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标题: 【讨论帖】蛋白质结构解析 [打印本页]

作者: koook5695 时间: 2013-5-2 13:34 标题: 【讨论帖】蛋白质结构解析

看到园子里有人呼吁，有很多战友也比较感兴趣，所以偶斗胆尝试一下。有错误或者不准确的地方就请大家指正了。

作者: koook5695 时间: 2013-5-2 13:34

到目前为止，蛋白质结构解析的方法主要是两种，x射线衍射和NMR。近年来还出现了一种新的方法，叫做Electron Microscopy。其中X射线的方法产生的更早，也更加的成熟，解析的数量也更多，我们知道，第一个解析的蛋白的结构，就是用x晶体衍射的方法解析的。而NMR方法则是在90年代才成熟并发展起来的。这两种方法各有优点和缺点。

P.S.偶是搞NMR的，所以更加希望有搞晶体的战友和偶一起做这个专题。

作者: koook5695 时间: 2013-5-2 13:35

这是到今天所有已经解析并且已经在pdb中release的结构统计

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15995

作者: koook5695 时间: 2013-5-2 13:35

首先来说一下，这两种方法的一般的步骤和各自的优点和缺点。电子显微镜（electron microscopy）作为一种新型的技术，目前的应用还是非常少，并且比较狭窄，我可能等到最后在给它作些介绍，而且相信绝大多数人也没有听说过，也不会有很大的兴趣。
首先是X晶体衍射。首先要得到蛋白质的晶体。
通常，都是将表达蛋白的基因PCR之后克隆到一种表达载体中，然后在大肠杆菌中诱导表达，提纯之后摸索结晶条件，等拿到晶体之后，工作便完成的80％，将晶体进行x射线衍射，收集衍射图谱，通过一系列的计算，很快就能得到蛋白质的原子结构。
用x射线的优点是：速度快，通常只要拿到晶体，甚至当天就能得到结构，另外不受大小限制，无论是多大的蛋白，或者复合体，无论是蛋白质还是RNA、DNA，还是结合了什么小分子，只要能够结晶就能够得到其原子结构。
所以x射线方法解析蛋白的瓶颈是摸索蛋白结晶的条件。这个时候运气就显的特别重要。关于这个有好多有趣的离子。据说国外一个同学在摸索两个月无果之后，毅然去度假，就将蛋白扔在一个很随便的地方，等度假回来之后，却发现已经结晶了。

作者: koook5695 时间: 2013-5-2 13:36

然后，来说一下NMR。
NMR（nuclear magnetic resonance）现象早已发现了很久，然后将这种方法用来解析蛋白结构，却是近一二十年的事情。不过到今天为止，用nmr方法来解析结构已经十非常成熟的方法。
原理暂且放在一边，先说常规步骤。
首先通过基因工程的方法，表达出目的蛋白，提纯之后，摸索一下蛋白稳定的条件，如果蛋白没有聚合，而且折叠良好，便将蛋白样品（通常是1mM－3mM，500ul，Ph6－7的PBS）装入核磁管中，放入核磁谱仪中，然后用一系列写好的程序控制谱仪，发出一系列的电磁波，激发蛋白中的H、N13、C13原子，等电磁波发射完毕，在收集受激发的原子所放出的“能量”，其实也是小磁场，通过收集数据、谱图处理、电脑计算从而得到蛋白的原子结构。
它的优点就是，蛋白在液体中得到结构，是一个动态的结构，事实上所有在pdb中或者文献中发表的NMR结构都是十个或者二十个结构的ensemble（集合），这就是因为这些结构都是进行能量优化后符合条件的结构，或者说就是溶液中的蛋白结构。因为是动态就很容易的研究蛋白与其他蛋白或者配基的相互作用。缺点是，受大小的限制，到目前为止NMR解析蛋白结构的上限是50kd。

作者: koook5695 时间: 2013-5-2 13:36

哈哈，人气毕竟不旺，很正常，毕竟搞结构的人太少了。
先说一些题外话。其实到现在很多搞蛋白的人也都慢慢会想到搞结构了。象湖南师范大学的梁宋平教授，虽然自己并不是专门搞结构的，但是他经常把自己发现的许多毒素然后拿去解析结构（基本是NMR），有的就是在我们实验室解的哈哈，其实非常简单的解析一个短肽，稍微作些功能，就是一篇JBC。目前就是这样，搞结构的实验室，在功能方面做的都不是很擅长，但是只要稍微作些细胞、或者生化试验，就是一篇很不错的文章。现在有很多人到我们实验室合作，这应该算是一个很好的趋势了，毕竟合作才能出大文章的。
我经常在板上看到有很多战友询问怎么预测结构，其实就可以考虑一下看看如果没有同源结构的话，就可以考虑解析结构的。也许自己从头学很难，但是当并列作者也不错了。
无论是晶体还是NMR，蛋白都要符合下面的条件：首先表达量要大，象NMR要求1个mM500UL，这就要求十几个毫克，结晶要摸索很多的条件也需要大量的蛋白。所以蛋白一定要在胞质中表达才行。其次，蛋白要折叠。我们知道许多蛋白，尤其是真核蛋白在大肠杆菌中是以包含体的形式存在，这种情况下是不行的，除非复性。如果你的蛋白在胞质中表达，如果你不确定是不是表达，可以从分子筛上的位置，或者扫CD确定一下，当然最简单的是做一个NMR一维谱，只需要几分钟。
小于20Kd的蛋白可以考虑NMR，因为NMR研究功能核相互作用方面是更加擅长的，而且不需要结晶，现在速度也不慢。如果比较大，可以考虑晶体解析。

作者: bongte 时间: 2013-5-2 13:36

谢谢你的专贴介绍,有几点补充一下:
1.长沙的师范大学叫湖南师范大学
2.梁老师的很多结构仅仅在你们那里搜的谱而已吧,小地方没核磁没办法啊.
3.解析结果后,功能不强或者不独特,发jbc现在也不容易哈.

请lz继续望下讲~

作者: koook5695 时间: 2013-5-2 13:37

QUOTE:

原帖由 bongte 于 2013-5-2 13:36 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
谢谢你的专贴介绍,有几点补充一下:
1.长沙的师范大学叫湖南师范大学
2.梁老师的很多结构仅仅在你们那里搜的谱而已吧,小地方没核磁没办法啊.
3.解析结果后,功能不强或者不独特,发jbc现在也不容易哈.

请lz继续望下讲~ ...

1，已经改过来了，不好意思。
2，是的，梁老师的一个学生在我们这读的博士。对于用NMR来解析结构，最重要的条件就是非常昂贵的核磁谱仪，以及同位素标记蛋白。只要采集了谱之后就算的得到了原始数据，其他的在电脑上通过专业的软件处理就可以了。对于小分子蛋白不需要同位素标记，也不需要600、800MHz的谱仪，一般的400、500MHz的小型谱仪也可以做了，但是对于10K以上的蛋白，基本上就要用磁场更强的600、800Mhz的核磁谱仪。梁老师只是一个例子，想告诉大家，所有有意愿解析结构进行合作的，搞结构的人都是非常愿意进行合作的。
3，这个怎么说呢，一般搞结构的人，如果同源性不高（identity大于30％），除非功能非常重要，是不会解析结构的。目前来说JBC还算可以吧。大家有兴趣可以搜索一下金长文教授的文章，一年发七篇JBC，应该很不错了吧。当然单纯的结构的确是很难发的，所以寻求合作是搞结构的一个趋势吧。

作者: koook5695 时间: 2013-5-2 13:38

图示一下这两种方法的一般原理

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15996

作者: koook5695 时间: 2013-5-2 13:38

X－ray

图片附件: 56473001.png (2013-5-2 13:38, 59.63 KB) / 该附件被下载次数 29
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15997

作者: koook5695 时间: 2013-5-2 13:38

更加形象一点

图片附件: 37674285.snap.jpg (2013-5-2 13:38, 26.77 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15998

作者: 8princess8 时间: 2013-5-2 13:39

这里转贴一些搜索到的关于 synchrotron 的内容，同步加速器是做蛋白质晶体 X-ray 衍射必不可少的大型设施。

同步加速器是一種環形的粒子加速器，使用磁場（讓帶電粒子在運行中可以改變方向）及電場（加速帶電粒子）與運行中的帶電粒子束同步化操作。粒子迴旋加速器使用均勻的磁場及固定頻率變化的電場加速帶電粒子，如果改變其中一項則為同步粒子迴旋加速器，兩者都改變則為同步加速器。藉著改變參數使帶電粒子獲得能量，同步加速器中的粒子束具有固定軌道，在抽真空的環境中（儲存環）不斷的運行。同步加速器中的儲存環包含了直線段與彎曲的部分，前後相連在一起。因此在結構上和粒子迴旋加速器有很大的不同。而儲存環中彎曲的部分會有許多磁鐵設施使粒子束改變運行方向；直線段的部分則設置高頻共振腔使用高能量的微波提供粒子加速所需的電場。

粒子在粒子迴旋加速器中，從中心以螺旋軌道運行到腔壁時，粒子迴旋加速器的最大半徑限制了粒子最後所獲得的全部能量。另一方面若以增加磁場強度的方式來提高加速能量，也有其極限。所以有同步加速器的出現。

同步加速器可以克服粒子迴旋加速器所遇到的問題，可以使用一個較小的管子來傳送粒子束，管子旁可裝設許多聚焦用的磁鐵或其他設施。

Armenia
Center for the Advancement of Natural Discoveries using Light Emission (CANDLE), Yerevan (proposed) [1]

[edit] Australia
Australian Synchrotron (AS), Melbourne, Victoria, [2] (under construction)

[edit] Brazil
Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS), Campinas

[edit] Canada
Canadian Light Source (CLS), University of Saskatchewan, Saskatoon, Saskatchewan

[edit] China (PRC)
Beijing Synchrotron Radiation Facility (BSRF), Institute of High Energy Physics, Chinese Academy of Sciences, Beijing
National Synchrotron Radiation Laboratory (NSRL), University of Science and Technology China, Hefei
Shanghai Synchrotron Radiation Facility (SSRF), Shanghai (under construction)

[edit] Denmark
Institute for Storage Ring Facilities (ISA, ASTRID), University of Aarhus, Aarhus, [3]

[edit] France
European Synchrotron Radiation Facility (ESRF), Grenoble
Laboratoire pour l'Utilisation du Rayonnement Electromagnétique (LURE), Orsay (decommissioned)
Soleil, Saint-Aubin

[edit] Germany
ANKA, Forschungszentrum Karlsruhe, Karlsruhe, [4]
Berliner Elektronenspeicherring-Gesellschaft für Synchrotronstrahlung (BESSY), Berlin, [5]
Dortmund Electron Test Accelerator (DELTA), Dortmund University, Dortmund, [6]
ELBE, Forschungszentrum Rossendorf, Dresden, [7]
Electron Stretcher Accelerator (ELSA), University of Bonn, Bonn, [8]
Hamburger Synchrotronstrahlungslabor (HASYLA, at DESY, Hamburg, [9]

[edit] India
INDUS, Center for Advanced Technology, Indore

作者: 8princess8 时间: 2013-5-2 13:39

[edit] Italy
DAFNE Light, Laboratori Nazionali di Frascati (LNF), Frascati, [10]
ELETTRA Synchtrotron Light Source, Trieste, [11]

[edit] Japan
Hiroshima Synchrotron Radiation Center (HSRC), Hiroshima University, Hiroshima
Instute of Free Electron Laser (iFEL), Osaka University, Osaka
IR FEL Research Center (FEL-SUT), Tokyo University of Science, Tokyo, [12]
Medical Synchrotron Radiation Facility, National Institute of Radiological Sciences, Chiba
Nagoya University Small Synchrotron Radiation Facility (NSSR), Nagoya University, Chikusa-ku, Nagoya, [13]
Photon Factory (PF) at KEK, Tsukuba
Photonics Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), Tsukuba Science City, Ibaraki
Saga Light Source (SAGA-LS), Tosu, Saga, [14]
Super Photon Ring - 8 GeV (SPring-8), Nishi-Harima
Ultraviolet Synchrotron Orbital Radiation Facility (UVSOR), Okazaki, [15]
VSX Light Source, University of Tokyo, Kashiwa, [16]

[edit] Jordan
Synchrotron-light for Experimental Science and Applications in the Middle East (SESAME), Al-Balqa Applied University, Salt, [17]

[edit] Netherlands
Free Electron Laser for Infrared eXperiments (FELIX), FOM-Institute for Plasma Physics, Nieuwegein

[edit] Russia
Dubna Electron Synchrotron (DELSY), Joint Institute for Nuclear Research (JINR), Dubna near Moscow, [18]
Kurchatov Synchrotron Radiation Source (SIBIR-1, SIBIR-2), Kurchatov Institute, Moscow, [19]
Siberian Synchrotron Radiation Centre (SSRC), Budker Institute of Nuclear Physics, Novosibirsk, [20]
U70 synchrotron Institute for High Energy Physics, Protvino near Moscow, [21]
TNK F.V Lukin Institute, Zelenograd near Moscow, [22]

[edit] Singapore
Singapore Synchrotron Light Source (SSLS), National University of Singapore, [23]

[edit] South Korea
Pohang Accelerator Laboratory, Pohang University of Science and Technology, Pohang, [24]

[edit] Spain
ALBA, Barcelona, [25]

[edit] Sweden
MAX-lab, Lund University, Lund, [26]

[edit] Switzerland
Swiss Light Source (SLS), Villigen, [27]

[edit] Taiwan
National Synchrotron Radiation Research Center (NSRRC), Hsinchu, [28]

[edit] Thailand
National Synchrotron Research Center (NSRC), Nakhon Ratchasima, [29]

[edit] United Kingdom
Diamond Light Source, Didcot
Synchrotron Radiation Source (SRS), Daresbury, [30]

[edit] United States
Advanced Light Source (ALS), Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, California
Advanced Photon Source (APS), Argonne National Laboratory, Argonne, Illinois
Center for Advanced Microstructures and Devices (CAMD), Louisiana State University, Baton Rouge, Louisiana
Cornell High Energy Synchrotron Source (CHESS), Cornell University, Ithaca, New York
UCSB Center for Terahertz Science and Technology (CTST), University of California, Santa Barbara, Santa Barbara, California, [31]
Duke Free Electron Laser Laboratory (DFELL), Duke University, Durham, North Carolina
Jefferson Laboratory Free Electron Laser (Jlab), Jefferson Laboratory, Newport News, Virginia, [32]
National Synchrotron Light Source (NSLS), Brookhaven National Laboratory, Upton, New York
Synchrotron Radiation Center (SRC), University of Wisconsin-Madison, Stoughton, Wisconsin
Stanford Picosecond FEL Center, Stanford University, Stanford, California, [33]
Stanford Synchrotron Radiation Laboratory (SSRL), Stanford Linear Accelerator Center, Menlo Park, California
Synchrotron Ultraviolet Radiation Facility (SURF), National Institute of Standards and Technology, Gaithersburg, Maryland
W. M. Keck Vanderbilt Free-electron Laser Center, Vanderbilt University, Nashville, Tennessee

作者: 8princess8 时间: 2013-5-2 13:39

下面是一个 synchrotron 的示意图

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15999

作者: koook5695 时间: 2013-5-2 13:40

不知道是不是可以更加深入的讨论一些，或者更加的专业一些，感兴趣的战友可以继续看看。
简单的说一下NMR的原理。
NMR（核磁共振）nuclear magnetic resonance。A phenomenon in which transitionsin the magnetic energy states of the nuclei of atoms are induced when the atoms are placed in a static magnetic fieldand subjected to an oscillatory magnetic field, perpendicular to
the static field, and oscillating at some characteristic radio frequency.
简单的说就是，处于一个静磁场中的核子（质子和中子），会由于磁场的作用而处于不同的能量状态，当一个外界的摆动的磁场来扰动处于“平衡”状态的核子时，吸收了能量的核子就会从不同的能级之间要迁，并再此过程中会释放出能量。而放出的能量被检测到之后，经过分析和计算就可以得到蛋白质内部的原子的结构信息。
进一步解释一下：首先不是所有的原子都是有NMR现象的，也不是具有了NMR现象就可以用于蛋白结构解析。象O16，C12是没有核磁共振现象的（偶数的质子中子和偶数的电子），象H2，N14，NMR很难分析也很少研究。只有C13，N15，H1才真正的被用于研究，并用于结构解析。所以小一点的蛋白（小于10kd）因为含有足够的H，可以直接用来NMR分析，而更大的蛋白则需要同位素标记，就是在M9培养中，加入C13的葡萄糖，N15的NH4cl，然后诱导，从而是表达出来的蛋白中的原子都是具有NMR的C13，N15，H1。
NMR所用到的静磁场，是磁场非常强大的静磁场。例如750MHz的谱仪，它的静磁场是17.5T（特斯拉），这么强的磁场是通过电磁场产生的，我们知道螺旋线圈是可以产生磁场的，NMR所用的就是处于超导状态下的螺旋线圈中的电流产生的磁场，为了是线圈是超导，所用要将线圈放在液氦中，使温度接近绝对零度。所以NMR要消耗大量的液氦，还有液氮（放在液氦外面）。
所以NMR是很昂贵的试验，第一是样品需要同位素标记，第二是仪器非常贵重。

作者: koook5695 时间: 2013-5-2 13:40

找到一些晶体学的原理。一起学习。
蛋白质纯化与结晶
获得蛋白质的晶体结构的第一个瓶颈，就是制备大量纯化的蛋白质(>10 mg)，其浓度通常在10 mg/ml 以上，并以此为基础进行结晶条件的筛选。运用重组基因的技术，将特定基因以选殖(clone)的方式嵌入表现载体(expression vector)内，此一载体通常具有易于调控的特性。之后再将带有特定基因的载体送入可快速生长的菌体中，如大肠杆菌(Escherichia coli)，在菌体快速生长的同时，也大量生产表现载体上的基因所解译出之蛋白质。一般而言纯度越高的蛋白质比较有机会形成晶体，因此纯化蛋白质的步骤就成为一个重要的决定因素。

在取得高纯度的蛋白质溶液后，接下来就是晶体的培养。蛋白质晶体与其他化合物晶体的形成类似，是在饱和溶液中慢慢产生的，每一种蛋白质养晶的条件皆有所差异，影响晶体形成的变量很多，包含化学上的变量，如酸碱度、沈淀剂种类、离子浓度、蛋白质浓度等；物理上的变数，如溶液达成过饱和状态的速率、温度等；及生化上的变数，如蛋白质所需的金属离子或抑制剂、蛋白质的聚合状态、等电点等，皆是养晶时的测试条件。截至目前为止，并无一套理论可以预测结晶的条件，所以必须不断测试各种养晶溶液的组合后，才可能得到一颗完美的单一晶体(图一) 。

蛋白质晶体的培养，通常是利用气相扩散法(Vapor Diffusion Method) 的原理来达成；也就是将含有高浓度的蛋白质(10-50 mg/ml)溶液加入适当的溶剂，慢慢降低蛋白质的溶解度，使其接近自发性的沈淀状态时，蛋白质分子将在整齐的堆栈下形成晶体。举例来说，我们将蛋白质溶于低浓度(~1.0 M) 的硫酸铵溶液中，将它放置于一密闭含有高浓度(~2.0 M)硫酸铵溶液的容器中，由气相平衡，可以缓慢提高蛋白质溶液中硫酸铵的浓度，进而达成结晶的目的(图二)。

蛋白质晶体在外观上与其他晶体并无明显不同之处，但在晶体的内部，却有很大的差异。一般而言，蛋白质晶体除了蛋白质分子外，其他的空间则充满约40 %至60 %之间的水溶液，其液态的成分不仅使晶体易碎，也容易使蛋白质分子在晶格排列上有不规则的情形出现，造成晶体处理时的困难及绕射数据上的搜集不易等缺点。但也由于高含水量的特性，让蛋白质分子在晶体内与水溶液中的状态，极为相似。所以由晶体所解出的蛋白质结构，基本上可视为自然状态下的结构。

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作者: koook5695 时间: 2013-5-2 13:41

绕射数据的记录
X 光绕射点搜集，随着时间的推移，也由早期以闪烁计数器(scintillation counter) 一次记录一个点及使用许多X-光片(X-ray film) 拍下绕射点，每张X 光片都要经过显影的步骤；之后进而使用多重金属丝板(multiwire)自动记录每次侦测到的绕射点。目前使用的荧光记录板(image plate)，则是利用磷化物经X 光激发后会产生荧光，经荧光扫描仪记录成数字模式的图像文件后，再以灯光照射一段时间去除记录板上的荧光点，即可再进行下一次的记录工作。电荷耦合器(charge-coupled devices, CCD) 的出现及技术的改良，可以不断地记录绕射点，而不需荧光板扫描及去除步骤，如此将加速绕射点的搜集。目前的同步辐射光源几乎全部使用CCD 来记录绕射数据(图三)。
在实验室中的X 光光源的产生，一般使用铜作为旋转式阳极靶(rotating anode)，可以产生波长为1.54 Å Cu Kα放射光。不过，以目前发表的文献来看，在同步辐射(synchrotron)光源所搜集的资料有增加的趋势，因为同步辐射所提供的X 光束，其强度较实验室强约百倍、甚至上千倍，同时它也可以改变不同频段的波长，以供非寻常散射(anomalous dispersion) 的实验研究

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作者: koook5695 时间: 2013-5-2 13:41

绕射原理
单一分子在X 光下的讯号极弱，无法被记录下来，然而在晶体中通常是由许多排列整齐的蛋白质分子所组成，当晶体内所有的分子(数量约在1015 个以上)一起在同一个方向上进行绕射且绕射波皆同步时，即足以使所产生的讯号被记录下来。每一个绕射波的强度与其振幅(amplitude)的平方成正比。但绕射波的另一个变数，绕射波的相角(phase)，则无法直接测量得到，必须利用其他的方法方能获得(见相角决定方法)。若是绕射点振幅与相角都可获知，则可以进一步地来计算晶体中的电子密度图。
下列方程式即是著名的傅立叶转换公式，ρ表示在晶体中任何一个位置上(x, y, z) 的电子密度，φhkl 为绕射光相角，|Fhkl|为绕射光振幅，可由实验测得的绕射光强度开平方获得。

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作者: koook5695 时间: 2013-5-2 13:41

所以若是记录了所有的绕射波的强度(h,k,l)，并计算出所有绕射光的相角，带入这个公式，蛋白质在晶体内的结构，就以电子密度图的方式呈现在我们的眼前了(图四)。
相角决定方法
决定相角通常有三种常用的方法，分别是同型置换法(isomorphous replacement method) 、非寻常散射法(anomalous dispersion method) 以及分子置换法(molecular replacement) ，现在分述如下：
(1）同型置换法
同型重原子置换法最早的应用是在1954 年，用来解出血红蛋白hemoglobin 的相角，需要在晶体蛋白质的内部加入重原子。通常以浸泡的方法使重原子能够渗透(diffuse) 进入到晶体内部和蛋白质结合。这些重原子对X 光产生较大的绕射，对绕射点的强度会有明显的差异，根据这些差异，可定出重原子的位置，并进而推算出蛋白质晶体绕射光的相角。理论上，若是只获得一组重原子衍生物数据(single isomorphous replacement, SIR)，经计算后，其解并不是唯一的；因此通常会结合数个不同的重原子衍生物所得到的数据(multiple isomorphous replacement, MIR)，来求得更精确的相角。
(2) 非寻常散射法
较重的原子会吸收特定波长的X 光，运用接近吸收边缘(absorption edge)的X 光进行绕射实验时，会产生不寻常的X 光散射或吸收现象，称为非寻常散射(anomalous scattering)，此一现象可导致绕射振幅及相角的改变。经由数个不同波长的X 光照射，记录吸收边缘前后所产生的不同绕射结果，可依此计算出相角。由于它使用数个不同波长，所以称为「多波长非寻常散射法」(multiwavelength anomalous dispersion, MAD) 。使用这个方法的前提是X 光的波长需依重原子的特性加以调整，而一般在实验室的X 光通常是属于固定波长的，并无法满足这个方法，所以非寻常散射法就需要利用同步辐射可变波长的光源来完成(5)。目前很多实验室使用硒化甲硫胺酸(selenomethionine)来取代甲硫胺酸 (methionine)，在养菌的同时加入硒化甲硫胺酸，使蛋白质的形成过程带入含有重原子硒的硒化甲硫胺酸，接下来养出蛋白质晶体，在硒的吸收边缘进行绕射实验，并运用MAD 的方法来计算出蛋白质晶体绕射波的相角(图四)。
(3) 分子置换法
若是一个未知的蛋白质与另一已解出结构的蛋白质，在胺基酸序列具有30 %以上的一致性(identity)，表示这两个蛋白质的结构可能类似，可以利用分子置换法来计算出未知蛋白质的相角。利用已知蛋白质之结构分子带入晶体中寻找旋转及位移的可能位置，解析出结构。随着蛋白质结构的增加，可以发现类似的蛋白质具有相同的折迭方式，而出现新的折迭的机率也相对减少，所以只要未知的蛋白质在蛋白质数据库(Protein Data Bank, PDB )中，找到序列上具有同源性(homology)的已知结构时，即可在取得晶体绕射数据后，快速地运用分子置换法来解决相角问题。

图片附件: 82587016.snap.jpg (2013-5-2 13:41, 31.4 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16003

作者: koook5695 时间: 2013-5-2 13:42

三维结构模型之建立及修正
藉由电子密度图的三维构形，可将每一个胺基酸依蛋白质序列建立蛋白质的起始模型。蛋白质的起始模型，常由于相角的解不够完美，使计算出来的电子密度图产生误差，误导模型的走向，因此需要做进一步的改善，称为修正(refinement)。修正的目的在于进行立体化学(stereochemistry)(如胜键键长、键角、胺基酸构形)优化的同时，减少计算与实验绕射点强度的差异，用来评估的数值则是「剩余值(R-factor)」：

其中Fobs 及Fcalc 分别表示观察值与计算值的绕射光振幅。尽可能将剩余值降到最低，直到进一步的修正无法减少其值为止，即达最终的蛋白质结构模型。大部分修正后可接受的剩余值约0.2 (20%)。但低的剩余值，并不代表其结构就是正确的。已有数个例子显示在蛋白质结构上的某些部分不正确时，仍可能获得较低的剩余值。因此Brünger (7)在1992 年提出一个交互验证的程序，也就是取出部分的绕射点(建议为10%)，排除于修正的程序之外，以对结构的正确性，提供个别的检查，称为「自由剩余值(R-free) 」，其计算方式同剩余值。

图片附件: 66728937.png (2013-5-2 13:42, 6.91 KB) / 该附件被下载次数 12
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16004

作者: koook5695 时间: 2013-5-2 13:42

除了剩余值外，分辨率是另一个判断晶体结构可信度的重要数值。分辨率在蛋白质晶体结构中通常是定义为：可以分辨二个平面的最小距离。分辨率对模型的建构所造成的影响，可以直接由电子密度图看出，在低分辨率(~6 Å )时，只能观察到由α螺旋(α-helix)所形成的圆柱形密度图；随着分辨率提高(3 Å ~ 2 Å ) ，主链与支链结构就会出现，但个别原子仍无法由密度图中看出，除非分辨率可以达到1.0 Å 或更高的分辨率。蛋白质结构所能达到的分辨率，主要是取决晶体内分子排列的整齐程度。小分子晶体内并没有太多的水分子，所以常能得到分辨率高于0.5 Å 的绕射数据。但因蛋白质结构由长的胜链所组成，其间又是由较弱的氢键及凡得瓦力所维系，造成蛋白质结构富有弹性，蛋白质分子与分子的堆栈也就没有那么整齐。同时分子与分子之间的空隙由水分子来填补，也因这些空隙的水分子排列比较紊乱，所以蛋白质晶体绕射出的结果，仅有少数高分辨率晶体，一般蛋白质晶体结构的分辨率约在2.0 至3.0 Å 之间。

作者: purrr 时间: 2013-5-2 13:43

不错，经典阿，不过如何才能得到天然蛋白的单晶，或做nmr需要多少量的蛋白呢？

作者: koook5695 时间: 2013-5-2 13:43

QUOTE:

原帖由 purrr 于 2013-5-2 13:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

不错，经典阿，不过如何才能得到天然蛋白的单晶，或做nmr需要多少量的蛋白呢？

得到天然蛋白的单晶。你的意思是不通过基因工程的手段，是不是？早期通过x射线解出的好几个结构都是天然蛋白，就是通过直接从动物组织提纯得到的。象第一个解出的结构肌红蛋白就是从抹香鲸的肌肉中提纯的。但是现在很少，基本都是通过基因工程的方法得到。就是将蛋白提纯之后，摸索结晶条件。如果大肠杆菌不能表达出折叠的目的蛋白，也可以用酵母或者培养的动物细胞表达。
NMR需要的体积通常是500ul，但是蛋白的浓度比较高，通常在1－2个毫摩，如果蛋白是20kd，也就是10－20mg。因为一般需要两个样品，如果特别稳定，一个样品也可以了。测一个蛋白结构所需要收集所有的谱的时间是20－30天。所以最好准备两个样品，所有至少要10个毫克吧。当然越多的话，信号越好。但是有的蛋白如果高浓度会聚合，也可以考虑零点几个毫摩，但是消耗的谱仪时间就会更长了。

作者: purrr 时间: 2013-5-2 13:44

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原帖由 koook5695 于 2013-5-2 13:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

得到天然蛋白的单晶。你的意思是不通过基因工程的手段，是不是？早期通过x射线解出的好几个结构都是天然蛋白，就是通过直接从动物组织提纯得到的。象第一个解出的结构肌红蛋白就是从抹香鲸的肌肉中提纯的。但是现在很少， ...

谢谢斑竹！在做蛋白与小分子相互作用的时候（计算机模拟), 都需要哪些数据和相关的软件。

作者: koook5695 时间: 2013-5-2 13:44

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原帖由 purrr 于 2013-5-2 13:44 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢斑竹！在做蛋白与小分子相互作用的时候（计算机模拟), 都需要哪些数据和相关的软件。

如果仅仅是需要模拟的话，你可以AUTODOCK软件，这是目前在文献中比较常用的软件，可以用来算蛋白质和小分子的结构。需要蛋白质的pdb结构，小分子的结构信心。

作者: purrr 时间: 2013-5-2 13:45

什么叫蛋白质的pdb结构，新手阿，请多多帮忙啊。能否从ncbi下载呢
另外，autodock软件是免费的么？

作者: koook5695 时间: 2013-5-2 13:45

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原帖由 purrr 于 2013-5-2 13:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
什么叫蛋白质的pdb结构，新手阿，请多多帮忙啊。能否从ncbi下载呢
另外，autodock软件是免费的么？

pdb结构，是蛋白质原子结构文本的格式。可以用好多软件打开，例如molmol，rasmol等。可以从网站上：cuturl('http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do')下载你想要研究的蛋白。
autodock有免费的，不过需要在linux系统上运行，而且装起来有点麻烦。

作者: purrr 时间: 2013-5-2 13:46

除了autodock 还有其他的计算蛋白质和小分子的结构相互作用的软件么,可以在网上down( can be used by windows)

作者: koook5695 时间: 2013-5-2 13:46

其他的我没有听说过，不过坦白的说好多这种很专业的都是linux版，因为只有linux才是真正free的。

作者: dragonkilly 时间: 2013-5-2 13:46

建议楼主作一个实例，我想这对将要从事晶体结构方面研究的学生来说是一个非常好的建议。
因为我刚拿到晶体，X－衍射和结构解析都拿到国外做去了，自己想做一下，但是不知道如何着手，具体怎么弄都感到一头雾水。

作者: koook5695 时间: 2013-5-2 13:47

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原帖由 dragonkilly 于 2013-5-2 13:46 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

建议楼主作一个实例，我想这对将要从事晶体结构方面研究的学生来说是一个非常好的建议。
因为我刚拿到晶体，X－衍射和结构解析都拿到国外做去了，自己想做一下，但是不知道如何着手，具体怎么弄都感到一头雾水。 ...

其实是这样的，一般搞晶体的，例如北京大学的苏晓东教授的实验室，他们实验室就是搞晶体衍射的，但是也是多办同学做基因工程，只有几个同学进行数据的收集、结构的计算，而我其中一个同学就专门的负责结构的计算，不做基因工程提取蛋白。
坦白的说，如果自己做的话是不现实的，首先，你并没有贵重的仪器，更不用说操作了。第二虽然现在结构计算的比较成熟，但是对于普通人还是很难掌握的。而且坦白的说，我也不觉得有那个必要。
如果你想真的自己学习的话，或者想建一个这样的平台，我可以私下给你我几个同学的联系方式，可以向他们请教。我对于这个也只是略知一二。至于具体操作，我也仅仅是只知皮毛呵呵，毕竟我的专业是NMR。

作者: idea2011 时间: 2013-5-2 13:47

“但是也是多办同学做基因工程，只有几个同学进行数据的收集、结构的计算”
？？？那么做基因工程的岂不是很无聊反复重复而得不到结构学的精髓所在？

作者: koook5695 时间: 2013-5-2 13:48

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原帖由 idea2011 于 2013-5-2 13:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

“但是也是多办同学做基因工程，只有几个同学进行数据的收集、结构的计算”
？？？那么做基因工程的岂不是很无聊反复重复而得不到结构学的精髓所在？ ...

其实不能这么说吧。结构生物学不是只解结构、只长晶体这么简单的，坦白的说，拿到结构只是第一步，而且也比较程式化，按照你说的，如果一个同学整体采集数据，不也是重复吗？
拿到结构之后，如何分析，如何和功能联系起来，如何设计相关的生物学试验，这些我我认为是更加重要的。拿到晶体可以发一个2点几的，单单一个结构也只能发一个strcture note，意义也并不大的。只有了其他的生物学方面的东西，文章才有意义，才上档次的。并不是说他们做基因工程，就完全不作不懂结构计算，只是每个人都有自己的专长吧。我个人认为，结构的计算顶多只是文章的1/3.将结构进行分析、与生物功能的联系、论文的写作更是结构生物学的精髓吧。
例如日本的那个NMR计划，每年可以解出300个结构，然后只是存到pdb中而已，没有分析、没有文章，我并不认为这是结构生物学的精髓。单纯的解析结构，国内好多实验室都有这个能力吧，呵呵，个人见解。

作者: koook5695 时间: 2013-5-2 13:48

是NMR的，还是X－ray的啊？

作者: nut6694 时间: 2013-5-2 13:49

楼主强这个蛋白纯度是不是要求很高呢

作者: misswu61 时间: 2013-5-2 13:49

学习中，有问题要请教．
yunerwenyu，有没有用过insight II 或discovery　studio，用途如何？

作者: biabiade 时间: 2013-5-2 13:49

看了楼主的介绍，非常感谢

我是做计算分子生物学的，做算法的。请问楼主可以稍微详细点的介绍一下蛋白质结构解析中计算机处理的那部分过程吗？

作者: koook5695 时间: 2013-5-2 13:50

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原帖由 nut6694 于 2013-5-2 13:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼主强这个蛋白纯度是不是要求很高呢

纯度当然是越高越好，但是一般只要纯度达到90％就可以了。

作者: koook5695 时间: 2013-5-2 13:50

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原帖由 biabiade 于 2013-5-2 13:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

看了楼主的介绍，非常感谢

我是做计算分子生物学的，做算法的。请问楼主可以稍微详细点的介绍一下蛋白质结构解析中计算机处理的那部分过程吗？ ...

可以呵呵。xray具体地我也不是很清楚，在用NMR进行结构解析时，其实可以分为两个步骤，第一个步骤是进行每个原子化学位移地归属。第二个步骤是进行结构地计算和refine。第一个步骤得到化学位移后，就可以将NOESY谱中地交叉峰进行归属，就是说将这个峰指定为哪两个原子地NOE效应，并且根据这个峰的大小体积，从而根据公式便可以计算出这两个H原子的距离。当所有存在noe效应的H原子之间的距离都算出来，其实蛋白的结构就算出来了，这一步目前用的软件主要是cyana。但是这得出的只是初始结构，还需要进行优化，所谓优化现在一般都是分为两步，第一步用sane软件，它可以在得到初始结构的基础上，将明显不对的对峰的指认进行分析判断，从而得到更加准确的指认。第三部是用amber软件，这一步是更加精细的优化，直到得到最后的结构。

作者: koook5695 时间: 2013-5-2 13:51

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原帖由 misswu61 于 2013-5-2 13:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
学习中，有问题要请教．
koook，有没有用过insight II 或discovery　studio，用途如何？

没有用过这两个，我们分析结构一般都是用molmol，我个人还喜欢用protein explore。也有同学喜欢用pmol，都是很好用的。

作者: koook5695 时间: 2013-5-2 13:51

其实也不是太难,但是如果没有自己真正开始做一个蛋白,只是纸上谈兵得话,的确很难,看再多得文献,不如自己亲身实践.

作者: JK.jon 时间: 2013-5-2 13:52

结构解析时也有用园二和红外的呀？楼主精通吗？我很想知道怎么用中红外光谱算出蛋白质的二级结构，正在做但很多资料没有。网络很多受限制不让我看，我又急着出结果要毕业，帮帮忙吧！谢谢！

作者: koook5695 时间: 2013-5-2 13:52

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原帖由 JK.jon 于 2013-5-2 13:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
结构解析时也有用园二和红外的呀？楼主精通吗？我很想知道怎么用中红外光谱算出蛋白质的二级结构，正在做但很多资料没有。网络很多受限制不让我看，我又急着出结果要毕业，帮帮忙吧！谢谢！ ...

用圆二只能看看是不是存在二级结构，但不能得到蛋白的原子结构吧。
不好意思，对这两种技术，我也没有接触。

作者: 98776langtao 时间: 2013-5-2 13:52

不错啊！对于自己知识的浅薄真是感到惭愧啊，要向各位前辈学习啊！
我目前想用Anthprot5.0软件估算细胞表位，好象也是需要蛋白质的PDB格式的，不知道怎么弄啊，有那位前辈能否指教一下！同时，如有Anthprot5.0软件的说明书能否发到我的邮箱一下：1983cf@163.com。谢谢了！希望在各位前辈的指导下自己能够进步啊，呵呵！

作者: koook5695 时间: 2013-5-2 13:53

pdb格式的蛋白，如果你的蛋白结构已经被解析了，可以从cuturl('http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do')
搜索并下载你的蛋白就可以了，一般都是pdb格式的。
你说的这个软件我没有用过，不好意思。

作者: NBA 时间: 2013-5-2 13:54

有战友问我晶体计算的软件，我大体说一下
“关于蛋白质晶体学有一本卢光莹和华子千合编的一本叫《生物大分子晶体学基础》
还有一本梁栋材著的X射线晶体学基础，这本主要是讲晶体学的数学物理基础

具体软件操作上没有什么特别好的教材，而且软件更新速度很快。我们一般都是上网上直接找manual看，边看边学。可以先找点关于晶体学的review文章来看，上NCBI或是google用crystallography一找就行了，先了解一下晶体解析的一般流程。

处理原始数据时可以用很多种软件比如 mosflm,shlex,hkl2000等等
最关键的定相位用的软件由采用的解析方法有关，有用于MAD，SAD的solve，resolve
也可以用分子置换法直接定相位
最后定蛋白分子结构最主要的可以用ccp4,cns,coot”

作者: TAT 时间: 2013-5-2 13:55

感谢NBA版主的精彩介绍，我有一个问题，目前国内能做生物大分子结构的地方也不多（也就是中科院生物物理所、北大、科大等几个地方），不知道这些地方是否提供合作吗？比如我们实验室发现一个很有意思的蛋白，想通过X-RAY解析蛋白结构，不知道可不可以去这些研究单位做实验。

作者: gogo 时间: 2013-5-2 13:55

刚刚接触这方面知识,弱问教楼主。
对一个新的膜蛋白来说，要了解它，一般的实验过程是什么？下面几步按什么顺序？
1. 蛋白表达
2.蛋白纯化
3. 蛋白提纯
4. 蛋白结晶
5.结构分析
6.测序
蛋白质测序所需蛋白的的条件是什么?

作者: NBA 时间: 2013-5-2 13:56

前5步是没有问题的。
一般的步骤就是这样的。
但是解析结构，首先肯定就是要知道蛋白的序列，这样才能表达出你想要的蛋白。
当然也存在结晶的蛋白是偶然得到的，我也见过这种文章，但是结晶后解析结构肯定就可以得到这种蛋白的序列了。
所以不存在第六步。
如果未知蛋白，或者你不却定你的蛋白是不是你想要的蛋白，你可以通过质谱测序。
条件就是拿到纯化好的溶于双蒸水里的蛋白即可。

作者: gogo 时间: 2013-5-2 13:56

非常感谢楼主的解答。还有不清楚的地方请教楼主：
一般情况下蛋白质测序所用蛋白和x射线衍射时所用蛋白质的纯度和所需量各为多少？

作者: bs4665 时间: 2013-5-2 13:56

如果是x射线算结构得话，蛋白纯度肯定是越高越好，至少90％以上吧。
量需要毫摩（一毫升）级别得，假如你得蛋白是20kd，量需要在20mg级别就可以。
测序需要得量要少得，但是具体得，我对质谱不是特别清楚，还是问问别得战友呵呵。

作者: standbyme 时间: 2013-5-2 13:57

请问一下楼主，有没有用过结晶试剂盒，目前的结晶试剂盒能提供多少个筛选条件？谢谢！

作者: birdfish 时间: 2013-5-2 13:57

请问一下楼主，有没有用过结晶试剂盒，目前的结晶试剂盒能提供多少个筛选条件？谢谢！

================================================

有试剂盒，通常用96孔的，也就是一次就可以筛选96格条件。

作者: DNA 时间: 2013-5-2 13:57

我在Hampton Research公司的网站上看到，他们的蛋白质结晶板是96个大孔（应该是装平衡液的）的，但是每个大孔旁边有三个用于结晶的小孔，这样一来是不是一块板的结晶条件就可以为288个？还有买这样的蛋白结晶办是否配有相应的结晶条件，还是自己设计？是不是结晶试剂盒要单独买？

作者: birdfish 时间: 2013-5-2 13:58

我们这边的实验室可能没有那么多money，他们都是自己配的，没有买试剂盒，而且他们的都是96个孔，也许不同的实验室，不大一样。不过你可以向他们公司email询问，他们应该会给你更加专业的介绍呵呵。

作者: ffooll 时间: 2013-5-2 13:58

我现在也在学习x-ray衍射方面的东东，觉得有一本书写得很好
《晶体、X射线和蛋白质》科学出版社 [美]D.舍伍德著

作者: ffooll 时间: 2013-5-2 13:59

有电子版
cuturl('http://www.crystalstar.cn/Soft/ShowSoftDown.asp?UrlID=1&SoftID=101')

作者: IAM007 时间: 2013-5-2 13:59

太好了，我现在正打算做这方面的工作。有两个问题想请教一下：
（1）做NMR，需要这样大量的蛋白，但是如果胞质表达的话，远没有包涵体表达的量高，要得到这样大量的蛋白，感觉很困难？
（2）我的目标蛋白，现在预测分子量大概是23KD，用NMR是否比较困难？

谢谢

作者: NBA 时间: 2013-5-2 14:00

太好了，我现在正打算做这方面的工作。有两个问题想请教一下：
（1）做NMR，需要这样大量的蛋白，但是如果胞质表达的话，远没有包涵体表达的量高，要得到这样大量的蛋白，感觉很困难？
（2）我的目标蛋白，现在预测分子量大概是23KD，用NMR是否比较困难？

谢谢

============================================================================

1，如果胞质中的蛋白是折叠了的话，那么如果将温度降低到18度，会得到更多的胞质中的蛋白。
2。23kd，如果蛋白折叠的好，解析是没有问题的。

作者: 831226 时间: 2013-5-2 14:01

相关疾病：
高血糖症
各位同行，现急需关于胰高血糖素样肽2（GLP-2）的分离提取相关资料，

作者: fsdd817 时间: 2013-5-2 14:01

QUOTE:

原帖由 831226 于 2013-5-2 14:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
相关疾病：
高血糖症
各位同行，现急需关于胰高血糖素样肽2（GLP-2）的分离提取相关资料，

最好可以查找文献，或者找国内期刊中做这个蛋白的询问一下

作者: koook5695 时间: 2013-5-2 15:13

结构解析目前是比较成熟了，许多实验室可以做，只是对仪器要求比较高罢了，和wb、Ms等等一样只是一项技术罢了，aa001不要这么说的。

作者: tuuu2 时间: 2013-5-2 15:13

我做了蛋白质的分子印迹聚合物,不知道如何去探讨形成的结构,就是找到分子结合方式,希望老师们能给予帮助.

作者: abc816 时间: 2013-5-2 15:13

哪位师兄师姐有王大成院士编写的《蛋白质工程》呀？

作者: bs4665 时间: 2013-5-2 15:16

搂主、诸位大虾好！我刚接触这一块，所以对此很陌生，请搂主或那位好心的大虾发几篇这样的综述好不好？中英文都可，小弟渴望进一步学习，谢谢了！

作者: koook5695 时间: 2013-5-2 15:17

综述太多了，最主要的是楼主想要了解，晶体还是NMR，坦白的说，这两个方面，都有非常多的教科书，如果是文献的话……因为结构解析已经是非常成熟了，我可以写几个
关于NMR：
1Heteronuclear multidimensional NMR experiments for the structure determination of proteins in solution employing pulsed field gradients
2-Nuclear Magnetic Resonance of Biological Macromolecules,
ENzyme MEthods。 239，338，339卷。
3，Understanding NMR Spectroscopy(作者keeler，网上到处都有）。

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-5-2 15:18

非常感谢楼主的辛勤劳动。
我最近在用15N标记表达蛋白，是酵母GS115表达的，但是遇到了困难。在原来的培养基中表达量比较高，但是换了培养基配方以后表达量很低，要得到大量的蛋白很困难，不知道有没有好的改进方法。
另外，蛋白质对温度的稳定性对于NMR解结构是不是很重要啊。

非常感谢。

作者: koook5695 时间: 2013-5-2 15:20

1、我们都是完全摸好条件再标记的，要提高表达量，无非就是换载体、诱导条件、时间、温度等等。
2、温度越高，NMR信号越好，这是肯定的，所以你的蛋白在温度高的时候越稳定，就可以在高温度下收谱，效果要很很多。
但是一般我们都是在25度做，只有蛋白比较大20kd以上，我们才尝试高温度。

作者: dotaaa 时间: 2013-5-2 15:20

如果蛋白的分子量很大，如200K，还能正常进行结晶培养吗？
多谢

作者: koook5695 时间: 2013-5-2 15:42

呵呵，那么你知道吗，原核蛋白的核糖体的结构就是结晶得到的。
晶体解析结构不受大小限制的。

作者: NBA 时间: 2013-5-2 15:42

显然这个领域是交叉性非常强的专业领域。物理，化学，生物，计算机的原理与技术都有应用到。所以很多专业的术语都是不同领域的，刚刚接触时候，会感觉到这个领域的知识有些难度。不过这些方法和技术都是不同专业人共同开发出来的结果，多多领悟和接触就会发现也不是非常的难了。
说说三个主要结构解析的技术
1，X-RAY
2, NMR
3, EM.(electron microscopy)
1，2 楼主兄，已经说明的非常的深入浅出，且自己没有实战经验和实验基础。避免只是纸上谈兵，不赘述。
说说EM的技术。
其实EM技术自从1939年西门子制造第一台商业电镜以来，它一直都是研究形态结构的利器。五十年代和六十年代，A.KLUG，运用EM拍摄的照片，结合中央截面定理的原理，把二维的照片，重建出三维的结构信息。开辟了3D-EM的新领域。由于各种限制，它的进展非常之慢。不过由于A.KLUG的独创性贡献，他独享了1982年的化学炸药奖。
90年代以后，由于制样技术，电镜的设备的进步，以及计算机解析的算法的进步以及硬件的成本的降低，使得该技术获得飞速的发展，和广泛的应用。1997年有NATURE发表了该技术研究乙肝病毒7.4埃分辨率的结构。使得其分辨率达到亚纳米级。随着研究的深入，该技术显示出非常广泛的应用前景。
其优点，（与X-RAY 和NMR 的比较）
1，样品无需结晶，显然自然界的很多蛋白质结晶是非常困难的，所以无需结晶成为其首要的优点。
2，对于分子量非常大的蛋白，以及蛋白质复合物同样可以解析，避免了NMR的这个缺点。核糖体的功能的研究，该技术起到了不可替代的作用
3，制样的过程中，采样快速冷冻技术，可以保持样品在生理的状态下的结构
4，可以研究细胞内亚细胞结构，以及生物大分子复合物结构其研究范围可以是10-6-----10-12m的尺度。研究对象非常之广。
缺点与不足
主要的不足分辨率还未能达到X-RAY和NMR那么高的分辨率。至今最高的分辨率已发表文章的结果在5埃左右，不过已有实验室未发表的结构能够做到4埃的分辨率。

作者: kulee 时间: 2013-5-2 15:50

现在有点懂得蛋白的晶体结构的由来了.谢谢讲解.
因为我看了一些蛋白的文章,国内的做结构的不是太多,好多文章都是国外的,希望国内快快发展啊.

作者: yapuyapu 时间: 2013-5-2 15:51

,国内的做结构还是不少的。
由于做结构的需要的仪器设备比较大型，所以做起来比较集中，而且不是随便一个实验室就能组建的
另外，这个专业比较交叉，需要不同专业的人，很多时候，国内的专业人只做本专业，没有太宽的专业外的视野，也可能是另外的一个原因。

作者: 3648755 时间: 2013-5-2 15:52

做蛋白结晶学大家一般如何找到课题呢？就是从那些渠道得到你要的材料，特别是基因或者蛋白。

作者: windy+++ 时间: 2013-5-2 15:52

请教各位大侠

用于NMR结构解析的蛋白需要多少毫克。用酵母表达估计要用去多少克15N标记硫酸铵，不知道大家有没有经验。

作者: windy+++ 时间: 2013-5-2 15:53

再请教一个问题：蛋白与Fab片段联合结晶有没有特别注意的问题。

先感谢了！！

作者: koook5695 时间: 2013-5-2 15:57

做蛋白结晶学大家一般如何找到课题呢？就是从那些渠道得到你要的材料，特别是基因或者蛋白。

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一般都是大规模的筛选蛋白，例如从人类cDNA、大肠杆菌cDNA中大量筛选出合适的蛋白。
当然也有很多是和别的实验室合作拿到的蛋白。

作者: koook5695 时间: 2013-5-2 15:58

请教各位大侠

用于NMR结构解析的蛋白需要多少毫克。用酵母表达估计要用去多少克15N标记硫酸铵，不知道大家有没有经验。

===============================================================================================================

这个要和你的蛋白大小有关。
一般需要500uL，蛋白的浓度需要1-2mM，如果一个20kD的蛋白，差不多20mg。
用酵母是有人做的，例如梁宋平老师的实验室就这样标记过，主要是蛋白小，不需要C13标记，而且N15标记的NH4SO4比较便宜，1g才差不多几十美元。

作者: koook5695 时间: 2013-5-2 16:03

再请教一个问题：蛋白与Fab片段联合结晶有没有特别注意的问题。

先感谢了！！

=====================================================

共结晶的例子是非常多的，关键是结合能力要强，才可以共结晶。

作者: misswu61 时间: 2013-5-2 16:07

在做蛋白与小分子相互作用的时候（计算机模拟), 都需要哪些数据和相关的软件。

对蛋白分子来讲,必须知道它的结构,就是直接从PDB data bank下载，最好是晶体结构

至于数据，要看你做的目的

软件很多：

windows 版本的，VEGA ZZ,Bigma(这个记不太清楚了），Arguslab etc.
linux 版本：HADDOCK,Autodock etc.

个人倾向于 HADDOCK,用这个前提是知道binding site

作者: misswu61 时间: 2013-5-2 16:08

感谢楼主开了一个好贴

做一点简单的补充，

对于最后的结构计算部分，现在常用的软件有，cyana,xplor,cns,xplor-nih,aria
xplor-nih,cns 都是依据xplor发展起来的，不同的是，xplor-nih 加入了python界面，和rdc的计算，cns则提供了网页式的编辑界面，aria则是在cns的基础上引入了autoassignment和waterrefinement.主要应用torsion angle dynamics ,distance geometry molecular dynanmics
insihtII就是给xplor/cns加了一个图形界面，本质是一样的，至于discover studio主要是用来modelling的

cyana 则主要是torsion angle dynamics但是没有enegy minimization,而且有autoassignment，并且计算速度远快于xplor.个人觉得cyana计算之后一定要做enegy minimization或者是waterrefinement,但是cyana没有rdc calculation module.

当然也可以将cyana和cns联合起来使用，但是中间的衔接有点tricky.

最后的refinement也可以用amber来做，但是不是必须的，cns就可以了。

作者: cocacola 时间: 2013-5-2 16:10

想请教一下各位老师，我想看一下人的血清白蛋白结构没有改变？可以用什么方法去做？前面都是纯化出白蛋白之后，再做质谱分析，分析结果都显示结构无改变？另外还想请教一下，怎么样看其二级结构，三级结构有无改变，谢谢各位老师

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-5-2 16:11

看你的蛋白多大，超过20kd,nmr不太合适。如果使用nmr,最简单的就是看一维谱，如果你的蛋白作了n15标记，做个两维的hsqc是最能说明问题的

作者: ququer787 时间: 2013-5-2 16:12

白蛋白66.5KD，以前我师姐用过质谱分析，但是结构未发现有什么异常改变，谢上面这位兄台

作者: tianmei001 时间: 2013-5-2 16:12

各位战友好，我想问一下，《晶体、X射线和蛋白质》这本书的电子版解压缩后应用用什么打开方式呀，怎么我的打不开呀。

作者: junhun 时间: 2013-5-2 16:13

楼主。做X-ray对蛋白有什么要求，纯度，量？
我得蛋白大概150-200kD，我每次做大概可以得到20mg/L左右的样子。
适合做结晶吗？
这个蛋白挺重要的。
谢谢。

作者: eric930 时间: 2013-5-2 16:14

是不是适合结晶，是蛋白本身决定的。
纯度越高越好，至少90％，大小都不是问题，你的蛋白的表达量也是没有问题的。
最重要的是你的蛋白是正确折叠的，你可以考虑做个cd。
应该可以结晶，但是要摸索条件还是挺需要运气的。

作者: junhun 时间: 2013-5-2 16:14

谢谢，我的蛋白是有活性的酶，所以，折叠应该没问题。
不过要切掉hig-tag，但是，酶浓度过高，会在温度高时沉淀。
如何解决这个问题？

是啊，至少几个月吧。

ps：哥们，你是哪个所的？

作者: koook5695 时间: 2013-5-2 16:15

可以考虑不要用pet28a，如果表达和提纯没有问题可以考虑换到pet24a，或者pet21a中，这样就不用担心有histag了。

作者: junhun 时间: 2013-5-2 16:15

我用的是pet15b, 有higtag的酶切位点，我的意思是酶浓度高了，容易沉淀

作者: bs4665 时间: 2013-5-2 16:16

我也做蛋白结构.正在为蛋白的表达有限而苦恼.而老板要用NMR和X-ray两种方法解析结构,还说比较两种有何同异.真是折磨我啊,我现在还是菜鸟级别呢.

作者: misswu61 时间: 2013-5-2 16:17

很感兴趣哦！
不过想咨询一下lz：内源、外源荧光，圆二色谱、动态光散射等手段对于初步解析蛋白的作用有多大？可信度有多大？
谢谢！

作者: koook5695 时间: 2013-5-2 16:17

除了圆二色谱，其他的没有接触过呵呵。
通常来说在解析结构之前，第一步就是看看蛋白质是不是真正折叠了，因为好多原核表达的蛋白虽然可溶，但是却并没有形成正确的构象。这时候，用园二色谱看看是不是具备二级结构就是很有必要了，或者用NMR一维谱也可以更加准确的确定，然后才会去考虑是不是可以解析其结构的。

作者: gogo 时间: 2013-5-2 16:18

您好！我想请教一下，我的蛋白是从发酵液里提取出来的，大概36.6kDa大，老板想让我做一下结构，我对这个一窍不通，应该从哪儿入手呢？谢谢

作者: koook5695 时间: 2013-5-2 16:19

您好！我想请教一下，我的蛋白是从发酵液里提取出来的，大概36.6kDa大，老板想让我做一下结构，我对这个一窍不通，应该从哪儿入手呢？谢谢

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这么大，只能结晶。
首先你要拿到纯度比较高的蛋白，量30mg左右吧，然后做个cD或者NMR一维谱，是不是折叠了，如果蛋白折叠了，那么就可以考虑结晶了。

作者: koook5695 时间: 2013-5-2 16:21

另外，我还想请教一下您给的那个pdb结构的网站，是怎么个用法呢，输入关键字怎么看到全文？具体用途是什么，新手上路，谢谢您！

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直接搜索就可以了，具体用途就是看看你的蛋白是不是已经有了结构，或者是不是有了同源结构。从而判断你的蛋白结构解析之后意义有多大呵呵

作者: huifeng0516 时间: 2013-5-2 16:21

想要知道结构是否有意义，关键是你的结构能说明什么问题，而不要太在乎是否是新结构。

作者: koook5695 时间: 2013-5-2 16:22

但是如果是一个新的fold话，那样文章更容易被接收。
如果有了同源结构，那么只有很好的功能实验，才能发表好的文章吧。

作者: dog002 时间: 2013-5-2 16:24

QUOTE:

原帖由 koook5695 于 2013-5-2 16:22 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
但是如果是一个新的fold话，那样文章更容易被接收。
如果有了同源结构，那么只有很好的功能实验，才能发表好的文章吧。

新结构一般也看功能和来源，现在只是结构的文章很难发表，因为不能说明什么问题，除了结构上的叙述外，和功能相关的部分都是猜测，没有说服力的。
所以结构生物学的发展必然是成为一门附属学科，还是为功能解释服务的。

作者: dog002 时间: 2013-5-2 16:24

很感兴趣哦！
不过想咨询一下lz：内源、外源荧光，圆二色谱、动态光散射等手段对于初步解析蛋白的作用有多大？可信度有多大？
谢谢！

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这些手段都只是辅助手段，一般只能是参考价值，和长晶体没有太大关系。
不过我们用动态光散射比较多，还有个比较有效的手段就是2级结构预测，看disorder区域多不多，比较多的话，就不太可能结晶，就要考虑做truncate或者复合物了.这个目前还是比较准的。

作者: 2541 时间: 2013-5-2 16:25

看到过有人用NMR做小分子和蛋白的相互作用,而且蛋白的分子量还比较大,他们应该是用的同位素标记的小分子.如果是这样的话,那么蛋白对于小分子的干扰很小吗?这和楼主说的较大的蛋白不适合用NMR来做有什么关系没有?
另外,问一个比较白痴的问题,H-D交换实验是用NMR来检测的还是其他方法?谢谢!

作者: koook5695 时间: 2013-5-2 16:26

H-D实验是一种非常常见和常用的NMR实验。
是这样，研究蛋白和小分子，一般都是把蛋白标记，小分子不标记，看小分子对蛋白的影响，找到相互作用的位置等等。
如果蛋白太大，因为蛋白的信号就会比较差，也是不利于研究的。

作者: dog002 时间: 2013-5-2 16:26

翻了一遍回复贴，还是没有具体的方法，现在拿到衍射数据了，下一步不知道该怎么做了，希望有这方面研究的大大能写点具体的东西出来。

作者: applebook=213 时间: 2013-5-2 16:27

小弟我初次来到这里，浏览中发现BZ的贴子，很是崇拜。我虽然不是专门做这方面的，但最近由于试验在研究功能蛋白，十分需要补充这部分的知识。LZ做的真的是太棒了，不胜感激啊，以后可能会有进一步的请教或者合作。

作者: wsll 时间: 2013-5-2 16:28

“如果你的蛋白在胞质中表达，如果你不确定是不是表达，可以从分子筛上的位置，或者扫CD确定一下，当然最简单的是做一个NMR一维谱，只需要几分钟。”
这句话的意思不懂，能不能解释一下啊？

作者: kulee 时间: 2013-5-2 16:28

这个帖子不错，建议置顶，欢迎继续讨论。
问一个可能外行的问题，如果我的蛋白晶体分辨率比较低，只有3.9A,我该如何才能提高分辨率呢？我做的是一个跨膜蛋白。

作者: koook5695 时间: 2013-5-2 16:28

“如果你的蛋白在胞质中表达，如果你不确定是不是表达，可以从分子筛上的位置，或者扫CD确定一下，当然最简单的是做一个NMR一维谱，只需要几分钟。”
这句话的意思不懂，能不能解释一下啊？

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写的有点简单了。
我的意思是，有时候你的蛋白虽然在胞质中表达了，也提纯了，但是并没有形成正确的构象，所有是无法结晶，解析结构的了。
所以
1、在分子筛上流出的位置（参照标准蛋白），可以粗略判断是不是多聚或者单体。
2、cd可以看看是不是有二级结构的存在
3、NMR一维谱可以更加准确的确定蛋白是不是折叠。
然后在考虑结晶。

作者: koook5695 时间: 2013-5-2 16:29

这个帖子不错，建议置顶，欢迎继续讨论。
问一个可能外行的问题，如果我的蛋白晶体分辨率比较低，只有3.9A,我该如何才能提高分辨率呢？我做的是一个跨膜蛋白。

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同步辐射可以提高分辨率。
另外如果晶体数量比较多，可以多挑一些晶体进行screen，另外还要考虑cryoprotect。

作者: koook5695 时间: 2013-5-2 16:30

另外，我还想请教一下您给的那个pdb结构的网站，是怎么个用法呢，输入关键字怎么看到全文？具体用途是什么，新手上路，谢谢您！

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你可以选择高级搜索选项，里面有一个sequence，你把你的序列贴进去，就可以轻松查找了。

作者: koook5695 时间: 2013-5-2 16:31

您好！我想请教一下，我的蛋白是从发酵液里提取出来的，大概36.6kDa大，老板想让我做一下结构，我对这个一窍不通，应该从哪儿入手呢？谢谢

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建议考虑结晶。
建议和国内晶体实验室联系。

作者: memory 时间: 2013-5-2 16:31

分辨率不是仪器问题，而是蛋白本身的性质，所以很难。

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那么我可以通过进一步优化结晶条件，改善晶体结构来提高分辨率吗？主要需要改变那些条件呢，detergent？temperature？

作者: orangecake 时间: 2013-5-2 16:31

结构哪个实验室比较好啊可以联系去做呢？
表达两个同源比较高的蛋白想做结构和功能

作者: zhezhe 时间: 2013-5-2 16:33

有没有战友讨论一下液质联用在蛋白质结构鉴定方面的应用，看到一个工作描述如下:
Applicants should have a PhD or equivalent experience in Chemistry/Biochemistry/
Analytical Science or a related area which has included the use of analytical instrumentation, together with considerable knowledge and experience in mass spectrometry and chromatography for the identification and structural elucidation of biomolecules.
我只知道液质可以做protein identification，但不明白在结构鉴定中的作用，请结构解析战友指教

作者: koook5695 时间: 2013-5-2 16:34

QUOTE:

原帖由 zhezhe 于 2013-5-2 16:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

有没有战友讨论一下液质联用在蛋白质结构鉴定方面的应用，看到一个工作描述如下:
Applicants should have a PhD or equivalent experience in Chemistry/Biochemistry/
Analytical Science or a related area which h ...

这里的structural是指蛋白的聚体、亚基、配体等，而不是蛋白的三维结构解析。

作者: flower-201 时间: 2013-5-2 16:35

这里的structural是指蛋白的聚体、亚基、配体等，而不是蛋白的三维结构解析。

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谢谢斑竹，能不能再介绍详细点啊，我是搞质谱的，不过对这个一点都不懂，所以想了解一下。

作者: mimili_901 时间: 2013-5-2 16:36

学习了不少。应用同源型的蛋白结构模型研究生理功能也可以，那么怎么寻找同源蛋白呢？

作者: idea2011 时间: 2013-5-2 16:37

你好，我马上要作一些比较简单的蛋白NMR实验，想多了解一些基础知识，能不能推荐一本系统的中文的参考书？科学出版社的蛋白质核磁共振波谱学原理与应用(第2版导读版)(精)，作者：(美)卡瓦纳，这本书如何？谢谢了！

作者: bring 时间: 2013-5-2 16:38

呵呵，现在核磁不需要那么多的蛋白质了，500uM，500ul也是够用的，也许是楼主的核磁功率不够，其次就是序列优化，用超快的序列可以减少时间。
再有就是固体核磁目前的大力发展和micell，bicell的使用，可以解决膜蛋白在磷脂中的构象，这些是其他解结构方法所不能比的...

作者: bring 时间: 2013-5-2 16:38

有没有战友讨论一下液质联用在蛋白质结构鉴定方面的应用，看到一个工作描述如下:
Applicants should have a PhD or equivalent experience in Chemistry/Biochemistry/
Analytical Science or a related area which has included the use of analytical instrumentation, together with considerable knowledge and experience in mass spectrometry and chromatography for the identification and structural elucidation of biomolecules.
我只知道液质可以做protein identification，但不明白在结构鉴定中的作用，请结构解析战友指教

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Maclaffty的实验室有做这类的工作，比如二硫键的确定等...

作者: c86v 时间: 2013-5-2 16:39

弱弱的问一声，描述蛋白三维结构的例如T=1是什么参数？

作者: PCR 时间: 2013-5-2 16:39

很棒的帖子！最近正好在做struct bio的présentation，看了之后受益匪浅啊！
另外想问一下做structure的同学，可以简单讲一下NCS和phase extension的原理么？

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