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标题: 【讨论帖】做磷酸化蛋白的Western blotting之我见 [打印本页]

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-2 17:22 标题: 【讨论帖】做磷酸化蛋白的Western blotting之我见

我做过不少磷酸化蛋白的Western blot，之前在免疫学技术讨论版发过贴子：

cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=68&id=11443307&sty=1&tpg=1&age=0')

根据蛋白版fangweibin119版主的建议，我在这里新开贴子，与同仁们交流。

如有同仁对磷酸化蛋白的Western blotting有问题，可在此跟贴交流。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-2 17:23

我最近提取血液中的netrophils，做Western blot，发现有些二抗会干扰到最后的条带。比如，二抗anti-mouse会有很多杂带，在42KD也有一条与actin重叠，如果您在做人体的白血球时，如果选择的normalized control为二抗是anti-mouse的actin，那么就要小心了！最好您可以选择二抗是anti-rabbit的GAPDH。但是我目前还没有发现体外培养的细胞株有如此现象。
提醒大家一下。

作者: dongdongqiang 时间: 2013-5-2 17:23

想做，但是还没做，
问个基础问题啊，一个抗体为啥能识别磷酸化和没有磷酸化的蛋白质呢？
如果我想自己做磷酸化的抗体，是否可以合成一段12个氨基酸左右的肽其中带有磷酸化的Ser，这样成功的几率怎么样？

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-2 17:24 标题: 回复 #3 dongdongqiang 的帖子

那要取决于您设计的多肽作为Immunogen的特异性如何了。如果氨基酸序列中带有磷酸化的Ser且特异性较好的，成功的几率就高一些。当然，生物体内比较复杂，所以提取抗体后还要做特异性和亲和性等方面的检测。
至于一个抗体为啥能识别磷酸化和没有磷酸化的蛋白质，那是因为抗体具有高度特异性，甚至可以分辨一个氨基酸的差别，区分其蛋白质特定氨基酸有无磷酸化。

作者: 831226 时间: 2013-5-2 17:24

看了楼主在免疫版的全部帖子，大有收获，非常感谢楼主
本人在做p-mTOR及mTOR的WB有2个月了，beta-actin已经做得挺满意了，但是目的蛋白一直没有做出来，原来以为做出来了后来发现是非特异性条带，郁闷极了。想请楼主指点迷津啊！
细胞裂解液是自己配置的，添加了PMSF及ROCHE的COCKTAIL
使用6%Sep GEL, 80V,100V 电泳
PVDF膜转膜，300V，3h
5%牛奶封闭 1h
一抗（用5%牛奶配置，没有完全按照说明书）overnight
二抗 1h
odyssey 看结果

看了楼主的帖子后，我发现问题会不会在于没有使用磷酸酶抑制剂，及一抗的配置呢？
楼主帮帮忙啊，我都快不敢见老板了，郁闷

作者: 831226 时间: 2013-5-2 17:25

还有一个问题想摆脱楼主
如果提取蛋白后立即进行电泳，能否不加磷酸酶抑制剂呢？
还有就是做磷酸化蛋白是不是用ECL会比较好呢？

再三感谢楼主了

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-2 17:26

QUOTE:

原帖由 831226 于 2013-5-2 17:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

还有一个问题想摆脱楼主
如果提取蛋白后立即进行电泳，能否不加磷酸酶抑制剂呢？
还有就是做磷酸化蛋白是不是用ECL会比较好呢？

再三感谢楼主了 ...

回答：
1，没有使用磷酸酶抑制剂会影响结果，尤其是一些初学者因为不太注意细节，影响更大。
2，一抗的配置最好参考厂商建议。
3，为了排除您个人操作的失误，建议您先用阳性对照试一下，以保证您是可以做出实验的。也有可能您对细胞的处理本身不会造成mTOR磷酸化。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-2 17:26

QUOTE:

回答：
1，即使马上电泳，也要加磷酸酶抑制剂。
2，用ECL做出的条带漂亮一些，但不会影响结果太多。
3，一抗很重要，有时一抗不合适就不容易出结果。而一抗的选择，我一般看文献，看文献中的条带清楚不清楚，与我是不是同一个细胞株，然后选相同的厂商的抗体。

作者: XYZQ 时间: 2013-5-2 17:26

我想用WB测定大鼠脊髓中nNOS（神经型一氧化氮合酶）四个位点的磷酸化水平，不知需要注意哪些问题，抗体选择有什么窍门呢？谢谢

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-2 17:27

QUOTE:

原帖由 XYZQ 于 2013-5-2 17:26 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我想用WB测定大鼠脊髓中nNOS（神经型一氧化氮合酶）四个位点的磷酸化水平，不知需要注意哪些问题，抗体选择有什么窍门呢？谢谢

您如果是初次做，建议如下：
1，操作尽量低温。
2，细胞裂解液中要加磷酸酶抑制剂。
3，最重要的一点，我在前面已提过，一抗很重要，有时一抗不合适就不容易出结果。而一抗的选择，我一般看文献，看文献中的条带清楚不清楚，与我是不是同一个细胞株，然后选相同的厂商的抗体。
4，一抗尽量选择多克隆抗体。如果厂商能提供阳性对照则更好。

作者: feima+ 时间: 2013-5-2 17:29

磷酸化蛋白加入磷酸酶抑制剂的同时还需要加入蛋白酶抑制剂及PMSF

作者: 66小飞侠 时间: 2013-5-2 17:30

我做了一年的WB，其中有很多磷酸化的，一些经验教训：

1. 正像楼主所说，抗体选择很重要，而且最最重要。好抗体，傻瓜也能做出来，不好的抗体神仙也无办法。有些公司的抗体很好，有些公司的抗体很差（一些大公司同样会有低劣产品），而且这一点对非磷酸化的抗原检测也很重要。
2. 标本收集要在冰上，保持低温。我没有用磷酸酶抑制剂，没有比较过用和不用的区别，但结果总体来说还可以。
3. 我们实验室对于磷酸化蛋白的检测，封闭必用5%BSA，而不用脱脂奶粉，道理讲不清，上面流传下来的方法，可能对于敏感性和特异性差的抗体会有帮助。一抗用1%BSA稀释，先1：1000 稀释，后根据情况调整。
4. 我们只有做IP的时候才用蛋白酶抑制剂。

又看了楼主过去的帖子，很佩服，楼主是个热心人。做过此类实验后，再看你的WB经验，既有同感有学习了很多。投上一票，聊表敬意！

作者: 831226 时间: 2013-5-2 17:30

做Western很久了，但是做磷酸化的抗体也是近几个月的事情，有几点经验与大家分享：
1. 抗体的说明书大家一定要仔细看，非常重要，因为不同的磷酸化抗体公司推荐的protocol不同，比如upstate的gamma-H2AX就需要non-fat milk封闭，一抗、二抗也需要non-fat milk配置，而CST的一些抗体则是non-fat milk封闭，一抗、二抗用BSA配置。其中原因不详，但是应该是非常关键的，我试过用BSA配gamma-H2AX，背景很高，目的条带非常淡。
2. 蛋白收集，洗涤贴壁细胞后，直接加1X上样缓冲液，超声后煮沸，不需要其他的磷酸酶抑制剂，效果不错。简单容易操作，适合新手。
3. 洗涤对最后的背景影响也较大，millipore最近的说明书推荐用双蒸水洗涤，效果很明显，具体：1st and 2nd抗体之间，DDW 5min X3次，2nd抗体后，DDW 5min X3次，TBST 5min X1次，DDW rinse 3-4次。我对比了TBST洗涤的membrane，效果有一定差距，背景有效降低，即使压片30min，背景仍然是可以忽略的。我想，DDW充分减少了ECL反映中其他缓冲的影响，应该是可取的。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-2 17:31

磷酸化蛋白加入磷酸酶抑制剂的同时还需要加入蛋白酶抑制剂及PMSF

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没错。PMSF也是蛋白酶抑制剂的一种。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-2 17:32

磷酸化蛋白加入磷酸酶抑制剂的同时还需要加入蛋白酶抑制剂及PMSF

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版主说得没错。另外，PMSF也是蛋白酶抑制剂的一种。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-2 17:32

我做了一年的WB，其中有很多磷酸化的，一些经验教训：

1. 正像楼主所说，抗体选择很重要，而且最最重要。好抗体，傻瓜也能做出来，不好的抗体神仙也无办法。有些公司的抗体很好，有些公司的抗体很差（一些大公司同样会有低劣产品），而且这一点对非磷酸化的抗原检测也很重要。
2. 标本收集要在冰上，保持低温。我没有用磷酸酶抑制剂，没有比较过用和不用的区别，但结果总体来说还可以。
3. 我们实验室对于磷酸化蛋白的检测，封闭必用5%BSA，而不用脱脂奶粉，道理讲不清，上面流传下来的方法，可能对于敏感性和特异性差的抗体会有帮助。一抗用1%BSA稀释，先1：1000 稀释，后根据情况调整。
4. 我们只有做IP的时候才用蛋白酶抑制剂。

又看了楼主过去的帖子，很佩服，楼主是个热心人。做过此类实验后，再看你的WB经验，既有同感有学习了很多。投上一票，聊表敬意！

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谢谢分享经验。没有用磷酸酶抑制剂，在磷酸化蛋白的量较多（如MAPK），且一抗质量较好时可能影响不大,其它时候影响都很大，尤其是一些不太好做的磷酸化蛋白。个人经验，封闭用5%BSA比脱脂奶粉要好一些，但不会好太多。一抗用1%，3%，5%BSA这三个浓度稀释，效果都还可以，但我个人使用的经验是5%BSA稀释的抗体reuse的次数会更多一些。
建议还是加蛋白酶抑制剂为好，个人经验，加了以后的实验结果相对稳定一些。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-2 17:33

做Western很久了，但是做磷酸化的抗体也是近几个月的事情，有两点经验与大家分享：
1. 抗体的说明书大家一定要仔细看，非常重要，因为不同的磷酸化抗体公司推荐的protocol不同，比如upstate的gamma-H2AX就需要non-fat milk封闭，一抗、二抗也需要non-fat milk配置，而CST的一些抗体则是non-fat milk封闭，一抗、二抗用BSA配置。其中原因不详，但是应该是非常关键的，我试过用BSA配gamma-H2AX，背景很高，目的条带非常淡。
2. 蛋白收集，洗涤贴壁细胞后，直接加1X上样缓冲液，超声后煮沸，不需要其他的磷酸酶抑制剂，效果不错。简单容易操作，适合新手。
3. 洗涤对最后的背景影响也较大，millipore最近的说明书推荐用双蒸水洗涤，效果很明显，具体：1st and 2nd抗体之间，DDW 5min X3次，2nd抗体后，DDW 5min X3次，TBST 5min X1次，DDW rinse 3-4次。我对比了TBST洗涤的membrane，效果有一定差距，背景有效降低，即使压片30min，背景仍然是可以忽略的。我想，DDW充分减少了ECL反映中其他缓冲的影响，应该是可取的。

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谢谢分享经验。对于第2点，我也这样做过，效果不错，只是有两点要注意：1，不容易测蛋白浓度，所以定量上相对不准确；2，因为相对而言要加的1X上样缓冲液较多，所以蛋白浓度可能较稀，对一些较少量的蛋白之WB可能不适合。
对于第3点，这可能是个不错的方法，我担心的是目的蛋白或者抗体会不会被DDW洗脱，影响结果？期待同仁能证实或排除这一点。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-2 17:33

有战友问：磷酸化后分子量会变吗？我做出来的磷酸化的位置和总蛋白的位置不在一起，谢

回答：磷酸化后分子量会增加一些，即增加几个磷酸根的分子量而已，相对几十KD的蛋白而言影响不大，所以条带应该在相同位置。如果您做出来的磷酸化的位置和总蛋白的位置不在一起时，其中的一个原因可能是您看到的是抗体的非特异性条带，而其特异性条带没有出现。

作者: cwcwcww 时间: 2013-5-2 17:34

对于第2点，我也这样做过，效果不错，只是有两点要注意：1，不容易测蛋白浓度，所以定量上相对不准确；2，因为相对而言要加的1X上样缓冲液较多，所以蛋白浓度可能较稀，对一些较少量的蛋白之WB可能不适合。

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1. 我定量的时候，空白对照用等体积1X上样缓冲，这样基本排除了定量误差，而且这一点已经用beta-actin等内参得到证实。
2. 这一点确实如此，特别是对于细胞密度较低或者所用培养皿较小的细胞，不过，我6cm的dish加入150ul 1X上样缓冲，完全没有问题，我用的细胞比较大，密度一般，因此应该适用于大多数的情况。

作者: cwcwcww 时间: 2013-5-2 17:34

对于第3点，这可能是个不错的方法，我担心的是目的蛋白或者抗体会不会被DDW洗脱，影响结果？期待同仁能证实或排除这一点。

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这点已经有文献报道过，而且我自己试过至少30种抗体（不同公司，包括CST磷酸化抗体）都没有问题，改天有空，我做一个平行对照，看看差距。

作者: ukonptp 时间: 2013-5-2 17:35

做Western很久了，但是做磷酸化的抗体也是近几个月的事情，有两点经验与大家分享：
3. 洗涤对最后的背景影响也较大，millipore最近的说明书推荐用双蒸水洗涤，效果很明显，具体：1st and 2nd抗体之间，DDW 5min X3次，2nd抗体后，DDW 5min X3次，TBST 5min X1次，DDW rinse 3-4次。我对比了TBST洗涤的membrane，效果有一定差距，背景有效降低，即使压片30min，背景仍然是可以忽略的。我想，DDW充分减少了ECL反映中其他缓冲的影响，应该是可取的。

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第三点中是你自己亲自实验对比后的结果吗？

作者: idea2011 时间: 2013-5-2 17:36

第三点中是你自己亲自实验对比后的结果吗？

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是的，但是没有做“头对头”比较，只是前后两次，一次用TBST洗，一次用DDW洗，但是前后差异很小，因为实验室是恒温的，而且是同一批样品，做出来的背景DDW洗的更好，所以推荐给大家。

作者: ukonptp 时间: 2013-5-2 17:36

是的，但是没有做“头对头”比较，只是前后两次，一次用TBST洗，一次用DDW洗，但是前后差异很小，因为实验室是恒温的，而且是同一批样品，做出来的背景DDW洗的更好，所以推荐给大家。

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昨天我试了一次
在二抗进行ECL孵育前如果用DDW洗的话背景是很干净，但是HRP催化底物的能力几乎丧失了
后来用TBST重新洗膜后加上ECL孵育，能曝出条带
供你参考

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-2 17:37

我也这样试了一下，与uk版主所看到的类似，背景很干净，但条带也很弱。

作者: KGZ564 时间: 2013-5-2 17:37

磷酸化抗体当然不能使用脱脂奶，因为脱脂奶含磷酸化蛋白丰富，是奶中磷元素的来源之一。但多肽序列特异的磷酸化抗体一半不受脱脂奶的影响。。双磷酸化MAPK （such as ERK1/2, JNKs, p38 MAPK)抗体很少受脱脂奶影响。信号变弱是因为脱脂奶可能会影响抗体进入固定于膜上的抗原而已。4度过夜好，主要原因不是抗体结合更好，而是蛋白抗原不容易从膜上脱落。蛋白抗原在膜上靠的是物理吸附属热力学范畴，高温下容易脱落。而但抗体-抗原结合是热力学与动力学问题，高温容易结合是热力学范畴，抗体抗原浓度却是动力学范畴。膜上的抗原脱落了，结合效率会低。

作者: TAT 时间: 2013-5-2 17:38

磷酸化蛋白加入磷酸酶抑制剂的同时还需要加入蛋白酶抑制剂及PMSF

好像PMSF很容易失活，许多WB达人在将组织裂解时，均交代要反复多次添加PMSF，请问裂解及提取上清并进行分装，以后在使用时还要添加PMSF吗？

作者: TAT 时间: 2013-5-2 17:38

1. 抗体的说明书大家一定要仔细看，非常重要，因为不同的磷酸化抗体公司推荐的protocol不同，比如upstate的gamma-H2AX就需要non-fat milk封闭，一抗、二抗也需要non-fat milk配置，而CST的一些抗体则是non-fat milk封闭，一抗、二抗用BSA配置。其中原因不详，但是应该是非常关键的，我试过用BSA配gamma-H2AX，背景很高，目的条带非常淡。

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说得没错，CST的一些抗体则是non-fat milk封闭，我试过用BSA配制，背景很脏。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-2 17:40

好像PMSF很容易失活，许多WB达人在将组织裂解时，均交代要反复多次添加PMSF，请问裂解及提取上清并进行分装，以后在使用时还要添加PMSF吗？

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我只在配制时添加，之后就不再加了。

作者: ukonptp 时间: 2013-5-2 17:41

好像PMSF很容易失活，许多WB达人在将组织裂解时，均交代要反复多次添加PMSF，请问裂解及提取上清并进行分装，以后在使用时还要添加PMSF吗？

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我的方法基本同楼上回答

PMSF在溶液中降解是30min左右

PMSF在溶液中与蛋白酶是呈不可逆结合
后续分装的过程是不需要加的

作者: dongdongqiang 时间: 2013-5-2 17:42

昨天我试了一次
在二抗进行ECL孵育前如果用DDW洗的话背景是很干净，但是HRP催化底物的能力几乎丧失了
后来用TBST重新洗膜后加上ECL孵育，能曝出条带
供你参考

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谢谢您补充实验，我想可能是实验条件及抗体的差异吧，您这样做肯定更有说服力，所以我也不推荐所有的抗体都用DDW洗了。

作者: 04906 时间: 2013-5-2 17:42

今天终于如愿以偿作出了自己想要的条带！
另外再请问下，
1.在磷酸化蛋白一抗（5%BSA稀释)中加叠氮钠以增加反复使用次数合适吗？
2.添加后在4度冰箱中能放多久？
3.记得llllcjchina大侠在上次贴中曾提到一抗稀释后要放置-20度保存，哪添加叠氮钠后还需要放置-20度吗？
4.添加叠氮钠后的一抗在重复使用时需补充少量一抗吗？以前师兄曾告诉我，叠氮钠会使一抗效价下降或损耗一抗，是这样的吗？
谢谢！

作者: 131415 时间: 2013-5-2 17:43

本人做了磷酸化蛋白的WB有几个月了，一开始得出的结果却发现是非特异性条带，差点崩溃掉。
昨天再做了一次WB。具体过程如下，请大侠们指教：
提取样品：
预冷的PBS清洗3次，细胞刮收集细胞，4度离心5分钟后，加入裂解液（含有ROCHE的蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂，PMSF),冰上裂解30分钟，4度离心15分钟收集上清液。
蛋白变性：
提取蛋白后立即加入RIPA及Loading buffer,100度变性5分钟，短暂离心，﹣80度保存
电泳：
Sep GEL 7%过夜
stack gel 80伏 18分钟
sep gel 100伏 80分钟
转膜
PVDF膜活化5分钟
转膜 100伏 3h
TBS 15min 3次
封闭液
5%脱脂牛奶（完全按照一抗说明书）1h
blotting buffer(按照一抗说明书配置) 15min 3次
一抗（按说明书配置） 4度过夜
blotting buffer 15min 3次
二抗（中杉金桥）1h
blotting buffer 15min 3次
ECL 发光液+H2O2 2 min
曝光

结果发现，连beta-actin 都没有条带，甚至在暗房中也没看见发光

请各位大侠帮忙分析一下吧
再不出结果，老板就会。。。

作者: wu11998866 时间: 2013-5-2 17:43

发现没有结果后，我用0.1%NaOH洗膜5min ，TBS 15min 3 次
5%BSA封闭（因为本次用的一抗CST建议使用BSA)1h
TBST 15min 3 次
一抗（按CST的要求配置5%BSA稀释）4度过夜
明天准备改用ODYSSEY来看
祈求明天会看到东西

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-2 17:44

另外再请问下，
1.在磷酸化蛋白一抗（5%BSA稀释)中加叠氮钠以增加反复使用次数合适吗？
2.添加后在4度冰箱中能放多久？
3.记得llllcjchina大侠在上次贴中曾提到一抗稀释后要放置-20度保存，哪添加叠氮钠后还需要放置-20度吗？
4.添加叠氮钠后的一抗在重复使用时需补充少量一抗吗？以前师兄曾告诉我，叠氮钠会使一抗效价下降或损耗一抗，是这样的吗？
谢谢！

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回答：
1，个人感觉，叠氮钠并不能很好地增加一抗的使用次数。而且叠氮钠会抑制HRP活性，我自己觉得没必要加。
2，稀释后的一抗建议不要放在4度冰箱太久，要放置-20度保存。
3，叠氮钠可以抑菌，稳定抗体，添加叠氮钠后稀释后的一抗在4度可以保存略久一些，但它确实可以使稀释后的抗体效价一降。
总之，我不建议在稀释后的抗体中加叠氮钠。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-2 17:45

本人做了磷酸化蛋白的WB有几个月了，一开始得出的结果却发现是非特异性条带，差点崩溃掉。
昨天再做了一次WB。具体过程如下，请大侠们指教：
提取样品：
预冷的PBS清洗3次，细胞刮收集细胞，4度离心5分钟后，加入裂解液（含有ROCHE的蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂，PMSF),冰上裂解30分钟，4度离心15分钟收集上清液。
蛋白变性：
提取蛋白后立即加入RIPA及Loading buffer,100度变性5分钟，短暂离心，﹣80度保存
电泳：
Sep GEL 7%过夜
stack gel 80伏 18分钟
sep gel 100伏 80分钟
转膜
PVDF膜活化5分钟
转膜 100伏 3h
TBS 15min 3次
封闭液
5%脱脂牛奶（完全按照一抗说明书）1h
blotting buffer(按照一抗说明书配置) 15min 3次
一抗（按说明书配置） 4度过夜
blotting buffer 15min 3次
二抗（中杉金桥）1h
blotting buffer 15min 3次
ECL 发光液+H2O2 2 min
曝光

结果发现，连beta-actin 都没有条带，甚至在暗房中也没看见发光

请各位大侠帮忙分析一下吧
再不出结果，老板就会。。。

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blotting buffer是什么？是TBST吗？
如果连actin都没有条带的话，原因就有很多了，所以就无从给你建议了。
也有可能是哪一个试剂变质了。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-2 17:46

发现没有结果后，我用0.1%NaOH洗膜5min ，TBS 15min 3 次
5%BSA封闭（因为本次用的一抗CST建议使用BSA)1h
TBST 15min 3 次
一抗（按CST的要求配置5%BSA稀释）4度过夜
明天准备改用ODYSSEY来看
祈求明天会看到东西

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我没有用0.1%NaOH洗膜过，我不知可行不可行。
建议您先压好做一点的actin吧，实验要一步一步做，先把actin做不出来的原因找到。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-2 17:46

有战友问：
再次请教，请问，对于42KD的蛋白，SDS-PAGE的胶浓度是选10%的好还是12%的好？跑胶时用一块胶好还是两块胶好？我个人经验是跑一块胶（30mA浓缩胶-20mA分离胶）的效果比两块胶（60mA浓缩胶-40mA分离胶）好，不知道是不是电流的原因？还有转膜的时间与电流强度与蛋白分子量大小有具体的公式吗？
谢谢！

回答：
对于42KD的蛋白，SDS-PAGE的胶浓度是选10%或者12%都可以，可以根据您要做的另一个蛋白的分子量来选择。如果只做这单一蛋白WB，10%即可。

跑一块胶（30mA浓缩胶-20mA分离胶）的效果比两块胶（60mA浓缩胶-40mA分离胶）好，是因为：1，running buffer用于一块胶或两块胶的效果略有差异。2，因为您是固定电流，而没有固定电压，所以可能跑两块胶造成的电压变化可能较大。

目前我并没有看到“转膜的时间与电流强度与蛋白分子量大小”有具体的公式，只有大约的估计：蛋白分子量越大，转膜的时间与电流强度要越久越强。

作者: 3N4G 时间: 2013-5-2 17:47

我没有用0.1%NaOH洗膜过，我不知可行不可行。
建议您先压好做一点的actin吧，实验要一步一步做，先把actin做不出来的原因找到。

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同意你的说法

我试过NaOH洗膜
这种方法行不通

作者: zhenxin 时间: 2013-5-2 17:47

我是做p-akt的，做来作去胶片都是空白，昨天按照建议，洗涤时间缩短，膜上亮了一片，一压胶片就全曝光了，根本看不出条带了。请问有什么建议?很急，请帮帮忙啊！

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-2 17:48

我是做p-akt的，做来作去胶片都是空白，昨天按照建议，洗涤时间缩短，膜上亮了一片，一压胶片就全曝光了，根本看不出条带了。请问有什么建议?很急，请帮帮忙啊！

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你以前做都是空白，现在洗涤时间缩短，却膜上亮了一片。如果只是洗涤时间缩短的话，按理说不应该如此的。那您洗多短时间？几次？有可能您这次的其它条件改变了，而您不知道，请查一下这次实验有什么操作或试剂改了。

作者: 04906 时间: 2013-5-2 17:48

谢谢两位大侠的帮忙
我决定今天把所有液体都配过
重新再做

作者: 98776langtao 时间: 2013-5-2 17:49

你以前做都是空白，现在洗涤时间缩短，却膜上亮了一片。如果只是洗涤时间缩短的话，按理说不应该如此的。那您洗多短时间？几次？有可能您这次的其它条件改变了，而您不知道，请查一下这次实验有什么操作或试剂改了。

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还有就是一抗用5%BSA TBST稀释的，因为才看到说明书上这么要求，以前都是5%no-fat milk TBST稀释的。

作者: 98776langtao 时间: 2013-5-2 17:49

洗涤是5min/次，洗三次，一抗是过夜的，二抗37度1小时

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-2 17:50

洗涤是5min/次，洗三次，一抗是过夜的，二抗37度1小时

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二抗室温1小时即可，不用37度。

作者: 98776langtao 时间: 2013-5-2 17:51

二抗室温1小时即可，不用37度。

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谢谢啦，那如果暗室能看到信号，压片却没条带，一般是什么原因呢？

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-2 17:52

谢谢啦，那如果暗室能看到信号，压片却没条带，一般是什么原因呢？

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这种可能性很小，我还没见过这样的。X光片过期了？如果X光片提前曝光则应是全黑的才对。
要不然就是洗片的试剂出问题了。

作者: 98776langtao 时间: 2013-5-2 17:53

QUOTE:

原帖由 箭头儿 于 2013-5-2 17:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
谢谢啦，那如果暗室能看到信号，压片却没条带，一般是什么原因呢？

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这种可能性很小，我还没见过这样的。X光片过期了？如果X光片提前曝光则应是全 ...

上次就怀疑是显影液或定影液问题，所以换了，结果就一压全曝光了，以为是胶片问题，就拿胶片直接显影、定影，胶片没有曝光，还是蓝色透明的，每次问题都不一样，真快崩溃了哈！

作者: 04906 时间: 2013-5-2 17:53

再请问一个关于提取核蛋白组织样品的制备的问题。
有方法推荐：对于一般组织，可以称量后切成小块放入机戒组织匀浆器中，按组织净重，加入相应体积的裂解液进行匀浆，离心收集上清（如有粘稠物可超声处理）加入Laemmli样品缓冲液强力混匀，样品置100度的水浴箱水浴加热3-5分钟，10000g离心10分钟，取上清液，样品即可立即使用也可也可以分装冻存，-20℃存放的样品可稳定保持数月。
对于脑组织，是否可以通过液氮冷冻、研磨后，加裂解液后再予超声处理，再加入Laemmli样品缓冲液、煮沸5分钟后提上清保存或上样呢？对于提核蛋白来说，经超声、煮沸处理是否更有效？

作者: 04906 时间: 2013-5-2 17:54

另外，对磷酸化蛋白来说，上述处理（液氮冷冻、研磨后，加裂解液后再予超声处理，再加入Laemmli样品缓冲液、煮沸5分钟后提上清保存）合适吗？

作者: kuohao17 时间: 2013-5-2 17:55

好像PMSF很容易失活，许多WB达人在将组织裂解时，均交代要反复多次添加PMSF，请问裂解及提取上清并进行分装，以后在使用时还要添加PMSF吗？

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我们实验室一般是把细胞裂解液配好以后分装成1ml/支，-20度或者-60度保存，临用前再添加PMSF和cocktail，整个样品处理过程全部在冰上或者4度进行。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-2 17:55

再请问一个关于提取核蛋白组织样品的制备的问题。
有方法推荐：对于一般组织，可以称量后切成小块放入机戒组织匀浆器中，按组织净重，加入相应体积的裂解液进行匀浆，离心收集上清（如有粘稠物可超声处理）加入Laemmli样品缓冲液强力混匀，样品置100度的水浴箱水浴加热3-5分钟，10000g离心10分钟，取上清液，样品即可立即使用也可也可以分装冻存，-20℃存放的样品可稳定保持数月。
对于脑组织，是否可以通过液氮冷冻、研磨后，加裂解液后再予超声处理，再加入Laemmli样品缓冲液、煮沸5分钟后提上清保存或上样呢？对于提核蛋白来说，经超声、煮沸处理是否更有效？

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提取核蛋白我用的是kit (PIERCE NE-PER nuclear and cytoplasmic extraction reagents)。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-2 17:55

另外，对磷酸化蛋白来说，上述处理（液氮冷冻、研磨后，加裂解液后再予超声处理，再加入Laemmli样品缓冲液、煮沸5分钟后提上清保存）合适吗？

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超声波的时间和强度要控制好，过量对磷酸化蛋白影响很大。

作者: 阿司匹林 时间: 2013-5-2 17:56

您如果是初次做，建议如下：
1，操作尽量低温。
2，细胞裂解液中要加磷酸酶抑制剂。
3，最重要的一点，我在前面已提过，一抗很重要，有时一抗不合适就不容易出结果。而一抗的选择，我一般看文献，看文献中的条带清楚不清楚，与我是不是同一个细胞株，然后选相同的厂商的抗体。
4，一抗尽量选择多克隆抗体。如果厂商能提供阳性对照则更好。
您好：我现在在做p-eNOS,用HUVEC和SD大鼠的胸主动脉做的，用乙酰胆碱诱导2-5分钟都没有，版主上面说的几点都做到了，总蛋白和actin也都做出来了，就是磷酸化做不出来，请求版主帮助，谢谢！

作者: 阿司匹林 时间: 2013-5-2 17:56

超声波的时间和强度要控制好，过量对磷酸化蛋白影响很大。
多少合适呢？我是5秒钟，3次。另外我们的一抗是CST的，并且有师姐在做血小板的，做出来的

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-2 17:57

楼上：
你的总蛋白和actin两个结果都有出来，而磷酸化蛋白没有出来。有两个可能：1，你提取的sample有问题，包括提取的过程可能有问题，或者药物没有诱导成功；2，磷酸化一抗有问题。
为了排除第2点，建议你用你师姐的血小板sample(实验已成功的)作为阳性对照，看能不能在你手上重复出来。
至于超声波强度，我发现不同的机器会有很大差别，需要你自己小心调试。至于时间，5秒钟，3次还可以接受。

作者: cj_mondy 时间: 2013-5-2 17:57

我在做ERK磷酸化的WB.封闭用的是5%脱脂奶粉，一抗是cell signaling的，稀释度按照他的说明书1：2000稀释，用碧云天的一抗稀释液稀释。
第一次做的时候做出来了。
可是后来我用同样的样本重复就再也看不到条带。把其他同学做出来过的阳性样本再做也压不出条带来。
麻烦您给点建议，谢谢。

作者: 阿司匹林 时间: 2013-5-2 17:58

今天带师姐的样本一起跑的，什么都没有，涛声依旧啊！师姐的连总蛋白都没有！

作者: 阿司匹林 时间: 2013-5-2 17:58

今天终于如愿以偿作出了自己想要的条带！
好羡慕啊！我什么时候才能做出来啊？希望版主能就sample的制备给点建议，非常感谢！

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-2 17:59

我在做ERK磷酸化的WB.封闭用的是5%脱脂奶粉，一抗是cell signaling的，稀释度按照他的说明书1：2000稀释，用碧云天的一抗稀释液稀释。
第一次做的时候做出来了。
可是后来我用同样的样本重复就再也看不到条带。把其他同学做出来过的阳性样本再做也压不出条带来。
麻烦您给点建议，谢谢。

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cell signaling的p-ERK一般应该1：1000，而且要含5%BSA之TBST配.否则，1，条带不清晰，2，reuse的次数减少，至少不能reuse.

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-2 17:59

今天终于如愿以偿作出了自己想要的条带！
好羡慕啊！我什么时候才能做出来啊？希望版主能就sample的制备给点建议，非常感谢！

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建议您先用actin等一些好做的蛋白先把您的WB技术练好，找到出错原因所在后再做磷酸化蛋白。

作者: cj_mondy 时间: 2013-5-2 17:59

箭头儿楼主，谢谢你的解答。
我还想请教一下：
1、磷酸酶抑制剂的作用很重要，那么在蛋白样本变性电泳、转膜的过程中是否也得注意呢？电泳液、电转液、TBST是不是需要高压？
2、用5%BSA稀释抗体的话，里面需要加吐温2.0吗？
谢谢。

作者: uuooii 时间: 2013-5-3 10:34

你用刮细胞的方式我也做过，但我会冰上裂解30min,不进行超声波处理，直接离心取上清。
你问的“您说测蛋白后冰浴30min（然后离心取上清），这个冰浴的作用是什么？”应该是您看错了。我是冰浴30min充分裂解细胞，离心后取上清，然后测蛋白。
而用trypsin处理有个好处是蛋白浓度较高，但要注意保持低温。p-ERK活化当然有时间上的峰值，但trypsin如果处理得好，不会影响其活化的，至少在我手中是如此。我比较这两种方法发现，刮细胞的方式简单，但蛋白浓度较低；而用trypsin方式所得蛋白浓度较高，但要小心处理，否则磷酸化蛋白容易失活。各有优缺点。

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A quick question:
when I boil the sample with loading buffer at 95 degree C, is 15min too long?
Usually I use 5 min, but yesterday I boiled 15min by mistake. and nothing showed up on the membrane.

作者: bring 时间: 2013-5-4 12:04

我在做ERK磷酸化的WB.封闭用的是5%脱脂奶粉，一抗是cell signaling的，稀释度按照他的说明书1：2000稀释，用碧云天的一抗稀释液稀释。
第一次做的时候做出来了。
可是后来我用同样的样本重复就再也看不到条带。把其他同学做出来过的阳性样本再做也压不出条带来。
麻烦您给点建议，谢谢。

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我想到的可能有这几点：
1，分子量ladder有没有荧光？显影？
2，如果ladder没有显影，查看膜有没有反了。
3，样本有没有加磷酸酶抑制剂?
4，跑胶之前样本可以再次煮沸以确保蛋白变性。煮沸样本之前一定要一直保持低温操作，且时间越短越好。
5。前一次使用一抗有没有及时放回冰箱？可能一抗失效，但是几率不大。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 12:05

QUOTE:

原帖由 uuooii 于 2013-5-3 10:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你用刮细胞的方式我也做过，但我会冰上裂解30min,不进行超声波处理，直接离心取上清。
你问的“您说测蛋白后冰浴30min（然后离心取上清），这个冰浴的作用是什么？”应该是您看错了。我是冰浴30min充分裂解细胞，离心后取上清，然后 ...

我一般用5min,10min以内都还可以。15min实在太长了，我没试过，请测试过的同仁发表一下意见，谢谢！

作者: pencil菲 时间: 2013-5-4 12:05

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原帖由 bring 于 2013-5-4 12:04 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我在做ERK磷酸化的WB.封闭用的是5%脱脂奶粉，一抗是cell signaling的，稀释度按照他的说明书1：2000稀释，用碧云天的一抗稀释液稀释。
第一次做的时候做出来了。
可是后来我用同样的样本重复就再也看不到条带。把其他同学做 ...

1、ladder没有荧光，也没有显影。
2、膜是做了标记的，不会弄反。
3、抽蛋白是用Fermentas的细胞蛋白抽取液，没有额外加磷酸酶抑制剂。蛋白是变性后-80°保存。第一次拿出来跑western是在相应分子量的地方有条带的。
4、以前上样之前都不再把蛋白拿来煮的。这几天和另外一个老师交流，他说要煮。
5、一抗是新鲜的。

作者: moonlight45 时间: 2013-5-4 12:07

1、ladder没有荧光，也没有显影。
2、膜是做了标记的，不会弄反。
3、抽蛋白是用Fermentas的细胞蛋白抽取液，没有额外加磷酸酶抑制剂。蛋白是变性后-80°保存。第一次拿出来跑western是在相应分子量的地方有条带的。
4、以前上样之前都不再把蛋白拿来煮的。这几天和另外一个老师交流，他说要煮。
5、一抗是新鲜的。

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1, do you see visible marker (blue ladder)?
2, ECL expired?
3, you can check internal control by stripping the membrane and incubate with actin or total Erk antibody.
Or, simply stain the membrane with gel gold.

作者: moonlight45 时间: 2013-5-4 12:08

我一般用5min,10min以内都还可以。15min实在太长了，我没试过，请测试过的同仁发表一下意见，谢谢！

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I loaded more protein (80ug) and exposed for 15min. Bands of p-Erk showed up, but definitely much weaker than what I had before.

作者: yapuyapu 时间: 2013-5-4 12:08

我想弱弱地问一个很不成熟的问题：一般磷酸化都有很多位点，那么磷酸化抑制剂应该怎样选择？谢谢！

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 12:08

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原帖由 yapuyapu 于 2013-5-4 12:08 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我想弱弱地问一个很不成熟的问题：一般磷酸化都有很多位点，那么磷酸化抑制剂应该怎样选择？谢谢！

我们所用的磷酸酶抑制剂都是广谱的，一般会对蛋白所有位点的磷酸化都有作用。

作者: yapuyapu 时间: 2013-5-4 12:09

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原帖由 箭头儿 于 2013-5-4 12:08 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我们所用的磷酸酶抑制剂都是广谱的，一般会对蛋白所有位点的磷酸化都有作用。

您好我说的不是那种蛋白酶抑制剂。我是做VEGFR-2磷酸化与血管新生，现在要定VEGFR-2磷酸化抑制剂，但有很多位点的磷酸化抑制剂，比如Y951，Y1175，Y1054，Y1059等，我不知道该选那个，文献上也没怎么查到。请楼主赐教！

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 12:27

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原帖由 yapuyapu 于 2013-5-4 12:09 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

您好我说的不是那种蛋白酶抑制剂。我是做VEGFR-2磷酸化与血管新生，现在要定VEGFR-2磷酸化抑制剂，但有很多位点的磷酸化抑制剂，比如Y951，Y1175，Y1054，Y1059等，我不知道该选那个，文献上也没怎么查到。请楼主赐教！ ...

我没用过VEGFR-2磷酸化抑制剂，所以只能凭自己用其他抑制剂的经验说明一些。
我一般会购买文献中使用的最多的抑制剂，同时也购买相应的目的蛋白的磷酸化抗体，然后用抗体测试抑制的效果，如果抑制效果还可以就继续使用，否则就买另一种抑制剂。

作者: am10 时间: 2013-5-4 12:28

感谢楼主的帮助与指导，我的p-eNOS做出来了，换了个二抗，真是郁闷！但现在有个问题是杂带多，背景脏，请教楼主该如何解决呢?谢谢！另外我们有个同学做的条带都是呈点状、竖条状，乍一看象条形码一样，重复多次，改进条件都不好，这是什么原因呢？该如何解决？感谢！

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 12:28

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原帖由 am10 于 2013-5-4 12:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

感谢楼主的帮助与指导，我的p-eNOS做出来了，换了个二抗，真是郁闷！但现在有个问题是杂带多，背景脏，请教楼主该如何解决呢?谢谢！另外我们有个同学做的条带都是呈点状、竖条状，乍一看象条形码一样，重复多次，改进条件都不好，这是什 ...

p-eNOS的WB结果杂带多，背景脏，最大的可能是一抗的问题（尤其是杂带多），其次是提取蛋白过程的问题。改善的方法是：提取蛋白时尽量低温且快速一点；最好当然是换一个好一点的抗体。另外，建议你所用的reagent采用你们实验室WB结果不错的那一批，以排除是reagent出现的问题。
你们同学的WB结果如果是整个胶片是满天星星的样子，那是一抗的问题。如果是各条带时断时好，最大的可能有两点：1，你们同学跑胶时经常漏running buffer；2，某一个reagent变质了。

作者: 韩梅梅 时间: 2013-5-4 12:29

用牛奶封闭后，在TBST里震荡几下就行，不用洗那么长时间，否则封闭就没用了

作者: 韩梅梅 时间: 2013-5-4 12:29

请教大家一个问题，收的细胞蛋白，冻在-80度，能放多长时间？反复冻容几次就不行了？谢谢？

作者: 韩梅梅 时间: 2013-5-4 12:29

还有个问题，就是用抗鼠的二抗，发完光以后，在GAPDH下还有一条带，还挺清楚，请教一下这是怎么回事！谢谢大家

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 12:30

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原帖由 韩梅梅 于 2013-5-4 12:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

用牛奶封闭后，在TBST里震荡几下就行，不用洗那么长时间，否则封闭就没用了

应该不是震荡（vortex）,而是shaking.

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 12:30

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原帖由 韩梅梅 于 2013-5-4 12:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请教大家一个问题，收的细胞蛋白，冻在-80度，能放多长时间？反复冻容几次就不行了？谢谢？

冻在-80度至少可以一年，但反复冻融次数要尽量少，最好5次以下。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 12:31

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原帖由 韩梅梅 于 2013-5-4 12:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

还有个问题，就是用抗鼠的二抗，发完光以后，在GAPDH下还有一条带，还挺清楚，请教一下这是怎么回事！谢谢大家

non-specific binding,很多抗体都有此现象。

作者: huifeng0516 时间: 2013-5-4 12:31

楼主，你有没有做过组织的p-protein western,有没有从裂解开始的protocol?谢谢

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 12:31

有，我已在我之前的贴子里贴出了一些细节，但我没有放在一起，麻烦您看完这个贴子和之前的贴子后自己摘录您自己需要的部分。

作者: vcve 时间: 2013-5-4 12:32

超声破碎对p-AKT影响可能不大，我的MEF细胞样品，BioRuptor 200W 超声30秒，间歇30秒，10个循环。p-AKT(S473, Cell signalling)信号很强，曝光只需1秒。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 12:32

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原帖由 vcve 于 2013-5-4 12:32 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

超声破碎对p-AKT影响可能不大，我的MEF细胞样品，BioRuptor 200W 超声30秒，间歇30秒，10个循环。p-AKT(S473, Cell signalling)信号很强，曝光只需1秒。

我要补充一点：p-AKT以及p-MAPK等大量表达磷酸化蛋白的对超声波可能影响小一些，但超声波对磷酸化蛋白一定会造成影响，只是影响大小不同而已，这一点请务必注意。

作者: xingyi08 时间: 2013-5-4 12:33

我们想做p-ERK和p-AKT的western，请问楼主磷酸酶抑制剂能不能只加NaF？钒酸钠有的前辈激活了有的直接溶了就用，所以不知道到底该怎么处理。请问NaF还需要特殊处理吗？

作者: BOSS2011 时间: 2013-5-4 12:33

请问版主，我做的iNOS,eNOS的WB，可是出来的条带都在55kDa左右，而不是预定的135kDa,一抗用的是abcam的，不知道是什么原因，还望不吝赐教。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 12:34

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原帖由 xingyi08 于 2013-5-4 12:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我们想做p-ERK和p-AKT的western，请问楼主磷酸酶抑制剂能不能只加NaF？钒酸钠有的前辈激活了有的直接溶了就用，所以不知道到底该怎么处理。请问NaF还需要特殊处理吗？ ...

NaF不需要特殊处理，只加NaF当然也可以，只是没有与钒酸钠联用的效果那么好。钒酸钠要激活一下效果会好一些。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 12:34

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原帖由 BOSS2011 于 2013-5-4 12:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请问版主，我做的iNOS,eNOS的WB，可是出来的条带都在55kDa左右，而不是预定的135kDa,一抗用的是abcam的，不知道是什么原因，还望不吝赐教。

有可能是非特异性条带，建议您与厂商联系进行troubleshooting，也可以自己找一个阳性对照试一下。

作者: zzzz 时间: 2013-5-4 12:35

请教版主：p-akt和p-erk的wb问题，我用碧云天的Western及IP细胞裂解液（主要成分为20mM Tris(pH7.5)，150mM NaCl，1% Triton X-100，以及sodium pyrophosphate，β-glycerophosphate，EDTA，Na3VO4，leupeptin等多种抑制剂），另加PMSF，裂解细胞，之后检测p-akt和p-erk，结果什么条带也没有，背景黑黑的。请指点迷津！谢谢！

作者: jrwyyplt 时间: 2013-5-4 12:35

谢谢版主，我已经与经销商联系了。另外，再问个问题，eNOS的条带在暗室中肉眼可见，曝出来也很亮，背景很干净，没有看到其它条带，这种情况非特异性条带存在的可能性大吗？还有，要怎样才能证明这条带是否为非特异性条带呢？

作者: sunnyB 时间: 2013-5-4 12:35

有战友问：磷酸化后分子量会变吗？我做出来的磷酸化的位置和总蛋白的位置不在一起，谢

回答：磷酸化后分子量会增加一些，即增加几个磷酸根的分子量而已，相对几十KD的蛋白而言影响不大，所以条带应该在相同位置。如果您做出来的磷酸化的位置和总蛋白的位置不在一起时，其中的一个原因可能是您看到的是抗体的非特异性条带，而其特异性条带没有出现。

个人认为这个主要取决于蛋白的磷酸化程度，尽管大多数蛋白磷酸化后分子量并无明显变化，但也有一些蛋白由于高度磷酸化，即使分子量相对较小，磷酸化蛋白和总蛋白相比也有很大的变化，一个明显的例子就是calcineurin, 这个已经有很多报道了。另外一个有意思的事情就是：尽管磷酸化蛋白和总蛋白相比，尽管一般磷酸化蛋白的表观分子量更大，但是也个别相反的例子。“磷酸化的位置和总蛋白的位置不在一起”这个很正常， Li-Cor的Odyssey imaging system 的使用说明书中举的一个例子就是可以同时检测p-ERK and total ERK，两者的位置明显不同，尽管差别不像p-calcineurin and total calcineurin那么大。希望上述信息对新手甚至老手也有帮助，祝大家好运！

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 12:37

请教版主：p-akt和p-erk的wb问题，我用碧云天的Western及IP细胞裂解液（主要成分为20mM Tris(pH7.5)，150mM NaCl，1% Triton X-100，以及sodium pyrophosphate，β-glycerophosphate，EDTA，Na3VO4，leupeptin等多种抑制剂），另加PMSF，裂解细胞，之后检测p-akt和p-erk，结果什么条带也没有，背景黑黑的。请指点迷津！谢谢！

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对照蛋白如actin，GADPH等的结果能出来吗？或者，您做其它蛋白的WB有没有问题？这是为了排除你的WB技术及试剂原因造成的无结果。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 12:37

谢谢版主，我已经与经销商联系了。另外，再问个问题，eNOS的条带在暗室中肉眼可见，曝出来也很亮，背景很干净，没有看到其它条带，这种情况非特异性条带存在的可能性大吗？还有，要怎样才能证明这条带是否为非特异性条带呢？

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您说的这种情况下，非特异性条带存在的可能性也很大。认为非特异性条带主要有3点：1，离目的条带的分子量很远；2，任何处理下其条带差异不大。3，与阳性对照（已经有人做出来的目的蛋白）明显有差别。当然，一般情况下，有时只要第1点就可判断。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 12:38

有战友问：磷酸化后分子量会变吗？我做出来的磷酸化的位置和总蛋白的位置不在一起，谢

回答：磷酸化后分子量会增加一些，即增加几个磷酸根的分子量而已，相对几十KD的蛋白而言影响不大，所以条带应该在相同位置。如果您做出来的磷酸化的位置和总蛋白的位置不在一起时，其中的一个原因可能是您看到的是抗体的非特异性条带，而其特异性条带没有出现。

个人认为这个主要取决于蛋白的磷酸化程度，尽管大多数蛋白磷酸化后分子量并无明显变化，但也有一些蛋白由于高度磷酸化，即使分子量相对较小，磷酸化蛋白和总蛋白相比也有很大的变化，一个明显的例子就是calcineurin, 这个已经有很多报道了。另外一个有意思的事情就是：尽管磷酸化蛋白和总蛋白相比，尽管一般磷酸化蛋白的表观分子量更大，但是也个别相反的例子。“磷酸化的位置和总蛋白的位置不在一起”这个很正常， Li-Cor的Odyssey imaging system 的使用说明书中举的一个例子就是可以同时检测p-ERK and total ERK，两者的位置明显不同，尽管差别不像p-calcineurin and total calcineurin那么大。希望上述信息对新手甚至老手也有帮助，祝大家好运！

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根据我的理解，p-ERK and total ERK应该在相同的位置，Odyssey imaging system之所以能同时检测，那是因为采用了不同的荧光的缘故。

作者: BOSS2011 时间: 2013-5-4 12:38

对照蛋白如actin，GADPH等的结果能出来吗？或者，您做其它蛋白的WB有没有问题？这是为了排除你的WB技术及试剂原因造成的无结果。

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别的都没问题，就磷酸化的WB出不来。提蛋白时感觉挺小心的，不知道那步出问题了，有时候会曝出一些细细的杂带，可目的带就是出不来，我都快疯了！

作者: ladyhuahua 时间: 2013-5-4 12:39

有没有人能提供一个国内外厂商在磷酸化蛋白方面的比较排名

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 12:39

谢谢版主及时回复！别的都没问题，就磷酸化的WB出不来。提蛋白时感觉挺小心的，不知道那步出问题了，有时候会曝出一些细细的杂带，可目的带就是出不来，我都快疯了！

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最大的可能有2个：1，一抗效果不好；2，提取蛋白的过程有点问题。
所以，1，向厂商要阳性对照，或者向实验室同仁要一些他们以前做出来过的样品来验证一下。
2，尽量保持低温。

作者: cwcwcww 时间: 2013-5-4 12:40

本人做了磷酸化蛋白的WB有几个月了，一开始得出的结果却发现是非特异性条带，差点崩溃掉。
昨天再做了一次WB。具体过程如下，请大侠们指教：
提取样品：
预冷的PBS清洗3次，细胞刮收集细胞，4度离心5分钟后，加入裂解液（含有ROCHE的蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂，PMSF),冰上裂解30分钟，4度离心15分钟收集上清液。
蛋白变性：
提取蛋白后立即加入RIPA及Loading buffer,100度变性5分钟，短暂离心，﹣80度保存
电泳：
Sep GEL 7%过夜
stack gel 80伏 18分钟
sep gel 100伏 80分钟
转膜
PVDF膜活化5分钟
转膜 100伏 3h
TBS 15min 3次
封闭液
5%脱脂牛奶（完全按照一抗说明书）1h
blotting buffer(按照一抗说明书配置) 15min 3次
一抗（按说明书配置） 4度过夜
blotting buffer 15min 3次
二抗（中杉金桥）1h
blotting buffer 15min 3次
ECL 发光液+H2O2 2 min
曝光

结果发现，连beta-actin 都没有条带，甚至在暗房中也没看见发光

请各位大侠帮忙分析一下吧
再不出结果，老板就会。。。

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我们提取样品的过程是这样的：
收集细胞（贴壁）于预冷的PBS洗三遍，然后置于冰上，加入裂解液裂解一个小时左右，大皿200UL，小皿100UL。（具体裂解液加多少根据你细胞密度来调节，否则测出来的蛋白浓度或低或高）。裂解的过程中注意在冰上均匀晃动，使裂解液能裂解到每个细胞。然后用细胞刮，将细胞收集起来，4°离心机离心15分钟，取上层上清液，测蛋白浓度即可。

作者: cwcwcww 时间: 2013-5-4 12:41

我不知道你跑的分子量是多少。我们实验室通常选用浓缩胶和分离胶两种。
电泳的时候选择恒流，两块胶 0.05A；一块胶0.03A
转膜选择恒压，100V，分子量30至100一个半小时就能转的很干净啦。通常我们选用12%的胶。
5%脱脂牛奶 1h
选择合适的浓度加入一抗过夜，二抗2到3个小时，ECL发光即可。

作者: sunnyB 时间: 2013-5-4 12:41

请教版主：p-akt和p-erk的wb问题，我用碧云天的Western及IP细胞裂解液（主要成分为20mM Tris(pH7.5)，150mM NaCl，1% Triton X-100，以及sodium pyrophosphate，β-glycerophosphate，EDTA，Na3VO4，leupeptin等多种抑制剂），另加PMSF，裂解细胞，之后检测p-akt和p-erk，结果什么条带也没有，背景黑黑的。请指点迷津！谢谢！

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我也是啊，出来的就是杂带，目的条带一点也看不到，完全搞不懂是什么问题！！！

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 12:42

有战友问：加入millipore substrate后，曝片，在目的条带位置膜上出现发黄色的条带，是什么原因，信号过强吗？出现这样的情况，再去曝X片，对实际结果有影响吗？

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回答：

这是信号过强造成的。如果出现这样的情况，要尽快压片，或者下次实验时，蛋白上样量适当减少一些。

作者: mickeylin 时间: 2013-5-4 12:42

请问一下，
p-erk在做灰度分析进行统计时，是要把p-erk1和p-erk2分别和t-erk1和t-erk2相比，得到相对磷酸化的值进行统计吗？
在总蛋白有变化的情况，还能计算相对磷酸化值进行分析吗？还是要把磷酸化的和总的都分别统计？
谢谢。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 12:43

p-ERK1/2在灰度统计时就不要分开了。如果总蛋白有变化，我建议用actin或GAPDH等蛋白作对照来统计，即：p-ERK / actin, t-ERK / actin

作者: caihong 时间: 2013-5-4 12:43

请问一下：ECL后tubline条带总有弥散显像，电泳时液体PH值都准确，不知道为什么？
还有就是Marker跑出来时斜的？我上边上的泳道了，可以前不会跑斜谢谢

作者: mickeylin 时间: 2013-5-4 12:43

p-ERK1/2在灰度统计时就不要分开了。如果总蛋白有变化，我建议用actin或GAPDH等蛋白作对照来统计，即：p-ERK / actin, t-ERK / actin

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您的意思是说要把p-erk1和p-erk2的灰度值相加，比较总的磷酸化水平的变化吗？
若总蛋白不变，计算p-erk1+p-erk2/t-erk1+t-erk2相对磷酸化水平；
若总蛋白有变化，计算p-erk1+p-erk2/actin,t-erk1+t-erk2/actin,即把总蛋白和磷酸化蛋白分开来比较。
是我理解的这个意思么？
谢谢。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 12:44

QUOTE:

原帖由 mickeylin 于 2013-5-4 12:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
p-ERK1/2在灰度统计时就不要分开了。如果总蛋白有变化，我建议用actin或GAPDH等蛋白作对照来统计，即：p-ERK / actin, t-ERK / actin

================================================================================ ...

没错。若您要比较单独的p-ERK1或p-ERK2的磷酸化，最好买它们的专一抗体做实验来比较。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 12:45

有两位同仁询问：我的实验要检测NF-κB通路，准备订购IκB和Phospho-IκB抗体，发现Cell Signaling Technology提供了IκBα ，IκBβ ，IκBε和IκB-ζ和相应的磷酸化抗体，我应该订购那种亚型的抗体呢？另外，要不要再定购p65和Phospho-p65抗体？

回答：一般检测IκBα蛋白。另外，若要研究NF-kB pathway，最好研究一下NF-kB与目的基因的启动子区的结合。

作者: duoduo 时间: 2013-5-4 12:45

我提取的蛋白浓度总是很低，不知道是怎么回事。
我用小鼠骨髓诱导的原代的巨噬细胞，细胞帖壁很紧，6孔板中每孔应该至少有一百万个细胞，我原来将裂解液直接加到6孔板的孔中，然后枪头抽打后没有用细胞刮，收集裂解的细胞，离心，测难度不到1mg/ml. 我用胰酶将细胞消化下来后离心，加入裂解液，但是浓度还是不到1mg/ml。
不知道这儿有没有做Jak-STAT 信号途径的，我一直没有做出Jak2-p 抗体是用cell signalling 的，不知道是不是我的总蛋白浓度太低了。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 12:46

QUOTE:

原帖由 duoduo 于 2013-5-4 12:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我提取的蛋白浓度总是很低，不知道是怎么回事。
我用小鼠骨髓诱导的原代的巨噬细胞，细胞帖壁很紧，6孔板中每孔应该至少有一百万个细胞，我原来将裂解液直接加到6孔板的孔中，然后枪头抽打后没有用细胞刮，收集裂解的细胞，离心，测 ...

您的蛋白浓度过低了！您加多少lysis buffer?

作者: ququer787 时间: 2013-5-4 12:46

老师您好，我之前一直按您的配方在做磷酸化的eNOS和VASP，蛋白来源是大鼠血小板。最初开始做的时候非常顺利，后期却出现了蛋白串珠状的异常情况，从目的蛋白到actin都有，而且条带越来越破碎，如下图示。请问一下原因可能是什么？
我的流程：
给药处理后离心取血小板沉淀，加入冰裂解液（您的配方，区别是临用前才加入氟化钠，钒酸钠和PMSF）100ul，超声破碎5秒，3次。4度静置30min。4度12000转离心15min，取上清测总蛋白含量。
市售的4×loading buffer，83度10min变性（实验室加热的仪器仅能到83度）。
80V过浓缩胶后加电压至120V；350mA转膜60或90min（根据分子量）；含5%BSA的TBST封闭；
抗体来自CST，一抗1：1000，4度过夜；二抗1：2000室温1h。ECL显色。

这是最早做出来的条带

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作者: ququer787 时间: 2013-5-4 12:47

相关疾病：
头痛
这是后来发生的情况

要说明的是，我最初以为是抗体重复使用的缘故，于是新配了抗体；后来又尝试了5%奶粉取代5%BSA；再后来是重配所有的电泳液、转膜液，氟化钠和钒酸钠；最近一次是重配裂解液。但是这种情况还是有，非常头疼。

图片附件: 34036764.jpg (2013-5-4 12:47, 1.59 KB) / 该附件被下载次数 25
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16038

作者: ququer787 时间: 2013-5-4 12:47

现在无论是磷酸化的eNOS还是VASP或者ERK，甚至相应的总蛋白和actin都是这样了，help!

图片附件: 34235812.jpg (2013-5-4 12:47, 2.36 KB) / 该附件被下载次数 19
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16039

作者: sunnyB 时间: 2013-5-4 12:48

感谢LZ的热心和耐心，使处在实验迷茫中的我有了找到亲人的感觉。
想请教一下，我用Santa cruze的抗体做磷酸化蛋白的WB,Santa网站关于WB的技术支持中提到封闭液和抗体稀释液中要加磷酸酶抑制剂混合物，而抗体本身的说明书推荐的封闭液是TBST稀释的5%milk,但建议加50 mM NaF ，您认为有必要再加这些抑制剂吗？看您的相关回帖，您好像只强调了在裂解液中加足量的抑制剂，其他步骤则没有必要。期待您的回复，谢谢！

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 12:48

现在无论是磷酸化的eNOS还是VASP或者ERK，甚至相应的总蛋白和actin都是这样了，help!

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您好！您这种状况很可能是您往胶上load样品时，一个well不止load一次，而是分好几次load造成的。另外，上样时速度过快也会造成一定的影响。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 12:48

感谢LZ的热心和耐心，使处在实验迷茫中的我有了找到亲人的感觉。
想请教一下，我用Santa cruze的抗体做磷酸化蛋白的WB,Santa网站关于WB的技术支持中提到封闭液和抗体稀释液中要加磷酸酶抑制剂混合物，而抗体本身的说明书推荐的封闭液是TBST稀释的5%milk,但建议加50 mM NaF ，您认为有必要再加这些抑制剂吗？看您的相关回帖，您好像只强调了在裂解液中加足量的抑制剂，其他步骤则没有必要。期待您的回复，谢谢！

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在裂解液中加足量的抑制剂即可，其他步骤则没有必要。

作者: sunnyB 时间: 2013-5-4 12:49

谢谢楼主解答，我的确有加样反复吹打现象，今天我试了试RIPA裂解液，明天看看结果如何。不管怎样，谢谢您

作者: yhz1973 时间: 2013-5-4 12:49

楼主以及各位同仁：
大家好！我是个新手！也准备测mTOR中的一些磷酸化蛋白，而且我做的是山羊的，抗山羊的一抗我查了一下很少！几乎没有，我想向各位高手请教下，对于mTOR下游蛋白的磷酸化检测，我用一抗种属来源是老鼠的或人的是否可以？
第二个问题就是在裂解细胞的时候，只用超声破碎，不用裂解液行不行？谢谢大家！

作者: yhz1973 时间: 2013-5-4 12:50

各位高手：
我一直有一个不明白的好像是白痴的问题，请教各位了：为什么测定蛋白质的磷酸化，必须是一个相对量，即必须要用磷酸化的蛋白比上总蛋白才能代表一个蛋白的磷酸化程度，而不是用磷酸化的蛋白量表示？谢谢各位，期待答复@

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 12:50

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原帖由 yhz1973 于 2013-5-4 12:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼主以及各位同仁：
大家好！我是个新手！也准备测mTOR中的一些磷酸化蛋白，而且我做的是山羊的，抗山羊的一抗我查了一下很少！几乎没有，我想向各位高手请教下，对于mTOR下游蛋白的磷酸化检测，我用一抗种属来源是老鼠的或人的是否可 ...

回答：
1，一抗种属来源可以是老鼠的或人的，但必须适用于山羊。（有些厂商会提供适用的信息，如适用于h,g,r,m）如果没有此方面的信息，那就只能自己试了。
2，不行，裂解不完全的。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 12:51

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原帖由 yhz1973 于 2013-5-4 12:50 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

各位高手：
我一直有一个不明白的好像是白痴的问题，请教各位了：为什么测定蛋白质的磷酸化，必须是一个相对量，即必须要用磷酸化的蛋白比上总蛋白才能代表一个蛋白的磷酸化程度，而不是用磷酸化的蛋白量表示？谢谢各位，期待答复@ ...

总蛋白是作为对照用的，以证明你在WB时您所加的蛋白量是一样的，也就是，排除“蛋白磷酸化的改变是因为WB时所加蛋白量不同”这一可能性。

作者: sunnyB 时间: 2013-5-4 12:51

我的WB结果今天出来了，果然是裂解液的缘故，可能是某种成分我配错了，或者冰冻保存出了问题

作者: 831226 时间: 2013-5-4 12:56

那我再请教一下，如果是由于处理因素导致总蛋白的量发生变化而磷酸化的量并没有改变，结果也是导致这个比值出现变化，也就是说磷酸化能力并没有改变，是否有这种可能性呢？这能说是这个过程的下游蛋白被激活了吗？不知道我说明白了没有？

作者: 831226 时间: 2013-5-4 12:57

回答：
1，一抗种属来源可以是老鼠的或人的，但必须适用于山羊。（有些厂商会提供适用的信息，如适用于h,g,r,m）如果没有此方面的信息，那就只能自己试了。
2，不行，裂解不完全的。

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但是大部分的抗体都没有goat这一项的，我如果按照物种的同源性来选择抗体，山羊跟人近还是跟老鼠近啊？这个怎么确定二者之间的同源性？谢谢

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 12:57

那我再请教一下，如果是由于处理因素导致总蛋白的量发生变化而磷酸化的量并没有改变，结果也是导致这个比值出现变化，也就是说磷酸化能力并没有改变，是否有这种可能性呢？这能说是这个过程的下游蛋白被激活了吗？不知道我说明白了没有？

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如果总蛋白发生变化，则统计时要用（磷酸化的目的蛋白/actin或GAPDH）和（总目的蛋白/actin或GAPDH）。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 12:58

谢谢，但是大部分的抗体都没有goat这一项的，我如果按照物种的同源性来选择抗体，山羊跟人近还是跟老鼠近啊？这个怎么确定二者之间的同源性？谢谢

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这不好说，有些蛋白跟鼠近，有些蛋白跟人近。你可以查这些目的蛋白的同源性。不过，理论归理论，最终你都要试过了才知道抗体可用不可用。

作者: gemei0115 时间: 2013-5-4 12:58

请教楼主，我做K562细胞的AKt，每孔上了100微克的蛋白，结果AKt总蛋白条带不错，但磷酸化没有出结果，只能隐约看到有条带。用的是CST的多抗，一抗冰上孵育过夜，抗体1：1000和1：500都试过。是否上样量不够，你们一般上多少样品？我想下次收细胞的时候用1×loading煮了直接上样，增加上样量，这样是否可行？如果上样太大的话，actin太粗会不会区分不出量来，用GAPDH有没更好？

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 12:59

请教楼主，我做K562细胞的AKt，每孔上了100微克的蛋白，结果AKt总蛋白条带不错，但磷酸化没有出结果，只能隐约看到有条带。用的是CST的多抗，一抗冰上孵育过夜，抗体1：1000和1：500都试过。是否上样量不够，你们一般上多少样品？我想下次收细胞的时候用1×loading煮了直接上样，增加上样量，这样是否可行？如果上样太大的话，actin太粗会不会区分不出量来，用GAPDH有没更好？

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不是上样量的问题，上样量50-100ug足够了，我平时就用50ug即可，最大的可能是一抗的问题，其次可能是样品收集的问题。actin和GAPDH差不多，你如上样量太大，actin孵育最好时间短一些，否则真的会条带太粗。

作者: H2O 时间: 2013-5-4 12:59

版主：
我最近在做TGF-beta1刺激细胞检测p-smad2（磷酸化位点465、467）的变化，用的一抗是SAB公司的Smad2和p-smad2（识别磷酸化位点467），二抗是HRP偶联的抗兔。
首先我待细胞长满后，无血清静置过夜，加入TGF-beta1刺激30min，通过RIPA裂解在冰上收集。4度5min离心收集上清。测定各刺激组总蛋白浓度。电泳,转膜。5%BSA(TBS、0.1%Tween) ,一抗（TBST）4度过夜，洗膜3次，每次5min，加入二抗室温孵育2h。ECL检测。
但是做出来的结果是内参有，目的条带没有。连本底的非磷酸化的Smad2都没有。很是让我无奈！会不会是我的
RIPA作用时间短了？可内参出来了？

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 12:59

5min的作用时间可能有点短。内参因为量大，结果自然容易出来。而磷酸化和总的Smad2因为量少，自然比内参不容易做。另外，你最好能找到阳性对照排除一下是否因为一抗不行的原因。

作者: zhenxin 时间: 2013-5-4 13:00

最近在做磷酸化蛋白的WB，整体还算顺利，但发现了一个很奇怪的问题，每次做的beta-actin总是不均一，条带宽度相似，但是灰度值有差异，图在附件里，比较大，所以我只能用压缩文件了，不好意思~两个图片，一个是beta-actin的，另一个是对应的t-stat3，请楼主指点一下是我上样量不同的问题，还是转膜过程出现问题~
大概阐述一下我的试验过程，测蛋白浓度，上样30ug,电泳150V，70min，因为我需要在同一张膜上做4个蛋白，即ACC,STAT3,AMPK，还有beta-actin,它们的分子量分别是250，78，68，40，为了保证分子量较大的ACC可以跑出一段距离，所以跑胶时间比较长，70min。转膜，100V，75min，然后将膜按照marker剪成4段，分别做以上四种蛋白，由于beta-actin出现了这个结果，导致我现在也不知道该怎么分析，谢谢楼主~

作者: is2011 时间: 2013-5-4 13:01

询问一下楼主
本人初步想做磷酸化蛋白质组学查阅文献做磷酸化蛋白质组学的人比较少我最近查到QIAGEN PhosphoProtein Purification Kit可以用于蛋白质组学2DE前的磷酸化蛋白质富集不知道楼主有没有搞过或见过磷酸化蛋白质组学我因为富集试剂盒很贵现在还不怎么敢下手请楼主指点
1. 磷酸化蛋白质富集试剂盒中，楼主有没有推荐的
2. 试剂盒里面没有磷酸酶抑制剂跑2DE前时候有没有必要搞加磷酸酶抑制剂啊（paper里面似乎都不加）

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:01

你的actin条带出现深浅不一的情况是因为ECL量不足造成的，一是可能你的actin一抗浓度太浓或孵育时间太长，二可能是你加ECL后过很长时间才压片。结果造成ECL很快被用完，而导致压片时条带深浅不一。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:01

询问一下楼主
本人初步想做磷酸化蛋白质组学查阅文献做磷酸化蛋白质组学的人比较少我最近查到QIAGEN PhosphoProtein Purification Kit可以用于蛋白质组学2DE前的磷酸化蛋白质富集不知道楼主有没有搞过或见过磷酸化蛋白质组学我因为富集试剂盒很贵现在还不怎么敢下手请楼主指点
1. 磷酸化蛋白质富集试剂盒中，楼主有没有推荐的
2. 试剂盒里面没有磷酸酶抑制剂跑2DE前时候有没有必要搞加磷酸酶抑制剂啊（paper里面似乎都不加）

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想做磷酸化蛋白质组学，最好用LC/MS做，用2DE做有点浪费时间，因为2DE所需要的蛋白量要比较多，相对较微量的大部分磷酸化蛋白测不出来。

作者: gemei0115 时间: 2013-5-4 13:02

你的actin条带出现深浅不一的情况是因为ECL量不足造成的，一是可能你的actin一抗浓度太浓或孵育时间太长，二可能是你加ECL后过很长时间才压片。结果造成ECL很快被用完，而导致压片时条带深浅不一。

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谢谢您的回复~
您觉得actin条带深浅不一的情况是ECL量不足造成的，而不是上样量不同或转膜有问题造成的。我现在把我做实验的条件跟您说一下：1 我用的是sigma的actin一抗，不用加二抗，一抗可直接和ECL结合，由于我每次把膜剪成四段来做，所以actin的那张膜都是5%NFDM四度封闭过夜，第二天其他几张膜加二抗的时候，actin那张膜加一抗，浓度为1：50000，室温45分钟，然后1XTBST5分钟3次。2 加ECL时，我是把膜放到装盖玻片的小盒里，由于膜是剪开的，面积不大，每张膜上我加3mlECL，2-3分钟，由于每次把一张膜剪成4段，我都是先做actin的那张，因为我觉得actin可能比较好做吧，呵呵，做完actin再去做其他几个，这样也就是大概actin做完15分钟左右才去压片，有时甚至更长时间。
结合我的试验，我觉得您说得很有道理，不知道您能不能就我的具体试验操作看看我有没有什么不正确的地方，另外，我放了两张曝光时间稍微长一些的actin的图，有一个是之前放的actin曝光时间长一些，另外一个我觉得很奇怪是因为两边比较深，中间比较浅，谢谢~

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:02

我可以断定是ECL加入后时间太长的缘故。加入ECL 1.5分钟后就可以压片了。一些量比较少的蛋白ECL作用时间长一点没有关系，但对于actin或GAPDH这样大量的蛋白，ECL处理后尽快压片。至于条带“两边比较深，中间比较浅”可能是你两边的ECL多一些，而中间的ECL buffer干得快一些造成的，这不奇怪。

作者: gemei0115 时间: 2013-5-4 13:03

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原帖由 箭头儿 于 2013-5-4 13:02 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我可以断定是ECL加入后时间太长的缘故。加入ECL 1.5分钟后就可以压片了。一些量比较少的蛋白ECL作用时间长一点没有关系，但对于actin或GAPDH这样大量的蛋白，ECL处理后尽快压片。至于条带“两边比较深，中间比较浅”可能 ...

您这么说我才觉得恍然大悟，呵呵，之前总觉得是转膜的问题，我会重新做一下看看结果如何~
按照您的说法，actin加入ECL 1.5分钟后，用纸将多余的ECL吸除，（我以前好像只是大概用纸吸一下，也没注意是不是两边残余的比较多，现在觉得可能是两边残余的多一些，因为每次的好像两边的条带都会深一些，粗一些），然后中间最好不要耽误时间，立即拿去压片，不知道我理解的是否正确~

另外，我的每张膜都剪成4段分别做ACC，STAT3，AMPK，actin，分子量分别是250，78，68，42，我将一张膜上的这四种蛋白的图片放附件了，按预期结果，总蛋白的量应该是没有变化的，但是我的STAT3和AMPK好像出现了一些条带比较粗的情况，是不是也有可能是最后一步ECL作用时间过长，或膜的某一部分ECL较多的缘故，谢谢~

作者: gemei0115 时间: 2013-5-4 13:03

我可以断定是ECL加入后时间太长的缘故。加入ECL 1.5分钟后就可以压片了。一些量比较少的蛋白ECL作用时间长一点没有关系，但对于actin或GAPDH这样大量的蛋白，ECL处理后尽快压片。至于条带“两边比较深，中间比较浅”可能是你两边的ECL多一些，而中间的ECL buffer干得快一些造成的，这不奇怪。

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我忽然想起来我最后一步用的是Thermo 34080 Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate，不知道和你所说的ECL是否一样，不过我觉得应该没什么很大的区别~

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:04

您这么说我才觉得恍然大悟，呵呵，之前总觉得是转膜的问题，我会重新做一下看看结果如何~
按照您的说法，actin加入ECL 1.5分钟后，用纸将多余的ECL吸除，（我以前好像只是大概用纸吸一下，也没注意是不是两边残余的比较多，现在觉得可能是两边残余的多一些，因为每次的好像两边的条带都会深一些，粗一些），然后中间最好不要耽误时间，立即拿去压片，不知道我理解的是否正确~

另外，我的每张膜都剪成4段分别做ACC，STAT3，AMPK，actin，分子量分别是250，78，68，42，我将一张膜上的这四种蛋白的图片放附件了，按预期结果，总蛋白的量应该是没有变化的，但是我的STAT3和AMPK好像出现了一些条带比较粗的情况，是不是也有可能是最后一步ECL作用时间过长，或膜的某一部分ECL较多的缘故，谢谢~

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请注意，不要将ECL吸得太干。也就是说，出现问题的，不是两边，而是中间部分（ECL量不足）。
但是你的这些蛋白出现一些条带比较粗的现象，可能与ECL量不足没有关系，可能是以下原因造成的：1，处理不稳定；2，蛋白定量不准；3，转膜时的cassette中间是不是鼓起来而造成接触不好了？
可能还有其它原因，总之，从您这4张图片看，与ECL可能没关系。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:04

我忽然想起来我最后一步用的是Thermo 34080 Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate，不知道和你所说的ECL是否一样，不过我觉得应该没什么很大的区别~

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类似

作者: 9900 时间: 2013-5-4 13:05

请教楼主
我做的p-p38 和p38, 总蛋白没有问题，可是药物处理的p-p38的band 非常浅，还有部分杂带。但是阳性对照的p-p38条带却很清晰(最左边的band)。原来做过相同条件的药物处理，应该不是药物处理无效的问题。请教！

图片附件: 21288937.jpg (2013-5-4 13:05, 4.07 KB) / 该附件被下载次数 15
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16040

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:05

QUOTE:

原帖由 9900 于 2013-5-4 13:05 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请教楼主
我做的p-p38 和p38, 总蛋白没有问题，可是药物处理的p-p38的band 非常浅，还有部分杂带。但是阳性对照的p-p38条带却很清晰(最左边的band)。原来做过相同条件的药物处理，应该不是药物处理无效的问题。请教！
...

有杂带很正常。条带浅的原因可能有2：1，样品收集和保存过程中出现了问题。2，p-p38抗体的效价下降了，因为你的阳性对照的p-p38条带虽然清晰，但不粗，而往往阳性对照是过量的，所以我才判断p-p38抗体的有效浓度已不足。

作者: 9900 时间: 2013-5-4 13:06

QUOTE:

原帖由 箭头儿 于 2013-5-4 13:05 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

有杂带很正常。条带浅的原因可能有2：1，样品收集和保存过程中出现了问题。2，p-p38抗体的效价下降了，因为你的阳性对照的p-p38条带虽然清晰，但不粗，而往往阳性对照是过量的，所以我才判断p-p38抗体的有效浓度已不足。 ...

谢谢啦，我上周末又作了一次确实是一抗的问题。
不过还有一个问题，为什么我每次marker的band总是跑丢呢！我确定小分子量的跑出来了，大分子量的没有。刚才看了一下以前的帖子，和胶的浓度有关么？我目前用10% running gel, 5% stacking gel.

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:06

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原帖由 9900 于 2013-5-4 13:06 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢啦，我上周末又作了一次确实是一抗的问题。
不过还有一个问题，为什么我每次marker的band总是跑丢呢！我确定小分子量的跑出来了，大分子量的没有。刚才看了一下以前的帖子，和胶的浓度有关么？我目前用10% running gel, 5% ...

"跑丢"是指丢的哪一条带？胶的浓度会决定哪一些条带会比较明显，如10%胶，则7kd或11kd的那条带就出不来。如为15%胶，是7kd或11kd的那条带会很明显。

作者: owanaka 时间: 2013-5-4 13:07

请问楼主我要做磷酸化蛋白的WB，我买thermo scientific halt protease inhibitor cocktail可以吗？因为我死穴临床的，很多不懂

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:07

QUOTE:

原帖由 owanaka 于 2013-5-4 13:07 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请问楼主我要做磷酸化蛋白的WB，我买thermo scientific halt protease inhibitor cocktail可以吗？因为我死穴临床的，很多不懂

可以，但这只是protease inhibitor cocktail，还要有phosphatase inhibitors.

作者: owanaka 时间: 2013-5-4 13:08

您如果是初次做，建议如下：
1，操作尽量低温。
2，细胞裂解液中要加磷酸酶抑制剂。
3，最重要的一点，我在前面已提过，一抗很重要，有时一抗不合适就不容易出结果。而一抗的选择，我一般看文献，看文献中的条带清楚不清楚，与我是不是同一个细胞株，然后选相同的厂商的抗体。
4，一抗尽量选择多克隆抗体。如果厂商能提供阳性对照则更好。

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为啥她们都跟我说单克隆抗体的特异性更好呢？

作者: owanaka 时间: 2013-5-4 13:08

可以，但这只是protease inhibitor cocktail，还要有phosphatase inhibitors.

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那有没有包括这2种酶的试剂啊？

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:08

QUOTE:

原帖由 owanaka 于 2013-5-4 13:08 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
您如果是初次做，建议如下：
1，操作尽量低温。
2，细胞裂解液中要加磷酸酶抑制剂。
3，最重要的一点，我在前面已提过，一抗很重要，有时一抗不合适就不容易出结果。而一抗的选择，我一般看文献，看文献中的条带清楚不清楚，与我是不是同一 ...

据我个人经验而言，一般单克隆抗体的特异性更好，而多克隆抗体特异性会差一些，但相当容易出结果。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:09

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原帖由 owanaka 于 2013-5-4 13:08 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
可以，但这只是protease inhibitor cocktail，还要有phosphatase inhibitors.

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那有没有包括这2种酶的试剂啊？

好像有这样的cocktail。我都是自己配的，所以没用过商品化的cocktail.

作者: 8princess8 时间: 2013-5-4 13:09

很好的帖子学习了

请问我们这几次测p-erk，和p-jnk，总的ERK和JNK都用ecl可以显出来条带，而磷酸化的都无法用ecl显出条带，不过每次压片后都再用dab显色发现磷酸化的都可以显出条带大小合适。
请教了。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:10

QUOTE:

原帖由 8princess8 于 2013-5-4 13:09 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
很好的帖子学习了

请问我们这几次测p-erk，和p-jnk，总的ERK和JNK都用ecl可以显出来条带，而磷酸化的都无法用ecl显出条带，不过每次压片后都再用dab显色发现磷酸化的都可以显出条带大小合适。
请教了。 ...

可能是你p-ERK和p-JNK抗体的浓度过低了。提高蛋白上样量和抗体浓度可能会有所改善。

作者: 8princess8 时间: 2013-5-4 13:10

请教关于图像灰度的问题
以下是用BIO-Rad的quantity one 扫描的图像，在进行灰度分析时怎样选定条带？我选的有问题吗?应该用矩形选还是自由选择图像画？
还有图像选定后分析时应该选择哪个数据？是平均灰度还是校正后的灰度值？
谢谢啦

作者: 8princess8 时间: 2013-5-4 13:10

这是第二张图谢谢大侠

图片附件: 97491201.jpg (2013-5-4 13:10, 23.97 KB) / 该附件被下载次数 16
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16041

作者: 8princess8 时间: 2013-5-4 13:11

第三问，请问楼主，你在准备样品的时候一般用多大的培养皿？12孔板还是6孔板？并且加药前血清浓度变否？看到很多关于phosphate文献报道至少6h的。

看了你的全部这方面帖子很有收获，我专门整理打印出来让实验室的研究生好好研读，非常感谢！

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:12

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原帖由 8princess8 于 2013-5-4 13:11 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

第三问，请问楼主，你在准备样品的时候一般用多大的培养皿？12孔板还是6孔板？并且加药前血清浓度变否？看到很多关于phosphate文献报道至少6h的。

看了你的全部这方面帖子很有收获，我专门整理打印出来让实验室的研究生好好研 ...

你的结果中条带太挤了，而且轮廓不清晰（会导致条带区域选择时无所适从），你可以压片时时间略短一些可能会好一些。
如果你选用“平均灰度”这一参数，那么你每条条带的区域大小要一样。如果不一样，则要“平均灰度”乘以“面积”。当然，一定要记得“平均灰度”要扣除背景。
我常用6孔板或10cm dish。加药前根据需要决定是否改血清浓度。有些我会维持10%血清，有时1%,有时直接serum starvation，根据研究的需要决定。一般情况下，血清越少，细胞越敏感。

作者: 8princess8 时间: 2013-5-4 13:12

再次提问，我觉得可以第一次将磷酸化erk的条带和内参（GAPDH等）一起压片，第二次再将总erk和内参一起压片，这样的意义在于：

关于磷酸化蛋白western的蛋白一致性有三道关卡：
第一关：上样前蛋白浓度测定必须一致，这是基础。
第二关：必须同一张膜上压片显示磷酸化erk和总erk，这排除了蛋白实际上样和转膜等过程的误差。
第三关：在同一张膜上同时压片目标条带和内参，这排除了ab孵育及显色实际操作过程的误差（即使前两关都有保证，但最后到底在实际实验条件下有多少蛋白显色，组成我们可以使用的data）。

麻烦了这是我的看法我们最近也在这么做，请各位多多指教。

作者: 3648755 时间: 2013-5-4 13:13

请问楼主一般Loading buffer 的配方，DTT等还原剂需不需要加？

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:13

再次提问，我觉得可以第一次将磷酸化erk的条带和内参（GAPDH等）一起压片，第二次再将总erk和内参一起压片，这样的意义在于：

关于磷酸化蛋白western的蛋白一致性有三道关卡：
第一关：上样前蛋白浓度测定必须一致，这是基础。
第二关：必须同一张膜上压片显示磷酸化erk和总erk，这排除了蛋白实际上样和转膜等过程的误差。
第三关：在同一张膜上同时压片目标条带和内参，这排除了ab孵育及显色实际操作过程的误差（即使前两关都有保证，但最后到底在实际实验条件下有多少蛋白显色，组成我们可以使用的data）。

麻烦了这是我的看法我们最近也在这么做，请各位多多指教。

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因为内参GAPDH或actin与ERK条带比较相近，我一般用同一张膜，先压片显示p-ERK；然后strip，再压ERK；然后再strip一次，压内参。同一张膜，我可以测三次。当然，内参GAPDH的条带在36左右，免强与ERK条带能分开，所以也可以将膜剪开后与p-ERK,ERK分开压片。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:13

请问楼主一般Loading buffer 的配方，DTT等还原剂需不需要加？

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我一般加巯基已乙醇（2-Mercaptoethanol），作用与DTT类似。

作者: NBA 时间: 2013-5-4 13:14

可以试试beta-tubulin做内参哈

作者: TAT 时间: 2013-5-4 13:15

我是个新手，才开始做WB实验，有几个问题请教楼主。
1.PVDF膜是需要甲醇预处理的，是不是在转膜前还要置于冷电泳转移缓冲液充分浸泡30min？经甲醇预处理多久比较合适
2.我今天转膜后用丽春红预染，能看见marker条带，但是看不到泳道和其他蛋白条带，是不是转膜没成功，那为什么marker能看见？谢谢楼主赐教哦！！！

作者: gmjghh 时间: 2013-5-4 13:15

版主好！我做心肌蛋白的磷酸化ERK时总是会出现一条杂带，试过其他蛋白还是有杂带。万分苦恼中啊。特向版主求教！我用的一抗是CST的，5%脱脂牛奶/TBST封闭2h（说明书建议用5%BSA），4度敷过夜，TBST洗20min 3次。请楼主赐教，谢谢！

作者: 101010 时间: 2013-5-4 13:15

非常感谢楼主，看过之后有种想马上做western的冲动。
请教楼主，如果只做磷酸化蛋白的表达量和内参，而不做总蛋白的表达量可信度强不强，只做这些大概能在什么级别的杂志上发表？
谢谢！！
另外，我做的目的蛋白分子量依次为25KD,36KD,58KD，请问电泳时胶的浓度采用10%的好还是12%的好呢？还有转膜的时候能否一起转膜？转膜用恒压好还是恒流好？大概用多大？转多长时间比较好呢？
谢谢楼主！！

作者: 00无名指00 时间: 2013-5-4 13:16

麻烦问下，磷酸化的抗体到底需要用BSA来封闭么？怎么有的人说用5%的MILK也一样呢？CST磷酸化抗体的话一般用哪个来封闭效果比较好

作者: greenbee 时间: 2013-5-4 13:16

各位大侠，想问下实验出现白片，要排除二抗和试剂的原因，直接用稀释后的二抗加上你的显色底物，这一步骤是怎样进行的，二抗多少浓度，是直接混匀以后到暗室观察荧光吗？

作者: lixi559 时间: 2013-5-4 13:16

lz你好~请问p-ERK和p-38，去年十一月份的样品（一直冻在-80），现在发了两遍都没有发出来，是不是说磷酸化的蛋白经过这么久时间后就发不出来呢？可是我同时发了别的同时间的磷酸化的蛋白，也发出来了。。。这是怎么回事呢？

作者: 04906 时间: 2013-5-4 13:17

我做两个蛋白：p-camkII,p-akt其中p-camkII能杂出目的条带，虽说有时候有些用刀也不出，但是p-akt一直杂不出来，要不就是白片。再压片时间长了以后就只能看到密密麻麻的杂带，在相应分子量附近有两条挨得得很近的细细条带。第一次是怀疑抗体有问题，换了一支还是这样，后来借了一支别人用过能杂出目的条带的还是这样，不知问题出在哪里？

作者: 子衿青青 时间: 2013-5-4 13:17

楼主，我最近在杂p-eNOS，很不好杂，用的是santa cruz的抗体，非特异性的条带多，想请问一下，这个蛋白用哪个公司的抗体比较好？这个蛋白western blot时的条件都是什么样的？
我用8%的分离胶跑电泳，200mA，200min湿转，0.45μm的PVDF膜，封闭是用0.9%BSA 150min,一抗4°过夜16小时，洗一抗是10min x6次，二抗150min，洗二抗是10min x6次。请问有什么问题，请指教，谢谢！

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:18

我是个新手，才开始做WB实验，有几个问题请教楼主。
1.PVDF膜是需要甲醇预处理的，是不是在转膜前还要置于冷电泳转移缓冲液充分浸泡30min？经甲醇预处理多久比较合适
2.我今天转膜后用丽春红预染，能看见marker条带，但是看不到泳道和其他蛋白条带，是不是转膜没成功，那为什么marker能看见？谢谢楼主赐教哦！！！

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回答：
1，PVDF膜用甲醇预处理1.5分种后再浸泡到转移缓冲液一会儿即可（根本不用30min），然后马上就可以进行转膜了。
2，最大的可能是你的样品出现了问题。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:18

版主好！我做心肌蛋白的磷酸化ERK时总是会出现一条杂带，试过其他蛋白还是有杂带。万分苦恼中啊。特向版主求教！我用的一抗是CST的，5%脱脂牛奶/TBST封闭2h（说明书建议用5%BSA），4度敷过夜，TBST洗20min 3次。请楼主赐教，谢谢！

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CST的p-ERK有时会出现三条带，其中最下面较浅的那条带是杂带，我的实验也会出现这一现象，所以你不用担心，这是正常的，发表论文时为了美观，你可以用PS切去杂带，或者不切也行。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:18

非常感谢楼主，看过之后有种想马上做western的冲动。
请教楼主，如果只做磷酸化蛋白的表达量和内参，而不做总蛋白的表达量可信度强不强，只做这些大概能在什么级别的杂志上发表？
谢谢！！
另外，我做的目的蛋白分子量依次为25KD,36KD,58KD，请问电泳时胶的浓度采用10%的好还是12%的好呢？还有转膜的时候能否一起转膜？转膜用恒压好还是恒流好？大概用多大？转多长时间比较好呢？
谢谢楼主！！

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1，最好做一下总蛋白的表达量。发表文章时，主要是审稿人提不提这个问题，而与什么级别的杂志关系不大，我有看过高IF的杂志没有做总蛋白的。
2，12%的胶浓度较好一些。可一起转膜。转膜条件最好自己摸一下，各实验室都不太一样。我一般调电压为最大，电流为80-120mA,时间为1.5-2hr。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:19

麻烦问下，磷酸化的抗体到底需要用BSA来封闭么？怎么有的人说用5%的MILK也一样呢？CST磷酸化抗体的话一般用哪个来封闭效果比较好

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最好根据厂商的说明，如果没有特别说明，可用5%的MILK。CST的很多磷酸化抗体是用BSA来封闭的，但也有一些抗体用milk封闭的。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:19

各位大侠，想问下实验出现白片，要排除二抗和试剂的原因，直接用稀释后的二抗加上你的显色底物，这一步骤是怎样进行的，二抗多少浓度，是直接混匀以后到暗室观察荧光吗？

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将二抗（1：10000）一小滴点到膜上，晾干，再在膜上加上显色底物后去暗室观察荧光或X光压片。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:19

lz你好~请问p-ERK和p-38，去年十一月份的样品（一直冻在-80），现在发了两遍都没有发出来，是不是说磷酸化的蛋白经过这么久时间后就发不出来呢？可是我同时发了别的同时间的磷酸化的蛋白，也发出来了。。。这是怎么回事呢？

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两个可能：1，样品保存不好，比如反复冻融多次，2，p-ERK和p-38抗体失效了。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:20

我做两个蛋白：p-camkII,p-akt其中p-camkII能杂出目的条带，虽说有时候有些用刀也不出，但是p-akt一直杂不出来，要不就是白片。再压片时间长了以后就只能看到密密麻麻的杂带，在相应分子量附近有两条挨得得很近的细细条带。第一次是怀疑抗体有问题，换了一支还是这样，后来借了一支别人用过能杂出目的条带的还是这样，不知问题出在哪里？

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两个可能：你的样品或者你的处理对p-AKT不起作用，即不能造成AKT磷酸化。2，请提高p-AKT抗体浓度试一试。你和别人的样品都是同一种细胞吗？处理相同吗？你再向别人借一点他已做出结果的样品作为阳性对照，试一试你能不能重复出来。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:20

楼主，我最近在杂p-eNOS，很不好杂，用的是santa cruz的抗体，非特异性的条带多，想请问一下，这个蛋白用哪个公司的抗体比较好？这个蛋白western blot时的条件都是什么样的？
我用8%的分离胶跑电泳，200mA，200min湿转，0.45μm的PVDF膜，封闭是用0.9%BSA 150min,一抗4°过夜16小时，洗一抗是10min x6次，二抗150min，洗二抗是10min x6次。请问有什么问题，请指教，谢谢！

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可能换一个抗体会好一些，试一试Cell Signaling Technology公司的抗体。湿转2.5hr即可，封闭最好用5%non-fat milk 1小时，二抗也室温1hr即可。

作者: 8princess8 时间: 2013-5-4 13:20

楼主
请问我现在得到了terk和perk以及gapdh的数字化的数据但是不知道怎样将其均一化处理我想先以gapdh为基础均一化处理再用terk为模板进行均一化最后得出结论

问题有点弱不好意思啊

谢谢啦

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:21

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原帖由 8princess8 于 2013-5-4 13:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼主
请问我现在得到了terk和perk以及gapdh的数字化的数据但是不知道怎样将其均一化处理我想先以gapdh为基础均一化处理再用terk为模板进行均一化最后得出结论

问题有点弱不好意思啊

谢谢啦 ...

应该是T-ERK / GAPDH, P-ERK / GAPDH,也就是说，全部以GAPDH为参考进行处理。

作者: 8princess8 时间: 2013-5-4 13:21

谢谢楼主，但是我还有问题
1 我看到很多文献都是最后用terk进行normalization，这又是什么意思呢，是T-ERK / GAPDH, P-ERK / GAPDH进行normalization后再以terk进行perk的统计处理吗？
2 想问问你是用什么软件和统计方法处理的呢？我正在学spss。

我们小组基本都是参照你开贴以来的方法进行实验的，效果很好，现在实验结果都很好，现在到统计分析data的时候了，不好意思麻烦了。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:22

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原帖由 8princess8 于 2013-5-4 13:21 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢楼主，但是我还有问题
1 我看到很多文献都是最后用terk进行normalization，这又是什么意思呢，是T-ERK / GAPDH, P-ERK / GAPDH进行normalization后再以terk进行perk的统计处理吗？
2 想问问你是用什么软件和统计方法处 ...

1，如果T-ERK没有变化的话，很多文献就会以p-ERK / T-ERK的比值作统计的，也就是常用的做法,此时GAPDH可做可不做。但如果T-ERK的量变化很明显的话，则用GAPDH进行normalization,也就是（p-ERK / GAPDH,T-ERK / GAPDH）。
2，我也用的是spss进行统计（ANOVA），简单的话，也可以用EXCEL的t test。

作者: 脱水萝卜 时间: 2013-5-4 13:23

麻烦问下，磷酸化的抗体到底需要用BSA来封闭么？怎么有的人说用5%的MILK也一样呢？CST磷酸化抗体的话一般用哪个来封闭效果比较好

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我做的是p-erk，CST的抗体，用的是5%的牛奶封闭，但是会有一条弱的杂带，背景还行。没用过BSA封闭。个人觉得影响不大

作者: 8princess8 时间: 2013-5-4 13:23

1，如果T-ERK没有变化的话，很多文献就会以p-ERK / T-ERK的比值作统计的，也就是常用的做法,此时GAPDH可做可不做。但如果T-ERK的量变化很明显的话，则用GAPDH进行normalization,也就是（p-ERK / GAPDH,T-ERK / GAPDH）。
2，我也用的是spss进行统计（ANOVA），简单的话，也可以用EXCEL的t test。

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你好，楼主我想问在（p-ERK / GAPDH,T-ERK / GAPDH）之后还需要perk/terk来得到最终perk的表达量改变的吧？

呵呵谢谢了

作者: 我佛慈悲 时间: 2013-5-4 13:24

我做磷酸化的目的蛋白的分子量是100KD,转膜时用300mA，2h会不会转过？请大家指教

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:25

你好，楼主我想问在（p-ERK / GAPDH,T-ERK / GAPDH）之后还需要perk/terk来得到最终perk的表达量改变的吧？

呵呵谢谢了

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你直接选perk/terk进行统计即可，GAPDH作为一般的参考，不用再参与统计了，否则太复杂了，反而不好。（前提是terk的量基本无变化）p-ERK反映的是蛋白活化情况，t-ERK才反映的是蛋白表达量的改变。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:25

磷酸化目的蛋白的分子量是100KD，湿转300mA,转两个小时会不会转过，谢谢指教！

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应该不会，甚至可能要2个多小时，你最好用protein marker自己测试一下转膜后的100KD 左右的marker的清晰度。

作者: 8princess8 时间: 2013-5-4 13:25

请问楼主，关于数据处理的方面，我的做法是：
1 将具体的perk/terk的百分比统计出来，例如23%，89%等。
2 将每组data的均值求出来，作图（柱状或折线等）
3 ttest或one way anova,分析是否统计学显著意义

请楼主指正，实在经验不足，麻烦你了啊

作者: 8princess8 时间: 2013-5-4 13:26

ps:如果terk，甚至gapdh压片后得出数据依然不均一，请问怎么处理？怎么进行normalization？

谢谢啦

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:26

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请问楼主，关于数据处理的方面，我的做法是：
1 将具体的perk/terk的百分比统计出来，例如23%，89%等。
2 将每组data的均值求出来，作图（柱状或折线等）
3 ttest或one way anova,分析是否统计学显著意义

请楼主指正，实在经验不足，麻 ...

可以，但要保证terk相差不大，否则误差会很大。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:27

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ps:如果terk，甚至gapdh压片后得出数据依然不均一，请问怎么处理？怎么进行normalization？

谢谢啦

我的做法是重新做实验，蛋白浓度一定要定量准，小心做实验至数据均一。如果不均一一般是你的实验技术不好造成的，所以要改进，否则很容易出现假阳性或假阴性。

作者: 8princess8 时间: 2013-5-4 13:27

那我想问问楼主你是怎么处理data的？和我的方法有什么不一样的？

问题有点多谢谢啦

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:27

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原帖由 8princess8 于 2013-5-4 13:27 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

那我想问问楼主你是怎么处理data的？和我的方法有什么不一样的？

问题有点多谢谢啦

尽量将实验做精确，尤其是参考蛋白，一定要做得均一，重复三次实验也很稳定的情况下，然后统计数据，方法与你的类似。

作者: 8princess8 时间: 2013-5-4 13:28

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原帖由 箭头儿 于 2013-5-4 13:27 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

尽量将实验做精确，尤其是参考蛋白，一定要做得均一，重复三次实验也很稳定的情况下，然后统计数据，方法与你的类似。

哦，明白了不过楼主，我还有一个疑问，就是有时候由于压片时间长短等因素，有时候得到的perk的数值比terk都大，perk/terk的比值大于1，这样的数据可以用吗？

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:28

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哦，明白了不过楼主，我还有一个疑问，就是有时候由于压片时间长短等因素，有时候得到的perk的数值比terk都大，perk/terk的比值大于1，这样的数据可以用吗？ ...

perk/terk的比值大于1或小于1都没有关系，数据都能用的，因为你最后还要以对照组的值为对照（即设为1）进行数据的统计。

作者: 8princess8 时间: 2013-5-4 13:29

哦，但是到底采用ttest还是one way-ANOVA,则应该是根据实验干预设计来区分的吧，比如说测试某一物质对erk的调节作用，就应该用ttest（成组数据平均数比较的假设检验），而若要检测多组处理了，就采用one way-ANOVA，
另外，我看到很多erk检测分析都是采用ttest，请赐教。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:29

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原帖由 8princess8 于 2013-5-4 13:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

哦，但是到底采用ttest还是one way-ANOVA,则应该是根据实验干预设计来区分的吧，比如说测试某一物质对erk的调节作用，就应该用ttest（成组数据平均数比较的假设检验），而若要检测多组处理了，就采用one way-ANOVA，
另外，我看到很多 ...

两组之间进行比较，用ttest；多组数据之间进行比较，用one way-ANOVA.

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:30

其实，你如果不嫌麻烦，将多组数据之间分别分成各两组进行比较，用ttest也可以。

作者: 8princess8 时间: 2013-5-4 13:30

哦，好的，问到这个份上了楼主好耐心谢谢啦，正在最后的处理。

有问题再来问你啊

作者: plaa 时间: 2013-5-4 13:31

楼主请教个问题磷酸化和为磷酸化的蛋白在上样前处理时有差别没谢谢

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:32

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原帖由 plaa 于 2013-5-4 13:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼主请教个问题磷酸化和为磷酸化的蛋白在上样前处理时有差别没谢谢

处理磷酸化蛋白的样品时要加磷酸酶抑制剂，当然，处理这两种蛋白的样品你都可以加磷酸酶抑制剂，这样就没有差别了。

作者: xue258 时间: 2013-5-4 13:32

各位高手好，看了以上的讨论，受益匪浅！我是WB的新手，最近做的结果出现了问题，令我很困惑，请各位高手指点。我的目的蛋白是26KD，但显出的条带是43KD左右，几乎和actin位置一样。我用构建的含该基因的质粒转293细胞后收的蛋白可显出26KD，但同时在43KD也有一条带，稍弱。开始以为是抗体混淆了，但后来重做发现不是抗体混淆。这种蛋白在我做的细胞及组织中尚无人做过，不知其条带增大是否是发生了磷酸化或糖基化等变化而形成的？如何才能证明该蛋白是以磷酸化或糖基化等形式存在的呢？请指点！多谢！

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:33

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原帖由 xue258 于 2013-5-4 13:32 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
各位高手好，看了以上的讨论，受益匪浅！我是WB的新手，最近做的结果出现了问题，令我很困惑，请各位高手指点。我的目的蛋白是26KD，但显出的条带是43KD左右，几乎和actin位置一样。我用构建的含该基因的质粒转293细胞后收的蛋白可显 ...

43KD那条带可能是非特异性的，而你的处理没有使目的蛋白（26KD那条带）增加。

作者: xueyouzhang 时间: 2013-5-4 13:33

请教楼主，我最近在做caspase 3,重复了好几次，曝光出来的总是白板。我用的是可以一起测pro-caspase3的cell signal的抗体。另外已经用试剂盒的方法测过caspase3，证明有表达。而且同一个样品和步骤做caspase 9和actin 都没有问题。实在不知道是哪一步出现问题了。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:34

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原帖由 xueyouzhang 于 2013-5-4 13:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请教楼主，我最近在做caspase 3,重复了好几次，曝光出来的总是白板。我用的是可以一起测pro-caspase3的cell signal的抗体。另外已经用试剂盒的方法测过caspase3，证明有表达。而且同一个样品和步骤做caspase 9和actin 都 ...

可能是caspase 3抗体的问题，建议您找一个阳性对照测试一下您的caspase 3抗体。

作者: 8princess8 时间: 2013-5-4 13:34

perk/terk的比值大于1或小于1都没有关系，数据都能用的，因为你最后还要以对照组的值为对照（即设为1）进行数据的统计。

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不好意思，麻烦问一下楼主怎样“以对照组的值为对照（即设为1）进行统计”？
我是这样理解的：以每次跑样的对照（假设为空白处理组）的百分比的数值设为1，在组内将其它干预组分别得出具体数值，这样就完成一次实验的有效统计，以此类推得到多个重复实验组数据，在进行统计描述和显著性检验。

请指教啊

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:36

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原帖由 8princess8 于 2013-5-4 13:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
perk/terk的比值大于1或小于1都没有关系，数据都能用的，因为你最后还要以对照组的值为对照（即设为1）进行数据的统计。

============================================================================================== ...

是的。

作者: tianmei001 时间: 2013-5-4 13:36

请教楼主一个非磷酸化的问题，我最近在做Western Blot，做的是TGFβ1/Smad信号通路，使用的是大鼠的肾组织，其中有一个目的蛋白是TGFβ1，但是我始终没有做出来，其他蛋白和内参都能做出来，借用别人的抗体还是没有。但是用R&D公司的TGFβ（1，2，3）做可以做出条带，位置大概在25KD偏下一点点，但不能确定是不是TGFβ1。我听别人说TGFβ1只能用培养的细胞的培养基做，他说TGFβ1是细胞因子，会分泌到外周，不知道是不是这样？所以我想问下能否用Western Blot做动物组织TGFβ1蛋白表达量的测定。我用的抗体是BIOWORLDE公司的，为Y369（附上抗体说明书）。请各位帮帮忙。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:37

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请教楼主一个非磷酸化的问题，我最近在做Western Blot，做的是TGFβ1/Smad信号通路，使用的是大鼠的肾组织，其中有一个目的蛋白是TGFβ1，但是我始终没有做出来，其他蛋白和内参都能做出来，借用别人的抗体还是没有。但是用R&D公 ...

我以前见到有人做过TGFβ1在培养基中的分泌，但我的理解是：用Western Blot做动物组织TGFβ1蛋白表达量的测定是可行的。只不过，这个蛋白不是太好做，尤其在组织中，建议抗体的浓度要大一些，另外，蛋白上样量也大些。如果不行，最好换一家公司买抗体。

作者: pou 时间: 2013-5-4 13:37

看了楼上各位的发言，还是有几个问题不明白，望楼主明示：
1.  有关磷酸化蛋白的抗体是不是分为：磷酸化抗体、去磷酸化抗体、总蛋白抗体三种？磷酸化抗体的识别位点是专一的磷酸化位点，总蛋白抗体的识别位点是磷酸化位点以外的任一位点，那么，请问去磷酸化抗体的识别位点是哪里，它是如何识别非磷酸化的蛋白的？
2.  楼主前面帖子提到：“用总蛋白抗体WB时，磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白的分子量应该差别不大(差几个磷酸的分子量而已，相对于几十kd分子量的蛋白，可以忽略不计)，故而一般情况下，这两条带应该是重叠在一起。”但据我查阅的文献，很多总蛋白抗体的WB结果都是两条分开的条带，始终不解，求明示。
3.  楼主前面帖子还提到：同时研究某一蛋白的磷酸化和总量时有两种方法，比较公认的是：“将原先结合上的磷酸化抗体及二抗洗去（strip）”那么，请问：这样的话，同一蛋白的磷酸化抗体和总抗体的选择有什么需要注意的，需要非同源的抗体吗？
4.  做磷酸化蛋白，选择磷酸化抗体时，是否最好选择多克隆的，这样更容易做出结果，谢谢！

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:38

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原帖由 pou 于 2013-5-4 13:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
看了楼上各位的发言，还是有几个问题不明白，望楼主明示：
1. 有关磷酸化蛋白的抗体是不是分为：磷酸化抗体、去磷酸化抗体、总蛋白抗体三种？磷酸化抗体的识别位点是专一的磷酸化位点，总蛋白抗体的识别位点是磷酸化位点以外的 ...

1，非磷酸化的蛋白识别的位点与磷酸化抗体的识别位点相同，但它识别该位点的非磷酸化状态，一旦该位点发生磷酸化了，抗体就不识别了。一般情况下，这种抗体不太多。
2，很多总蛋白抗体的WB结果都是两条分开的条带，那是因为该蛋白可能有两个亚型（如ERK1和ERK2）或两个亚基，并且具有相同的抗原决定簇能被抗体识别。
3，与一般做法相同，不需要非同源的抗体。
4，是的，一般情况下选择多克隆抗体可能会好一些，但这不是绝对正确的。

作者: kswl870 时间: 2013-5-4 13:38

楼主，您好：
我有个问题想请教您一下：我做磷酸化ATM(350KD)，我用的是Cellsignal Phospho-ATM (Ser1981)(10H11.E12) Mouse mAb的一抗，想问问每次总蛋白上样量要多少ug才能检测出来？整个检测最注意是哪里？谢谢！

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:39

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原帖由 kswl870 于 2013-5-4 13:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼主，您好：
我有个问题想请教您一下：我做磷酸化ATM(350KD)，我用的是Cellsignal Phospho-ATM (Ser1981)(10H11.E12) Mouse mAb的一抗，想问问每次总蛋白上样量要多少ug才能检测出来？整个检测最注意是哪里？谢谢！ ...

50ug以上/lane 较好。因为ATM(350KD)分子量较大，最好跑长一点的胶，容易分开条带。如果跑浓度梯度胶更好（双向电泳常用的）。但摸条件时可以用mini-gel试一试。

作者: owanaka 时间: 2013-5-4 13:39

楼主，您好：
我马上要提细胞磷酸化的蛋白做western，想请教你，做磷酸化的蛋白，细胞需要饥饿吗？我问的不同的人回答都不同。如果饥饿时间久了会不会影响细胞磷酸化蛋白的表达？期待帮助哦，谢谢。

作者: 04906 时间: 2013-5-4 13:40

1，非磷酸化的蛋白识别的位点与磷酸化抗体的识别位点相同，但它识别该位点的非磷酸化状态，一旦该位点发生磷酸化了，抗体就不识别了。一般情况下，这种抗体不太多。

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请教一下磷酸化与非磷酸化抗体制备原理

作者: standbyme 时间: 2013-5-4 13:40

版主，你好：
我马上要提细胞磷酸化的蛋白做western，想请教你，做磷酸化的蛋白，细胞需要饥饿吗？我问的不同的人回答都不同。如果饥饿时间久了会不会影响细胞磷酸化蛋白的表达？期待帮助哦，谢谢。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:41

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原帖由 04906 于 2013-5-4 13:40 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
1，非磷酸化的蛋白识别的位点与磷酸化抗体的识别位点相同，但它识别该位点的非磷酸化状态，一旦该位点发生磷酸化了，抗体就不识别了。一般情况下，这种抗体不太多。

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请教一下磷酸化与非 ...

磷酸化特异性抗体的生产以磷酸化多肽为抗原，磷酸化多肽一般是用磷酸化氨基酸制备而成。用磷酸化多肽免疫兔子或小鼠以制备抗体。磷酸化抗体的抗血清需要预先用非磷酸化的多肽进行亲和吸附，以除去一些存在的非磷酸化多肽抗原产生的抗体。

而非磷酸化特异性抗体的生产则与之相反，以相应位点的非磷酸化多肽为抗原。同样，也要用磷酸化的多肽进行亲和吸附，以除去一些存在的磷酸化多肽抗原产生的抗体。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:41

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原帖由 standbyme 于 2013-5-4 13:40 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

版主，你好：
我马上要提细胞磷酸化的蛋白做western，想请教你，做磷酸化的蛋白，细胞需要饥饿吗？我问的不同的人回答都不同。如果饥饿时间久了会不会影响细胞磷酸化蛋白的表达？期待帮助哦，谢谢。 ...

是否要做饥饿处理，要根据你的实验决定。饥饿处理一般都会影响细胞磷酸化蛋白的表达的改变的，也就是说，饥饿处理会使蛋白磷酸化很敏感。

作者: ero11 时间: 2013-5-4 13:42

楼主您好！我们现在做A431细胞EGFR磷酸化的表达，一抗是Santa公司的单抗，内参用贝塔-actin。actin和EGFR做的很好了，条带很清楚，pi-EGFR也做出来了，但结果却很诡异。按道理讲，细胞饥饿时pi-EGFR表达低，加入EGF刺激后表达增高才对，但我们加与不加EGF表达一样高，而且细胞不饥饿状态下也是一样的结果，甚至细胞饥饿比不饥饿磷酸化程度还要高。我简直欲哭无泪了，觉得这个结果比做不出条带还要郁闷。楼主做过很多磷酸化蛋白的表达了，不知道遇到过类似的情况没有，还请指教一二，不胜感激！！

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:42

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原帖由 ero11 于 2013-5-4 13:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼主您好！我们现在做A431细胞EGFR磷酸化的表达，一抗是Santa公司的单抗，内参用贝塔-actin。actin和EGFR做的很好了，条带很清楚，pi-EGFR也做出来了，但结果却很诡异。按道理讲，细胞饥饿时pi-EGFR表达低，加入EGF刺激后表达增高才 ...

1,很多时候，饥饿处理会使蛋白磷酸化更敏感.
2,EGF灭活了？
3，p-EGFR抗体结果的条带确定是目的条带吗？

作者: kewanqi2011 时间: 2013-5-4 13:43

细胞饥饿后pi-EGFR表达会减弱，资料上都是这样的，可是我们的仍然很强，这是最难以解答的问题。另外，我们在转膜后按照Marker把相应目的条带部位的膜裁了下来，然后再进行免疫反应的，应该不会是非特异性条带，不过仍不排除这种可能，那么如果是非特异性条带该怎么样进行鉴别和解决呢？谢谢版主！！

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:43

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原帖由 kewanqi2011 于 2013-5-4 13:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
细胞饥饿后pi-EGFR表达会减弱，资料上都是这样的，可是我们的仍然很强，这是最难以解答的问题。另外，我们在转膜后按照Marker把相应目的条带部位的膜裁了下来，然后再进行免疫反应的，应该不会是非特异性条带，不过仍不排除这种可 ...

可以看总EGFR蛋白的抗体所做的实验结果中，条带是否在同一位置（分子量类似），以判断是否为特异性条带。

作者: rxcc33 时间: 2013-5-4 13:43

楼主您好！

不知道你或者你的同学做过磷酸化的AKT吗？

这个蛋白是不是有些特殊性呢？我发了一个相关的帖子，但是问题还没有解决。

感觉上WB的整个过程问题不大，是不是动物或者细胞刺激的不够，根本看不到磷酸化的AKT呢？

因为我后两次的样品，那是一点信号都没有啊！

非常感谢！

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:44

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原帖由 rxcc33 于 2013-5-4 13:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼主您好！

不知道你或者你的同学做过磷酸化的AKT吗？

这个蛋白是不是有些特殊性呢？我发了一个相关的帖子，但是问题还没有解决。

感觉上WB的整个过程问题不大，是不是动物或者细胞刺激的不够，根本看不到磷酸化的AKT呢？

因 ...

两个可能：1，AKT磷酸化抗体效价不高。你可找一个阳性对照测试一下。
2，动物或者细胞刺激的不够，不能造成其磷酸化程度上升。

作者: kewanqi2011 时间: 2013-5-4 13:44

前几天买到A431细胞裂解液标准品，有EGF刺激和无刺激两个，进行了pi-EGFR检测，结果很好，无刺激的很浅一条带，有刺激的表达很强。看来，是我自己细胞处理过程中出现了问题。我们是买的生工的RIPA裂解液（含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的），0.05ml/1000,000个细胞，冰上裂解20min，然后4度离心取上清的，EGFR和内参actin都做得很好，条带非常清晰，就是pi-EGFR不行，想问一下楼主，可能哪个处理过程会出错误呢？是不是裂解液加的太少了？

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:45

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原帖由 kewanqi2011 于 2013-5-4 13:44 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

前几天买到A431细胞裂解液标准品，有EGF刺激和无刺激两个，进行了pi-EGFR检测，结果很好，无刺激的很浅一条带，有刺激的表达很强。看来，是我自己细胞处理过程中出现了问题。我们是买的生工的RIPA裂解液（含有蛋白酶抑制剂和磷酸 ...

最大的可能是你处理样品时没有很好地保持低温，尤其是收集细胞的时候，而不是“裂解液加的太少”。

作者: dotaaa 时间: 2013-5-4 13:45

蛋白变性时未加上样缓冲液，待做WB时再加入上样缓冲液混匀，可否？我做的是p-erk的，前天这样做时做出来的p44，p42条带很好很清晰

作者: dotaaa 时间: 2013-5-4 13:45

补充一下，就是我蛋白变性的时候没有加Loading buffer，请问有什么补救措施吗？

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:46

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原帖由 dotaaa 于 2013-5-4 13:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
补充一下，就是我蛋白变性的时候没有加Loading buffer，请问有什么补救措施吗？

没有加Loading buffer你如何使蛋白变性？直接把细胞裂解液加热吗？那你的细胞裂解液里就应该有变性剂的成分（甚至就含有loading buffer的成分）。

作者: lgm 时间: 2013-5-4 13:46

lz你好，我这些一直在做p-erk，但是每次只有一条带显出来，一抗用的santa的，milk封闭，想请教你p-erk是不是肯定会出现两条带呢，会不会是给药时间长了细胞内的p-erk回到了基础水平所以另一条带显不出来了？或者上样量太少？我上了30ug，楼主一般上多少呢？压片多久呢？非常感谢，lz真是太无私了

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:47

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原帖由 lgm 于 2013-5-4 13:46 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

lz你好，我这些一直在做p-erk，但是每次只有一条带显出来，一抗用的santa的，milk封闭，想请教你p-erk是不是肯定会出现两条带呢，会不会是给药时间长了细胞内的p-erk回到了基础水平所以另一条带显不出来了？或者上样量太少？我上了3 ...

有些细胞中p-ERK的其中一条带不太明显，或者只是浅浅的一条带再加上很深的一条带。建议你上样50ug,压片超过2分钟。

作者: yes4 时间: 2013-5-4 13:47

我在做磷酸化蛋白,在作出来两次之后就再也出不来了,非常郁闷!!
最近的结果是在所有条件都没变的情况下,在100-150左右出现两条比较强的非特异性条带,目的蛋白应该在40...我觉得不是实验本身和抗体的问题,因为3周之前都做出来了2回,而且每次actin还不错.我在想会不会是磷酸化蛋白降解了...但是我这几次的样本都是原来做出来过得,有的是和loading dye加热变性保存在-20度的,有的是纯化的蛋白直接保存在-20度的,都在2-3周左右.按说变性以后应该稳定才对...中间也没有解冻...
今天我还作了一个coomassie stain,发现胶上蛋白还是挺多的,但是marker的蛋白都转膜上了,我上了30ug蛋白.尤其值得注意的是stacking gel和resolving gel中间有一条挺深的带...我查过buffer pH,都是对的.我在想会不会是isobutanol(异丁醇?)没洗干净???

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:47

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原帖由 yes4 于 2013-5-4 13:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我在做磷酸化蛋白,在作出来两次之后就再也出不来了,非常郁闷!!
最近的结果是在所有条件都没变的情况下,在100-150左右出现两条比较强的非特异性条带,目的蛋白应该在40...我觉得不是实验本身和抗体的问题,因为3周之前 ...

stacking gel和separating gel中间如果有深色条带的话，可能是做胶用的试剂出现了问题，尤其你要注意一下是否是TEMED变质了。

作者: yes4 时间: 2013-5-4 13:48

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原帖由 箭头儿 于 2013-5-4 13:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

stacking gel和separating gel中间如果有深色条带的话，可能是做胶用的试剂出现了问题，尤其你要注意一下是否是TEMED变质了。

谢谢!不过TEMED应该还好,我每次都特别注意一下有没有变黄.APS我们都是存在-20的,每次化一管,立即就用了.别的试剂tris-HCl的pH我才测过,有一点不准,我也都在实验之前都调过了(因为做了3周都没做出来了,所以把能想到的都查过了...)只有10%SDS没有查...有可能是因为SDS失效了,所以蛋白都聚成多聚体了???我在转膜之后染色发现胶上有好多蛋白,特别是大分子.胶片曝光以后发现比目的蛋白大很多的地方有两条很亮的条带.还有我猜是因为我用纯isobutanol封resolving gel,然后没洗干净的缘故...

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:48

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原帖由 yes4 于 2013-5-4 13:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢!不过TEMED应该还好,我每次都特别注意一下有没有变黄.APS我们都是存在-20的,每次化一管,立即就用了.别的试剂tris-HCl的pH我才测过,有一点不准,我也都在实验之前都调过了(因为做了3周都没做出来了,所以把能想到 ...

TEMED不一定变黄才变质的，有时颜色没变时也会变质。我一直用水封separating gel，所以不知isobutanol残留的作用有多大，但无感觉可能不是isobutanol导致的，你可能想岔了。

作者: wu11998866 时间: 2013-5-4 13:48

请教楼主
磷酸酶抑制剂到底有哪些，自己配的话可否提供配方，不胜感激

作者: wu11998866 时间: 2013-5-4 13:49

前几天买到A431细胞裂解液标准品，有EGF刺激和无刺激两个，进行了pi-EGFR检测，结果很好，无刺激的很浅一条带，有刺激的表达很强。看来，是我自己细胞处理过程中出现了问题。我们是买的生工的RIPA裂解液（含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的），0.05ml/1000,000个细胞，冰上裂解20min，然后4度离心取上清的，EGFR和内参actin都做得很好，条带非常清晰，就是pi-EGFR不行，想问一下楼主，可能哪个处理过程会出错误呢？是不是裂解液加的太少了？

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RIPA裂解液里面一般含有磷酸酶抑制剂的吗

作者: 969 时间: 2013-5-4 13:49

我做了好几次pASK1可就是没有条带，电泳200V40分钟，转膜200毫安100分钟，用牛奶封闭一小时，其他的抗体都可以出来可是这个做了好几次都没有求助高人指点，我的样品中没有添加磷酸酶抑制剂，不过我做的其他的几个磷酸化蛋白都能出结果，一抗是1:1000二抗是1:1500

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:50

请教楼主
磷酸酶抑制剂到底有哪些，自己配的话可否提供配方，不胜感激

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见我的贴子：
cuturl('http://immunotech.dxy.cn/bbs/topic/11443307')

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:50

RIPA裂解液里面一般含有磷酸酶抑制剂的吗

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一般没有包含。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:50

我做了好几次pASK1可就是没有条带，电泳200V40分钟，转膜200毫安100分钟，用牛奶封闭一小时，其他的抗体都可以出来可是这个做了好几次都没有求助高人指点，我的样品中没有添加磷酸酶抑制剂，不过我做的其他的几个磷酸化蛋白都能出结果，一抗是1:1000二抗是1:1500

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可能是一抗的问题，建议换抗体，或者一抗浓度调高为1：200——1：500试一试。另外，你的电泳速度太快了，100v左右就差不多了，约1.5-2hr。

作者: yes4 时间: 2013-5-4 13:51

谢谢版主，我用的是CST的抗体，另外我想问一下电泳的速度快慢和结果有关系吗

作者: yes4 时间: 2013-5-4 13:51

还有我测得目的蛋白的分子量是155.，我是用脱脂牛奶封闭的

作者: kulee 时间: 2013-5-4 13:52

如果我用RIPA+PMSF再加上罗氏的那种磷酸酶抑制剂片剂溶解剂是不是也可以呢，自己配您提供的那种裂解液很多东西实验都没有哦

作者: kulee 时间: 2013-5-4 13:52

再请教版主一个问题
如果要同时做分子量为92KD和P-ERK能否在一块同一块胶上跑
电泳及电转条件最好怎么设置比较好，用12%还是10%的分离胶比较好？
我已经试过很多条件了，但是都不好，
我的一般条件如下：
电泳80v浓缩胶100v分离胶
电转湿转300mA恒流2h或者250mA2h
请指教，谢谢

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:52

谢谢版主，我用的是CST的抗体，另外我想问一下电泳的速度快慢和结果有关系吗

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电压过高会造成温度过高，目的蛋白容易脱磷酸。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:53

如果我用RIPA+PMSF再加上罗氏的那种磷酸酶抑制剂片剂溶解剂是不是也可以呢，自己配您提供的那种裂解液很多东西实验都没有哦

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RIPA+磷酸酶抑制剂,就可以了。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:53

再请教版主一个问题
如果要同时做分子量为92KD和P-ERK能否在一块同一块胶上跑
电泳及电转条件最好怎么设置比较好，用12%还是10%的分离胶比较好？
我已经试过很多条件了，但是都不好，
我的一般条件如下：
电泳80v浓缩胶100v分离胶
电转湿转300mA恒流2h或者250mA2h
请指教，谢谢

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8%分离胶较好，10%也行，12%不好。

作者: kulee 时间: 2013-5-4 13:54

8%分离胶较好，10%也行，12%不好。

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很多英文文献中写用的都是12%的胶同时做这两个蛋白哦，但我自己做了也觉得92KD那个比较难跑开，目前都是用10%的结果很不好，还不如以前用12%的，现在想再用回12%试试
我的电转条件不知电压会不会高了点
还有版主说加了磷酸酶抑制剂就不用加蛋白酶抑制剂PMSF了？
真是不好意思老是麻烦版主，我也是做了两个多月的WB了，还是偶尔只有内参还行，真是急啊

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:54

很多英文文献中写用的都是12%的胶同时做这两个蛋白哦，但我自己做了也觉得92KD那个比较难跑开，目前都是用10%的结果很不好，还不如以前用12%的，现在想再用回12%试试
我的电转条件不知电压会不会高了点
还有版主说加了磷酸酶抑制剂就不用加蛋白酶抑制剂PMSF了？
真是不好意思老是麻烦版主，我也是做了两个多月的WB了，还是偶尔只有内参还行，真是急啊

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个人经验，8%可能好些。
你的电转条件，电压只会过低，不会过高。（记得常换电转液）
我以为RIPA中已有PMSF了。

另外，不要着急两个蛋白一起做，你先做出一个蛋白再说，等熟练后再多做几个蛋白。

作者: kulee 时间: 2013-5-4 13:55

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原帖由 箭头儿 于 2013-5-4 13:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
很多英文文献中写用的都是12%的胶同时做这两个蛋白哦，但我自己做了也觉得92KD那个比较难跑开，目前都是用10%的结果很不好，还不如以前用12%的，现在想再用回12%试试
我的电转条件不知电压会不会高了点
还有版主说加了磷酸酶 ...

嗯，谢谢版主
那么根据经验您觉得92KD的用8%的胶电转电流用多大，时间多久比较好，我用的内参是GAPDH

作者: JK.jon 时间: 2013-5-4 13:55

请问楼主如何进行stripping，谢谢！

作者: okhaha 时间: 2013-5-4 13:55

我最近要做磷酸化蛋白的Western,已经留了一些蛋白了，留的是刺激48小时候的人PBMC蛋白，但是我听说测磷酸化蛋白的话，刺激半个小时就可以了，刺激48个小时就测不出来了，是这样吗？望各位大侠给予指点！

作者: okhaha 时间: 2013-5-4 13:56

请问内参怎么选，是所有的Western都用同样的内参呢，还是根据做的东西不同而不同呢，能不能有人给详细介绍一下呢，非常感谢！

作者: kulee 时间: 2013-5-4 13:56

请问内参怎么选，是所有的Western都用同样的内参呢，还是根据做的东西不同而不同呢，能不能有人给详细介绍一下呢，非常感谢！

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内参选择应该是根据要跑的目的蛋白的分子量来选择，尽量和你的目的蛋白分离开来
比如内参b-actin是43KD，你的目的蛋白最好在50KD以上或者35KD以下比较好

作者: fsdd817 时间: 2013-5-4 13:56

楼主辛苦了！
我是做小歪的新手，内参做了几次都是白板。从肿瘤细胞中用细胞裂解液和pmfs提蛋白，每孔加相当于100ug的蛋白，内参43，半湿转45分钟，pvdf膜上能看见marker。一抗浓度1:200。买的是scientific的super signal west pico 发光底物，说明书上要求二抗稀释度从1mg/ml原浓度稀释为1：20000~1:100000,可是我的二抗说明书上要求稀释有效范围为1；2000~1：20000，于是我就取了二抗中间值1:20000，可是曝光之后什么都没有，愁死我了，我该怎么办呀，二抗浓度怎么调？是不是我其他地方出了问题？谢谢楼主了！！

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:57

嗯，谢谢版主
那么根据经验您觉得92KD的用8%的胶电转电流用多大，时间多久比较好，我用的内参是GAPDH

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电流300mA,2hr.

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:57

请问楼主如何进行stripping，谢谢！

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将PVDF膜浸入stripping buffer中（我习惯用塑料薄膜袋封好），50度30min即可。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:58

我最近要做磷酸化蛋白的Western,已经留了一些蛋白了，留的是刺激48小时候的人PBMC蛋白，但是我听说测磷酸化蛋白的话，刺激半个小时就可以了，刺激48个小时就测不出来了，是这样吗？望各位大侠给予指点！

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一般情况下，几分钟到一两个小时最明显，但也有些蛋白24-48hr以后也会依然很明显。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:58

楼主辛苦了！
我是做小歪的新手，内参做了几次都是白板。从肿瘤细胞中用细胞裂解液和pmfs提蛋白，每孔加相当于100ug的蛋白，内参43，半湿转45分钟，pvdf膜上能看见marker。一抗浓度1:200。买的是scientific的super signal west pico 发光底物，说明书上要求二抗稀释度从1mg/ml原浓度稀释为1：20000~1:100000,可是我的二抗说明书上要求稀释有效范围为1；2000~1：20000，于是我就取了二抗中间值1:20000，可是曝光之后什么都没有，愁死我了，我该怎么办呀，二抗浓度怎么调？是不是我其他地方出了问题？谢谢楼主了！！

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建议二抗浓度改为1:2000，一抗也可以改为1：1000或1：2000.
我没用过super signal west pico 发光底物，所以不好给你建议。

作者: windy+++ 时间: 2013-5-4 13:58

最近有人建议说在刺激细胞的时候就加磷酸酶抑制剂...这样磷酸化蛋白就不会降解,信号就会增强,请问可以这么做吗?

作者: tie8 时间: 2013-5-4 13:59

请问楼主，做磷酸化蛋白加不加磷酸酶抑制剂很重要吧，那是不是该买质量比较好的磷酸酶抑制剂啊？

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:59

最近有人建议说在刺激细胞的时候就加磷酸酶抑制剂...这样磷酸化蛋白就不会降解,信号就会增强,请问可以这么做吗?

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谁建议的？有出处吗？
刺激细胞的时候就加磷酸酶抑制剂，那么磷酸酶抑制剂也就变成了一种药物处理，这是两个不同的概念。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 13:59

请问楼主，做磷酸化蛋白加不加磷酸酶抑制剂很重要吧，那是不是该买质量比较好的磷酸酶抑制剂啊？

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如果科研经费还可以的话，当然这样做最好。

作者: 8princess8 时间: 2013-5-4 14:00

楼主你好，我是你的帖子的忠实读者，我们的方法基本按照你的建议进行的，现在实验结果很好，只是我们现在用一种药物干预目的细胞后，发现p-ERK水平反倒下降了，我只见过药物作用后p-ERK上升或者不变的，但没有见过下降的，我做的这是一个全新的东西，没有文献支持，想问问你的看法，谢谢啦！

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 14:00

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原帖由 8princess8 于 2013-5-4 14:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼主你好，我是你的帖子的忠实读者，我们的方法基本按照你的建议进行的，现在实验结果很好，只是我们现在用一种药物干预目的细胞后，发现p-ERK水平反倒下降了，我只见过药物作用后p-ERK上升或者不变的，但没有见过下降的，我做的这 ...

你所处理的药物有可能是p-ERK的抑制剂，目前市面上已有一些小分子的p-ERK的抑制剂，你比较一下你的药物的结构是否与这些抑制剂有相似之处？

作者: 8princess8 时间: 2013-5-4 14:00

我们这个药物是短的蛋白质，它是配体，而它的受体家族里都是对ERK 升高或者没有作用的报道，不知道楼主有没有看到类似的报道？我怎么差都查不出来

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 14:01

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原帖由 8princess8 于 2013-5-4 14:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我们这个药物是短的蛋白质，它是配体，而它的受体家族里都是对ERK 升高或者没有作用的报道，不知道楼主有没有看到类似的报道？我怎么差都查不出来 ...

在同一个受体家族里，不同的蛋白分别对ERK有促进、抑制以及没有影响这三种不同或者说截然相反的作用，这是个很有意思的课题，值得深入研究下去。我印象中好像也没见过类似的报道。

作者: 8princess8 时间: 2013-5-4 14:01

请问用striping buffer 洗完后还用封闭吗？再加一抗、二抗

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 14:02

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原帖由 8princess8 于 2013-5-4 14:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请问用striping buffer 洗完后还用封闭吗？再加一抗、二抗

可以不用封闭，洗完后直接加一抗。

作者: qqq111 时间: 2013-5-4 14:02

我最近在做p-ERK的western, 曝光15min有时候有条带,第二次曝光不管多长时间总是空白一片! 请问lz 您p-ERK一般曝光多长时间合适？能重复曝光吗？ERK呢？
不胜感激

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 14:03

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原帖由 qqq111 于 2013-5-4 14:02 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我最近在做p-ERK的western, 曝光15min有时候有条带,第二次曝光不管多长时间总是空白一片! 请问lz 您p-ERK一般曝光多长时间合适？能重复曝光吗？ERK呢？
不胜感激 ...

我做p-ERK时一般曝光0.5-1分钟，最长约2分钟左右，ERK的曝光时间略短一些。

你说的“重复曝光”是什么意思？如果指的是加一次ECL以后曝光好几张X光片，那当然可以，只要控制时间在0.5-1小时以内即可，否则ECL荧光就会萃灭。我经常一次曝光几张X光片（曝光时间略有不同而导致条带深浅不一样），然后选一两张较好的X光片用来发表文章。

作者: qqq111 时间: 2013-5-4 14:03

我做p-ERK时一般曝光0.5-1分钟，最长约2分钟左右，ERK的曝光时间略短一些。

你说的“重复曝光”是什么意思？如果指的是加一次ECL以后曝光好几张X光片，那当然可以，只要控制时间在0.5-1小时以内即可，否则ECL荧光就会萃灭。我经常一次曝光几张X光片（曝光时间略有不同而导致条带深浅不一样），然后选一两张较好的X光片用来发表文章。
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感谢lz回答，最近p-erk做的很烂，有几个问题请教
1. 2分钟p-erk条带很清楚吗?是不是和蛋白表达量有关? 我曝光15分钟有时候还空白，p-erk荧光一般能持续多长时间淬灭啊？
2. 我的细胞裂解液是自己配的，加了NaF Na3VO4和蛋白酶抑制剂cocktail，样品煮沸后western效果不是很好，如果不煮沸的话-20度能放多长时间？
3、p-erk一抗是signal的，用BSA稀释，4度保存一般能用几次啊？我用了3次好像就不行了，-20是不是能延长保存时间？

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 14:03

楼主，麻烦你帮我看看哪两条是p-jnk，谢谢啦

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你最好标出marker，以利于判断。如果这三条条带中有两条是p-JNK的话，那么最下面紧挨着的两条最可能就是。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 14:04

感谢lz回答，最近p-erk做的很烂，有几个问题请教
1. 2分钟p-erk条带很清楚吗?是不是和蛋白表达量有关? 我曝光15分钟有时候还空白，p-erk荧光一般能持续多长时间淬灭啊？
2. 我的细胞裂解液是自己配的，加了NaF Na3VO4和蛋白酶抑制剂cocktail，样品煮沸后western效果不是很好，如果不煮沸的话-20度能放多长时间？
3、p-erk一抗是signal的，用BSA稀释，4度保存一般能用几次啊？我用了3次好像就不行了，-20是不是能延长保存时间？

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1，2分钟p-erk条带已足够清楚，如果药物处理可以使其发生磷酸化的话。ECL荧光大约一个小时左右淬灭。
2，不管是否煮沸，样品在-20度放一两个月应该没有问题。但不能反复冻融次数太多。
3，p-erk一抗放在4度保存只有两三天时间就容易失效了，放-20度最好，但也不能反复冻融次数太多，所以最好分装一下再保存。保存得好的话，p-erk一抗可能反复冻融七八次以后效果都还可以。

作者: qqq111 时间: 2013-5-4 14:04

2，不管是否煮沸，样品在-20度放一两个月应该没有问题。但不能反复冻融次数太多。
3，p-erk一抗放在4度保存只有两三天时间就容易失效了，放-20度最好，但也不能反复冻融次数太多，所以最好分装一下再保存。保存得好的话，p-erk一抗可能反复冻融七八次以后效果都还可以。

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您平常做p-erk 样品煮沸吗？
您说的-20度保存是没经过稀释的p-erk抗体吧！ BSA稀释后的p-erk放4度一般能用几次？怎么保存稀释后的抗体才能多用几次呢 -20？？
感激不尽

作者: qqq111 时间: 2013-5-4 14:05

还有一事不明请指教：
细胞裂解液是自己配的，和您用的配方大体类似，只是 Sodium deoxycholate 和EDTA没有加，文献说Sodium deoxycholate 是中度变性剂和蛋白溶解剂，EDTA是变性剂和稳定剂，这样对实验结果p-erk有影响吗？是不是加了Sodium deoxycholate蛋白就变性了，相当于煮沸，以后反复冻融多少次都可以啊
谢谢

作者: 8princess8 时间: 2013-5-4 14:05

你最好标出marker，以利于判断。如果这三条条带中有两条是p-JNK的话，那么最下面紧挨着的两条最可能就是。

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我们当时没有做Marker，但是根据文献，也应该就是最下面两条。我不敢肯定，所以找你看看。现在觉得应该确定了。
谢谢啊

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 14:06

您平常做p-erk 样品煮沸吗？
您说的-20度保存是没经过稀释的p-erk抗体吧！ BSA稀释后的p-erk放4度一般能用几次？怎么保存稀释后的抗体才能多用几次呢 -20？？
感激不尽

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1，我一般收集样品后加loading buffer 95度5分钟，然后保存。当然，有时也会收集样品后直接保存。
2，我说的就是5%BSA稀释后的p-erk一抗。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 14:06

还有一事不明请指教：
细胞裂解液是自己配的，和您用的配方大体类似，只是 Sodium deoxycholate 和EDTA没有加，文献说Sodium deoxycholate 是中度变性剂和蛋白溶解剂，EDTA是变性剂和稳定剂，这样对实验结果p-erk有影响吗？是不是加了Sodium deoxycholate蛋白就变性了，相当于煮沸，以后反复冻融多少次都可以啊
谢谢

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这两个试剂分别起变性和稳定的作用，对实验结果影响很大，尤其是EDTA(或EGTA可能更好),但是还是需要95度5分钟，这是不能代替的。反复冻融次数要尽量少！！！

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 14:07

最近用ly294002处理2种细胞系，添加浓度为20uM处理2-12小时，wb检测p-Akt的量发现不但没减少，反而增加，很奇怪的！百思不得其解，不知是何原因？用50uM处理时也是这样?请帮忙分析一下。

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你试一试把ly294002的浓度降为10uM,提前0.5hr加入？我也发现有时ly294002会促进p-Akt，但我目前尚不知确切原因。这可能与ly294002会影响其它细胞活性有关。所以，我一般不敢浓度加太高。你也可以试一试Wortmannin，这个抑制剂会好一些，但会贵一些。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 14:07

谢谢答疑，还有点问题：我做p-erk,因为裂解液配起来挺麻烦，我想用碧云天的裂解液，不知道LZ用过没？有些人说效果还可以，您看用P0013还是P0013B好呢？

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我没用过碧云天的，我都是自己配的裂解液。P0013或P0013B可能都可以。你再找了解的人问一问？

作者: zsxan1990 时间: 2013-5-4 14:08

你试一试把ly294002的浓度降为10uM,提前0.5hr加入？我也发现有时ly294002会促进p-Akt，但我目前尚不知确切原因。这可能与ly294002会影响其它细胞活性有关。所以，我一般不敢浓度加太高。你也可以试一试Wortmannin，这个抑制剂会好一些，但会贵一些。

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我又试过用5%、10%、80%、100%的ly294002处理细胞，检测结果还和上次的一样。这是我的细胞处理程序，请帮分析一下哪个环节还有不当之处。
10%FBS血清添加到DMEM培养基中，传代后24小时细胞汇合度达到50-60%，弃去培养基。分别添加浓度为10uM、20uM、50uM的ly294002，培养基用含10%FBS血清的DMEM。在2、12、24h裂解细胞收集蛋白，电泳，并用CST的p-Akt(473)一抗杂交，ECL曝光。

作者: qqq111 时间: 2013-5-4 14:08

非常感激LZ的无私援助，有一问题请赐教，比较啰嗦，急ing,谢谢了
我正在做p-erk的western，细胞裂解并离心取上清加loading buffer煮沸后室温冷却-20冻存（10月1号）。同批样品同样上样量第1次（10-3）7条带都很清楚很好，第2次（10-5）只有两条带显影但明显比第1次弱（这两条带是第1次7条带中最明显的），第3次（10-8）提高了二抗浓度但还是只有那两条带显影，比第2次弱还很多，3次试验呈明显衰减趋势。电泳、转膜、封闭、抗体、显影等步骤没有明显差别，重复性如此之差，lz经验丰富，请赐教， cell lysis自己配的，和您发的配方类似（protein inhibitors，phospotase inhibitor都有），但没加EGTA、脱氧胆酸钠，您说它们是稳定剂而且影响结果很大，会不会是这个原因？冻融只有3次，时间不到10天，别的实在想不起来了，拜托

作者: 66小飞侠 时间: 2013-5-4 16:59

有一问题请赐教，比较啰嗦，急ing,谢谢了
我正在做p-erk的western，细胞裂解并离心取上清加loading buffer煮沸后室温冷却-20冻存（10月1号）。同批样品同样上样量第1次（10-3）7条带都很清楚很好，第2次（10-5）只有两条带显影但明显比第1次弱（这两条带是第1次7条带中最明显的），第3次（10-8）提高了二抗浓度但还是只有那两条带显影，比第2次弱还很多，3次试验呈明显衰减趋势。电泳、转膜、封闭、抗体、显影等步骤没有明显差别，重复性如此之差，lz经验丰富，请赐教， cell lysis自己配的，和您发的配方类似（protein inhibitors，phospotase inhibitor都有），但没加EGTA、脱氧胆酸钠，您说它们是稳定剂而且影响结果很大，会不会是这个原因？冻融只有3次，时间不到10天，别的实在想不起来了，拜托

作者: yonger 时间: 2013-5-4 16:59

你好，我也在做磷酸化蛋白，当初提取蛋白时未加入磷酸酶抑制剂。现在做western blot，目的蛋白分子量为51kda,而扫描结果为一个条带和GAPDH条带位置非常接近，几乎就在一个位置上，没有其他的条带了。可能是什么原因导致的呢？这个明显的条带怎样判定是不是我想要的目的蛋白呢？望高人指点啊

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 17:01

非常感谢楼主！
我又试过用5%、10%、80%、100%的ly294002处理细胞，检测结果还和上次的一样。这是我的细胞处理程序，请帮分析一下哪个环节还有不当之处。
10%FBS血清添加到DMEM培养基中，传代后24小时细胞汇合度达到50-60%，弃去培养基。分别添加浓度为10uM、20uM、50uM的ly294002，培养基用含10%FBS血清的DMEM。在2、12、24h裂解细胞收集蛋白，电泳，并用CST的p-Akt(473)一抗杂交，ECL曝光。

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细胞贴壁后，用ly294002处理时，培养基用无血清的DMEM试一试，另外，ly294002的浓度也不要太高了，用5-10uM应该就可以了。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 17:01

有一问题请赐教，比较啰嗦，急ing,谢谢了
我正在做p-erk的western，细胞裂解并离心取上清加loading buffer煮沸后室温冷却-20冻存（10月1号）。同批样品同样上样量第1次（10-3）7条带都很清楚很好，第2次（10-5）只有两条带显影但明显比第1次弱（这两条带是第1次7条带中最明显的），第3次（10-8）提高了二抗浓度但还是只有那两条带显影，比第2次弱还很多，3次试验呈明显衰减趋势。电泳、转膜、封闭、抗体、显影等步骤没有明显差别，重复性如此之差，lz经验丰富，请赐教， cell lysis自己配的，和您发的配方类似（protein inhibitors，phospotase inhibitor都有），但没加EGTA、脱氧胆酸钠，您说它们是稳定剂而且影响结果很大，会不会是这个原因？冻融只有3次，时间不到10天，别的实在想不起来了，拜托

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1，细胞裂解液中没有加EGTA或EDTA，样品不太稳定，对结果当然有影响。
2，“细胞裂解并离心取上清加loading buffer煮沸后室温冷却-20冻存”，这是不对的，样品煮沸后应该马上冻存。
3，一抗是否保存得好？

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 17:02

你好，我也在做磷酸化蛋白，当初提取蛋白时未加入磷酸酶抑制剂。现在做western blot，目的蛋白分子量为51kda,而扫描结果为一个条带和GAPDH条带位置非常接近，几乎就在一个位置上，没有其他的条带了。可能是什么原因导致的呢？这个明显的条带怎样判定是不是我想要的目的蛋白呢？望高人指点啊

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有很多原因造成这样的结果，最大的可能是：1，样品出问题，2，一抗出问题了。

判断条带是否为目的蛋白，一是通过marker判断条带在相应位置上，二是可用阳性对照对比，三是通过刺激剂或抑制剂处理细胞后，看条带的粗细是否发生相应的改变。

作者: cj_mondy 时间: 2013-5-4 17:02

你好，看到前面有同仁问过：如果没有磷酸化抗体，怎么来检测磷酸化蛋白？回答基本是先IP，后做WB用泛磷酸化抗体去杂。
我现在遇到的问题跟这个类似，但又有些不一样。因为我要检测的是非磷酸化蛋白的变化，只有总抗体，磷酸化与非磷酸化都没有。如果我照上面方法先IP后WB，还是不能直接检测非磷酸化蛋白的变化。请问有什么好的方法吗？

作者: greenbee 时间: 2013-5-4 17:03

各位老师、师哥师姐：
请问有没有人用Western blot做BMP7的，BMP7的分子量到底是多少啊？我现在要检测这个因子，但是相关文献主要为它作为干预因素，检测它的很少；查到的文献里它的分子量也不一样。选择一抗时有没有什么注意的啊？非常感谢！

作者: DNA 时间: 2013-5-4 17:04

楼主，您好！我最近打算做药物对肾脏疾病NF-KB信号通路的干预作用，想用Western Blot测定NF-KB p65活性。但是我在查文献及抗体的时候发现以下几个问题：
1、NF-KB p65存在不存在磷酸化？如果不存在磷酸化为什么抗体公司用磷酸化抗体？
2、一些国外的文献NF-KB p65活性测定采用的是普通的抗体，也有文献采用的是磷酸化的抗体，所以很不理解。园子的朋友说p65活化后入核，所以测核内普通的NF-KB p65活性与测总的NF-KB p65活性意义是一样的，我想知道是不是这样？
3、对于NF-KB p65活性测定，用p-p65抗体时，组织蛋白提取能不能用全蛋白提取试剂盒？还是必须用包浆蛋白或者核蛋白提取试剂盒？
4、对于NF-KB p65活性测定时，内参应该选用actin还是GAPDH？如果用GAPDH做内参影响大吗？
期盼您的答复，谢谢！！

作者: KGZ564 时间: 2013-5-4 17:04

请问，内参在用凯基的BCA试剂盒定量后，为什么总是不齐呢？而且相同上样量每次条带都不一样，不知道哪出问题了？每次上样都尽量不让它溢出来，我的是半干转。谢谢！

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 17:05

你好，看到前面有同仁问过：如果没有磷酸化抗体，怎么来检测磷酸化蛋白？回答基本是先IP，后做WB用泛磷酸化抗体去杂。
我现在遇到的问题跟这个类似，但又有些不一样。因为我要检测的是非磷酸化蛋白的变化，只有总抗体，磷酸化与非磷酸化都没有。如果我照上面方法先IP后WB，还是不能直接检测非磷酸化蛋白的变化。请问有什么好的方法吗？

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目前只能通过IP后WB,通过磷酸化抗体间接判断非磷酸化蛋白。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 17:05

楼主，您好！我最近打算做药物对肾脏疾病NF-KB信号通路的干预作用，想用Western Blot测定NF-KB p65活性。但是我在查文献及抗体的时候发现以下几个问题：
1、NF-KB p65存在不存在磷酸化？如果不存在磷酸化为什么抗体公司用磷酸化抗体？
2、一些国外的文献NF-KB p65活性测定采用的是普通的抗体，也有文献采用的是磷酸化的抗体，所以很不理解。园子的朋友说p65活化后入核，所以测核内普通的NF-KB p65活性与测总的NF-KB p65活性意义是一样的，我想知道是不是这样？
3、对于NF-KB p65活性测定，用p-p65抗体时，组织蛋白提取能不能用全蛋白提取试剂盒？还是必须用包浆蛋白或者核蛋白提取试剂盒？
4、对于NF-KB p65活性测定时，内参应该选用actin还是GAPDH？如果用GAPDH做内参影响大吗？
期盼您的答复，谢谢！！

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1，p65存在磷酸化。
2，理论是这样的。
3，可以用全蛋白提取试剂盒。
4，如果测p65磷酸化，内参选actin或GAPDH都可以；如果测核内p65，内参可选用histone。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 17:10

请问，内参在用凯基的BCA试剂盒定量后，为什么总是不齐呢？而且相同上样量每次条带都不一样，不知道哪出问题了？每次上样都尽量不让它溢出来，我的是半干转。谢谢！

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两个可能：1，可能你定量不太准确，比如标准曲线没做好，蛋白没混均等等；2，加样或跑胶时有点问题，如加样没加好，跑胶时老漏电泳液。

作者: okhaha 时间: 2013-5-4 17:10

1.BCA试剂盒定量时，加了BCA后没有用枪吹打，因为担心吹打容易产生气泡，而且有点费枪头，所以在摇床上摇了2-3分钟左右吧，不知道这样是否会产生影响？
2.加样倒是很小心，应该不会漏的！

谢谢！

作者: okhaha 时间: 2013-5-4 17:11

再补充一下，标准曲线还是挺直的，R2达到0.99以上，不知不用枪头吹打是否会有影响？

作者: yychen 时间: 2013-5-4 17:12

版主您好！我是新手，有太多地方不懂，我先想问下您做过磷酸化的ve-cadherin（血管内皮钙粘蛋白）吗？还有为什么测做总蛋白的表达量？不胜感激！

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 17:13

1.BCA试剂盒定量时，加了BCA后没有用枪吹打，因为担心吹打容易产生气泡，而且有点费枪头，所以在摇床上摇了2-3分钟左右吧，不知道这样是否会产生影响？
2.加样倒是很小心，应该不会漏的！

谢谢！

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1，最好用涡旋振荡器vortex振荡 3-5次
2，你有没有分成几次加样了？最好一个样只加一次。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 17:15

版主您好！我是新手，有太多地方不懂，我先想问下您做过磷酸化的ve-cadherin（血管内皮钙粘蛋白）吗？还有为什么测做总蛋白的表达量？不胜感激！

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我没做过磷酸化的ve-cadherin。测总蛋白表达量，一是作为参照，二是了解磷酸化程度的改变是否因为其蛋白表达量发生了改变，还是因为仅仅是相同蛋白量的磷酸化水平发生改变了。

作者: zwsyrt 时间: 2013-5-4 17:16

1.您上次说最好每个样只加一次，但是一次最多只能加10ul啊！大多数时候加样量都在10ul以上啊？请问您用的是什么加样啊？
2.再请教一下，磷酸化蛋白上样量最好是多少，50ug最优？一抗一定要4度过夜孵吗？
3.有一次跑蛋白电泳时发现泳道条带的宽度不一，是为什么啊？

作者: 8princess8 时间: 2013-5-4 17:16

是的，但是没有做“头对头”比较，只是前后两次，一次用TBST洗，一次用DDW洗，但是前后差异很小，因为实验室是恒温的，而且是同一批样品，做出来的背景DDW洗的更好，所以推荐给大家。

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请问DDW如何配制，谢谢！

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 17:19

1.您上次说最好每个样只加一次，但是一次最多只能加10ul啊！大多数时候加样量都在10ul以上啊？请问您用的是什么加样啊？
2.再请教一下，磷酸化蛋白上样量最好是多少，50ug最优？一抗一定要4度过夜孵吗？
3.有一次跑蛋白电泳时发现泳道条带的宽度不一，是为什么啊？

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1,也有20ul的枪和枪头。我一般加15-20ul.
2,50ug/15ul.磷酸化蛋白抗体最好过夜，当然，许多抗体不过夜也能做出来，只是不保险而已。
3，原因很多，胶没做好，有些孔道加样量太大（或者含有的蛋白量太大）。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 17:21

请问DDW如何配制，谢谢！

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DDW我猜应该就是ddWater,也就是双蒸水。这是我的贴子中的内容吗？我好像不记得了。

作者: viviwang1987 时间: 2013-5-4 17:21

请问楼主，稀释样品的buffer是什么啊？测蛋白时稀释bsa的buffer用什么好？

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 17:22

请问楼主，稀释样品的buffer是什么啊？测蛋白时稀释bsa的buffer用什么好？

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PBS就可以了。

作者: tudou85 时间: 2013-5-4 17:22

最近用ly294002处理2种细胞系，添加浓度为20uM处理2-12小时，wb检测p-Akt的量发现不但没减少，反而增加，很奇怪的！百思不得其解，不知是何原因？用50uM处理时也是这样?请帮忙分析一下。

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你这两株是什么细胞？我建议：
1，你使用常见的一些细胞，比如Hela，NIH3T3之类的做个对照，如果仍然增加，那么多半是你这个药物来源出问题了，总不会把rapamycin当作ly294002来配了。
2，血清饥饿16hr，然后添加抑制剂，半小时后添加血清，然后，1到12hr收几个时间点，检查看看是什么结果。
如果两个实验结果都和你现在观察到的不一致，那么你这两株细胞里观察到的应该是个非常重要的发现（虽然可能性很小），可以马上购买wortmannin看看是否会得出一样的结果。

作者: gogo 时间: 2013-5-4 17:26

请问大侠，
一抗稀释后放-20度，用时又融化，若反复使用一抗的话，就会反复冻融，这会不会影响抗体活性呢？
一抗稀释后放4度，虽无反复冻融的问题，但与-20相比，会加快蛋白的降解，那究竟放4度好还是-20好呢？
谢谢啊

作者: yueban-1147 时间: 2013-5-4 17:27

请问大侠，
一抗稀释后放-20度，用时又融化，若反复使用一抗的话，就会反复冻融，这会不会影响抗体活性呢？
一抗稀释后放4度，虽无反复冻融的问题，但与-20相比，会加快蛋白的降解，那究竟放4度好还是-20好呢？
谢谢啊

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不是大侠，不过尝试回答一下你的问题：
1，不能反复冻融，这样会极大降低抗体活性。可以买来后，小体积分装。
2，一般商业购买的纯化后的抗体，4度不会加快抗体的降解，未纯化的抗体在4度活性会衰减很快，或者由于蛋白酶的污染，或者由于其它成分的干扰。所以会建议在－20度保存，但这一般都会添加50%的甘油以防止反复冻融。如果你的抗体在20度是冻起来的，那么还是小体积分装，然后一旦放在4度了，就不要再冻，直到用完为止。一般这样的抗体4度放一个月，活性不会有太多变化。

作者: PINK 时间: 2013-5-4 17:27

有很多包装，在-20度时也是液体状的，所以我一般不分装。分装有时也会造成效价的下降，因为管壁吸附了一些抗体。

作者: 00无名指00 时间: 2013-5-4 17:28

p_akt条带很淡，怎么办？这次提高了抗体浓度一倍，现在的上样量是24ug。抗体是cst的，对比度拉到最大，才看得到，但是保存图片就会失真。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 17:28

QUOTE:

原帖由 00无名指00 于 2013-5-4 17:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

p_akt条带很淡，怎么办？这次提高了抗体浓度一倍，现在的上样量是24ug。抗体是cst的，对比度拉到最大，才看得到，但是保存图片就会失真。

上样量可以再提高至50ug. 抗体重复用几次了？如何重复次数有点多，可以取抗体原液稀释后试一试。

作者: 00无名指00 时间: 2013-5-4 17:29

QUOTE:

原帖由 箭头儿 于 2013-5-4 17:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

上样量可以再提高至50ug. 抗体重复用几次了？如何重复次数有点多，可以取抗体原液稀释后试一试。

没有重复用，都是第一次。今天暴不出来，我就加大上样量试试。

作者: 00无名指00 时间: 2013-5-4 17:30

今天1-500稀释的，没有条带，不知为啥，我只换成了pierce的ecl，但是另一个磷酸化的蛋白爆出来了，不过条带很淡，总蛋白一半没爆出来，但actin很好，是否考虑转膜出了问题？今天上样量加到40ug，不过电泳条带就看到粘连了，明天曝光看看结果。我使用的是15孔梳子。

作者: 00无名指00 时间: 2013-5-4 17:31

提高了上样量，提高了稀释比，结果actin粘连了，但是磷酸化连条带都没了，泪奔啊

作者: 00无名指00 时间: 2013-5-4 17:31

akt通路不刺激是不是就没有p-akt的条带啊？

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 17:31

今天1-500稀释的，没有条带，不知为啥，我只换成了pierce的ecl，但是另一个磷酸化的蛋白爆出来了，不过条带很淡，总蛋白一半没爆出来，但actin很好，是否考虑转膜出了问题？今天上样量加到40ug，不过电泳条带就看到粘连了，明天曝光看看结果。我使用的是15孔梳子。

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10孔梳会好一些，15孔梳会容易粘连，所以15孔梳做预实验好一些。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 17:32

akt通路不刺激是不是就没有p-akt的条带啊？

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如果不刺激的话p-akt一般会没有条带，即使有，条带也会很淡。你没有做阳性对照吗？

另外，建议做p-akt还是选用10孔梳会好一些。

作者: 00无名指00 时间: 2013-5-4 17:32

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akt通路不刺激是不是就没有p-akt的条带啊？

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如果不刺激的话p-akt一般会没有条带，即使有，条带也会很淡。你没有做阳性对照吗？

另外，建议做p-akt ...

没有做阳性对照，那肯定是没有刺激的原因了

作者: ffooll 时间: 2013-5-4 17:33

大家好，关于做p-akt的疑问请帮忙

封闭用的是BSA+脱脂牛奶+TBST两小时，一抗CST的稀释1:1000（稀释液用加叠氮钠、bsa），曝光后除了目的条带外，上下各有几条特别清楚的条带，比p-akt表达还要清楚，整体的背景倒不是特别深的，这是怎么回事啊
之后碧云天的一抗二抗去除液洗脱后重新封闭、敷抗体做总akt（boster akt1/2，稀释1:300），曝光后出现类似p-akt的多个条带，奇怪啊

作者: 00无名指00 时间: 2013-5-4 17:33

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大家好，关于做p-akt的疑问请帮忙

封闭用的是BSA+脱脂牛奶+TBST两小时，一抗CST的稀释1:1000（稀释液用加叠氮钠、bsa），曝光后除了目的条带外，上下各有几条特别清楚的条带，比p-akt表达还要清楚，整体的背景倒不是特别深的，这是怎 ...

兄弟你用的是cst哪个货号的磷酸化抗体，我用的是9272s可就是出不了条带啊

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 17:34

QUOTE:

注意一下二抗是不是有什么问题？你的材料是组织样品吗？如是，则更要注意了。

作者: tudou85 时间: 2013-5-4 17:34

非常感谢楼主的解答。可能是二抗的问题啊，我是细胞提的蛋白、

我今天重复一次，其他条件不变，一抗稀释液就用bsa和tbst（按照cst的说明没加叠氮钠），但是bsa溶后液体变成淡蓝色，放一会会有不溶的蓝色沉淀，把pvdf膜上也染了蓝色的点点，不知哪里出了问题（bsa过期？tbst配错？都不像，实在想不出），我就用抗体去除液洗了洗后再孵育，不知明天会有什么结果，哎

p-akt一抗封闭和一抗稀释做好用什么啊，

作者: tudou85 时间: 2013-5-4 17:35

兄弟你用的是cst哪个货号的磷酸化抗体，我用的是9272s可就是出不了条带啊

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9661s,我准备换用4085s试试，这几种有什么区别啊

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 17:35

非常感谢楼主的解答。可能是二抗的问题啊，我是细胞提的蛋白、

我今天重复一次，其他条件不变，一抗稀释液就用bsa和tbst（按照cst的说明没加叠氮钠），但是bsa溶后液体变成淡蓝色，放一会会有不溶的蓝色沉淀，把pvdf膜上也染了蓝色的点点，不知哪里出了问题（bsa过期？tbst配错？都不像，实在想不出），我就用抗体去除液洗了洗后再孵育，不知明天会有什么结果，哎

p-akt一抗封闭和一抗稀释做好用什么啊，

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你配的液体变成淡蓝色，这我还是第一次听说，应该是加错什么药品了。BSA变质，那也不会变蓝色的。因为pvdf膜上也染了蓝色的点点，问题比较严重，所以建议你还是找原因再做实验比较好。

封闭一般用含5%non-fat milk的TBST，稀释则用含5%BSA的TBST。

作者: tudou85 时间: 2013-5-4 17:36

你配的液体变成淡蓝色，这我还是第一次听说，应该是加错什么药品了。BSA变质，那也不会变蓝色的。因为pvdf膜上也染了蓝色的点点，问题比较严重，所以建议你还是找原因再做实验比较好。

封闭一般用含5%non-fat milk的TBST，稀释则用含5%BSA的TBST。

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谢谢，我在想是不是bsa被考马斯亮蓝污染啊，因为我染胶的时候台面和手套上都有些蓝色，今天曝光什么都没爆出来

作者: tudou85 时间: 2013-5-4 17:36

谢谢，我在想是不是bsa被考马斯亮蓝污染啊，因为我染胶的时候台面和手套上都有些蓝色，今天曝光什么都没爆出来

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我重新做的没有再出现那种情况，但还是爆出多个条带，有一条和目的条带离的很近，我都判断不出到底哪个是目的条带啦
之前操作从来没有注意整洁、避免污染之类的，看来wb也要注意这些啊

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 17:37

谢谢，我在想是不是bsa被考马斯亮蓝污染啊，因为我染胶的时候台面和手套上都有些蓝色，今天曝光什么都没爆出来，

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肯定是被染料污染了：）不过，这是偶然现象，没有关系的。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 17:37

我重新做的没有再出现那种情况，但还是爆出多个条带，有一条和目的条带离的很近，我都判断不出到底哪个是目的条带啦
之前操作从来没有注意整洁、避免污染之类的，看来wb也要注意这些啊

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你向厂商要一个阳性对照试一试。（你可以要求troubleshooting,一般厂商会免费给阳性对照测试。）

作者: PCR 时间: 2013-5-4 17:38

你好，想咨询一个问题，磷酸化的蛋白能做免疫共沉淀吗？
我们的前期实验发现，对于某细胞株，在刺激物存在的情况下，蛋白A和蛋白B能发生相互作用，并且这种相互作用可能与蛋白B的磷酸化有关，为了验证这一点，因此我们做了刺激后的IP实验，具体是：刺激物刺激细胞后收集蛋白，IP用蛋白A的抗体来拉，免疫共沉淀，然后Western时用蛋白B的磷酸化抗体来检测(在提取蛋白时加入了磷酸酶抑制剂的)，却一直没有得到结果，想请问一下是我们的实验思路有问题吗还是技术上考虑欠妥当，谢谢了哈！

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 17:38

QUOTE:

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你好，想咨询一个问题，磷酸化的蛋白能做免疫共沉淀吗？
我们的前期实验发现，对于某细胞株，在刺激物存在的情况下，蛋白A和蛋白B能发生相互作用，并且这种相互作用可能与蛋白B的磷酸化有关，为了验证这一点，因此我们做了刺激后的IP ...

磷酸化的蛋白当然可以做免疫共沉淀。
但IP要摸条件，如蛋白A的抗体能否拉下蛋白A。IP与WB对抗体的要求还是不一样的。
你用总的蛋白B的抗体试一试？有时，拉下来的蛋白量过少，就不太容易测到磷酸化。

作者: PCR 时间: 2013-5-4 17:39

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磷酸化的蛋白当然可以做免疫共沉淀。
但IP要摸条件，如蛋白A的抗体能否拉下蛋白A。IP与WB对抗体的要求还是不一样的。
你用总的蛋白B的抗体试一试？有时，拉下来的蛋白量过少，就不太容易测到磷酸化。 ...

非常感谢及时的回复。前期实验中已经用总的蛋白B的一抗试过，得到阳性的结果。关于上面的实验，还有些疑问，再咨询一下，谢谢！
我们的实验，是用蛋白A的特异刺激物来刺激细胞株，然后观察蛋白A与蛋白B的结合情况。免疫共沉淀实验中，我们是用蛋白A的一抗来拉，做免疫共沉淀，然后用蛋白B的一抗(非磷酸化抗体)做WB，已经得到明确的阳性结果。因为这种阳性结果(蛋白A与蛋白B的结合)是发生在刺激物刺激细胞15min开始，30min比较明确，2h后开始衰减，因此我们推论可能与蛋白的磷酸化有关。然后我们检测了刺激物刺激细胞后，蛋白B的磷酸化情况，发现其中2个位点在刺激后15min发生磷酸化，30min明显，2h后开始减退，因此又推论刺激后，蛋白A可能是与磷酸化的蛋白B结合，不知这样的想法是否正确？如果我想进一步确认刺激后蛋白A 的确是与磷酸化的蛋白B结合，免疫共沉淀实验中有什么需要特殊注意的地方吗？如何能保证最后的磷酸化检测成功？谢谢！

作者: one 时间: 2013-5-4 17:40

请加下有没有人做PHLPP的？分子量170KD,表达的很少，悬浮细胞，
细胞裂解时候只加磷酸酶抑制剂，不加NaF或者矾酸钠行么？？
先谢了啊

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 17:41

非常感谢及时的回复。前期实验中已经用总的蛋白B的一抗试过，得到阳性的结果。关于上面的实验，还有些疑问，再咨询一下，谢谢！
我们的实验，是用蛋白A的特异刺激物来刺激细胞株，然后观察蛋白A与蛋白B的结合情况。免疫共沉淀实验中，我们是用蛋白A的一抗来拉，做免疫共沉淀，然后用蛋白B的一抗(非磷酸化抗体)做WB，已经得到明确的阳性结果。因为这种阳性结果(蛋白A与蛋白B的结合)是发生在刺激物刺激细胞15min开始，30min比较明确，2h后开始衰减，因此我们推论可能与蛋白的磷酸化有关。然后我们检测了刺激物刺激细胞后，蛋白B的磷酸化情况，发现其中2个位点在刺激后15min发生磷酸化，30min明显，2h后开始减退，因此又推论刺激后，蛋白A可能是与磷酸化的蛋白B结合，不知这样的想法是否正确？如果我想进一步确认刺激后蛋白A 的确是与磷酸化的蛋白B结合，免疫共沉淀实验中有什么需要特殊注意的地方吗？如何能保证最后的磷酸化检测成功？谢谢！

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从你的实验看，蛋白A可以和蛋白B结合。有一种可能是，蛋白A可以和总的蛋白B结合（然后可能促进蛋白B的磷酸化），不管蛋白B是否磷酸化，那么磷酸化蛋白B在IP后只有极少的一部分，自然就可能测不出来了。

作者: JK.jon 时间: 2013-5-4 17:42

请问前辈：
1、转膜采用300mA恒流，那么和蛋白分子量的关系如何。采用多长时间？100KD一下、20KD一下、100KD以上应该用多长时间？
前辈能给一些经验吗？或者规律。也盼望其它战友能给一些经验。
2、另外，转移液中加SDS吗？看蛋白免疫印记手册上说小蛋白(100KD一下)转膜，不要加SDS，说妨碍蛋白和膜结合，大蛋白(100KD以上)需要SDS(0.1%),但甲醇量要低，10%以下。是吗？前辈。
3、还有就是还想重复一下我前面的问题：我在培养细胞的总蛋白裂解后，最后14000rpm，10min离心取上清时，发现上清液面有白色悬浮物，粘稠，Bradford蛋白定量的时候孔下面有蓝色沉淀。这是DNA，还是蛋白？后续的WB实验需要吗？如果想避免或者去除，有什么办法？
一下子问了前辈好多问题，真的很对不起！由于问题多，问了很多人都得不到确切的答案。淤在心里特别不是滋味。所以再次恳求前辈指点。
我在上海华理，有空前辈过来玩。

作者: JK.jon 时间: 2013-5-4 17:42

最进开始做γ-H2AX ser139磷酸化的检测和ser-15 p53的检测。采用的是bioworld公司的抗体。封闭和抗体稀释液都是5%的脱脂奶粉，采用NBT-BCIP底物显色，上样80ug。不是ECL化学发光。结果发现膜上面很脏。很多蓝色的点状，向下雨冲刷过的(一会把图发上来)。同时一起电泳，actin的哪一张膜跑的挺干净的。用前辈的话说可能是一抗不好！不过还有其他的原因吗？麻烦前辈指点！
另外，这两天在论坛上浏览了前辈发起的所有的磷酸化蛋白WB实验的帖子，受益甚丰！在次有几个笨拙一直未解的问题，期望前辈指点。
1、我在培养细胞的总蛋白裂解后，最后14000rpm，10min离心取上清时，发现上清液面有白色悬浮物，粘稠，师姐说是DNA，说可要可不要。但不知道怎样去除。Bradford蛋白定量的时候孔下面有蓝色沉淀。
2、在前辈发起的讨论中发现有战友说磷酸化抗体要用5%BSA封闭、抗体稀释。说“磷酸化抗体当然不能使用脱脂奶，因为脱脂奶含磷酸化蛋白丰富，是奶中磷元素的来源之一”。是吗？前辈，是不是一定要用5%BSA封闭，稀释。
3、如果采用5%脱脂奶封闭、稀释一抗、二抗。那么请问前辈，封闭之后需要在用TBST洗吗？可以直接孵育一抗吗？5%脱脂奶封闭，5%BSA稀释一抗呢？
4、转膜问题：看到战友的帖子上有用100V恒压转、250mA、300mA和350mA恒流转膜的，情况都不一样。所以请问前辈，转膜应该采用多大电压、电流转。有规律吗？我们实验室都是采用300mA恒流转膜、时间是蛋白分子量*1.5（min），这样对吗？

作者: viviwang1987 时间: 2013-5-4 17:43

请教：组织或细胞蛋白提取时，添加的磷酸酶抑制剂哪家公司的比较好？如果加入了PMSF，还需要再添加cocktail蛋白酶抑制剂么？

作者: junhun 时间: 2013-5-4 17:43

回答：
从你上传的图来看，最大的可能是你的一抗有问题，而且从出厂就有问题了。你可以再重复一两次，排除一下你操作的问题，如果问题依然存在，那么就要考虑换抗体了。
再回答你其它的问题：
1，上清液面有白色悬浮物是正常的，可能是一些破碎的膜脂类聚在一起形成的，可要可不要，不会影响结果，所以不需要去除。而Bradford蛋白定量的时候孔下面有蓝色沉淀也是正常的，混均就好，它好像是kit中的G250，与前半个问题无关。
2，封闭用5%脱脂牛奶就好，虽然脱脂奶含磷酸化蛋白丰富，但比例极少，即使内含有磷酸化目的蛋白，其含量也少到可以忽略不计，所以封闭没必要用5%BSA。而一抗是否要用5%BSA稀释，则最好按照厂商的说明，这与厂商当初提取、浓缩、保存抗体所用的溶液有关。
3，5%脱脂奶封闭，如果5%BSA稀释一抗，则封闭后用TBST洗一次会比较好；如果5%脱脂奶稀释一抗，则封闭后可洗可不洗。
4，转膜时的条件因为各实验室的电泳仪和转膜仪不一样，所以大家可能要微调。可以电流恒流300mA，电压调最大（此时电压也就在80-120v左右）。时间大家也要根据经验调整一下，一般1.5--2.5小时，但不是绝对的。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 17:44

请问前辈：
1、转膜采用300mA恒流，那么和蛋白分子量的关系如何。采用多长时间？100KD一下、20KD一下、100KD以上应该用多长时间？
前辈能给一些经验吗？或者规律。也盼望其它战友能给一些经验。
2、另外，转移液中加SDS吗？看蛋白免疫印记手册上说小蛋白(100KD一下)转膜，不要加SDS，说妨碍蛋白和膜结合，大蛋白(100KD以上)需要SDS(0.1%),但甲醇量要低，10%以下。是吗？前辈。
3、还有就是还想重复一下我前面的问题：我在培养细胞的总蛋白裂解后，最后14000rpm，10min离心取上清时，发现上清液面有白色悬浮物，粘稠，Bradford蛋白定量的时候孔下面有蓝色沉淀。这是DNA，还是蛋白？后续的WB实验需要吗？如果想避免或者去除，有什么办法？
一下子问了前辈好多问题，真的很对不起！由于问题多，问了很多人都得不到确切的答案。淤在心里特别不是滋味。所以再次恳求前辈指点。
我在上海华理，有空前辈过来玩。

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回答：
1，没有很好的关系式，只能说，分子量大的时间需要久一点，反之时间短一点。
2，我没有在转移液中加过SDS.
3，见我回答你的上一个贴子。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 17:44

请教：组织或细胞蛋白提取时，添加的磷酸酶抑制剂哪家公司的比较好？如果加入了PMSF，还需要再添加cocktail蛋白酶抑制剂么？

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磷酸酶抑制剂，我是自己配的，见我的相关贴子。加了PMSF后，最好还要加其它的蛋白酶抑制剂。

作者: mimili_901 时间: 2013-5-4 17:44

做WB之前用紫光分光光度计做蛋白定量，结果260/280的值为负值是什么原因呀，今天测得一批竟然出现2.73这样的值，不知道怎么解释，请楼主帮忙想想。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 17:45

QUOTE:

原帖由 mimili_901 于 2013-5-4 17:44 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
做WB之前用紫光分光光度计做蛋白定量，结果260/280的值为负值是什么原因呀，今天测得一批竟然出现2.73这样的值，不知道怎么解释，请楼主帮忙想想。

你是测蛋白还是测DNA呀？

作者: kuaizige 时间: 2013-5-4 17:46

课题实验中需要做到磷酸化蛋白的分析，但是我是个新手，有些问题想请问llllcjchina前辈。

我的课题是验证某病毒感染细胞可能激活某个通路，该通路磷酸化并诱导波形蛋白重排，通过文献得知该通路为丝氨酸/苏氨酸位点磷酸化，且能特异性磷酸化波形蛋白的ser71位点，实验设计为用Western blot的方法检测病毒感染后0、4、8、12、24、48h的磷酸化波形蛋白含量，有以下几个问题求助：
1.磷酸化抗体的选择是使用抗波形蛋白的丝氨酸/苏氨酸磷酸化抗体呢，还是使用抗波形蛋白的磷酸化ser71位点的抗体？
2.用WB检测不同时相点磷酸化蛋白含量变化这样的设计是否有可行性？因为担心WB的条带不能起到很好的量化标志。
3.测定不同时相点的WB除使用常规内参外，是否需要有抗波形蛋白总蛋白的参考，因为我觉得测定的是样品在不同时间点的情况，总蛋白量应该是不变的。

谢谢前辈！！

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 17:46

QUOTE:

原帖由 kuaizige 于 2013-5-4 17:46 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

课题实验中需要做到磷酸化蛋白的分析，但是我是个新手，有些问题想请问llllcjchina前辈。

我的课题是验证某病毒感染细胞可能激活某个通路，该通路磷酸化并诱导波形蛋白重排，通过文献得知该通路为丝氨酸/苏氨酸位点磷酸化， ...

回答：
1，抗波形蛋白的磷酸化ser71位点的抗体。
2，还要在0-4小时的时间多设计几点时间点，因为蛋白磷酸化的反应时间一般都时间较短。
3，最好要有抗波形蛋白总蛋白的参考，一是通过实验明确总蛋白量真的没变化，二也是为了排除你自己实验操作造成的误差。

作者: kuaizige 时间: 2013-5-4 17:47

QUOTE:

原帖由 箭头儿 于 2013-5-4 17:46 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

回答：
1，抗波形蛋白的磷酸化ser71位点的抗体。
2，还要在0-4小时的时间多设计几点时间点，因为蛋白磷酸化的反应时间一般都时间较短。
3，最好要有抗波形蛋白总蛋白的参考，一是通过实验明确总蛋白量真的没变化，二也是为了排除 ...

非常感谢您的回答，另外我想问问现在一般的商业化抗体有没有那种能检测出一个蛋白在所有丝氨酸/苏氨酸位点发生磷酸化的抗体,还是都是针对具体位点的，因为我在网上查找抗体目录没有找到这种抗体。
我研究的通路对这个蛋白文献报道有两个磷酸化位点ser38和ser71，但是ser38也能被其他通路磷酸化，而ser71是特异性被研究的这个通路磷酸化，如果实验设计只使用ser71，实验结果是否具有说服力？

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 17:47

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非常感谢您的回答，另外我想问问现在一般的商业化抗体有没有那种能检测出一个蛋白在所有丝氨酸/苏氨酸位点发生磷酸化的抗体,还是都是针对具体位点的，因为我在网上查找抗体目录没有找到这种抗体。
我研究的通路对这个 ...

1，我记得某些公司有丝氨酸/苏氨酸位点磷酸化抗体，或者只对丝氨酸磷酸化抗体（只对苏氨酸磷酸化抗体），你再找找。时间过得有点久，我记不清哪家公司了。
2，你只是做这个蛋白活化的情况的话，针对ser71的磷酸化抗体就可以说明问题了。

作者: 8princess8 时间: 2013-5-4 17:47

楼主你好，用wesetern检测用药物干预细胞后引起的NF-kb信号激活情况，我们采用IKKb,IKKa,以及P-IKKa/b三种抗体，请问一般来说时间浓度多久？2h？你经常见到的是多少呢？

谢谢

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 17:48

我记得我做p-IKalpha用的时间是0.5hr-2hr，你最好自己摸索一下最优的时间点。

作者: 8princess8 时间: 2013-5-4 17:48

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我记得我做p-IKalpha用的时间是0.5hr-2hr，你最好自己摸索一下最优的时间点。

谢谢楼主，我今天结果出来了，是105分钟，很明显。
再请问如果想用WB测NF-kb通路的改变情况，你觉得用IIK系列抗体呢还是IK，甚至P65?不过我觉得NF-kb家族有5个成员，仅仅P65不是很严谨，但见过用IK的辅以免疫荧光测P65进入核内的照片来说明的。楼主觉得测哪个指标较好呢？
我们的WB技术是看着你的帖子一路成长的，真的很谢谢你。
ps：帮忙推荐一下公司吧，我们的MAPK抗体都是cst的，效果很好，不知道NF-kb怎么样，我见到文献中cst和santa 都挺多，也有磷酸化的用cst，然后总抗体用santa的，莫非老外也要省钱?

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 17:49

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谢谢楼主，我今天结果出来了，是105分钟，很明显。
再请问如果想用WB测NF-kb通路的改变情况，你觉得用IIK系列抗体呢还是IK，甚至P65?不过我觉得NF-kb家族有5个成员，仅仅P65不是很严谨，但见过用IK的辅以免疫荧光测P65进入核内的 ...

最好有p65入核的数据，比较直观，再辅以别的数据。
我的也是磷酸化的用cst，总抗体用santa的，原因是以前实验室的人是这样做的，而且结果能出来，所以就不想改条件了。

作者: 8princess8 时间: 2013-5-4 17:51

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最好有p65入核的数据，比较直观，再辅以别的数据。
我的也是磷酸化的用cst，总抗体用santa的，原因是以前实验室的人是这样做的，而且结果能出来，所以就不想改条件了。 ...

楼主你好，我发现用药物干预后，提取全细胞裂解液进行wb,（顺序：P-IKK，IKKa，IKKb,gapdh），发现P-IKK较空白对照组升高，这说明我的药物作用是抑制还是激活NF-kb？
我的理解是IKK磷酸化水平增高，会导致IK激活，继而释放NF-kb因子入核，激活特定基因表达，所以结论是：药物激活NF-kb通路。

初次接触NF-kb，尽管看了些文献，但总是想向你请教一下。麻烦了啊。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 18:14

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原帖由 8princess8 于 2013-5-4 17:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼主你好，我发现用药物干预后，提取全细胞裂解液进行wb,（顺序：P-IKK，IKKa，IKKb,gapdh），发现P-IKK较空白对照组升高，这说明我的药物作用是抑制还是激活NF-kb？
我的理解是IKK磷酸化水平增高，会导致IK激活，继而释放NF-kb因子入核，激 ...

IKK活化（磷酸化）后使IkappaB磷酸化，从而使IkappaB从NF-kappaB上脱离，这样可使得NF-kappaB激活入核，活化某些基因。
另一方面，根据一些新的报道，IKK磷酸化后也可以自己入核，则会抑制另外一些基因的表达。

作者: 8princess8 时间: 2013-5-4 18:15

IKK活化（磷酸化）后使IkappaB磷酸化，从而使IkappaB从NF-kappaB上脱离，这样可使得NF-kappaB激活入核，活化某些基因。
另一方面，根据一些新的报道，IKK磷酸化后也可以自己入核，则会抑制另外一些基因的表达。

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楼主，麻烦再问一下你有没有专门提取细胞核蛋白和细胞浆蛋白的配方，ps：你的全细胞提取lysis配方很好用。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 18:16

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IKK活化（磷酸化）后使IkappaB磷酸化，从而使IkappaB从NF-kappaB上脱离，这样可使得NF-kappaB激活入核，活化某些基因。
另一方面，根据一些新的报道，IKK磷酸化后也可以自己入核，则会抑制另外一些基因的表达。

=================== ...

这个我是买公司的，按厂商的protocol做。

作者: orangecake 时间: 2013-5-4 18:16

看了以上的分享受益匪浅。我最近在做pERK的WB，以前做出的都是两组条带，即P42/44KD的蛋白，但最近做出来的都是一组条带。一直用3%BSA封闭2h，3%BSA稀释一抗，4度过夜；二抗3%BSA稀释，室温50min。与之前不同的是上样量增加了一点，后来一抗和二抗浓度也增加了，但还是一组条带，有时甚至是白片子。
搞不懂怎么回事，想请教一下。谢谢！

作者: newway 时间: 2013-5-4 18:16

拿到手一个新的抗体对一抗的浓度没有把握，请教楼主一般我们在确定一抗浓度前需要做怎样的操作呢？由于抗体和样本量都不多，迟迟不敢下手，请楼主明示。

我看了帖子里的一些说法但感觉不够详细，万望多多指教。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 18:17

楼主，您好！！我最近在做肾组织磷酸化NF-KB和磷酸化P-38的蛋白表达，用的是CST公司的抗体，提取的是组织全蛋白（未用核蛋白提取试剂盒），100ug未见条带，上样200ug时，压片15min后，曝光发现条带位置不对。说明书上NF-KB的位置在65KD，而我做出来在55KD左右；说明书上说P38为43KD，但是提供的图片其位置在40KD左右，而我做出来位置在35KD左右。想请教楼主是什么原因？
谢谢！！

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1，“上样200ug时，压片15min“，压片时间过久容易导致非特异性条带出现，所以不排除你所做的条带是非特异性条带。2，也可能是不同组织或细胞的目的蛋白的条带略有差别。你可看一看药物作用后条带是否有变化，有变化的可能是目的条带，没变化的则往往是百特异性条带（注：这只是一般情况下这样判定，并不完全准确）。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 18:17

看了以上的分享受益匪浅。我最近在做pERK的WB，以前做出的都是两组条带，即P42/44KD的蛋白，但最近做出来的都是一组条带。一直用3%BSA封闭2h，3%BSA稀释一抗，4度过夜；二抗3%BSA稀释，室温50min。与之前不同的是上样量增加了一点，后来一抗和二抗浓度也增加了，但还是一组条带，有时甚至是白片子。
搞不懂怎么回事，想请教一下。谢谢！

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如果所做的细胞相同的话，最大的可能是一抗的效价有所下降。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 18:18

拿到手一个新的抗体对一抗的浓度没有把握，请教楼主一般我们在确定一抗浓度前需要做怎样的操作呢？由于抗体和样本量都不多，迟迟不敢下手，请楼主明示。

我看了帖子里的一些说法但感觉不够详细，万望多多指教。

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我没办法给一个具体的答案。
我只能说：在保证一抗稀释后的量达到最低要求的情况下，尽可能地让一抗浓度高一些。

作者: 8princess8 时间: 2013-5-4 18:18

楼主请问你测NF-KB的时候（WB），血清饥饿吗多久？

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 18:19

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原帖由 8princess8 于 2013-5-4 18:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼主请问你测NF-KB的时候（WB），血清饥饿吗多久？

我有的实验没有，有的实验serum starvation 12hr。

作者: 8princess8 时间: 2013-5-4 18:19

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原帖由 箭头儿 于 2013-5-4 18:19 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我有的实验没有，有的实验serum starvation 12hr。

如果测化合物的呢？我见到的文献都不写血清饥饿，但是测ERK的时候我们常规采用血清饥饿的，可文献同样不写，是不是在测定信号蛋白时关于血清饥饿的情况都默认自己摸索，不需要在文献中说明？谢谢啊

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 18:19

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原帖由 8princess8 于 2013-5-4 18:19 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

如果测化合物的呢？我见到的文献都不写血清饥饿，但是测ERK的时候我们常规采用血清饥饿的，可文献同样不写，是不是在测定信号蛋白时关于血清饥饿的情况都默认自己摸索，不需要在文献中说明？谢谢啊 ...

现在很多文献中都不写，所以我一般自己两种情况都初步做一下，再选一个自己感觉效果好而且方便处理的。
另外，因为实验延续性的原因，最好一个实验室内，要保持实验条件的稳定。

作者: orangecake 时间: 2013-5-4 18:20

楼主你好，我最近在做磷酸化的MLC,一直未出结果，老板叫我尝试下用尿素甘油凝胶电泳，但实验室以前都没人做过，不知楼主可有经验传授一下，不胜感激

作者: PCR 时间: 2013-5-4 18:20

图片由下往上分别是内参GAPDH、磷酸化目的蛋白（分子量92kDa左右）、总目的蛋白；左侧是8%分离胶，右边是10%分离胶，两张膜孵育的抗体、条件基本一样。
我是采用楼主的protocol，先孵育磷酸化蛋白然后洗脱掉再孵育总蛋白的，结果发现有两个问题：
1、8%胶的磷酸化蛋白两侧marker也会显影，而10%胶却很干净，一抗跟marker蛋白结合好像说不通。
2、总目的蛋白爆出n条带，而跟磷酸化蛋白相比，我怀疑最黑的那条可能还不是目的蛋白。因为磷酸化蛋白条带的背景是往上走，而总蛋白的杂带是往下走，两者的分子量不太一致。总蛋白的一抗是CST的兔单克隆抗体，说明书建议用5%脱脂奶粉稀释，1：1000，封闭我用的也是5%脱脂奶粉。是不是一抗浓度应该降低？

求高手解答，谢谢！

图片附件: 67753740.snap.jpg (2013-5-4 18:20, 19.96 KB) / 该附件被下载次数 22
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16046

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 18:21

QUOTE:

原帖由 PCR 于 2013-5-4 18:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

图片由下往上分别是内参GAPDH、磷酸化目的蛋白（分子量92kDa左右）、总目的蛋白；左侧是8%分离胶，右边是10%分离胶，两张膜孵育的抗体、条件基本一样。
我是采用楼主的protocol，先孵育磷酸化蛋白然后洗脱掉再孵育总蛋白的，结果 ...

回答：
1，可能是marker位置有凹痕，使得ECL在那有残留造成的，不用担心。
2，建议你分别跑胶，再分别做磷酸化蛋白和总蛋白，看看它们的条带是否在一个位置。先不考虑strip了。我担心总蛋白的一抗效价下降了，所以条带不太能压片压得出来。或者增加总蛋白一抗的浓度试一试，而不是降低浓度。

作者: 131415 时间: 2013-5-4 18:21

感谢楼主，受益匪浅啊，想请问楼主，我做P-P38，用的cell signaling的，一抗稀释液用的是说明书上5% w/v BSA, 1X TBS,0.1% Tween-20，平时实验室用的是0.05%的TBST，可以用这个配吗？或者用0.1%的TBST配，洗膜时也用0.1%的洗？谢谢楼主的回答。

作者: junjie05 时间: 2013-5-4 18:22

您好，对于你的义举十分感谢。我现在在做r-H2AX的western，我是用依托泊苷孵育细胞1个小时诱导的，跑SDS-PAGE 染色依稀看到有这个蛋白。但做western的时候就没看到，我的操作如下，不知道哪里出错了

1.药物孵育细胞1h,37度

2.收集细胞，用PBS洗，冻存在-80度

3.细胞裂解，冰上，加1mM PMSF

4.加5X loading buffer,95度5min变性，4度保存

5.SDS-PAGE，先70V*30min，后120V*50min

6.划出92kd-36kd的和25kd-10kd的胶（分别是β-actin和r-H2AX），浸泡在半干转移缓冲液里

7.转膜，半干转移，25V*30min

8，5%脱脂奶粉37 度封闭1h，TBST洗

9. 一抗加TBST孵育过夜，4度(CST抗体)

10.TBST洗3次

10.孵二抗，室温2h

11.显影，ECL发光，压片10min。

β-actin做出来了，而且都很漂亮，但奇怪的是我做了9个，但出来就只有8个，做了两次都这样子

而r-H2AX曾经在低药物浓度下做过出来，但很淡很淡，不仔细都看不出来，而这次连影子都没。

不知道我的操作哪里有问题呢？望回复。

作者: kuohao17 时间: 2013-5-4 18:22

楼主

我一般是，用细胞裂解液+PMSF提取蛋白，4度15-20分钟，然后离心，吸取上清，4度保存。再做电泳和后面的WB。样品在5倍的上扬缓冲液煮沸10分钟。

我每次都把bata内参和一抗一起孵育，结果内参每次有条带，就是一直做不出目的条带。用的是5%的脱脂奶粉封闭，一抗4度过夜，DAB显色。

请指教，谢谢

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 18:22

感谢楼主，受益匪浅啊，想请问楼主，我做P-P38，用的cell signaling的，一抗稀释液用的是说明书上5% w/v BSA, 1X TBS,0.1% Tween-20，平时实验室用的是0.05%的TBST，可以用这个配吗？或者用0.1%的TBST配，洗膜时也用0.1%的洗？谢谢楼主的回答。

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就用你们平时用的TBST，然后加入5%BSA即可.

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 18:23

您好，对于你的义举十分感谢。我现在在做r-H2AX的western，我是用依托泊苷孵育细胞1个小时诱导的，跑SDS-PAGE 染色依稀看到有这个蛋白。但做western的时候就没看到，我的操作如下，不知道哪里出错了

1.药物孵育细胞1h,37度

2.收集细胞，用PBS洗，冻存在-80度

3.细胞裂解，冰上，加1mM PMSF

4.加5X loading buffer,95度5min变性，4度保存

5.SDS-PAGE，先70V*30min，后120V*50min

6.划出92kd-36kd的和25kd-10kd的胶（分别是β-actin和r-H2AX），浸泡在半干转移缓冲液里

7.转膜，半干转移，25V*30min

8，5%脱脂奶粉37 度封闭1h，TBST洗

9. 一抗加TBST孵育过夜，4度(CST抗体)

10.TBST洗3次

10.孵二抗，室温2h

11.显影，ECL发光，压片10min。

β-actin做出来了，而且都很漂亮，但奇怪的是我做了9个，但出来就只有8个，做了两次都这样子

而r-H2AX曾经在低药物浓度下做过出来，但很淡很淡，不仔细都看不出来，而这次连影子都没。

不知道我的操作哪里有问题呢？望回复。

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收集细胞后最好马上裂解提取蛋白，然后保存。95度5min变性后，如果不是马上跑胶，最好-80度保存。β-actin能做出来，这是最基本的，并不代表r-H2AX能做出来。r-H2AX一抗的浓度最好一倍以上。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-4 18:23

楼主

我一般是，用细胞裂解液+PMSF提取蛋白，4度15-20分钟，然后离心，吸取上清，4度保存。再做电泳和后面的WB。样品在5倍的上扬缓冲液煮沸10分钟。

我每次都把bata内参和一抗一起孵育，结果内参每次有条带，就是一直做不出目的条带。用的是5%的脱脂奶粉封闭，一抗4度过夜，DAB显色。

请指教，谢谢

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这个原因有很多，一般情况下，你的目的蛋白不象内参一样量大，所以有些目的蛋白本身就不容易做成功。除了你本人可能的操作出现问题以外，最大的可能是你的目的蛋白一抗浓度过低或质量不好。

作者: yjf1026 时间: 2013-5-4 18:24

收集细胞后最好马上裂解提取蛋白，然后保存。95度5min变性后，如果不是马上跑胶，最好-80度保存。β-actin能做出来，这是最基本的，并不代表r-H2AX能做出来。r-H2AX一抗的浓度最好一倍以上。

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我现在是1000:1稀释的，难道要500:1稀释？

作者: mamamiya 时间: 2013-5-6 15:00

您好！我想问一个问题，用一个细胞因子刺激肿瘤细胞，检测NF-KB 的总蛋白和磷酸化蛋白，用WB做

一般刺激多长时间呀然后是不是要裂解离心取上清呀检测这两个用的一抗是不是不易样呀

作者: 8s5g 时间: 2013-5-6 15:00

想问下楼主们，我是做的指标是P44 42（MAPK），一抗买的是碧云天代理的进口分装抗体，一抗浓度1:1000 ，二抗1:2000 转膜45分钟，marker很清晰，牛奶封闭2小时，洗膜三次，每次15分钟，一抗孵育过夜，洗膜三次，每次15分钟，二抗 1小时，洗膜三次，每次15分钟，内参tublin 一抗1:3000，二抗1:2000，和目的一起孵育，软件曝光，内参条带满意，没有背景，但是目的有一张膜比较满意，有两条条带分别是42和44kd，也没有背景，但是另外同样一张膜，内参满意，但是目的的话，在43KD处有一条很粗的条带，在42和44kd处有模糊的影子，后来以为跑胶的时候没分开，就把分离胶浓度从10%改成8%，最后的结果还是和以前一样。同仁们解救一下，谢谢了。

作者: dog002 时间: 2013-5-6 15:05

我提取蛋白后，立即和5倍的上样缓冲液煮沸，然后保存在4°，对实验结果的影响大不？最多可以保存几天？

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-6 15:06

我现在是1000:1稀释的，难道要500:1稀释？

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如果抗体的质量不好，可能需要500:1稀释，甚至更高稀释。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-6 15:34

我提取蛋白后，立即和5倍的上样缓冲液煮沸，然后保存在4°，对实验结果的影响大不？最多可以保存几天？

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应该-80度保存，至少要-20度保存。在保存在4°，对实验结果的影响很大，尤其对磷酸化蛋白。至于保存几天，这个不好说。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-6 15:34

想问下楼主们，我是做的指标是P44 42（MAPK），一抗买的是碧云天代理的进口分装抗体，一抗浓度1:1000 ，二抗1:2000 转膜45分钟，marker很清晰，牛奶封闭2小时，洗膜三次，每次15分钟，一抗孵育过夜，洗膜三次，每次15分钟，二抗 1小时，洗膜三次，每次15分钟，内参tublin 一抗1:3000，二抗1:2000，和目的一起孵育，软件曝光，内参条带满意，没有背景，但是目的有一张膜比较满意，有两条条带分别是42和44kd，也没有背景，但是另外同样一张膜，内参满意，但是目的的话，在43KD处有一条很粗的条带，在42和44kd处有模糊的影子，后来以为跑胶的时候没分开，就把分离胶浓度从10%改成8%，最后的结果还是和以前一样。同仁们解救一下，谢谢了。

====================================================

不知是否内参的抗体影响的？建议不要与内参一起孵育试一试。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-6 15:34

您好！我想问一个问题，用一个细胞因子刺激肿瘤细胞，检测NF-KB 的总蛋白和磷酸化蛋白，用WB做

一般刺激多长时间呀然后是不是要裂解离心取上清呀检测这两个用的一抗是不是不易样呀

======================================================

时间在几小时之内。NF-KB 的总蛋白和磷酸化蛋白的一抗是不一样的。

作者: dog002 时间: 2013-5-6 15:35

不知是否内参的抗体影响的？建议不要与内参一起孵育试一试。

===============================

我也试过单独孵育的，结果还是一样。

作者: dog002 时间: 2013-5-6 15:36

1，细胞裂解液中没有加EGTA或EDTA，样品不太稳定，对结果当然有影响。
2，“细胞裂解并离心取上清加loading buffer煮沸后室温冷却-20冻存”，这是不对的，样品煮沸后应该马上冻存。
3，一抗是否保存得好？

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做磷酸的蛋白提取时一定要加EGTA或EDTA，那提取蛋白RIPA 和PMSF 与EGTA或EDTA 的比例是多少？还有加磷酸酶抑制剂吗？

作者: dog002 时间: 2013-5-6 15:36

没错。若您要比较单独的p-ERK1或p-ERK2的磷酸化，最好买它们的专一抗体做实验来比较。

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敢问同仁，你的P-ERK1和p-ERK2 做出来了，条件是怎么样的？你有加入磷酸酶抑制剂吗，不是说碧云天的PMSF中已经有磷酸化酶抑制剂了吗？，我也做两个指标，虽然每次都有条带，可是我的44 KD和42KD 大多数时间是分不开的，有时候在44 和42 中间可见一较粗的条带，你用的分离胶是多少的，我用的是10%。谢谢指教。

作者: caihong 时间: 2013-5-6 15:37

日本有一个公司卖专门的磷酸化蛋白试剂盒，可以将磷酸化和非磷酸化的蛋白分开，好像里面有Mn离子，忘记具体是哪个公司，可以在谷歌上搜一下

作者: mickeylin 时间: 2013-5-6 15:37

楼主你好，请问bio-world的抗体怎么样？测凋亡系列的 cas3,8,9，和cyto c，bid。感觉和cst的差远了。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-6 15:38

楼主你好，请问bio-world的抗体怎么样？测凋亡系列的 cas3,8,9，和cyto c，bid。感觉和cst的差远了。

============================================

我没用过bio-world的抗体，希望了解的同仁帮助解答。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-6 15:41

敢问同仁，你的P-ERK1和p-ERK2 做出来了，条件是怎么样的？你有加入磷酸酶抑制剂吗，不是说碧云天的PMSF中已经有磷酸化酶抑制剂了吗？，我也做两个指标，虽然每次都有条带，可是我的44 KD和42KD 大多数时间是分不开的，有时候在44 和42 中间可见一较粗的条带，你用的分离胶是多少的，我用的是10%。谢谢指教。

=================================================================

我用的是自己配的裂解液，内含磷酸酶抑制剂。分离胶10%和12%都用过，都可以。

我也不知您在44 和42 中间那条粗条带是什么。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-6 15:41

做磷酸的蛋白提取时一定要加EGTA或EDTA，那提取蛋白RIPA 和PMSF 与EGTA或EDTA 的比例是多少？还有加磷酸酶抑制剂吗？

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我的细胞裂解液都是自己配制的，配方见我的以下贴子的第一页的附件：

cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=68&id=11443307&sty=1&tpg=1&age=0')

内含磷酸酶抑制剂。

作者: mickeylin 时间: 2013-5-6 15:41

我没用过bio-world的抗体，希望了解的同仁帮助解答。

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那请问楼主你测凋亡吗如果测得话，用的什么牌子的？推荐一下吧

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-6 15:42

那请问楼主你测凋亡吗如果测得话，用的什么牌子的？推荐一下吧

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我用Annexin V-FITC在流式上做的。

作者: 8princess8 时间: 2013-5-6 15:42

做了p-jnk有半年了总是没结果真是太郁闷

作者: mickeylin 时间: 2013-5-6 15:44

请问楼主，做凋亡系列wb时，必须要显出凋亡的断裂带吗？主带可见明显减少，但因为抗体因素没有显出尾巴后面的断裂带

作者: rxcc33 时间: 2013-5-6 15:45

正式做磷酸化western之前，有幸学习了此贴的内容，现在实验已经有了初步结果，非常感谢楼主的无私奉献~！

最近在做western的时候遇到一个现象，我的内参和磷酸化蛋白都是把膜剪开分开孵育抗体，然后进行曝光的，在曝光的时候，我先加ECL（皮尔斯公司）到目的蛋白膜上，而内参的膜泡在最后洗膜的TBST中，在暗室中目的蛋白肉眼可见明显绿色荧光，目的蛋白压片之后再压内参（中间间隔约20min），结果内参就出不了条带，压片5min，10min，30min、过夜都没条带。当晚对二抗与ECL孵育进行检验，没有问题。第二天对这两张膜进行strip，重新封闭，孵抗体，步骤基本和前一天一致，结果进暗室先压内参，条带肉眼可见荧光，效果不错，而一旁泡在TBST中的目的蛋白压片时就做不出来了。是不是我曝光一张膜时，把另外一张泡在TBST里（一般10-20min）对结果有影响？？因为之前的实验中发现内参一般很亮，而目的条带就要弱一些，在暗盒一起曝光的话不好控制时间，就用了这种分开曝光的方式，不知道楼主和各位战友有什么好的建议，谢谢~！！

作者: mickeylin 时间: 2013-5-6 15:49

非常感谢楼主的无私奉献，请问个问题，钒酸钠活化时的浓度是200 nM，但你的储存液中的浓度是1 M。请问如何处理这个问题？

作者: langlang 时间: 2013-5-6 15:49

请教楼主一个问题，我现在做AKT蛋白，分子量62，什么转膜条件比较合适叻，按照我们实验室以前的条件150mA,2小时，总觉得marker很淡，而滤纸上有像有点颜色了，是不是转过了，但是在同一个转膜夹子内的100分子量的蛋白条带marker就很清楚，请教请教高人

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-6 15:50

请教楼主一个问题，我现在做AKT蛋白，分子量62，什么转膜条件比较合适叻，按照我们实验室以前的条件150mA,2小时，总觉得marker很淡，而滤纸上有像有点颜色了，是不是转过了，但是在同一个转膜夹子内的100分子量的蛋白条带marker就很清楚，请教请教高人

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转膜有点过了。我发现各个实验室的转膜条件会差别很大，所以你要把电流或转膜时间调小一些，自己找到最适合的条件。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-6 15:54

非常感谢楼主的无私奉献，请问个问题，钒酸钠活化时的浓度是200 nM，但你的储存液中的浓度是1 M。请问如何处理这个问题？

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不好意思，我后来用200mM来活化钒酸钠，然后加到lysis buffer中时是加入5倍体积，终浓度是一样的。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-6 16:00

正式做磷酸化western之前，有幸学习了此贴的内容，现在实验已经有了初步结果，非常感谢楼主的无私奉献~！

最近在做western的时候遇到一个现象，我的内参和磷酸化蛋白都是把膜剪开分开孵育抗体，然后进行曝光的，在曝光的时候，我先加ECL（皮尔斯公司）到目的蛋白膜上，而内参的膜泡在最后洗膜的TBST中，在暗室中目的蛋白肉眼可见明显绿色荧光，目的蛋白压片之后再压内参（中间间隔约20min），结果内参就出不了条带，压片5min，10min，30min、过夜都没条带。当晚对二抗与ECL孵育进行检验，没有问题。第二天对这两张膜进行strip，重新封闭，孵抗体，步骤基本和前一天一致，结果进暗室先压内参，条带肉眼可见荧光，效果不错，而一旁泡在TBST中的目的蛋白压片时就做不出来了。是不是我曝光一张膜时，把另外一张泡在TBST里（一般10-20min）对结果有影响？？因为之前的实验中发现内参一般很亮，而目的条带就要弱一些，在暗盒一起曝光的话不好控制时间，就用了这种分开曝光的方式，不知道楼主和各位战友有什么好的建议，谢谢~！！

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一起曝光就好了，为什么分开呢？

我经常是好几张膜一起加ECL然后一起曝光的。

把一张膜泡在TBST中一二十分钟没有问题的，但如果是加ECL以后再泡到TBST中，那ECL就没什么作用了，需要重新加ECL然后曝光。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-6 16:01

请问楼主，做凋亡系列wb时，必须要显出凋亡的断裂带吗？主带可见明显减少，但因为抗体因素没有显出尾巴后面的断裂带

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最好是这样的。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-6 16:01

做了p-jnk有半年了总是没结果真是太郁闷

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你可以先做容易点的，如内参蛋白，看是你个人操作的问题，还是抗体的问题。

作者: dog002 时间: 2013-5-6 16:02

一起曝光就好了，为什么分开呢？

我经常是好几张膜一起加ECL然后一起曝光的。

把一张膜泡在TBST中一二十分钟没有问题的，但如果是加ECL以后再泡到TBST中，那ECL就没什么作用了，需要重新加ECL然后曝光。

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分开曝光是因为经常内参和目的条带的亮度相差很大，内参肉眼明显可见荧光，而目的蛋白就看不到，一起曝光的话不好控制时间，不知道您的意思是不是一起曝光，然后分开取出来显影定影？

另外，还有最近一直困扰我的情况，就是曝光出来的条带总是不齐全，9个泳道只能爆出6、7条，而对膜strip之后重新曝光发现原本有条带的曝不出来了，而上次没有出来的又曝得很好，现在为止，还没做出完整的可用于光密度分析的结果来，曾经考虑过转膜气泡、孵育不均匀的问题，但是半干转三明治我做的很小心，气泡都是用玻璃管赶出去的，丽春红染色条带也比较均匀，至于孵育不均匀，我是用封口膜折成小盒子孵育一抗，膜都是泡在里面的，摇床孵育过夜，封闭、二抗、洗膜就都是用平皿，液体都能浸没PVDF膜，一直重复实验，每一步小心翼翼，单都出现这种情况，难不成是一抗的问题？还是ECL的问题，ECL是皮尔斯的。。请楼主指教~谢谢

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-6 16:03

分开曝光是因为经常内参和目的条带的亮度相差很大，内参肉眼明显可见荧光，而目的蛋白就看不到，一起曝光的话不好控制时间，不知道您的意思是不是一起曝光，然后分开取出来显影定影？

另外，还有最近一直困扰我的情况，就是曝光出来的条带总是不齐全，9个泳道只能爆出6、7条，而对膜strip之后重新曝光发现原本有条带的曝不出来了，而上次没有出来的又曝得很好，现在为止，还没做出完整的可用于光密度分析的结果来，曾经考虑过转膜气泡、孵育不均匀的问题，但是半干转三明治我做的很小心，气泡都是用玻璃管赶出去的，丽春红染色条带也比较均匀，至于孵育不均匀，我是用封口膜折成小盒子孵育一抗，膜都是泡在里面的，摇床孵育过夜，封闭、二抗、洗膜就都是用平皿，液体都能浸没PVDF膜，一直重复实验，每一步小心翼翼，单都出现这种情况，难不成是一抗的问题？还是ECL的问题，ECL是皮尔斯的。。请楼主指教~谢谢

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一起曝光：在同一张X光上，左边压片时间短一点（比如几秒），右边压片时间长一点（比如几分钟），如果X光片还有空位，可再压片1分钟的，总之，多取几个时间点就是了。然后一起洗片就好了。这样，不管是内参，还是目的蛋白，你都能得到较好的条带。

你的问题可以是加ECL以后的操作及时间安排不恰当造成的。ECL加完后最好在十几分钟内完成操作，这样的效果是最好的。时间超过30-60分钟，ECL荧光可能就消失或变得不均匀了。

作者: lgm 时间: 2013-5-6 16:03

你好！
我在做NF-KB磷酸化的WB.封闭用的是5%脱脂奶粉，一抗是santa cruz的，稀释度1：200稀释，用碧云天的一抗稀释液稀释。结果膜上加发光液后在第一条带和第三条带之间一片都发光了（Pho-NF-KB分子量65KD，本应在第二和第三条带间），看不清楚条带，一起做的ACTIN条带很清楚。
麻烦给点建议，谢谢。

作者: lgm 时间: 2013-5-6 16:03

你好！我今天又磷酸化NF-KB抗体又稀释到1：:500和1:800做了一遍，结果加发光液后除了条带区域其他地方都发光了，这是什么原因呢？急切等待帮助！万分感谢！

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-6 16:06

你好！
我在做NF-KB磷酸化的WB.封闭用的是5%脱脂奶粉，一抗是santa cruz的，稀释度1：200稀释，用碧云天的一抗稀释液稀释。结果膜上加发光液后在第一条带和第三条带之间一片都发光了（Pho-NF-KB分子量65KD，本应在第二和第三条带间），看不清楚条带，一起做的ACTIN条带很清楚。
麻烦给点建议，谢谢。

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将抗体稀释得稀一些，如1：1000，然后多洗两次膜，看能不能改善；如果不能，就只能换抗体了。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-6 16:07

你好！我今天又磷酸化NF-KB抗体又稀释到1：:500和1:800做了一遍，结果加发光液后除了条带区域其他地方都发光了，这是什么原因呢？急切等待帮助！万分感谢！

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如果是这样，就不是你的抗体的问题了。可能的原因：1，多洗几次膜。2，压片用的东西最好擦洗干净。3，不要加太多的发光液。4，你封闭膜了吗？

你先这样试一试，如再有问题，请继续留言。

作者: mickeylin 时间: 2013-5-6 16:08

非常感谢各位战友的热心帮忙和关注，特别感谢箭头儿、NBA两位高手的建议，使我的实验有了一些进展。现在用ly294002处理细胞后，可以下调p-Akt，只是效果不是很显著，我想可能还是处理方法不合适?想求助各位战友们，请大家出手帮忙！以下是我处理细胞的方法：

细胞传代培养，汇合度40-50%后，血清饥饿16小时，30uM或50uM ly294002处理30--60min，洗二遍，再用10%血清培养，2、6、12h收集蛋白。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-6 16:08

QUOTE:

原帖由 mickeylin 于 2013-5-6 16:08 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

非常感谢各位战友的热心帮忙和关注，特别感谢箭头儿、NBA两位高手的建议，使我的实验有了一些进展。现在用ly294002处理细胞后，可以下调p-Akt，只是效果不是很显著，我想可能还是处理方法不合适?想求助各位战友们，请大家出手帮 ...

1，后来需要加血清吗？

2，你可以试一试不要把ly294002洗去的效果。

作者: mickeylin 时间: 2013-5-6 16:09

QUOTE:

原帖由 箭头儿 于 2013-5-6 16:08 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

1，后来需要加血清吗？

2，你可以试一试不要把ly294002洗去的效果。

加血清和不加血清组都做过。

加血清组：对照和处理组p-Akt表达水平会升高，而处理组升高幅度小一些，有差异但不明显。

不加血清组：对照和处理组p-Akt表达水平都较低，而处理组会有小幅度降低，与对照组相比差异也不明显。

不洗去ly294002，检测时发现p-Akt表达水平会持续升高。

我想是不是处理程序、方法不对？急盼各位战友帮忙呀！！

作者: any333 时间: 2013-5-6 16:09

想请教楼主一个问题，我做P-AKT，用的是CST的一抗，二抗用的是中山金桥分装的，你说有没有必要二抗也用试剂盒里自带的二抗啊？

还有磷酸化蛋白丰度低，我封闭和杂一抗的时间都较长，一抗杂了一天两夜。我想大不了多洗两次。不知可不可以？

作者: TAT 时间: 2013-5-6 16:10

您好，我是从组织中提取的蛋白，刚试了一下您说的步骤，发现裂解后的液体很红，不知道是否要应用红细胞裂解液，还是在取组织时进行生理盐水的漂洗来尽量避免这种情况

作者: u234 时间: 2013-5-6 16:11

看了楼主的帖子，受益匪浅。我刚刚开始做WESTERN，第一次做大鼠脑组织的p-JNK，GAPDH出来的很好，隐约可以看到46KD会看到条带，很弱，很不清楚。
组织提取蛋白的时候全程在冰上操作，蛋白酶抑制剂和磷酸化抑制剂都加了，唯独我比较贪心，一下提取了30多个样本的蛋白，所以花费的时间比较长，但是我提取拿样本的时候是一部分一部分从-80°冰箱里拿出来的。今天下午STRIP后加入了JNK一抗，不知道明天结果如何。另外，我的P-JNK是CST，稀释根据说明书进行，5%脱脂奶粉，1：2000稀释。像我这种情况下一步改如何改善呢？谢谢。

作者: u234 时间: 2013-5-6 16:12

还有个问题想请教您，我想做P -JNK和JNK，根据坛子里大家的经验最好是：先加P-JNK,strip 后加JNK，strip 后再加GAPDH是吗？我是否可以加p-JNK和GAPDH ，然后STRIP再加JNK和GAPDH，不知道哪种更好。另外楼上我说的问题中，我用的分离胶是10%。期待您的回答。谢谢

作者: ffooll 时间: 2013-5-6 16:12

请教有经验的前辈：

蛋白是从组织提取的，我的目的蛋白是核蛋白，是否必须要用专门的抽提核蛋白的蛋白抽提液？

之前做的几次，都是用提总蛋白的Thermo的蛋白提取液（不知道有没有有效期，反正一大瓶已经了3年了)。

用这个抽提液提的蛋白的actin内参都做得不错，而且从actin的亮度来看，蛋白的含量已经很高了。但是目的核蛋白90KD就是不理想。

我的目的蛋白是磷酸化的蛋白，所以后来又加了国产的贝博牌的磷酸酶抑制剂，还是效果不好。

我的点样孔最多可以点20ul的样，我也不知道我的蛋白是多少微克上的样，因为我没有做蛋白定量。就是加到了20ul才在目的大小区域出现了很细很弱的条带。但是背景很高，不知道如何改进。

我的胶是8%的胶

我的电泳条件是80V，20min，100V，120min

我的转膜条件是250mA, 120min

封闭条件：5%的脱脂牛奶，1小时

我的一抗是个多抗，而且没有相应的单抗卖。

非常期待您的建议！

作者: DNA 时间: 2013-5-6 16:13

大家一般用的磷酸酶抑制剂是自己配制的，还是买的~还有我提蛋白一般都是煮沸提取的，我看很多同仁都在冰上操作，两者有什么不同，哪个效果更好~

作者: ROSE李 时间: 2013-5-6 16:13

这几天又做了几次，总的JNK 条带，出来的非常漂亮，p-JNK抗体我1:1000，结果只出来一条条带，反复做了两次，都是一样，难道是规律性的非特异性条带，这是为啥呢？

请楼主现身，给予指点

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-6 16:14

这几天又做了几次，总的JNK 条带，出来的非常漂亮，p-JNK抗体我1:1000，结果只出来一条条带，反复做了两次，都是一样，难道是规律性的非特异性条带，这是为啥呢？

请楼主现身，给予指点

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1，确定条带是否是规律性的非特异性条带，主要看你的处理与对照组相比，会不会引起条带的变化。二是对照marker,看条带的大小是否在相应的位置上。

2，对于有些细胞，p-JNK的两条条带可能有一条会不太清晰，但一般来说，总的JNK也会相应有一条条带浅一些。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-6 16:15

大家一般用的磷酸酶抑制剂是自己配制的，还是买的~还有我提蛋白一般都是煮沸提取的，我看很多同仁都在冰上操作，两者有什么不同，哪个效果更好~

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磷酸酶抑制剂可以是自己配制的，也可以是买的。

提蛋白如果是直接加loading buffer煮沸提取，则不能测蛋白的浓度，无法较好地定量。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-6 16:15

请教有经验的前辈：

蛋白是从组织提取的，我的目的蛋白是核蛋白，是否必须要用专门的抽提核蛋白的蛋白抽提液？

之前做的几次，都是用提总蛋白的Thermo的蛋白提取液（不知道有没有有效期，反正一大瓶已经了3年了)。

用这个抽提液提的蛋白的actin内参都做得不错，而且从actin的亮度来看，蛋白的含量已经很高了。但是目的核蛋白90KD就是不理想。

我的目的蛋白是磷酸化的蛋白，所以后来又加了国产的贝博牌的磷酸酶抑制剂，还是效果不好。

我的点样孔最多可以点20ul的样，我也不知道我的蛋白是多少微克上的样，因为我没有做蛋白定量。就是加到了20ul才在目的大小区域出现了很细很弱的条带。但是背景很高，不知道如何改进。

我的胶是8%的胶

我的电泳条件是80V，20min，100V，120min

我的转膜条件是250mA, 120min

封闭条件：5%的脱脂牛奶，1小时

我的一抗是个多抗，而且没有相应的单抗卖。

非常期待您的建议！

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可能是你的目的蛋白量较少造成的。最好是用提核蛋白的提取液，以更好地浓缩蛋白。

作者: 98776langtao 时间: 2013-5-6 16:16

能提供详细的磷酸酶抑制剂配方吗，还有具体用法，谢谢

作者: 98776langtao 时间: 2013-5-6 16:20

还有可否提供提蛋白冰上操作的具体步骤

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-6 16:30

您好，我是从组织中提取的蛋白，刚试了一下您说的步骤，发现裂解后的液体很红，不知道是否要应用红细胞裂解液，还是在取组织时进行生理盐水的漂洗来尽量避免这种情况

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取组织之前要把血液尽量清干净。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-6 16:31

看了楼主的帖子，受益匪浅。我刚刚开始做WESTERN，第一次做大鼠脑组织的p-JNK，GAPDH出来的很好，隐约可以看到46KD会看到条带，很弱，很不清楚。
组织提取蛋白的时候全程在冰上操作，蛋白酶抑制剂和磷酸化抑制剂都加了，唯独我比较贪心，一下提取了30多个样本的蛋白，所以花费的时间比较长，但是我提取拿样本的时候是一部分一部分从-80°冰箱里拿出来的。今天下午STRIP后加入了JNK一抗，不知道明天结果如何。另外，我的P-JNK是CST，稀释根据说明书进行，5%脱脂奶粉，1：2000稀释。像我这种情况下一步改如何改善呢？谢谢。

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我买的CST抗体p-JNK是用5%BSA稀释的，1：1000.

如果结果不好，你就要把抗体的浓度加高了。

提取的时候只要在冰上，保持低温，应该问题不大。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-6 16:31

还有个问题想请教您，我想做P -JNK和JNK，根据坛子里大家的经验最好是：先加P-JNK,strip 后加JNK，strip 后再加GAPDH是吗？我是否可以加p-JNK和GAPDH ，然后STRIP再加JNK和GAPDH，不知道哪种更好。另外楼上我说的问题中，我用的分离胶是10%。期待您的回答。谢谢

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最好是P-JNK,strip 后加JNK，strip 后再加GAPDH。

两个抗体p-JNK和GAPDH一起加，因为条带太接近，容易造成影响，所以最好不要这样做。

如果是条带距离很远，那就将membrane剪开分别加抗体，总之最好不要两个抗体一起加。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-6 16:31

能提供详细的磷酸酶抑制剂配方吗，还有具体用法，谢谢

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见我的贴子的前几页。

cuturl('http://immunotech.dxy.cn/bbs/topic/11443307?tpg=1&ppg=1&age=0#0')

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-6 16:32

还有可否提供提蛋白冰上操作的具体步骤

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就是普通WB的方法，你到版里搜一下就能找到。

作者: memory 时间: 2013-5-6 16:34

做P-JNK，JNK是不是就是P-JNK的内参了，上面提到还有GAPDH，是不是这里的JNK不是内参？

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-6 16:35

想请教楼主一个问题，我做P-AKT，用的是CST的一抗，二抗用的是中山金桥分装的，你说有没有必要二抗也用试剂盒里自带的二抗啊？

还有磷酸化蛋白丰度低，我封闭和杂一抗的时间都较长，一抗杂了一天两夜。我想大不了多洗两次。不知可不可以？

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二抗用中山金桥分装或试剂盒里自带的都可以。

封闭的时间不要太长，一小时就好，一抗overnight就好，时间太长效果反而不好。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-6 16:35

加血清和不加血清组都做过。

加血清组：对照和处理组p-Akt表达水平会升高，而处理组升高幅度小一些，有差异但不明显。

不加血清组：对照和处理组p-Akt表达水平都较低，而处理组会有小幅度降低，与对照组相比差异也不明显。

不洗去ly294002，检测时发现p-Akt表达水平会持续升高。

我想是不是处理程序、方法不对？急盼各位战友帮忙呀！！

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我是不加血清的，但我没有洗去抑制剂，但浓度要调合适。抑制效果比较明显。

你这种情况我没遇到过，我也很想知道，请有经验的同仁帮忙回答，谢谢！

作者: memory 时间: 2013-5-6 16:38

这几天又做了几次，总的JNK 条带，出来的非常漂亮，p-JNK抗体我1:1000，结果只出来一条条带，反复做了两次，都是一样，难道是规律性的非特异性条带，这是为啥呢？

请楼主现身，给予指点

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你好，你做的P-JNK，是使用GAPDH做内参的吗，我感觉JNK本身就可以做内参了~

作者: qumm1985 时间: 2013-5-6 16:39

请问P-AKT上样量要提高到多少才比较好？因为丰度低，条带总是淡。还是一抗浓度是否需要提高呢？原来用1:1000，现在用1:500可以吗？

作者: BOSS2011 时间: 2013-5-6 16:45

请问P-AKT上样量要提高到多少才比较好？因为丰度低，条带总是淡。还是一抗浓度是否需要提高呢？原来用1:1000，现在用1:500可以吗？

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增加ECL的敏感性比较可行

作者: applebook=213 时间: 2013-5-6 16:46

楼主的帖子收获颇深啊！楼主的解答都正是我的疑惑之处。好好学习，找找自己磷酸化蛋白没有做出来的原因！

作者: bring 时间: 2013-5-6 16:47

请教：

我购买sigma的磷酸酶抑制剂1ml，培养的细胞是用25X25的培养瓶，请问原液是需要稀释100倍吗？用蒸馏水稀释就可以了吗？如果是，稀释的水师傅要消毒？稀释后每次收细胞的时候加多少？谢谢～

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-6 16:47

做P-JNK，JNK是不是就是P-JNK的内参了，上面提到还有GAPDH，是不是这里的JNK不是内参？

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JNK可以作p-JNK的内参，但如果JNK的量有变化，最好再做一个内参如GAPDH或actin。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-6 16:50

你好，你做的P-JNK，是使用GAPDH做内参的吗，我感觉JNK本身就可以做内参了~

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如果JNK的量没有变化，JNK作p-JNK的内参比较好，但如果JNK的量有变化，最好再做一个内参如GAPDH或actin。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-6 16:50

请问P-AKT上样量要提高到多少才比较好？因为丰度低，条带总是淡。还是一抗浓度是否需要提高呢？原来用1:1000，现在用1:500可以吗？

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上样量50ug/孔，压片时时间长一点。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-6 16:50

请教：

我购买sigma的磷酸酶抑制剂1ml，培养的细胞是用25X25的培养瓶，请问原液是需要稀释100倍吗？用蒸馏水稀释就可以了吗？如果是，稀释的水师傅要消毒？稀释后每次收细胞的时候加多少？谢谢～

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磷酸酶抑制剂是放到细胞裂解液中的，不是细胞培养液中的。sigma有说明书告诉你稀释倍数。

作者: KGZ564 时间: 2013-5-6 16:51

看了大家的讨论很受用，我想问一个问题，我最近在做P-SMAD2的WB，老是做不出来，我裂解蛋白时加的PSTOP和cocktail，上总蛋白量80微克，细胞先用TGF刺激半小时，用的是cst的抗体，用BSA配的一抗，用TBST洗涤，大家看看有什么地方有问题！

作者: DONT 时间: 2013-5-6 16:51

请教楼主：

我用的是DAB显色，用您提供的strip发50度30min，然后TBST洗3次x5min/次，可DAB的显色洗不掉啊？这样再孵育下一个抗体后DAB显色，原来显色的条带应该还存在吧？如果总蛋白和磷酸化的蛋白分子量相同，怎么能区分第二次是否成功呢？

作者: tianmei001 时间: 2013-5-6 16:54

楼主你好，我最近在跑一个磷酸化蛋白，分子量是48

15%的胶，电压是80v 150V,

湿转300mA，60分钟

5%BSA封闭两小时，TBST洗膜10min 3次，一抗是ABcam的，1:2000,二抗中杉的 1:5000

用的是ECL发光，电脑曝光的

但是我的图片总是这样，图片好像反向了，泳道间隔处是暗的泳道是亮的

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图片附件: 28668048.jpg (2013-5-6 16:55, 17.85 KB) / 该附件被下载次数 15
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16065

作者: tianmei001 时间: 2013-5-6 16:57

我重复两次，图片均是这样的

另外一个非磷酸化的蛋白也不太理想，之前用的5%光明脱脂奶粉，santa的一抗1:200，其他和上述类似

图片附件: 51127770.jpg (2013-5-6 16:57, 14.26 KB) / 该附件被下载次数 16
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16066

作者: tianmei001 时间: 2013-5-6 16:58

后来我改用了10%脱脂奶粉，增加了封闭时间，一抗改为1:100

可是条带也不行

问题有点多，麻烦楼主帮忙分析下，我需要怎样改进，我刚做wb不久，很多东西还不太会分析，谢谢啦！

图片附件: 17291243.jpg (2013-5-6 16:58, 31.51 KB) / 该附件被下载次数 15
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16067

作者: 00无名指00 时间: 2013-5-6 16:59

本人菜鸟一只，请教版主，我实验主要是测磷酸化蛋白，需要做免疫共沉淀跟WB，做免疫共沉淀测的蛋白为非磷酸化蛋白，这两种用到的细胞裂解液有区别吗？可不可以用同一种裂解液？cocktail是不是也包含磷酸酶抑制剂的，那这样还需要另外加磷酸酶抑制剂吗？

作者: KGZ564 时间: 2013-5-6 16:59

楼主您好，我做的是4E-BP1(PHAS-1)的磷酸化和非磷酸化WB,抗体用的是santcruz的，第一次和第二次有条带，大小正确并且有明显的区别，我做的是假5-HT后0,5,10,20,30,40min收取细胞加RIPA+PMSF+磷酸酶抑制剂。但是第三次至今都没做出来过，其它条件都没变啊，我想是不是一抗的问题。

转膜用的是90mA,2.5h，加20%甲醇。丽春红染色有是有有时没有

纠结啊~~~~

作者: 8princess8 时间: 2013-5-6 17:00

楼主，你好，这么久过去了这个帖子还在真佩服你的敬业精神。

我又遇到问题了，加上ECL液后整张膜都亮了，我分析原因：
1 封闭不好。我们用TBST+5%脱脂奶粉（sangon），室温2h。
2 一抗太久。我用CST（1:1000），4度过夜，循环使用，这是第3次。
3 二抗。我们用中杉金桥（1:2000）。第8次使用，室温3h，平时都是2h。
4 ECL.我们用pierce，应该没问题。
5 保鲜膜。国产的，这个因素好像太挑剔，但我看到有影响的，平时都用那一卷的。应该排除。

我觉得可能是二抗的问题，整张膜都亮。很多东西都是从你这里学习的，真的很谢谢你哥们！

跟错了帖子，刚才发到免疫版了，现在挪过来谢谢

作者: bling 时间: 2013-5-6 17:01

我用组织提取的蛋白做WB，暗室压片后出现的杂带异常多，请楼主现身帮忙分析原因，本人不胜感激！……

作者: glass 时间: 2013-5-6 17:01

楼主，您好！借着这块宝地，我也很想向您请教几个问题。我在做内皮祖细胞的P-AKT,P-ERK,P-eNOS.但是目前都还没有做出来。我的操作过程如下：1.弃去旧的培养液，用预冷的PBS洗2次，把细胞吹打下来，收集至EP管，1000转/分钟，5分钟（没有加胰酶，这步花了大约30~40分钟，会不会太久导致磷酸化蛋白的量？）2.尽量吸干管内PBS，加入裂解液（用的是贝茵莱的RIPA高效裂解液，加了PMSF、激活的原钒酸钠、还有那种可用于抑制磷酸酶的蛋白酶混合抑制剂，还需要加别的抑制剂么），然后涡旋15秒后将EP管插冰上5分钟，再涡旋15秒，这样裂解20分钟（磷酸化蛋白要求速度快，我只裂解了20分钟，但后来没结果会不会裂解的时间短了？一般用这种方式裂解要多长时间呢）。3.12000rpm离心12分钟（取上清时，没看到有什么沉淀）。4.100度煮了3分钟，负80度保存。

要是用加裂解液然后刮细胞的方式，在冰上刮细胞的那一过程最好控制在多长时间呢？

作者: 831226 时间: 2013-5-6 17:02

同时看到这个讨论区有蛋白芯片的话题，介绍到抗体芯片检测信号通路的蛋白磷酸化，应该是可以筛选出来通路上哪个蛋白受到影响的，不知道有无哪位大侠试用过吗？效果如何？我是想研究信号通路的，通路上的几十个成员一个个用WB来试验不是要了我的命啦。

谢谢！

作者: yes4 时间: 2013-5-6 17:15

因为内参GAPDH或actin与ERK条带比较相近，我一般用同一张膜，先压片显示p-ERK；然后strip，再压ERK；然后再strip一次，压内参。同一张膜，我可以测三次。当然，内参GAPDH的条带在36左右，免强与ERK条带能分开，所以也可以将膜剪开后与p-ERK,ERK分开压片。

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楼主您好：我现在正仔仔细细的从头看您的帖子，并且做着笔记。收获很大。

这个帖子很早了。STRIP 是什么意思？是不是压完一个蛋白后把之前的一抗二抗洗掉再重新blocking，用另外一个蛋白的一抗孵育？具体操作是怎么样的呢？在这一过程中蛋白不会降解影响结果吗？

还有个问题，我最近做的p-smad3, ECL发光后可以看到整张膜都发光，压出来就是黑乎乎一片，任何条带看不出来。3%BSA BLOCKING 4度 overnight，一抗4度overnight。洗10minx3次。二抗室温1H, 洗10minx3次。第一次做的时候是出来结果的了，由于背景稍高，稀释了一抗重做就出现这种现象了。楼主认为可能的原因是什么呢？

[ 本帖最后由 yes4 于 2013-5-6 17:23 编辑 ]

作者: gogo 时间: 2013-5-6 17:25

我做了一年的WB，其中有很多磷酸化的，一些经验教训：

1. 正像楼主所说，抗体选择很重要，而且最最重要。好抗体，傻瓜也能做出来，不好的抗体神仙也无办法。有些公司的抗体很好，有些公司的抗体很差（一些大公司同样会有低劣产品），而且这一点对非磷酸化的抗原检测也很重要。
2. 标本收集要在冰上，保持低温。我没有用磷酸酶抑制剂，没有比较过用和不用的区别，但结果总体来说还可以。
3. 我们实验室对于磷酸化蛋白的检测，封闭必用5%BSA，而不用脱脂奶粉，道理讲不清，上面流传下来的方法，可能对于敏感性和特异性差的抗体会有帮助。一抗用1%BSA稀释，先1：1000 稀释，后根据情况调整。
4. 我们只有做IP的时候才用蛋白酶抑制剂。

又看了楼主过去的帖子，很佩服，楼主是个热心人。做过此类实验后，再看你的WB经验，既有同感有学习了很多。投上一票，聊表敬意！

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脱脂奶粉里含磷酸化酶，所以用脱脂奶粉封闭和配一抗做磷酸化的蛋白的话必须加磷酸化酶抑制剂。

作者: gogo 时间: 2013-5-6 17:26

楼主您好：我现在正仔仔细细的从头看您的帖子，并且做着笔记。收获很大。

这个帖子很早了。STRIP 是什么意思？是不是压完一个蛋白后把之前的一抗二抗洗掉再重新blocking，用另外一个蛋白的一抗孵育？具体操作是怎么样的呢？在这一过程中蛋白不会降解影响结果吗？

还有个问题，我最近做的p-smad3, ECL发光后可以看到整张膜都发光，压出来就是黑乎乎一片，任何条带看不出来。3%BSA BLOCKING 4度 overnight，一抗4度overnight。洗10minx3次。二抗室温1H, 洗10minx3次。第一次做的时候是出来结果的了，由于背景稍高，稀释了一抗重做就出现这种现象了。楼主认为可能的原因是什么呢？

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可以拿含Tween封闭液配抗体背景会低一点。而且在很多说明书中都说强调要求用无Tween的配封闭液封闭，而用含0.1%-2%Tween-20的封闭液配1抗和2抗

作者: 831226 时间: 2013-5-6 17:29

楼主您好，请问用Western测定NF-kB合理吗？能解释下吗？谢谢楼主的回答！

作者: vcve 时间: 2013-5-6 17:39

大家好，看到大家的交流帖受益匪浅啊，最近我也在做磷酸化的蛋白的WB ，抗体是cellsignall 的，用我们实验室的RIPA 1*SDS裂解液，跑不出来条带或者很弱。昨天准备配箭儿达人的细胞裂解时，在钒酸钠活化时遇到了问题，按200mM配好后，用1M的HCL 调到10后颜色变黄，废水中加热30 分钟都没见变回透明色。想问一下什么原因。

作者: 66+77 时间: 2013-5-6 17:41

您好，我最近在做大鼠心肌的tlr4受体的表达，分子量95，因为表达量较少，上样量为80微克，用的是santa的抗体，一抗按1：30，二抗是1：2000，目的条带比较弱，背景很高，通过增加二抗稀释度，洗膜的时间，吸干多余的发光液，4张胶片同时压2个小时减少了背景，
但目的条带太弱了，我想通过加大样本量提高表达量，但在之前的实验中，每孔加样量到80微克，样本已经有点弥散了，有时候出来的条带不太容易分开，怎么解决这个问题？或者还有什么方法让目的条带增强吗？谢谢

作者: windy+++ 时间: 2013-5-6 17:42

想问大家用的磷酸化酶抑制剂是哪家公司的，价钱多少？谢谢了
我买了碧云天的磷酸酯酶抑制剂可否用来防止磷酸化降解？

作者: ero11 时间: 2013-5-6 17:42

受教了！！！很感谢各位大侠的经验分享！小弟也准备做磷酸化蛋白wb了，希望吸收了各位的经验后能做出结果！谢谢啦

作者: yonger 时间: 2013-5-6 17:43

请教楼主，我做K562细胞的AKt，每孔上了100微克的蛋白，结果AKt总蛋白条带不错，但磷酸化没有出结果，只能隐约看到有条带。用的是CST的多抗，一抗冰上孵育过夜，抗体1：1000和1：500都试过。是否上样量不够，你们一般上多少样品？我想下次收细胞的时候用1×loading煮了直接上样，增加上样量，这样是否可行？如果上样太大的话，actin太粗会不会区分不出量来，用GAPDH有没更好？

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我以前也碰到这种情况，改换封闭液和抗体稀释液就可以出来了,结果很漂亮
封闭液配方：1×TBS,0.1%Tween-20，5%w/v nofat dry milk
AKT稀释液：1×TBS,0.1%Tween-20，5%w/v BSA

作者: mimili_901 时间: 2013-5-6 17:45

上次就怀疑是显影液或定影液问题，所以换了，结果就一压全曝光了，以为是胶片问题，就拿胶片直接显影、定影，胶片没有曝光，还是蓝色透明的，每次问题都不一样，真快崩溃了胶片还是透明蓝色

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胶片还是透明蓝色不一定就没曝光，我之前也是这样不相信是胶片曝光了，后来跟同学一起用暗室，人家的胶片泡在显影液里好久都不变黑，我的没多久就变黑了，那我才知道原来胶片有问题，之前我也试过，放在显影液里不久就放定影液里的话，胶片可以是透明蓝色的。

作者: plaa 时间: 2013-5-6 17:46

我做的是289的p-mTOR和185的 p-ErBb3，但是做出来都发现有拖尾现象，用的小梳子，加的15ul的量，转膜条件是100V，4h，想问一下是什么原因出现这样的情况！

作者: jujuba 时间: 2013-5-6 17:50

楼主你好我也做磷酸化CREB,打算不做总CREB,这样行吗？如果必须做，加这两种抗体有什么讲究没？怎样洗脱，加另一种抗体？

作者: S6044 时间: 2013-5-6 17:50

楼主你好，看了你的帖子和对大家的回复，收获很多，我也有一个问题请教：
我做的是MMC（50ng/ml）处理293T细胞，37°一个小时，然后修复不同的时间0h，24h，和48h，用裂解液裂解细胞，BCA蛋白定量，做Western Blot检测磷酸化的H2AX，但是我做了很多次，要么信号很弱，要么让师妹做了好多次连信号都看不到，而内参是有的。抗体没有问题，做免疫荧光信号挺强的。不知道是什么原因，麻烦您帮我分析一下吧。还有一个问题，就是BCA定量，因为是不同的时间点收的细胞，细胞量差别比较大，而BCA总觉得定的不那么准确。您有什么建议吗？
谢谢！

作者: INK 时间: 2013-5-6 17:51

楼主您好！有几个问题想要资询一下，最近我一直在做磷酸化的western，显色时发现普通蛋白能够被显出来，而磷酸化抗体显色时就看不到条带了，之前没有加磷酸酶抑制剂，最近一次做的时候加了磷酸酶抑制剂，但结果仍旧是阴性的。
我想问一下，我用RIPA提总蛋白的时候是加了磷酸酶抑制剂的，跑western之前用2×loading变性样本的时候需不需要在loading中也加入适量的磷酸酶抑制剂呢？100度变性对蛋白磷酸化会不会有什么影响？

还有，不知道楼主有没有磷酸化蛋白免疫荧光方面的经验？谢谢啦。。

作者: 00无名指00 时间: 2013-5-6 17:51

楼主，我想问一下，
1、VEGF作用细胞后，检测ERK,P38,FAK的磷酸化程度，加药后多长时间裂解细胞？磷酸化的蛋白是不是随着时间增加然后又去磷酸化了？我怎么掌握这个时间点？我只是想知道是否有磷酸化，还需要测总蛋白作对照吗？和不加药的组做对照不可以吗？由于经费问题不太想做总蛋白了，这样是否可以？
2、我看文献，FAK的磷酸化检测得先做IP,再WB，这样的话就要买两个抗体，能不能直接WB呢？
跪谢！

作者: u234 时间: 2013-5-6 17:52

由于很多磷酸化蛋白的抗体很难买到，能不能提取细胞的总磷酸化蛋白，再用普通的抗体（非磷酸化）去做呢？另外，我们在做双向的时候习惯加一些核酸酶，一般情况下会让跑出来的点更清晰没有拖尾，不知道western适不适用

作者: tuuu2 时间: 2013-5-6 17:52

最近做perk，总是做不出来，或者背景深条带浅，但是总蛋白做的很好，有些疑问：
1、蛋白裂解后要马上变性吗？我因为BCA法测总蛋白，配平总蛋白需要时间，不能马上变性。
2、变性后不要室温冷却而是直接放冰箱吗？我们实验室好像都是室温冷却再放-20.
3、封闭用10%的脱脂牛奶有问题吗？网上都说用5%的
4、二抗用5%牛奶稀释，还是5%BSA,还是TBST?
5‘条带不明显是抗体（CST）原因还是蛋白不够多呀（加样总蛋白估计有60ug）？
急求楼主回答，我现在做了不下七次了，劳心劳力，很纠结。

作者: yueban-1147 时间: 2013-5-6 17:53

我是WB新手，要做血小板中的磷酸化蛋白检测，有些问题想请教一下。
1.从血小板中抽提蛋白，要加入含蛋白酶抑制剂的裂解液，我看到文献说要同时加入磷酸酶抑制剂，PMSF和磷酸酶抑制剂是要一起加入裂解液中吗？需要加入多少？
2.磷酸化蛋白和总蛋白可以同时进行电泳和转膜吗？
3.我要测的蛋白分子量在110KD，选用哪个内参比较好？
4.我的strip想买碧云天的，不知道效果怎么样？
5.蛋白定量选用BCA试剂盒好还是bradford试剂盒好？

作者: one 时间: 2013-5-6 17:53

楼主您好！我刚刚开始做western，想做磷酸化的ERK,内参和总蛋白都做了，最后发现总蛋白的量发生了变化而内参基本一致，那是否能评价磷酸化水平呢？

作者: 04906 时间: 2013-5-6 17:53

你好，请教您一个问题，我做p38的western，但是p38有多个亚型，不同器官分布比例不同，分别为p38α、β、γ、δ。我想做p38α，并且买了磷酸化p38抗体（师兄买的），但是抗体说明书上没有说具体针对哪个亚型，说明书上的图显示一条带。那么我有几个问题请教：
1.不同亚型分子量有差别吗？
2.针对我买的抗体您怎么看？为什么只有一条带?
3.今天做了磷酸化p38的western，出现了两条带，相差几kd，下面那条带很细，但是和清楚，上面一条带比较粗。对比说明书我不知道那条是我需要的带，为什么会有两条？

作者: gogo 时间: 2013-5-6 17:54

磷酸化丝氨酸，苏氨酸

作者: 911 时间: 2013-5-6 17:55

您的意思是说要把p-erk1和p-erk2的灰度值相加，比较总的磷酸化水平的变化吗？若总蛋白不变，计算p-erk1+p-erk2/t-erk1+t-erk2相对磷酸化水平；若总蛋白有变化，计算p-erk1+p-erk2/actin,t-erk1+t-erk2/actin,即把总蛋白和磷酸化蛋白分开来比较。是我理解的这个意思么？谢谢。

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没错。若您要比较单独的p-ERK1或p-ERK2的磷酸化，最好买它们的专一抗体做实验来比较。

我的问题是，有时p-ERK1出不全，怎么算灰度值呢？谢谢。

作者: 2541 时间: 2013-5-6 17:56

因为内参GAPDH或actin与ERK条带比较相近，我一般用同一张膜，先压片显示p-ERK；然后strip，再压ERK；然后再strip一次，压内参。同一张膜，我可以测三次。当然，内参GAPDH的条带在36左右，免强与ERK条带能分开，所以也可以将膜剪开后与p-ERK,ERK分开压片。

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请教strip后您是怎么确定有没有strip干净呢？谢谢。

作者: 89tongzijun 时间: 2013-5-6 17:58

请问有必要买专门的蛋白质提取试剂盒么？

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