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标题: 【求助】大分子蛋白的western [打印本页]

作者: chenshuanhe 时间: 2013-5-7 16:10 标题: 【求助】大分子蛋白的western

我要做350KD的蛋白，电泳需要跑到多大的marker出胶为止？我的内参是GAPDH（34KD）能否同时做？
同时，还想弱弱的问一下，在帖子上看大家有的电转是衡流有的是衡压，哪个好？

作者: youyou99 时间: 2013-5-7 16:11

这个需要经验吧，恒压恒流其实效果差不多的，一般一块胶就用恒流，2块一起转就用恒压吧，这么大分子量的蛋白真没做过啊。内参是需要同时做的

作者: u234 时间: 2013-5-7 16:11

不能一起转，要分为两块胶。因为这么大的蛋白，如果你的技术稍微不好，就需要通过降低胶浓度弥补转膜的低效，因此GAPDH必然跑出去（此外，做DNA、RNA采用GAPDH做内参；蛋白则是核内tubulin，核外actin）。不过如果你用梯度胶，那我就说不上话了，没做过。
应该恒压，因为你必须采用湿转，而湿转通常恒压；而半干一般恒流。
跑多大的出去，看你的胶了，其实不用问这个问题，把溴酚蓝跑到底就对了。

作者: owanaka 时间: 2013-5-7 16:12

非常感谢楼上！
我还有些不明白：我用6%的分离胶，溴酚蓝跑到底后，将胶切开，GAPDH和靶蛋白分开转还是用12%的胶再单跑一次GAPDH？
另外，转膜条件30v，4度过夜可否？我们通常用的都是含20%甲醇的转膜液（电转液不含SDS，电泳液含SDS），从网上看有的帖子说大分子蛋白转膜液中可加0.1-0.05%的SDS，正确否？已经做了很多次了，一次也没做出来过。急需帮助！！

作者: zzzz 时间: 2013-5-7 16:13

350KD的蛋白和GAPDH不好一起转的，GAPDH（34KD）用一般的电转条件就可以，但是350KD的蛋白，我们做的话一般电泳buffer，电转buffer都是另外配置的和一般的电泳，电转buffer不一样的，蛋白分子太大电转的电压和时间都会不一样的。肯定是要分开转的。

作者: ffooll 时间: 2013-5-7 16:16

我以前在一个帖子里提过，没有这个问题切题，我就来稍微叙述一下我的经验：
1.首先是，可以同时跑，我经常做15kD和450kD的两个蛋白，同时在一块胶上做。不需要制备梯度胶，直接制备三层胶即可。最下一层15%分离胶，中间一层8%分离胶，或者优化8% low-bis分离胶，最上一层当然是常规的浓缩胶。这样做出来基本和梯度胶分离效果相当。在跑的时候不需要多大的技巧，你会看到当指示剂进入最下层的15%分离胶后，电泳速度明显变慢，但在上面的大分子量marker还是继续往下跑，最后指示剂不会跑出胶底端，同时250kD（我们的经验）会在距离分离胶/浓缩胶界面下1-1.5cm处，足够做很大分子量的蛋白。

注意一点：该方法对于处于界面的蛋白效果不是很好，可能会有蚯蚓状的条带，我所知道的是如果用8% low-bis和15%分离胶，Actin会出现蚯蚓状条带。不同的组合结果会不一样，大家可以试一下。

2. 第二，可以同时转。没有太多要说的，只是注意我们使用的是NC膜，最近没有试过PVDF膜了（但是我想结果应该是没有太大区别的）。半干转100V恒压，加入搅拌子stir，Bio-Rad小型转膜仪2h足够。20mA恒流cold room过夜也是做过的，效果相当，不推荐，浪费时间。

附上我的low-bis分离胶的配方：
1.5M Tris PH8.8 12.5ml
10% SDS 0.5ml
40% acrylamide 7ml
30% acrylamide/Bis 4ml
H2O 26ml
如果你没有现成配好的纯的acrylamide，可以按照上面配方的计算，效果一样的。

最后附上我的图片：

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16081

作者: zranqi_1 时间: 2013-5-7 16:17

我以前在一个帖子里提过，没有这个问题切题，我就来稍微叙述一下我的经验：
1.首先是，可以同时跑，我经常做15kD和450kD的两个蛋白，同时在一块胶上做。不需要制备梯度胶，直接制备三层胶即可。最下一层15%分离胶，中间一层8%分离胶，或者优化8% low-bis分离胶，最上一层当然是常规的浓缩胶。这样做出来基本和梯度胶分离效果相当。在跑的时候不需要多大的技巧，你会看到当指示剂进入最下层的15%分离胶后，电泳速度明显变慢，但在上面的大分子量marker还是继续往下跑，最后指示剂不会跑出胶底端，同时250kD（我们的经验）会在距离分离胶/浓缩胶界面下1-1.5cm处，足够做很大分子量的蛋白。

注意一点：该方法对于处于界面的蛋白效果不是很好，可能会有蚯蚓状的条带，我所知道的是如果用8% low-bis和15%分离胶，Actin会出现蚯蚓状条带。不同的组合结果会不一样，大家可以试一下。

2. 第二，可以同时转。没有太多要说的，只是注意我们使用的是NC膜，最近没有试过PVDF膜了（但是我想结果应该是没有太大区别的）。半干转100V恒压，加入搅拌子stir，Bio-Rad小型转膜仪2h足够。20mA恒流cold room过夜也是做过的，效果相当，不推荐，浪费时间。

附上我的low-bis分离胶的配方：
1.5M Tris PH8.8 12.5ml
10% SDS 0.5ml
40% acrylamide 7ml
30% acrylamide/Bis 4ml
H2O 26ml
如果你没有现成配好的纯的acrylamide，可以按照上面配方的计算，效果一样的。

最后附上我的图片：

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很漂亮的结果！

作者: ending 时间: 2013-5-7 16:17

6%分离胶适合５０－１５０ＫＤ，更大的应该用低浓度的了

作者: caihong 时间: 2013-5-7 16:18

我发现大家对分离胶的浓度与其分离范围的认识都不太一致，什么说法都有，很困惑！

作者: 3N4G 时间: 2013-5-7 16:18

我以前在一个帖子里提过，没有这个问题切题，我就来稍微叙述一下我的经验：
1.首先是，可以同时跑，我经常做15kD和450kD的两个蛋白，同时在一块胶上做。不需要制备梯度胶，直接制备三层胶即可。最下一层15%分离胶，中间一层8%分离胶，或者优化8% low-bis分离胶，最上一层当然是常规的浓缩胶。这样做出来基本和梯度胶分离效果相当。在跑的时候不需要多大的技巧，你会看到当指示剂进入最下层的15%分离胶后，电泳速度明显变慢，但在上面的大分子量marker还是继续往下跑，最后指示剂不会跑出胶底端，同时250kD（我们的经验）会在距离分离胶/浓缩胶界面下1-1.5cm处，足够做很大分子量的蛋白。

注意一点：该方法对于处于界面的蛋白效果不是很好，可能会有蚯蚓状的条带，我所知道的是如果用8% low-bis和15%分离胶，Actin会出现蚯蚓状条带。不同的组合结果会不一样，大家可以试一下。

2. 第二，可以同时转。没有太多要说的，只是注意我们使用的是NC膜，最近没有试过PVDF膜了（但是我想结果应该是没有太大区别的）。半干转100V恒压，加入搅拌子stir，Bio-Rad小型转膜仪2h足够。20mA恒流cold room过夜也是做过的，效果相当，不推荐，浪费时间。

附上我的low-bis分离胶的配方：
1.5M Tris PH8.8 12.5ml
10% SDS 0.5ml
40% acrylamide 7ml
30% acrylamide/Bis 4ml
H2O 26ml
如果你没有现成配好的纯的acrylamide，可以按照上面配方的计算，效果一样的。

最后附上我的图片：

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真的服了lee800265，我做260的核蛋白，怎么做都不出这种结果，我染过胶，发现250以年蛋白条带就少的可怜，我是湿转，低压过夜跟恒流300ma三小时都试过了，膜上有泳道，不出目的蛋白条带。。。。郁闷中！

作者: cwcwcww 时间: 2013-5-7 16:22

我做260的核蛋白，怎么做都不出这种结果，我染过胶，发现250以年蛋白条带就少的可怜，我是湿转，低压过夜跟恒流300ma三小时都试过了，膜上有泳道，不出目的蛋白条带。。。。郁闷中！

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这个和你做的蛋白表达丰度以及抗体质量都有较大的关系，不要气馁，继续摸索条件。250kD以上的蛋白条带是比较少，但不是没有。另外我也是那我的最好的结果出来的，有时也跑不了这么漂亮的

作者: cwcwcww 时间: 2013-5-7 16:22

我发现大家对分离胶的浓度与其分离范围的认识都不太一致，什么说法都有，很困惑！

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有时大家说的是有效分离范围，有的说的是最佳分离范围，有些是实际的经验。当然会有一些不同。最好的是根据别人的说法，自己亲自实验。说点我自己的经验，25-100kD的蛋白，8-15%的胶都可以做出来，no problem，只是有些比较漂亮，有的比较勉强。10-25kD的15%，100-250kD的8-10%，250kD以上的low-bis 8%或者也可以试试6%（自己没有用过，据说是可以，胶的成形性好于low-bis 8%）。我最近做的抗体比较多，一批样品大概要test 10-12个抗体，这样来说我一般同一批跑两块胶一块low-bis8%/10%，一块low-bis8%/15%，首先做8个抗体，然后strip后再做2-4个不是很重要的抗体，基本上两天就能搞定一批样品的全部检测

当然前提是，这些都是一些预实验，或者说是探索性的，其中有一部分结果比较好可以用在最后文章的figure里，但还有一些我是首先用15well的胶确定了这些样品的趋势与预计吻合后，再重新run一次10well的胶，最终成为figure中可以用的图。我的一些经验仅供参考。

作者: yonger 时间: 2013-5-7 17:55

我正在学习western，请问各位高手，在做组织蛋白western时，用的梳子是多大的啊？宽的和窄的对跑出来的条带弥散有差别吗？还有上样量的选择，若目的条带表达弱，该怎么权衡弥散和上样量的关系啊？？我用的是1mm的10个道宽梳子，上样20ul，蛋白浓度在20mg/ml,出来的内参条带弥散差不多成一条明亮的线，而目的条带还算轮廓清楚就是稍有点弱。我师兄用的是12个道的窄梳子，做细胞可以，但是组织就弥散的更厉害。请各位高手帮帮忙，谢谢啊！！

作者: 89tongzijun 时间: 2013-5-7 17:56

10个道德梳子上20ul没问题啊，是不是蛋白质量不好造成的。另外，转染的时间太长了，会不会把蛋白转过模啊？

作者: 969 时间: 2013-5-7 17:57

我以前在一个帖子里提过，没有这个问题切题，我就来稍微叙述一下我的经验：
1.首先是，可以同时跑，我经常做15kD和450kD的两个蛋白，同时在一块胶上做。不需要制备梯度胶，直接制备三层胶即可。最下一层15%分离胶，中间一层8%分离胶，或者优化8% low-bis分离胶，最上一层当然是常规的浓缩胶。这样做出来基本和梯度胶分离效果相当。在跑的时候不需要多大的技巧，你会看到当指示剂进入最下层的15%分离胶后，电泳速度明显变慢，但在上面的大分子量marker还是继续往下跑，最后指示剂不会跑出胶底端，同时250kD（我们的经验）会在距离分离胶/浓缩胶界面下1-1.5cm处，足够做很大分子量的蛋白。

注意一点：该方法对于处于界面的蛋白效果不是很好，可能会有蚯蚓状的条带，我所知道的是如果用8% low-bis和15%分离胶，Actin会出现蚯蚓状条带。不同的组合结果会不一样，大家可以试一下。

2. 第二，可以同时转。没有太多要说的，只是注意我们使用的是NC膜，最近没有试过PVDF膜了（但是我想结果应该是没有太大区别的）。半干转100V恒压，加入搅拌子stir，Bio-Rad小型转膜仪2h足够。20mA恒流cold room过夜也是做过的，效果相当，不推荐，浪费时间。

附上我的low-bis分离胶的配方：
1.5M Tris PH8.8 12.5ml
10% SDS 0.5ml
40% acrylamide 7ml
30% acrylamide/Bis 4ml
H2O 26ml
如果你没有现成配好的纯的acrylamide，可以按照上面配方的计算，效果一样的。

最后附上我的图片：

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不加APS和TEMDE的话，胶好像不能凝啊。

作者: lgm 时间: 2013-5-7 17:59

请教各位前辈，我做的是210KD-240kd之间的分子量的蛋白，分离胶8%，电泳条件：浓缩胶60v，分离胶80v，电泳缓冲液的配方是：Tris30g,Gly144g,SDS10g。转模电压40伏、50伏、60伏、80伏、90伏、95伏、100伏都尝试过，但还是没有做出来过目的条带，转膜缓冲液配方时：Tris30g,Gly144g，稀释为时加入5%的甲醇。不知道是哪一步有问题，老板一直催着要结果，各位可否指导一下，感激不尽。

作者: remenb 时间: 2013-5-7 18:00

我以前在一个帖子里提过，没有这个问题切题，我就来稍微叙述一下我的经验：
1.首先是，可以同时跑，我经常做15kD和450kD的两个蛋白，同时在一块胶上做。不需要制备梯度胶，直接制备三层胶即可。最下一层15%分离胶，中间一层8%分离胶，或者优化8% low-bis分离胶，最上一层当然是常规的浓缩胶。这样做出来基本和梯度胶分离效果相当。在跑的时候不需要多大的技巧，你会看到当指示剂进入最下层的15%分离胶后，电泳速度明显变慢，但在上面的大分子量marker还是继续往下跑，最后指示剂不会跑出胶底端，同时250kD（我们的经验）会在距离分离胶/浓缩胶界面下1-1.5cm处，足够做很大分子量的蛋白。

注意一点：该方法对于处于界面的蛋白效果不是很好，可能会有蚯蚓状的条带，我所知道的是如果用8% low-bis和15%分离胶，Actin会出现蚯蚓状条带。不同的组合结果会不一样，大家可以试一下。

2. 第二，可以同时转。没有太多要说的，只是注意我们使用的是NC膜，最近没有试过PVDF膜了（但是我想结果应该是没有太大区别的）。半干转100V恒压，加入搅拌子stir，Bio-Rad小型转膜仪2h足够。20mA恒流cold room过夜也是做过的，效果相当，不推荐，浪费时间。

附上我的low-bis分离胶的配方：
1.5M Tris PH8.8 12.5ml
10% SDS 0.5ml
40% acrylamide 7ml
30% acrylamide/Bis 4ml
H2O 26ml
如果你没有现成配好的纯的acrylamide，可以按照上面配方的计算，效果一样的。

最后附上我的图片：

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版主您好，看见您的三层胶，非常感兴趣，之前我自己也做过这样的尝试，但是结果好像不好。主要是最下面的分层胶由于脱水卷缩了，我的每一层胶的间隔时间大约均为90分钟。也就是说，倒胶时，由于最下层的分离胶倒好后与最上层积沉胶完全凝固到上样这段时间与原来只有单层的分离胶和积沉胶比，时间至少增加了1.5h，这样是否会导致最下层的分离胶失水干裂？通过什么方法来避免该问题。非常感谢！

作者: remenb 时间: 2013-5-7 18:01

我以前在一个帖子里提过，没有这个问题切题，我就来稍微叙述一下我的经验：
1.首先是，可以同时跑，我经常做15kD和450kD的两个蛋白，同时在一块胶上做。不需要制备梯度胶，直接制备三层胶即可。最下一层15%分离胶，中间一层8%分离胶，或者优化8% low-bis分离胶，最上一层当然是常规的浓缩胶。这样做出来基本和梯度胶分离效果相当。在跑的时候不需要多大的技巧，你会看到当指示剂进入最下层的15%分离胶后，电泳速度明显变慢，但在上面的大分子量marker还是继续往下跑，最后指示剂不会跑出胶底端，同时250kD（我们的经验）会在距离分离胶/浓缩胶界面下1-1.5cm处，足够做很大分子量的蛋白。

注意一点：该方法对于处于界面的蛋白效果不是很好，可能会有蚯蚓状的条带，我所知道的是如果用8% low-bis和15%分离胶，Actin会出现蚯蚓状条带。不同的组合结果会不一样，大家可以试一下。

2. 第二，可以同时转。没有太多要说的，只是注意我们使用的是NC膜，最近没有试过PVDF膜了（但是我想结果应该是没有太大区别的）。半干转100V恒压，加入搅拌子stir，Bio-Rad小型转膜仪2h足够。20mA恒流cold room过夜也是做过的，效果相当，不推荐，浪费时间。

附上我的low-bis分离胶的配方：
1.5M Tris PH8.8 12.5ml
10% SDS 0.5ml
40% acrylamide 7ml
30% acrylamide/Bis 4ml
H2O 26ml
如果你没有现成配好的纯的acrylamide，可以按照上面配方的计算，效果一样的。

最后附上我的图片：

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图片非常漂亮，但我想请教下，跑电泳的时候可以三层胶跑，那转膜的时候条件又如何呢？而且你有合适的marker吗，我也要做近400KD的蛋白，就是苦于没有合适的marker,看不到转没转过去，就是孵不出来。。。

作者: remenb 时间: 2013-5-7 18:01

我以前在一个帖子里提过，没有这个问题切题，我就来稍微叙述一下我的经验：
1.首先是，可以同时跑，我经常做15kD和450kD的两个蛋白，同时在一块胶上做。不需要制备梯度胶，直接制备三层胶即可。最下一层15%分离胶，中间一层8%分离胶，或者优化8% low-bis分离胶，最上一层当然是常规的浓缩胶。这样做出来基本和梯度胶分离效果相当。在跑的时候不需要多大的技巧，你会看到当指示剂进入最下层的15%分离胶后，电泳速度明显变慢，但在上面的大分子量marker还是继续往下跑，最后指示剂不会跑出胶底端，同时250kD（我们的经验）会在距离分离胶/浓缩胶界面下1-1.5cm处，足够做很大分子量的蛋白。

注意一点：该方法对于处于界面的蛋白效果不是很好，可能会有蚯蚓状的条带，我所知道的是如果用8% low-bis和15%分离胶，Actin会出现蚯蚓状条带。不同的组合结果会不一样，大家可以试一下。

2. 第二，可以同时转。没有太多要说的，只是注意我们使用的是NC膜，最近没有试过PVDF膜了（但是我想结果应该是没有太大区别的）。半干转100V恒压，加入搅拌子stir，Bio-Rad小型转膜仪2h足够。20mA恒流cold room过夜也是做过的，效果相当，不推荐，浪费时间。

附上我的low-bis分离胶的配方：
1.5M Tris PH8.8 12.5ml
10% SDS 0.5ml
40% acrylamide 7ml
30% acrylamide/Bis 4ml
H2O 26ml
如果你没有现成配好的纯的acrylamide，可以按照上面配方的计算，效果一样的。

最后附上我的图片：

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主要是我们实验室的转膜工具里并没有搅拌子stir啊，而且平时220KD左右的恒压100V转3H也没有转过去呢。。。

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