品附加值够不够了。呵呵，共同讨论吧

作者: ffaa 时间: 2013-5-2 13:14

我们现在是安装了一个向超市里面（放酸奶的）的4度的柜子，可以关门，隔成好几个区域，可以分别开关温控，人手进去操作就可以，如果是低温车间主要是人长期操作受不了

至于凝胶能不能用，赞成KGZ观点

作者: KGZ564 时间: 2013-5-2 13:14

想必楼楼上作的不是药吧，不然你的冷柜肯定要有一个验证。比如，你的冷柜内的温度分布，是否能在4度的显示温度下达到4度；长时间运行冷柜内温度分布是否会有变化；冷柜的清洁与消毒是否可以满足操作要求......估计一大本验证文件，呵呵，很烦啊。如果各位战友作的是药品的话，建议哪怕多花点钱也要买个有验证文件的设备（尤其是关键设备），以后会省不少事。

作者: ffaa 时间: 2013-5-2 13:15

恩，我不是做药的，所以对验证要求不是很严格

作者: yueban-1147 时间: 2013-5-2 13:15

验证真的很重要，而且相当繁琐！有很多制药公司在能用的情况下都省略了验证这一步，到了出问题的时候再想办法解决。有时候是得不偿失。

作者: ffaa 时间: 2013-5-2 13:17

今天刚发现的一本好的GE Healthcare BioProcess Product Guide 2007版，感觉很不错，分享一下吧
cuturl('http://wolfson.huji.ac.il/purification/PDF/Others/AMERSHAM_BioProcess.pdf')

图片附件: 85657734.jpg (2013-5-2 13:17, 36.34 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15994

作者: wmp1234 时间: 2013-5-2 13:18

论坛上很多人都很擅长于蛋白质的纯化，但是大家很少涉及与对于一个实验室的纯化方法是否可以放大成可行的纯化工艺，应用于生产，或者要求更高的话适合于GMP的种种验证。
正如GE公司所言：精心筹备的技术转化基础上建立起平稳、顺利的放大程序，将保证产品质量，节约整体成本，及时获得市场认可。
在这里我们可以举个例子说明工艺设计的重要性：例如：我们在纯化前处理时常常选择反复冻融（-20度）来破碎细胞（一般为几十毫升以下的样品），但是如果是在生产中处理几百升样品，等待样品溶化的时间成本以及在溶化过程中蛋白损失就是不可预计的，所以这种工艺是不适合放大的
例如：现在很多人使用protein A作为亲和层析配基，而在GMP中必须验证protein A的脱落是否对你的产品质量造成影响，如果你的产品是药，是否会引起病人的其它方面的副作用

现阶段正在研究纯化的工艺放大，想与在座的同志一起探讨一下：纯化工艺的放大

=============================================================================================================

就这个话题，结合我实际接触到的中试以上规模生产，说说自己的看法吧。
目前药用生物制品类别主要包括疫苗，抗体，重组蛋白，血液制品等。这几种从中下游工艺上说流程有些相似，但也有很大不同，因此从实验室规模放大到生产规模，路线也是不同的。

国内企业疫苗生产一般采用300L以上的发酵罐，也有750L规模的，比如霍乱疫苗等。而后续的纯化主要采用层析分离。世界最大的疫苗生产商GSK也采用AMERSHAM的介质进行纯化，GE的产品手册上有相关介绍。

对抗体而言，目前主要的单抗生产方法才有体内法和体外法，各有优劣。而大规模制备单抗一般采用体外培养杂交瘤细胞，然后纯化培养液上清中的单抗。相对来说，发酵阶段更为关键，培养周期，细胞活性/密度，发酵工艺都会很大程度影响单抗的表达量。而纯化之前的预处理同样重要，直接决定纯化等后续步骤是否顺利。而这些是和小量培养不同的。通常单抗表达周期很长，一般都要超过1个月以上的连续培养/换液/收集。一次性可以纯化克级以上产物，纯化系统一般采用AKTA就可以满足要求。

原核表达重组蛋白的放大生产，难度最大在于大规模复性。通常大肠杆菌/酵母/CHO细胞宿主，表达工艺相对成熟和稳定，不需要采用特别复杂的优化手段。而复性却因蛋白而异，也是极大的难点。由于重组蛋白药物剂量一般很小，生产规模并非很大。一次性生产数十毫克就足够。拿大肠杆菌来说，采用100L的高密度发酵，一次可以制备2000~4000g湿菌体，包含体质量可以达到100g。对于复性来说，这个含量就非常大了。而目前的稀释复性和透析复性都是最常用的方法，也相对稳定。一次复性10g包含体，复性液体积达到200L。一般可以在24h之内以100ml/min的流速采用2L左右柱床体积的离子交换凝胶或疏水凝胶捕获，最后再进一步精细纯化分离。

我个人感觉，中式规模以上生产一般需要考虑设备和生产周期方面的因素更多，而工艺优化并非最主要的内容，因为很难在很大的规模上去摸索工艺条件，更多的是建立在经验和实验室水平的工艺参数基础上。

作者: ha111 时间: 2013-5-2 13:18

还是有点麻烦，收率低得很。国内做的厂家都不多。只有二十多家而已。

作者: gmjghh 时间: 2013-5-2 13:19

各位战友说的都很全面。

任何一个药用蛋白的中试生产乃至放大到生产规模，都是以前期实验室规模的小试研发作为基础的。放大的成功与否很大程度上取决于小试的前期研发工作是否扎实，是否经得起推敲。
参数优化和重要参数的验证都非常重要，这根本上决定了工艺是否稳定，从而保证能够生产出质量可靠的产品。
查阅国外的一些资料，看到生产过程中每个操作，乃至每个小的细节都严格的控制各种参数，而每个参数的确定都本着科学性的原则有严谨的数据加以支持，这正是质量合格可靠的必要条件。
中式放大过程要以小试为基础，尽量控制减小与小试试验参数的偏差，这是放大成功的保证。

做一个产品，到了生产规模，优化的工作已经不是最主要的了，更重要的是生产过程的统筹设计，这是个数学问题了。

有关抗体的工艺放大想说几句。
治疗用抗体的剂量在 500~600mg/dose，这样大的剂量使得纯化的概念和目前国内大多数规模的生产有不小的差别。1g 抗体只够两个剂量。柱子规模也会大不少。
亲和层析是最常用的capture步骤，有关脱落配基的问题，GE应该会提供相关文件，一般要求polish后，产品中PrA含量<10ppm。
内毒素的控制非常严格，一般要求<0.1EU/mg，相比1mg/dose （5EU/kg/dose）而言, 内毒素限度要严格N倍。

作者: hyuu 时间: 2013-5-2 13:19

我看到你在另一个贴子上讲,国内有的厂家都有用1M直径的色谱柱了,这么大的生产规模用的是什么基质的填料,sepharose 还是聚苯乙烯类的? 我看了一些资料,这么大的色谱柱GE和pall有,价钱很高.
要从生产规模上来看,我了解胰岛素的生产,通化东宝的生产规模应该用得上这么大的色谱柱.

作者: ero11 时间: 2013-5-2 13:20

用这么大的大多都是离子交换的填料,而且大多是琼脂糖凝胶的,聚苯乙烯类的对大分子分离纯化还是不成熟.而且生物兼容性不好.

作者: KGZ564 时间: 2013-5-2 13:20

对蛋白复性的东西比较感兴趣，请教ha111战友，你是否听说过百克级以上的层析复性？如果有，是那个公司？什么产品？用的是什么柱子呢？入行尚短，望指教。

作者: ffaa 时间: 2013-5-2 13:21

我看到你在另一个贴子上讲,国内有的厂家都有用1M直径的色谱柱了,这么大的生产规模用的是什么基质的填料,sepharose 还是聚苯乙烯类的? 我看了一些资料,这么大的色谱柱GE和pall有,价钱很高.
要从生产规模上来看,我了解胰岛素的生产,通化东宝的生产规模应该用得上这么大的色谱柱.

======================================

是GE的填料，产品附加值高，就用的起，呵呵

作者: ffaa 时间: 2013-5-2 13:21

这段时间开始做纯化的放大，因为发酵优化产品的表达量有了很大的提高（5倍以上的提高），今天用以前的纯化工艺（摇瓶发酵）做就发现有很大的差异，具体的结果我还得去分析，但是终于深刻体会到以前前辈告诉我的“必须等发酵工艺成熟以后再去确定最终纯化工艺”的道理

作者: ha111 时间: 2013-5-2 13:22

QUOTE:

原帖由 KGZ564 于 2013-5-2 13:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
对蛋白复性的东西比较感兴趣，请教ha111战友，你是否听说过百克级以上的层析复性？如果有，是那个公司？什么产品？用的是什么柱子呢？入行尚短，望指教。 ...

百克级的复性规模真没听说过，这个难度实在太大了，恐怕世界上的公司很少这样做。不过克级规模的复性是有的，当然这个是指蛋白的含量，而不是包涵体的含量。
而且目前复性工艺最成熟和稳定的还是稀释复性和透析复性，层析复性并不怎么实用。如果实验室规模的工艺探索，能选用的凝胶产品无非就是那几家公司，GE，pall，等等

作者: ha111 时间: 2013-5-2 13:22

QUOTE:

原帖由 ffaa 于 2013-5-2 13:21 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

这段时间开始做纯化的放大，因为发酵优化产品的表达量有了很大的提高（5倍以上的提高），今天用以前的纯化工艺（摇瓶发酵）做就发现有很大的差异，具体的结果我还得去分析，但是终于深刻体会到以前前辈告诉我的“必须等发酵工艺成熟 ...

我个人觉得这个问题可能出在发酵和纯化中间预处理过程。不论发酵工艺如何，是采用flask还是fermentor，产物的性质/含量有一定差别，但是对纯化来说，包涵体或上清液的预处理更加关键。对于大肠杆菌表达来说，发酵罐一般用来制备包涵体，因此它的破菌/洗涤制备条件需要适当摸索，然后裂解复性。如果制备的是周质表达的上清，破菌抽提条件是很关键的。

作者: ffaa 时间: 2013-5-2 13:23

没做过层析蛋白质复性，但是上次听了苏志国老师的一堂课，他们现在在做多梯度层析法重折叠蛋白质，就是在层析柱上形成浓度梯度，然后复性。
我看了一下，可逆吸附（疏水、亲和、离子交换）的回收率还行，可逆吸附
对于放大还是可行性大一些，不知道可以可以，大家可以谈论一下。

作者: xingyi08 时间: 2013-5-2 13:23

我想请教一下各位，在工艺放大过程中，配液量也在增大，我看到有的公司是用定做的大的聚四氟桶下开口来实现的，但溶液量也就几十升，但如果色谱柱填装体积达到上百升，所需溶液量大大增加，工业化时用什么来配液？
如果资金又有限，买不起GE等大公司的成套设备，如何完成泵液？如何完成梯度洗脱？

作者: KGZ564 时间: 2013-5-2 13:23

工业化生产中可以采用金属的配液罐进行配液，然后放入储罐，层析时使用。对于泵液就很好解决了，换国产的蠕动甭就行。梯度如果没有自动调节的双泵系统的话，可以这样做，以前试验时用过：A液使用一个大罐，带搅拌，先装满A液。B液不断通过泵以一定速度打入A液的罐，然后通过搅拌混匀A\B两液，并不断进入柱子。这样A罐中的A液比例逐渐减少，B液比例逐渐增加，进入柱子的液体的比例也是如此。只是这样的梯度不是严格的线性梯度，但是也不失为一种办法。当然，操作前应准确计算一下大概的梯度情况。

作者: xingyi08 时间: 2013-5-2 13:23

我们用的是隔膜计量泵，有国产的，但泵上面的刻度和实际流速相差很多，声音很大，也有进口的，泵速很准，但有一个问题就是，接柱的那个泵由于承受着很大的柱压，流速不宜校准。我们的梯度也是如你所说，实际应用效果还可以，但的确线性差些。
我不知道蠕动泵可以耐多大压力，但我想应该不会太大，隔膜泵按标称是可耐0.6MPa。象树脂类200---800微米，填装起来柱压并不高，但精细纯化用的填料装大柱子柱压很高。
其实大的配液罐用空压作为动力也是个好办法，而且液流不宜产生脉冲。

作者: okhaha 时间: 2013-5-2 13:24

工业化生产中可以采用金属的配液罐进行配液，然后放入储罐，层析时使用。对于泵液就很好解决了，换国产的蠕动甭就行。梯度如果没有自动调节的双泵系统的话，可以这样做，以前试验时用过：A液使用一个大罐，带搅拌，先装满A液。B液不断通过泵以一定速度打入A液的罐，然后通过搅拌混匀A\B两液，并不断进入柱子。这样A罐中的A液比例逐渐减少，B液比例逐渐增加，进入柱子的液体的比例也是如此。只是这样的梯度不是严格的线性梯度，但是也不失为一种办法。当然，操作前应准确计算一下大概的梯度情况。

===============================================================================================================

在工业生产上，使用线性梯度会方便很多，分辨率会高很多，省去了很多工艺优化的时间。请问在工业生产上，线性梯度的方法使用的多？这种技术是否成熟？

作者: JK.jon 时间: 2013-5-2 13:25

线性梯度用于生产规模肯定是可以的，但对设备本身要求比较高，严格的设备验证(IQ/OQ/PQ/RQ)都是必不可少的，目的就是确保设备的功能完全可以符合要求，这样配制出来的梯度才是需要的梯度。
但实现起来和lab scale的层析系统会有差异，不能直接预设泵的比例，需要用cond作反馈调节，才能生成精密的盐梯度。

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)