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标题: 【讨论帖】抗体纯化及相关应用实验技术讨论帖 [打印本页]

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 15:01 标题: 【讨论帖】抗体纯化及相关应用实验技术讨论帖

在学校做了2年，在一家抗体公司做了5年多的抗体和抗原纯化，经过我的手或者下面员工的手，纯化过的抗体不下几千个了，如果以重量计估计要以斤算……

单抗，多抗

IgG IgM IgY

上清血清腹水蛋黄

疏水抗原免疫亲和嗜硫 proteinA proteinG 硫酸铵沉淀辛酸萃取

……
都做过一些

在抗体纯化或者抗体相关技术方面有需要帮助的战友们（也时常有战友私下发短消息给我，不如发出来，大家一起讨论），欢迎发帖来讨论，大家互相学习，共同提高

作者: NBA 时间: 2013-5-8 15:02

我最近也在做抗体纯化，正苦于没人问。看来楼主是抗体纯化的高手啊，以后要多请教了。

先问个问题，从血清纯化IgG，需要经过哪些纯化步骤？我现在是用辛酸-硫酸铵沉淀，然后过DEAE-纤维素阴离子交换柱，感觉效果不太好。

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 15:03

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我最近也在做抗体纯化，正苦于没人问。看来楼主是抗体纯化的高手啊，以后要多请教了。

先问个问题，从血清纯化IgG，需要经过哪些纯化步骤？我现在是用辛酸-硫酸铵沉淀，然后过DEAE-纤维素阴离子交换柱，感觉效果不太好。 ...

高手不敢当啊，就是纯化过不少抗体而已
纯化抗血清，如果有纯抗原（0.5mg以上）都推荐做抗原免疫亲和纯化，其次是proteinA的亲和纯化。再其次是用硫酸铵分级沉淀。

作者: wood533 时间: 2013-5-8 15:04

本来我很有些反对那个年终排名的，没想到能把楼主引出来开这个帖子，有幸！

关于抗体纯化，看起来很简单，protocol一堆一堆的，当然，如果只是纯化一点少量抗体做试验室的试验用，抗体纯化很简单。

但实际上做过几十个或上百个以上抗体纯化的老手就会知道，抗体纯化不简单！甚至比那些大肠杆菌表达的重组蛋白要难。做商品化应用的抗体纯化同行们也有此体会吧？
难有几个方面。

例如原料的差异。无论是单抗腹水还是多抗血清，不能保证每批原料的相同，有时候甚至差异很大。当一批纯化抗体出现问题时，是原料原因引起还是纯化过程引起的排查就很有得受。而重组的E.Coli.或酵母蛋白相对要均一性的多。

例如抗体活性的保持。对重组E.Coli.或酵母蛋白，如果是可溶蛋白，其活性往往较稳定，只要不降解，变化不大。而抗体却表现的很微妙。缓冲液、温度或纯化用柱的细微变化往往会带来差异较大的结果。

非常高兴楼主开这个帖子。我先来问一个问题。
在单抗腹水前处理过程中，由于免疫方式的不同，有些腹水往往含有较多的石蜡油，造成过滤困难，而且会堵纯化的在线过滤器和柱头，也会粘附在纯化胶上，如何通过前处理过程去除呢？希望对抗体的损失不大。

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 15:04

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本来我很有些反对那个年终排名的，没想到能把楼主引出来开这个帖子，有幸！

关于抗体纯化，看起来很简单，protocol一堆一堆的，当然，如果只是纯化一点少量抗体做试验室的试验用，抗体纯化很简单。

但实际上做过几十个或上百个以 ...

说的很专业

很多实验技术，都是看起来原理简单，方法常规，但是真正做起来就会发现这样那样的问题和情况，你遇到过，就会知道实际情况比理论要复杂，这个就是所谓的经验了。

腹水里面和血清里面，有时经常有油脂类或者SKYKILLER提到的石蜡油，很讨厌，我们也经常遇到。

我们一般是使用稀释液把样品稀释，然后高速离心，然后小心拿出来，油脂类的会浮在液面上，然后就用棉签之类的挑去。样品稍微会有些损失，但是因为稀释过了，单位体积里的抗体损失比原液就少很多。

不知道还有没有什么更好的方法:p
期待路过的大侠们多发表意见

作者: wood533 时间: 2013-5-8 15:05

多谢楼主回答我的问题。再问一下楼主，纯化抗体需要哪些仪器和材料？可以从哪里购买？我现在手头基本上一无所有。刚才上GE的网站，找到他们北京办事处的电话，想问问他们的层析柱，居然全是空号。

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 15:06

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多谢楼主回答我的问题。再问一下楼主，纯化抗体需要哪些仪器和材料？可以从哪里购买？我现在手头基本上一无所有。刚才上GE的网站，找到他们北京办事处的电话，想问问他们的层析柱，居然全是空号。 ...

对于小量纯化而言，其实对设备的要求是很低的。尤其是亲和色谱

关键在技术和填料，填料有进口国产之分（技术不分国产和进口哈）

因为工作的便利，个人几乎用过抗体纯化领域所有进口知名厂家的填料和国产某些厂家的填料。
感觉GE的填料整体上是业界最好的，但是单项来看不一定是最出色的。
不少厂家都有拿手的填料，有些国产的产品也是不错的。

人家嫩生存必有其道理所在，虽然GE（或者叫amersham亦或Pharmacia）在生物纯化这个领域还是一家独大。

还有一个建议，不一定要买最贵的填料，适合自己，能满足自己需要的，价格最便宜的，就是好填料！

实验室设备主要需要有离心机分光光度计注射器空柱子填料连接管线等等

不过个人的意见：如果像你这种以前也没做过，也没设备，不需要建立纯化平台，又不需要靠纯化抗体来发文的，其实我更建议你找个外面的公司外包算了，免疫亲和纯化一个抗体也就是1，2千块的事情，这样比一穷二白，自力更生建立这个体系方便实惠的多

作者: wood533 时间: 2013-5-8 15:06

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对于小量纯化而言，其实对设备的要求是很低的。尤其是亲和色谱

关键在技术和填料，填料有进口国产之分（技术不分国产和进口哈）

因为工作的便利，个人几乎用过抗体纯化领域所有进口知名厂家的填料和国产某些厂家的填料。
...

我是在公司做生产，正是想建立纯化平台的，又不知道如何下手。楼主有GE的销售或客服部门的电话吗？

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 15:07

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原帖由 wood533 于 2013-5-8 15:06 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我是在公司做生产，正是想建立纯化平台的，又不知道如何下手。楼主有GE的销售或客服部门的电话吗？

我不知道您在什么区域

我在浙江这边，GE的试剂耗材找的国药，GE的设备找的是一个销售人员

作者: ritou1985 时间: 2013-5-8 15:07

楼主，那我想请问，你们所用稀释液怎么配置的啊？！

作者: DDD 时间: 2013-5-8 15:09

我做过多次，玻璃纤维没有用过，但滤纸过滤是绝对除不干净的，还会引起一定的乳化作用。

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呵呵，除石蜡不用那么麻烦吧，就能去掉，滤纸、玻璃纤维等都可以用的；

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 15:10

那我想请问，你们所用稀释液怎么配置的啊？！

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稀释液要看用途的，不同的需要用不同的组分

如果只是稀释一下腹水样品，可以用PBS或者纯水，如果抗体丰度低，不推荐稀释很多倍

抗体浓度太低，影响过柱时的结合

作者: DDD 时间: 2013-5-8 15:10

我对抗体纯化的看法是：不用亲和柱，离子交换柱、疏水柱、羟磷灰石等足以纯化任何抗体，而且费用低廉，又高效。

作者: TNT 时间: 2013-5-8 15:11

最近实验室做了些兔多抗，染出来特异性很差，杂带多而且很亮，想纯化一下又没有经验，请问楼主
1我们没有染出目的条带，不知道做完纯化能不能实现从无到有
2有两条杂带每次都有，在55KD-72KD一条，42KD-55KD一条，以楼主经验看，这是什么带啊，什么原因
3不知道抗体纯化对技术要求怎么样，我们没有做过的这种实验。
4楼主有没有比较推荐的详细步骤
5看了楼主是公司的大牛了，实验室以后还要制备抗体，不知道楼主对抗体制备和纯化的公司和条件有没有什么推荐

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 15:11

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原帖由 TNT 于 2013-5-8 15:11 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

最近实验室做了些兔多抗，染出来特异性很差，杂带多而且很亮，想纯化一下又没有经验，请问楼主
1我们没有染出目的条带，不知道做完纯化能不能实现从无到有
2有两条杂带每次都有，在55KD-72KD一条，42KD-55KD一条，以楼主经验看，这是 ...

您指的兔多抗染出来是拿兔血清直接做的WB?

1,血清当一抗直接做WB，如果没有主带，纯化后有可能做出来，特异性的抗原亲和纯化可以起到一定的浓缩作用，但是也有可能做不出来，毕竟纯化不是万能的。

另外对于WB，我想建议的是，如果有抗原蛋白，最好拿抗原蛋白跑胶做阳性对照，其次拿细胞裂解液或者组织裂解液做筛选，如果一种细胞裂解液做了好几次都失败，阳性CONTROL每次都出来，可以考虑换几个细胞株的裂解液试试。

2，你说的杂带，最好把图贴出来，标明裂解液

3，4抗体纯化做做是不难，只要一路都顺利。详细的PROTOCOL坛子里应该有，可以搜索一下。

5，制备抗体，如果自己有建立平台和靠抗体制备发文的需求，那不管多难都要自己做的；如果只是短时间需要用到，买又买不到，可以考虑外包给专业的公司做。

作者: plaa 时间: 2013-5-8 15:12

我想问楼主，就是我做抗原亲和纯化抗血清，用pH2.5 Gly洗脱时，前2管总是有沉淀，您说沉淀是什么呀？

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 15:12

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原帖由 plaa 于 2013-5-8 15:12 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我想问楼主，就是我做抗原亲和纯化抗血清，用pH2.5 Gly洗脱时，前2管总是有沉淀，您说沉淀是什么呀？

多抗比单抗容易沉淀，不同的抗体，互相聚集沉淀的最低浓度是不一样的。

你这个可能刚好碰到这个抗体比较容易沉淀。

你可以改变这个洗脱液的PH ，其实3就够了，没必要非2.5不洗。

另外可以减慢点洗脱流速，让抗体在配基上缓慢脱落，或者减少一次上样量。

预防为主，这样的沉淀，大部分后期是无法复容的。

其他方法也有，比如加甘油什么的，但是我觉得添加剂这个东西，看后期实验需要，有时能不加最好不加

作者: DDD 时间: 2013-5-8 15:13

您是说沉淀的肯定是我的抗体吗？
而且沉淀只能扔掉是吧？
怎样减慢洗脱速度呢？我是靠重力流出的。

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 15:14

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原帖由 DDD 于 2013-5-8 15:13 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
您是说沉淀的肯定是我的抗体吗？
而且沉淀只能扔掉是吧？
怎样减慢洗脱速度呢？我是靠重力流出的。

只要你上完样，平衡柱子彻底（10倍柱体积以上），那沉淀的一般都是抗体，而且多抗发生这种情况居多。

像你这种重力流的，流速已经很慢了，那你就减少些单次血清上样量，多纯化几次也一样能拿到大部分抗体

作者: DDD 时间: 2013-5-8 15:14

沉淀是在洗脱出来形成的，那么在预先收集的管子里先装上偏碱性的缓冲液来中和酸性洗脱液，会有好的效果，可以防止沉淀形成。

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 15:18

兄台说的在管子中预先加一定比例的中和液然后接收洗脱液后，立刻晃匀，这是标准做法。

但也有特例，在我们遇到的一些沉淀的案例中，洗脱的时候，柱子下出水口就会看到混浊沉淀流出，而不是因为没有中和的原因，当然有时轻微的沉淀，你把收集的管子立刻摇晃，沉淀也会消失。

很多年前，我用一个5ml的proteinA柱子纯化过量血清时，一洗脱，流出来的洗脱液不一会儿就在管道中变白色，当时着实吓了我一跳，呵呵

作者: BOSS2011 时间: 2013-5-8 15:20

您指的兔多抗染出来是拿兔血清直接做的WB?

另外对于WB，我想建议的是，如果有抗原蛋白，最好拿抗原蛋白跑胶做阳性对照，其次拿细胞裂解液或者组织裂解液做筛选，如果一种细胞裂解液做了好几次都失败，阳性CONTROL每次都出来，可以考虑换几个细胞株的裂解液试试。

用抗原蛋白做了WB，结果可以出来，曾用买来的蛋白做细胞株的也染出来了，就是量比较低，但用血清就染细胞株裂解液就不行了
这个血清也是请公司做的，可惜不行

我试着纯化一下吧，希望可以大大提高

作者: orangecake 时间: 2013-5-8 15:20

不知道楼上可否把具体的你们纯化时（包括单抗和多抗的）认为比较理想的PROTOCOL拿出来分享？我想大家可以在你的推荐下进行操作，这样大家纯化后出了问题也可以在这个帖子下进行讨论。这样不就可以有的放矢了吗？

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 15:21

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原帖由 orangecake 于 2013-5-8 15:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
不知道楼上可否把具体的你们纯化时（包括单抗和多抗的）认为比较理想的PROTOCOL拿出来分享？我想大家可以在你的推荐下进行操作，这样大家纯化后出了问题也可以在这个帖子下进行讨论。这样不就可以有的放矢了吗？ ...

这个世界上没有万能的protocol，不同的实验材料，不同的仪器设备，不同的人的理解，都有可能在同一份protocol下做出不同的实验结果。针对不同的项目，我们这里也有不同版本的protocol，基于我们实验室的条件和环境。

在这个帖子里，我还是希望以帮助大家分析疑难杂症为主，而不是在这里讲经说道，实在没这个底气和能力。

望斑竹理解。

作者: lixi559 时间: 2013-5-8 15:21

我想从羊多抗中纯化针对一个多肽片段的抗体，用多肽连接NHS-activated FF（GE）柱子，但说明书中没讲柱体积和配体应该按什么比例进行偶联，如果按摩尔数1：1的话，需要量很大，大概要30mg左右,不太可行。想问下有经验的人，应该怎么选择什么浓度？

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 15:22

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原帖由 lixi559 于 2013-5-8 15:21 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我想从羊多抗中纯化针对一个多肽片段的抗体，用多肽连接NHS-activated FF（GE）柱子，但说明书中没讲柱体积和配体应该按什么比例进行偶联，如果按摩尔数1：1的话，需要量很大，大概要30mg左右,不太可行。想问下有经验的人，应该怎么选 ...

你想用一个多肽片段去抗原免疫亲和羊血清中的特异性抗体？

多肽一般都是1-2KD，抗体份子是150KD，所以摩尔比是75-150倍

也就是说理论上你要纯化出75mg特异性多抗，只要1mg多肽就够了

呵呵，不过以上都是理论上的，实际真正在应用领域，需要考虑多肽的纯度，多肽的长度，多肽偶联在填料上后的空间位阻，你偶联的化学反应效率，你填料的配基密度，你血清的特异性抗体丰度等等……

我推荐你如果羊血清足够多的化，用10-15mg多肽（纯度>70%）去偶联5ml的活化填料吧。

作者: abc816 时间: 2013-5-8 15:29

想问一下用GE公司的1mlHis柱纯化抗体，可见有洗脱峰，电泳液跑出目的条带，但是ELISA没有检测活性很弱请问是怎么回事啊？谢谢

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 15:30

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想问一下用GE公司的1mlHis柱纯化抗体，可见有洗脱峰，电泳液跑出目的条带，但是ELISA没有检测活性很弱请问是怎么回事啊？谢谢

为什么用HIS柱（兰色的镍柱）纯化抗体？

作者: abc816 时间: 2013-5-8 15:30

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为什么用HIS柱（兰色的镍柱）纯化抗体？

是因为抗体的羧基端有His和c-myc标签，纯化是用His标签，检测是用c-myc标签

作者: abc816 时间: 2013-5-8 15:31

可能没表达清楚，蛋白是原核表达，载体上有His和c-myc标签，故利用His标签来纯化

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 15:31

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可能没表达清楚，蛋白是原核表达，载体上有His和c-myc标签，故利用His标签来纯化

你抗原蛋白上有6HIS标签是不错，但是你抗体上不会有6HIS标签啊

作者: abc816 时间: 2013-5-8 15:31

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你抗原蛋白上有6HIS标签是不错，但是你抗体上不会有6HIS标签啊

我的抗体就是原核表达的重组蛋白，是一个单链抗体

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 15:32

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原帖由 abc816 于 2013-5-8 15:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我的抗体就是原核表达的重组蛋白，是一个单链抗体

哦，我以为你抗原是HIS融合蛋白，抗体是天然表达的完整抗体。

原来你表达的是单链抗体.

你说你的洗脱产物没有活性，那你原液流穿有没有同一块板子测过活？

测的是C-MYC？

作者: abc816 时间: 2013-5-8 15:33

测的是c-myc，原液有，流出液也有但较弱，不知道是不是洗脱的时候蛋白变性了

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 15:34

那有可能你这个单链抗体在纯化的过程中失活

最好你把电泳结果和ELISA结果都放上来，那样看的更全面

现在做单链抗体的不多了，就是因为单链抗体不稳定，相对比较容易失活

作者: eric930 时间: 2013-5-8 15:35

抗原免疫亲和纯化怎么做？我想纯化多肽抗体。到Pubmed上找相关文献，不知道用什么关键词，没找到。您手上有这方面的文献吗？

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 15:35

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抗原免疫亲和纯化怎么做？我想纯化多肽抗体。到Pubmed上找相关文献，不知道用什么关键词，没找到。您手上有这方面的文献吗？

mmunoaffinity purification

主要分抗原的偶联，亲和柱制备，血清的处理，纯化和鉴定这几个大步骤

没有固定的万金油protocol的

作者: sunshine039 时间: 2013-5-8 15:36

单链抗体亲和力是很弱的

作者: sunshine039 时间: 2013-5-8 15:36

如果是基因重组的，会更弱

作者: remenb 时间: 2013-5-8 15:38

你想用一个多肽片段去抗原免疫亲和羊血清中的特异性抗体？

多肽一般都是1-2KD，抗体份子是150KD，所以摩尔比是75-150倍

也就是说理论上你要纯化出75mg特异性多抗，只要1mg多肽就够了

呵呵，不过以上都是理论上的，实际真正在应用领域，需要考虑多肽的纯度，多肽的长度，多肽偶联在填料上后的空间位阻，你偶联的化学反应效率，你填料的配基密度，你血清的特异性抗体丰度等等……

我推荐你如果羊血清足够多的化，用10-15mg多肽（纯度>70%）去偶联5ml的活化填料吧。

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谢谢指导，我用2mg的多肽连到1ml柱子上，纯化15-20ml的羊血清（针对该多肽的效价为10^4，预先经protein A纯化过），结果不好，不仅纯化后的抗体不纯，漏过液中还有未结合的针对该多肽的抗体，不知道什么原因？是柱子连接的问题，还是纯化过程的问题？
那个偶联多肽的时候，由于说明书上要求用高浓度的Na盐做偶联buffer,我的多肽在里面不溶，就用的水溶解的，不知道是不是这个原因啊？？？

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 15:38

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原帖由 remenb 于 2013-5-8 15:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你想用一个多肽片段去抗原免疫亲和羊血清中的特异性抗体？

多肽一般都是1-2KD，抗体份子是150KD，所以摩尔比是75-150倍

也就是说理论上你要纯化出75mg特异性多抗，只要1mg多肽就够了

呵呵，不过以上都是理论上的，实际真正在 ...

你说的10E4是什么概念？ ELISA测的？多少稀释度下，OD读数是多少，最好用这个来表示

比如你告诉我OD值大于0.3的时候，你的血清样品稀释了多少倍，这样我才好判断你的血清效价

抗体不纯，最好能提供SDS-PAGE结果照片

流穿里还有阳性抗体残留，这个都有可能

偶联的原因也有

作者: remenb 时间: 2013-5-8 15:39

血清稀释1：10^4的时候OD值0.29，抗体不纯是说纯化后的抗体不仅能和我纯化的多肽片段反应，还有和其他片段反应的抗体，效价比目的片段低一个数量级，10^3左右
不知道应该怎么鉴定柱子偶联的是不是成功呢

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 15:41

1：10000稀释度，OD等于0.29，这样的滴度以我们的标准来衡量是中低，不过也不算最差

抗体的特异性不好，这个可能跟你抗原设计有关，抗原的序列本身同源性高，就容易交叉

作者: flower-201 时间: 2013-5-8 15:42

请教几个问题：
关于嗜硫，proteinA和proteinG不是太明白他们的区别：
1.嗜硫(Thiophilic Resin)和 protein A resin的区别：
在clontech公司网站上这样介绍嗜硫树脂：
Both Thiophilic-Uniflow and -Superflow Resins utilize thiophilic adsorption chromatography. With this technique, protein adsorbs to a sulfone thioether ligand. The adsorption of different proteins can be promoted by adding different salts to the mixture. Varying the concentration of the loading salt can affect the adsorption affinities of IgG, IgM, IgA, Fab and Fc fragments, and C3 and C4 complement factors (1).

Purification with Thiophilic Resins offers several advantages over purification with Protein A, the conventional method used for immunoglobulin purification:

Purification at neutral pH
High linear flow rates
High capacity (15–20 mg Ab/ml resin)
Broader selectivity (IgY, IgM, IgE, scAb)
Reusability
Higher stability of the purified product
好像嗜硫树脂的优点非常多，但是在实际应用中，好像大部分人还是倾向于protein A resin。我没有实际应用过这两种树脂，想问一下实际应用中这两种树脂的差别？

2.proteinA和proteinG的区别：
我知道在免疫沉淀实验时候同时用proteinA和proteinG效果会比较好，但是他们的区别是什么呢？何时用proteinA比较好，何时用proteinG比较好呢？

3.据我了解，proteinA有普通蛋白的也有重组蛋白的，重组蛋白会删掉一些非特异结合区域。想问一下在实际应用中你们用那种比较多？如果我想开发商品化的proteinA resin，从使用者角度对我有什么建议？

不好意思一下问了这么多问题，有的可能比较初级。
先谢谢了！

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 15:44

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原帖由 flower-201 于 2013-5-8 15:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请教几个问题：
关于嗜硫，proteinA和proteinG不是太明白他们的区别：
1.嗜硫(Thiophilic Resin)和 protein A resin的区别：
在clontech公司网站上这样介绍嗜硫树脂：
Both Thiophilic-Uniflow and -Superflow Resins utilize ...

嗜硫不是一种特异性亲和，是疏水+亲硫
所以特异性不如proteinA好，还有吸附力也是proteinA强

先回答你proteinA和rProteinA的区别

天然的proteinA是提取自金黄色葡萄球菌表面的膜蛋白，重组的proteinA则是大肠杆菌重组表达的。

重组的优点是通过基因工程改造，使得FC片段的结合区域增多，另外更好的rProteinA在改造的时候在proteinA的原有序列上，在特定的位置编入一个Cystein，使得在和环氧填料结合时，能特异性的定向偶联。这样做也是为了提高载量。

proteinG其实现在已经没什么优点了，以前早起的proteinA载量低，亲和力弱，所以用proteinG亲和力强和对IgG亚型广谱的优点。

但是现在rProteinA已经可以替代proteinG

作者: 831226 时间: 2013-5-8 15:45

但是现在rProteinA已经可以替代proteinG

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对单抗IgG，基本上绝大部分都可以替代。
但是对多抗血清，很多时候还是不能替代的。例如，羊多抗血清（goat）。

作者: ukonptp 时间: 2013-5-8 15:46

看了大家的讨论，受益很多!
Protein A和protein G还是不能完全替代。某些种属的抗体如rabbit，还是需要protein G。
对于生物制药，一般为人抗体(多为IgG，当然也有IgM等)，除human IgG3外，都可以用protein A，所以，protein A的填料发展近年较迅猛些。

无论是research还是生产，填料的清洗和寿命是非常关键的，尤其是近年SFDA对清洗验证的要求，所以能否耐碱是非常关键的。SuRe填料无疑是最佳，去年，Genentech也已经将生产用protein A升级到SuRe，是新填料技术降低了药企的生产成本。

[ 本帖最后由 ukonptp 于 2013-5-8 15:48 编辑 ]

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 15:48

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原帖由 ukonptp 于 2013-5-8 15:46 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

看了大家的讨论，受益很多!
Protein A和protein G还是不能完全替代。某些种属的抗体如rabbit，还是需要protein G。
对于生物制药，一般为人抗体(多为IgG，当然也有IgM等)，除human IgG3外，都可以用protein A，所以，protein A的填 ...

从我纯化的无数兔单抗和多抗的经验来看，对于rabbit IgG，mabselect SuRe(rproteinA）完全可以取代proteinG

我们还用SuRe纯化过小鼠的腹水，效果也比proteinG好

作者: ukonptp 时间: 2013-5-8 15:49

很多时候我们会发现，即使种属和亚型一样，亲和结合和洗脱的条件可能也会大相径庭，再比如很多时候低pH洗脱的方式就是不合适的。
作为生物药物的重磅炸弹，治疗用单抗上下游工艺要考虑的问题可能会稍多一些。
多抗和单抗还是会有一定的差别，另外兔单抗在很多方面优于鼠抗，laboy这方面能否可以多分享一些？

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 15:50

很多时候我们会发现，即使种属和亚型一样，亲和结合和洗脱的条件可能也会大相径庭，再比如很多时候低pH洗脱的方式就是不合适的。
作为生物药物的重磅炸弹，治疗用单抗上下游工艺要考虑的问题可能会稍多一些。
多抗和单抗还是会有一定的差别，另外兔单抗在很多方面优于鼠抗，laboy这方面能否可以多分享一些？

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兔单抗和鼠单抗各有优缺点吧

作者: ukonptp 时间: 2013-5-8 15:50

其实这个问题，色谱兄也提到过，比如最常见的就是某些抗体在pH下易聚集沉淀，这样低pH洗脱中和后，得到抗体是沉淀的。
解决方案：根据我的经验，可以选用配基亲和力适中的亲和层析方法（包括自己偶联配基时的配体选择，亲和常数要适中，既保证高的选择性，又兼顾洗脱方式尽量温和），这样洗脱条件温和有利于避免蛋白的沉淀变性；其次，洗脱的缓冲液中可以加入添加剂，如有文献报道arg了，同样的pH下，arg和w/o arg的洗脱强度有显著差异；另外，有的只能选用其他方式，如HIC等。
曾经做过同样是mouse的IgG2a,但洗脱pH相差很大，所以多数情况下可以按一般的protocol来操作，但遇到问题的时候只能具体分析了，抛砖引玉，呵呵

作者: ffooll 时间: 2013-5-8 15:51

其实,如果不采用亲和层析,就不会有沉淀出现了.并非亲和层析是抗体纯化的首选

作者: orangecake 时间: 2013-5-8 15:51

请问楼主住否做过抗体亲和力改造实验可能是要做基因工程改造
是否有好的参考的资料实验的大致方法如何周期多长谢谢

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 15:52

抗体的修饰，根据不同的需要，现在常用的主要是人源化糖基化 PEG化
至于修饰后的亲和力变化，那还是需要经过筛选才能知道，也许变好也许变坏，这个没有什么特别的规律和诀窍，修饰以后的抗体活性只有检测才知道，很难事先预测，定向突变。

尤其是人源化，在抗体药的研发道路上是不可避免的，有时过分追求100%的人源化，往往对抗体的损害是实现意想不到的。

总的来说对于蛋白质的功能结构，人类了解的还不透彻，所以擅自的改动，经常有意外

方法可以看看相关的书籍，这方面都是抗体技术比较前沿的东西，一般厂家都比较神秘，呵呵

作者: ladyhuahua 时间: 2013-5-8 15:53

我们也是离心后，用10ml注射器针头平端沿内壁下移至腹水层将腹水慢慢吸出来，这样可以避免石蜡油污染~··

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很多实验技术，都是看起来原理简单，方法常规，但是真正做起来就会发现这样那样的问题和情况，你遇到过，就会知道实际情况比理论要复杂，这个就是所谓的经验了。

腹水里面和血清里面，有时经常有油脂类或者SKYKILLER提到的石蜡油，很讨厌，我们也经常遇到。

我们一般是使用稀释液把样品稀释，然后高速离心，然后小心拿出来，油脂类的会浮在液面上，然后就用棉签之类的挑去。样品稍微会有些损失，但是因为稀释过了，单位体积里的抗体损失比原液就少很多。

不知道还有没有什么更好的方法:p
期待路过的大侠们多发表意见

作者: 911 时间: 2013-5-8 15:53

楼主，请问一个问题，我们准备抗体，用免疫亲和纯化以后，用pbs缓冲液透析，经常会发现抗体出现沉淀的情况，请问这是什么原因，该如何避免？

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 15:54

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原帖由 911 于 2013-5-8 15:53 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼主，请问一个问题，我们准备抗体，用免疫亲和纯化以后，用pbs缓冲液透析，经常会发现抗体出现沉淀的情况，请问这是什么原因，该如何避免？

多抗吧

你用PBS透析只是为了缓冲液置换？

那我推荐你用超滤的方法，塞托利斯的离心式超滤管。透析的时间太长，我们一般不采用。

但是既然你这个抗体那么容易沉淀，你超滤的时候工作浓度最好也别太高，建议低于0.5mg/ml

作者: 911 时间: 2013-5-8 15:55 标题: 回复 #58 蒜泥面条的帖子

是多抗，纯化以后ph太低，需要有pbs透析。请问沉淀是什么原因导致的，浓度太大？出现这种情况和抗体的质量有关系么？

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 15:55

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原帖由 911 于 2013-5-8 15:55 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
是多抗，纯化以后ph太低，需要有pbs透析。请问沉淀是什么原因导致的，浓度太大？出现这种情况和抗体的质量有关系么？

你洗脱后没用TRIS中和到pH7？

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 15:56

说错了，是中和以后，需要透析到pbs体系，出现沉淀

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 15:57

pH测过没？

可以稍微调整一下pH

不过我还是建议你换超滤吧

透析时间长，抗体失活和聚集的几率都高

作者: ha111 时间: 2013-5-8 15:59

我现在正准备做重组蛋白去除内毒素方面的工作，看了一些相关资料，可还是一头雾水，如果哪位前辈有这方面的经验，望不吝赐教，万分感谢！也感谢楼主开这样一个帖子，给大家提供一个学习的平台。

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 15:59

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原帖由 ha111 于 2013-5-8 15:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我现在正准备做重组蛋白去除内毒素方面的工作，看了一些相关资料，可还是一头雾水，如果哪位前辈有这方面的经验，望不吝赐教，万分感谢！也感谢楼主开这样一个帖子，给大家提供一个学习的平台。 ...

你是大肠杆菌表达还是真核细胞表达？

作者: ha111 时间: 2013-5-8 16:00

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你是大肠杆菌表达还是真核细胞表达？

是大肠杆菌表达的带有His标签的一种蛋白

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 16:00

大肠杆菌的重组蛋白要去内毒素达标那是相当麻烦滴了

你镍柱下来后的样品内毒素检过没？在多少EU/ML的水平？

后期要去除高含量的内毒素，不是那么容易的，当初制定的工艺路线就有问题。

应该选择用细胞真核表达，全程控制内毒素的水平

作者: ha111 时间: 2013-5-8 16:00

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大肠杆菌的重组蛋白要去内毒素达标那是相当麻烦滴了

你镍柱下来后的样品内毒素检过没？在多少EU/ML的水平？

后期要去除高含量的内毒素，不是那么容易的，当初制定的工艺路线就有问题。

应该选择用细胞真核表达，全程控制内 ...

还没有检测过内毒素的含量，打算去除内毒素后再用鲎试剂检测。看来要麻烦大了，蛋白是用于动物实验的，内毒素必须得去除的。您还有什么高招吗？

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 16:01

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原帖由 ha111 于 2013-5-8 16:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

还没有检测过内毒素的含量，打算去除内毒素后再用鲎试剂检测。看来要麻烦大了，蛋白是用于动物实验的，内毒素必须得去除的。您还有什么高招吗？ ...

去内毒素没有高招

疏水，离子交换，亲和，一个一个试，样品损失和去除率都是问题

何况你是细菌表达的，最大的内毒素来源就是细菌

哦米托佛，回头是岸

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 16:03 标题: 回复 #68 蒜泥面条的帖子

那好，我已近提出一批了，就差去内毒素一步了，只能硬着头皮往下做了。非常感谢！

作者: loli 时间: 2013-5-8 16:04

那好，我已近提出一批了，就差去内毒素一步了，只能硬着头皮往下做了。非常感谢！

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如果是碱性蛋白，用阴离子交换柱穿透目标蛋白，可以很好地去除内毒素。
如果是酸性蛋白，很麻烦，要从破菌开始就要进行控制，全程使用注射用水，在无菌环境下进行各步纯化操作等等。

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 16:15

他这个案例中，用细菌来表达无热源重组蛋白，本身就不是最佳的路线。

要除干净，达到药典的标准，要花很大的力气，除非运气特别好，摸索到一个很好的条件，样品损失也不多，内毒素还能达标

作者: ha111 时间: 2013-5-8 16:16

他这个案例中，用细菌来表达无热源重组蛋白，本身就不是最佳的路线。

要除干净，达到药典的标准，要花很大的力气，除非运气特别好，摸索到一个很好的条件，样品损失也不多，内毒素还能达标

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确实，要有好运气。
和目标蛋白的性质关系非常大。

不过在我有限的重组蛋白药物纯化工艺开发过程中，倒是成功地开发了两个这样的产品，碱性蛋白，方便地去除了内毒素，符合药品申报QC检测，呵呵。

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 16:17

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原帖由 ha111 于 2013-5-8 16:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
他这个案例中，用细菌来表达无热源重组蛋白，本身就不是最佳的路线。

要除干净，达到药典的标准，要花很大的力气，除非运气特别好，摸索到一个很好的条件，样品损失也不多，内毒素还能达标

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你太谦虚了

细菌表达的产品能做到内毒素达标那已经很了不起了,你还做成功过2个，牛！

不过现在真核体系也蛮多的，如果用量不是很大的蛋白产品，可以考虑用真核，这样后期会方便很多

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-8 16:17

目前已经上市的很多生物药物都是细菌表达，甚至包括剂量较大的治疗用plasmid。
难度主要在于宿主本身细胞壁是大量内毒素的直接来源。
最终产品能否达到药典要求，更重要的是看药物的使用剂量，如果剂量只有ug级，那并不困难，如果不考虑蛋白的翻译后修饰引起的比活问题，仅考虑内毒素的话，动物细胞由于本身培养条件和成本的苛刻并没有优势；如果剂量达到上百毫克蛋白，原核是非常困难的。
规模现在并不是问题，即使国内也已经有上千升的动物细胞反应器成功地运转，国外据我所知，动物细胞培养的抗体滴度可以达到27g/L发酵液以上，比起原核也并不逊色多少。

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 16:18

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原帖由 箭头儿 于 2013-5-8 16:17 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

目前已经上市的很多生物药物都是细菌表达，甚至包括剂量较大的治疗用plasmid。
难度主要在于宿主本身细胞壁是大量内毒素的直接来源。
最终产品能否达到药典要求，更重要的是看药物的使用剂量，如果剂量只有ug级，那并不困难 ...

国内真核表达抗体
能做到1-5g/L就已经很不错了

作者: idea2011 时间: 2013-5-8 16:22

国内真核表达抗体
能做到1-5g/L就已经很不错了

我刚刚纯化了一批抗体，2.9升的腹水生产了3.7克的抗体，看来要达到27g/L还有很长的路要走啊。

作者: am10 时间: 2013-5-8 16:27

我们打了500只老鼠，纯化了近半个月，挺费力的一件事，纯化过程中也遇到一些问题，比如用Tris-Hcl PH9.0回调PH值时有少量沉淀产生，后来通过离心除去，但毕竟还是损失了一些。因为洗脱的量很大，我们回调PH值时并不是事先在离心管里加好tris ，而是全部洗下来后再用Tris回调的，请问 laboy 兄，有没有好的办法解决回调PH值时产生的沉淀问题，谢谢了。

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 16:28

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原帖由 am10 于 2013-5-8 16:27 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我们打了500只老鼠，纯化了近半个月，挺费力的一件事，纯化过程中也遇到一些问题，比如用Tris-Hcl PH9.0回调PH值时有少量沉淀产生，后来通过离心除去，但毕竟还是损失了一些。因为洗脱的量很大，我们回调PH值时并不是事先在离心管 ...

哇，真是那么多腹水啊，太残忍了
你们打肿瘤恐怕都倒到手抽筋吧

抗体沉淀前面也讨论到过
如果你的洗脱液缓冲体系没问题的话
一个是预先滴加中和液
另一个是控制洗脱的速度和浓度

另外可以在洗脱液中添加一些保护剂什么，比如低浓度甘油，如果对你的后续没影响。

作者: ha111 时间: 2013-5-8 16:30

我刚刚纯化了一批抗体，2.9升的腹水生产了3.7克的抗体，

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2.9L腹水只纯化了3.7g抗体太少了。不知道你是腹水制备的有问题，还是纯化得有问题。
2.9L腹水应该得到10-15g左右抗体正常。

作者: ha111 时间: 2013-5-8 16:32

我们打了500只老鼠，纯化了近半个月，挺费力的一件事。

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为什么要纯化这么长时间？这个规模我们也常做，应该不超过5天。

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 16:32

这个规模我们也常做，应该不超过5天。

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你们这些刽子手！！

我一般从来不自己动手杀生，何况是那么大规模的杀生

作者: 98776langtao 时间: 2013-5-8 16:34

2.9L腹水只纯化了3.7g抗体太少了。不知道你是腹水制备的有问题，还是纯化得有问题。
2.9L腹水应该得到10-15g左右抗体正常。

为什么要纯化这么长时间？这个规模我们也常做，应该不超过5天。

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我们的产量确实偏低了些，纯化方面有些问题，离心时看见那些沉淀都心疼，最近一次纯化我们改进了一些，降低了洗脱浓度，增加了稀释倍数，沉淀的问题得到了一些改善，3L的腹水得到了7g的抗体，虽然还没有能达到如您所说的10-15g，但毕竟有了一些提高。我的穿透液里还有些未结合部分，所以再上一次柱应该还能回收一点。下一步我们会解决一下挂柱效率的问题，进一步减少损失。

我们用的层析柱是10ml的，一次纯化使用8个柱子，所以上样量有限，另外我们是一边收腹水一边纯化，所以感觉战线拉的长了点，呵呵。

作者: 66+77 时间: 2013-5-8 16:34

请问表达在包涵体的带his标签的蛋白，怎么样过柱纯化效果最好？如果在尿素中不能挂柱，要用什么表面活性剂去处理？采用什么处理方法呢？谢谢！

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 16:36

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原帖由 66+77 于 2013-5-8 16:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请问表达在包涵体的带his标签的蛋白，怎么样过柱纯化效果最好？如果在尿素中不能挂柱，要用什么表面活性剂去处理？采用什么处理方法呢？谢谢！

我就凭我仅有的经验越俎代庖一下

不挂柱有3个方法去解决：

1，样品变性要充分，如果8M尿素不行，就换6M盐酸胍，还可以加点低浓度2-ME打开2硫建
2，用IDA介质的NI填料，不用NTA，IDA载量更高，所以对HIS的吸附力会更强一些，同时降低上洋流速
3，N-/C-两端加6HIS 防止出现单侧6HIS被肽链特殊结构给遮盖

希望对你有帮助，祝顺利

作者: DONT 时间: 2013-5-8 16:37

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原帖由 蒜泥面条 于 2013-5-8 16:36 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我就凭我仅有的经验越俎代庖一下

不挂柱有3个方法去解决：

1，样品变性要充分，如果8M尿素不行，就换6M盐酸胍，还可以加点低浓度2-ME打开2硫建
2，用IDA介质的NI填料，不用NTA，IDA载量更高，所以对HIS的吸附力会更强一些，同时降低 ...

你说的对我都很有用。
目前我尝试了变性纯化，效果不是很理想，所以我希望能用表面活性剂处理。

作者: H2O 时间: 2013-5-8 16:40

我现在刚进实验室老板让我纯化抗体IgG（从细胞培养液中纯化），现在关于proteinA/G的有很多种哦，我不知买那一种比较好，希望得到各位的指点。谢谢啦~~
现在看到的介质有:HITRAP PROTEIN A/G HP, HITRAP RPROTEIN A FF,PROTEIN A SEPHAROSE CL-4B, RPROEIN A/G SEPHAROSE FF, NPROTEIN A SEPHAROSE 4 FF

PS:问个比较弱智的问题哦，FF，HP 是什么意思啊？

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 16:40

FF Fast Flow 高流速
HP High Performance 高载量或者高性能

不知道你要纯化多少抗体，如果要经常用，重复使用，那建议买GE公司Mabselect SuRe，不过这个包装有点大

另外可以买Hitrap rProteinA的散装和预装都可以，如果是一般用用，国产有些proteinA填料也可以，GE的就是价格贵。

没什么特殊需要，不需要买nProteinA

作者: fox_79 时间: 2013-5-8 16:41

我现在正在处理Sephadex G-50干粉，准备装柱哦，我是先泡24小时然后用0.1M的NAOH泡一小时然后用蒸馏水洗到中性哦（用布氏漏斗抽滤），不过装柱时发现飘起来很多泡泡哦不容易沉降。。我想请教楼主填料怎么处理啊？谢谢。

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 16:42

会浮起来，可能是因为颗粒内部有气体

你可以煮一下

作者: fox_79 时间: 2013-5-8 16:42

煮完之后让它自然冷却再装？还是煮完之后用NAOH处理下再装啊？

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 16:43

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原帖由 fox_79 于 2013-5-8 16:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

煮完之后让它自然冷却再装？还是煮完之后用NAOH处理下再装啊？

如果是新的填料，不一定需要NAOH处理

煮完，自然冷却就行

作者: kswl870 时间: 2013-5-8 16:43

我想进行抗原纯化，这种抗原是位于肝脏组织中，分子量为57KD，想请问下，该怎么纯化？如何选择纯化方式？谢谢了！

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 16:44

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原帖由 kswl870 于 2013-5-8 16:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我想进行抗原纯化，这种抗原是位于肝脏组织中，分子量为57KD，想请问下，该怎么纯化？如何选择纯化方式？谢谢了！

天然蛋白如果在组织里不是高丰度的，或者不容易粗分成几个组分的，建议还是放弃吧，会比较麻烦

首先考虑的是亲和，假如你有这个蛋白已有大量抗体，那可以做一个免疫亲和柱

或者考虑做重组吧，重组的蛋白做抗原和天然的蛋白，差不多的

作者: ero11 时间: 2013-5-8 16:47

我想进行抗原纯化，这种抗原是位于肝脏组织中，分子量为57KD，想请问下，该怎么纯化？如何选择纯化方式？谢谢了！

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首先要搞明白该抗原的具体理化性质，然后对组织匀浆，用缓冲盐粗提，对粗提液检测，一定要建立起检测目标物的准确方法，后面高纯度的提取就要选择层析方法了

作者: ero11 时间: 2013-5-8 16:47

整个过程要在低温下操作，还需要加入一定的蛋白酶抑制剂

作者: 831226 时间: 2013-5-8 16:48

用Protein A从血清中提取抗体，上柱前如何对血清进行处理？盐析？直接稀释？请指教。

作者: ukonptp 时间: 2013-5-8 16:50

用Protein A从血清中提取抗体，上柱前如何对血清进行处理？盐析？直接稀释？请指教。

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盐析和直接稀释都可以

作者: 04906 时间: 2013-5-8 16:52

你好，我现在需要从血清中纯化一点多抗，然后将这多抗偶联到NHS活化基质上。我做过一次抗体纯化，但纯化后的抗体失活了，找不到什么原因。麻烦楼主帮忙看看

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用的是proteinA的柱子，2ml兔血清用pbs稀释了10倍，缓冲液是pbs，pH7.4，洗脱液是0.1M柠檬酸缓冲液pH4.0，由于多抗是要偶联NHS的，不能够有氨基，我就没有用tris缓冲液中和，用的是0.5M的磷酸氢二钠，pH9.1吧。结果纯化后测定多抗效价就1：1600才 OD 0.3，血清里面的效价是1：10000 OD0.7，基本上完全失活了。不知道什么原因。

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 16:53

你好，我现在需要从血清中纯化一点多抗，然后将这多抗偶联到NHS活化基质上。我做过一次抗体纯化，但纯化后的抗体失活了，找不到什么原因。麻烦楼主帮忙看看

用的是proteinA的柱子，2ml兔血清用pbs稀释了10倍，缓冲液是pbs，pH7.4，洗脱液是0.1M柠檬酸缓冲液pH4.0，由于多抗是要偶联NHS的，不能够有氨基，我就没有用tris缓冲液中和，用的是0.5M的磷酸氢二钠，pH9.1吧。结果纯化后测定多抗效价就1：1600才 OD 0.3，血清里面的效价是1：10000 OD0.7，基本上完全失活了。不知道什么原因。

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你要做抗体偶联然后免疫反亲和抗原蛋白，偶联上去的抗体必须是特异性的，不能是proteinA纯化下来的总IgG

作者: ha111 时间: 2013-5-8 16:54

你好，我现在需要从血清中纯化一点多抗，然后将这多抗偶联到NHS活化基质上。我做过一次抗体纯化，但纯化后的抗体失活了，找不到什么原因。麻烦楼主帮忙看看

用的是proteinA的柱子，2ml兔血清用pbs稀释了10倍，缓冲液是pbs，pH7.4，洗脱液是0.1M柠檬酸缓冲液pH4.0，由于多抗是要偶联NHS的，不能够有氨基，我就没有用tris缓冲液中和，用的是0.5M的磷酸氢二钠，pH9.1吧。结果纯化后测定多抗效价就1：1600才 OD 0.3，血清里面的效价是1：10000 OD0.7，基本上完全失活了。不知道什么原因。

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测定一下柱穿透液的效价，看看是否一定是抗体失活还是活性抗体没有好好吸附。

tris中和后可以透析除去，对偶联没有影响。

作者: hyuu 时间: 2013-5-8 16:55

请教大家，在用DTT还原抗体的时候，打开的是所有的二硫键？还是重链跟重链之间的二硫键，两条重链之间有两个二硫键，请问是两个二硫键都代开了，还是打开其中的一个啊？如果是其中的一个，那么请问打开的是上面的二硫键还是下面的二硫键啊？
非常感谢。

作者: uaubc 时间: 2013-5-8 16:56

兔多抗血清用蛋白A胶纯化后，进一步用抗原亲和胶来纯化特异性抗体。
纯化在离心管内进行，纯化过程及结果如下
结合：室温震荡0.5h。洗涤：PBS洗4次。
洗脱buffer：第一步洗脱50mM KAc-HAc，pH4.5；第二步洗脱50mM KAc-HAc，pH3（此处用两步洗脱主要想看一下不同pH对抗体效价的影响），分别洗2次。
结果：
（1）上样总蛋白量10mg，洗脱0.3mg。
（2）检测效价：穿透中的抗体基本无活性，但洗脱中的抗体其效价仅比上样中高1倍。第二步洗脱的效价略高于第一步洗脱。（用抗原包板，样品稀释到相同的浓度，间接ELISA法）
我的疑问是：
理论上推算洗脱中的抗体单位浓度下的效价应该是纯化前的十倍左右，而我的结果里，穿透中已基本无效价，但洗脱中又不高，抗体失活了？在哪儿失活的呢？而且从两步洗脱的结果看，pH3与pH4.5相比，活性并没有降低，说明低pH的影响不大。

作者: yysr238 时间: 2013-5-8 16:57

你要做抗体偶联然后免疫反亲和抗原蛋白，偶联上去的抗体必须是特异性的，不能是proteinA纯化下来的总IgG

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我是用纯化的蛋白免疫的兔子，IgG应该大部分是特异性的吧！

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 16:58

我是用纯化的蛋白免疫的兔子，IgG应该大部分是特异性的吧！

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即使你用纯蛋白免疫动物，在该动物的血清中特异性的IgG也是极少的比例

所以你用proteinA纯化出来的总IgG直接偶联上去，这个亲和柱的效率不是很高

作者: greenbee 时间: 2013-5-8 17:02

我用辛酸-硫酸铵的方法纯化鼠腹水中的IgG，步骤如下：
1.将腹水与PH4.4，60mm醋酸缓冲液1:3混合，
2.室温下边搅拌边缓慢加入辛酸，按每ml样品中加25ul辛酸,搅拌30min
3.10000rpm离心30min，取上清用0.45um滤膜过滤，调至PH7.4,加入硫酸铵0.277g/mL，继续搅拌30min。
4.12000rpm离心30min，收集沉淀物，溶于少量,ph7.4PBS中，透析.
我同时做6个不同的腹水，其中有三个是正常的，但是有三个在加入硫酸铵离心后也没有沉淀下来，如果抗体的浓度太低会不会造成这种结果，有啥挽救的措施不？还能不能重新纯化？恳请回答，谢谢！

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 17:03

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原帖由 greenbee 于 2013-5-8 17:02 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我用辛酸-硫酸铵的方法纯化鼠腹水中的IgG，步骤如下：
1.将腹水与PH4.4，60mm醋酸缓冲液1:3混合，
2.室温下边搅拌边缓慢加入辛酸，按每ml样品中加25ul辛酸,搅拌30min
3.10000rpm离心30min，取上清用0.45um滤膜过滤，调至PH7.4,加入 ...

如果你用同样的方法，同样的试剂，同一批次做，有的好，有的不好，那基本就是样品的问题了

如果腹水中抗体少，即使有沉淀也很难看出来的

另外我不推荐做辛-硫酸铵，你一定要先粗纯，就硫酸铵沉淀一下，然后用PBS复溶就行了。

如果是后面还要过PROTEIN A柱子，连硫酸铵都不需沉淀，用PBS稀释，高速离心半个小时，直接上柱就行

至于你试验失败的几个项目，你把沉淀复溶和沉淀的上清混合，还可以用来过柱的。

作者: u234 时间: 2013-5-8 17:04

谢谢，我也有GE公司的protein A柱，但是纯化鼠我一般用protein G柱，protein A会比较好吗？平衡液和洗脱液用什么溶液比较好咧？

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如果你用同样的方法，同样的试剂，同一批次做，有的好，有的不好，那基本就是样品的问题了

如果腹水中抗体少，即使有沉淀也很难看出来的

另外我不推荐做辛-硫酸铵，你一定要先粗纯，就硫酸铵沉淀一下，然后用PBS复溶就行了。

如果是后面还要过PROTEIN A柱子，连硫酸铵都不需沉淀，用PBS稀释，高速离心半个小时，直接上柱就行

至于你试验失败的几个项目，你把沉淀复溶和沉淀的上清混合，还可以用来过柱的。

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 17:05

谢谢，我也有GE公司的protein A柱，但是纯化鼠我一般用protein G柱，protein A会比较好吗？平衡液和洗脱液用什么溶液比较好咧？

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你用proteinG 也可以，我们用Mabselect SuRe（protein A）纯化过小鼠腹水和杂交瘤都可以的

平衡液你简单点就是PBS,洗脱液用柠檬酸

你可以看买的GE填料所带的说明书上有写

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 17:05

不过不排除有些腹水的IgG亚型，proteinA不识别，proteinA proteinG可以试着用，哪个好，以后就用哪个

最好你纯化前用Elisa法测定一下IgG的浓度和总量（估计）

然后把每一步的样品和流穿都留着，以便失败后，2次重复纯化

作者: ero11 时间: 2013-5-8 17:06

你好，我想向你请教一个问题，就是在半年前我用4T-2的载体诱导出来我的目的蛋白在上清表达，37度的温度，0.4mM的IPTG，宿主菌为BL21。但是现在我用同样的条件诱导，结果上清里面很少，主要在沉淀当中。也就是隔了半年时间现在就不能在上清中表达了，我后来又试了很多温度在上清中还是没有表达，有也是在沉淀中表达。麻烦大哥帮我看看到底是什么原因？？我现在急的头都发白了。谢谢了。

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 17:06

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原帖由 ero11 于 2013-5-8 17:06 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你好，我想向你请教一个问题，就是在半年前我用4T-2的载体诱导出来我的目的蛋白在上清表达，37度的温度，0.4mM的IPTG，宿主菌为BL21。但是现在我用同样的条件诱导，结果上清里面很少，主要在沉淀当中。也就是隔了半年时间现在就不 ...

这个，可能和你的菌种保存也有关系

你后面几次上清没表达了，或者表达减少了，有没有看过沉淀里的表达情况？是什么趋势？

作者: ero11 时间: 2013-5-8 17:07

我后面把菌种就保存在-20度，没有保存在-80度。沉淀里有表达，但是也不是太明显，趋势的话没有太大的变化。谢谢。

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 17:07

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原帖由 ero11 于 2013-5-8 17:07 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我后面把菌种就保存在-20度，没有保存在-80度。沉淀里有表达，但是也不是太明显，趋势的话没有太大的变化。谢谢。

建议重新提质粒，测序和转新的表达克隆

-20度不建议放半年，我估计可能是菌种退化

作者: flower-201 时间: 2013-5-8 17:08

我在做IgG的纯化，也就是用硫酸铵＋DEAE-SEPHAROSE,但是在过DEAE柱的时候在主峰后半段，总会有白蛋白混在目的蛋白中洗脱下来，分离效果不是很好。
因为我们采用的是线性洗脱0.15-1.0 M NaCl 洗脱的，是否需要改变盐离子浓度，将峰拉开。

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 17:09

我在做IgG的纯化，也就是用硫酸铵＋DEAE-SEPHAROSE,但是在过DEAE柱的时候在主峰后半段，总会有白蛋白混在目的蛋白中洗脱下来，分离效果不是很好。
因为我们采用的是线性洗脱0.15-1.0 M NaCl 洗脱的，是否需要改变盐离子浓度，将峰拉开。

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最快的方式，建议改用rProteinA亲和法纯化IgG吧，不要用那么传统的方法

proteinA亲和效率高，纯度高，价格也不贵，进口的好的rProteinA 也就是六七百块1毫升

可以一次载20-30mg高纯度IgG抗体，填料还可以重复用。

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 17:10

最快的方式，建议改用rProteinA亲和法纯化IgG吧，不要用那么传统的方法

proteinA亲和效率高，纯度高，价格也不贵，进口的好的rProteinA 也就是六七百块1毫升

可以一次载20-30mg高纯度IgG抗体，填料还可以重复用。

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前天帮一个客户用了一个公司的rProteinA纯化了一次小鼠腹水，效果非常好，回收率和纯度好于他们原先用GE和金思特proteinG和硫酸铵，辛酸法的效果

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 17:11

大部分人现在固有的思维其实是技术发展最大的障碍

小鼠腹水IgG就是一个典型例子

作者: mickeylin 时间: 2013-5-8 17:12

很多rProteinA和rProteinA还是有区别的

作者: ha111 时间: 2013-5-8 17:15

最快的方式，建议改用rProteinA亲和法纯化IgG吧，不要用那么传统的方法

proteinA亲和效率高，纯度高，价格也不贵，进口的好的rProteinA 也就是六七百块1毫升

可以一次载20-30mg高纯度IgG抗体，填料还可以重复用。

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不一定是费用的问题，传统的方法有时候确实会有不一样的结果。抗体的活性或特异性有时候是有差别的。

作者: DONT 时间: 2013-5-8 17:29

不错可以整一个精华贴了弱弱问楼主有没有人是做植物病毒的抗原表位的或者楼主有相关的了解吗

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 17:30

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原帖由 DONT 于 2013-5-8 17:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
不错可以整一个精华贴了弱弱问楼主有没有人是做植物病毒的抗原表位的或者楼主有相关的了解吗

植物病毒的抗体一般都是农科院，农学院之类的研究的多，普通的抗体试剂公司，更多的研究是人蛋白抗原

可以用病毒株直接免疫，就是后期筛选的时候，表位定位会麻烦一点

如果明确知道病毒表面蛋白序列的，也可以合成多肽抗原

作者: tudou85 时间: 2013-5-8 17:30

我们纯化的羊多抗，PH3.0左右的甘氨酸洗脱下来后滴到1M的TRIS-HCL缓冲液PH9.0中和，出来的时候是清澈的，滴加进去就立马沉淀了，而且透析了也没有效果，怎么处理呢

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 17:32

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原帖由 tudou85 于 2013-5-8 17:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我们纯化的羊多抗，PH3.0左右的甘氨酸洗脱下来后滴到1M的TRIS-HCL缓冲液PH9.0中和，出来的时候是清澈的，滴加进去就立马沉淀了，而且透析了也没有效果，怎么处理呢 ...

改用柠檬酸洗脱液试试，另外，预先在接收管里滴加好预估的中和液，一般是洗脱总体积的1/10。

比如说你这管打算接受10ml洗脱液，那就事先滴加1ml中和液，然后再去接洗脱，并且接洗脱液的时候要晃动接受管子，迅速混匀

作者: okhaha 时间: 2013-5-8 17:32

您好：
先简述一下我的实验步骤：用亲和层析的方法纯化了一个抗体，洗脱液为PH3.0的甘氨酸溶液，收集液体后粗测了一下PH值PH3.3，按50：1的倍数加入10ul左右PH9.0的1.5MTris,混匀后出现胶体状沉淀,此时PH大概在6左右，过量加入Tris后沉淀溶解。此抗体的PI4.2.
另有一个抗体用20mMPB保存PH7.0， 4度保存一个多月后出现大量沉淀，但是OD280检测蛋白浓度没有减少，那么沉淀时什么？谢谢您！

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 17:33

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原帖由 okhaha 于 2013-5-8 17:32 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

您好：
先简述一下我的实验步骤：用亲和层析的方法纯化了一个抗体，洗脱液为PH3.0的甘氨酸溶液，收集液体后粗测了一下PH值PH3.3，按50：1的倍数加入10ul左右PH9.0的1.5MTris,混匀后出现胶体状沉淀,此时PH大概在6左右，过量加入Tri ...

第一种情况下，那个沉淀复溶了，一般都是pH9.0的Tris-HCL 10:1中和，而且是在收集管子里预先加好。

第2种情况，我们也遇到过，有些抗体，产生沉淀，但是总量并没有减少多少，只能理解为沉淀出来的是少数吧，虽然肉眼看起来很严重，离心离掉后，并没有损失多少。

一般建议抗体加甘油，保存在-80度或者-20度，4度只能短时间存放

作者: tangxin_80 时间: 2013-5-8 17:34

【求助】protein A 亲和层析纯化IgG抗体
纯化好的抗体由于有杂带，binding buffer透析过夜
准备重新过柱，哪知透析袋破了，，，
崩溃啊
现在把2L 溶有抗体的 binding buffer 重新过柱。。。
问：
1.这样有没有效果，抗体还能不能尽数吸附上
2.这么低浓度，大体积对实验结果有哪些影响
3.还有没有其他的补救措施（PGE浓缩可不可行，据说对抗体有影响）

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 17:34

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【求助】protein A 亲和层析纯化IgG抗体
纯化好的抗体由于有杂带，binding buffer透析过夜
准备重新过柱，哪知透析袋破了，，，
崩溃啊
现在把2L 溶有抗体的 binding buffer 重新过柱。。。
问：
1.这样有没有效果，抗体还能 ...

过好一点的proteinA填料，应该可以抓些回来。不知道你的总量和浓度有多高

PEG浓缩我看就算了，你2L的体积，得多长的透析袋哇，呵呵

另外我不明白，你的proteinA纯化下来的抗体（多抗还是单抗？），SDS-PAGE电泳怎么会有杂带？
一般我们认为一步proteinA下来的纯度应该是90%-95%以上的，不然要不就是你的proteinA填料有问题或者纯化的方法有问题

作者: gmjghh 时间: 2013-5-8 17:35

楼主，您好，有几个问题想向您请教一下。
我通过原核表达的方法表达了真菌的一种蛋白A，并对表达出的融合蛋白进行了Western Blot验证，先是用抗His标签单克隆抗体，后来又用了购买的A的抗体，结果均呈阳性。但有几个问题一直困扰着我：
第一，该A抗体是以哺乳动物的A蛋白为抗原制备的（但不知是A的哪个亚型），对我表达的真菌A蛋白有反应能说明什么问题呢？是否能说明我的A蛋白在抗原决定簇处折叠正确还是其它？但Western Blot时将蛋白样煮沸后上的样，说折叠是否不妥，因为此时蛋白已经变性了？
第二，鉴于A抗体同原核表达的真菌A蛋白有反应，我又从真菌体内直接提取总蛋白进行Western。提取时加入了8M的尿素及硫脲等物质，想将所有蛋白均提取出来。但令人奇怪的是，Western总无反应。为什么此抗体能同原核表达的重组蛋白有反应，而对真菌体内的A蛋白无反应呢？
第三，除了His抗体外，我还想对我表达出的融合蛋白做进一步的鉴定，请问还有什么方法可以进行？如果仍想用Western做，请问哪家公司有真菌的蛋白抗体？如果没有，市面上其它的哺乳动物A抗体能否用来进行试验（市面上大多是以哺乳动物的A单位为抗原制备的抗体）？
事情紧急，望不吝赐教。

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 17:36

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楼主，您好，有几个问题想向您请教一下。
我通过原核表达的方法表达了真菌的一种蛋白A，并对表达出的融合蛋白进行了Western Blot验证，先是用抗His标签单克隆抗体，后来又用了购买的A的抗体，结果均呈阳性。但有几个问题一直困扰 ...

1，说明真菌的A蛋白的序列和哺乳动物的同源性比较高，另外不知道你买的是单抗还是多抗，如果是单抗能交叉变性反应，说明那个单抗识别的是线性表位，而且这个表位序列出于同源序列中。

2，这种情况有3种可能，有可能是A蛋白在总蛋白中的丰度非常低，这样你做WB时不足以检出，建议你可以加大跑胶时上的总蛋白量，最好是这个A蛋白的丰度在提取总蛋白前，能刺激一下（看看是否有文献做过同个蛋白的刺激表达）。还有一种可能是你重组表达的和天然的蛋白有差别（因为亚型不明），最后一种可能就是天然A蛋白是否稳定，会不会在提取总蛋白的时候没有提出来，或者提出来降解了。

3，你表达的A蛋白表达量怎么样，如果还可以，可以试着多表达一些，然后用NI柱去做一下纯化，如果能纯化出来，大小也是吻合的，也能说明是目的蛋白。另外多找一些抗A蛋白抗体来测试一下WB，但是要搞清楚这个抗体的抗原属性（种属/亚型/表位序列）

作者: fox_79 时间: 2013-5-8 17:38

我在使用G50柱和DEAE-BLUE柱的时候出了点奇怪的问题，想请教一下各位大虾。
G50柱在进行一次0.2M NaOH清洗后，出现胶膨胀，在使用平衡液平衡时胶面会下降，但是静止的时候，胶面就会上升，胶会膨胀？
在使用DEAE-BULE柱的时候，在使用一段时间后，柱子的下半部分，会空柱，不知道是怎么回事？
希望大虾指教

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 17:39

呵呵，琼脂糖虽然是刚性的但是也有一定的伸缩性，尤其在在线的压力下

很多刚性不好的填料，在柱上在线平衡的时候体积会相应缩小一点，然后一旦失去柱压，胶的体积就会膨胀一些。

是sephedex g50么，这个胶的说明书上写了可以用0.2M NaOH在位清洗？清洗多久时间？

如果都没超过手册里的极限，那这个胶就不会被你清洗坏

作者: qqq111 时间: 2013-5-8 17:40

附上我近期做的兔血清IgG纯化案例，请各位大侠指点。

辛酸-硫酸铵＋DEAE-SEPHAROSE Fash Flow（弱阴离子交换剂，GE出产）
辛硫纯化后，混有两种杂蛋白（高于70kDa），IgG轻链弥散非常严重。
所以又过DEAE弱阴离子交换柱，用PH7.8的系统，总有杂蛋白混在目的蛋白中洗脱下来，分离效果不是很好。

柱平衡液、柱淋洗液：20mM Tris, 25 mM NaCl, 2.5﹪甘油 pH7.8
柱洗脱液：20mM Tris, 50/100/150/200/300/500mM NaCl, 2.5﹪甘油 pH7.8

上样：辛酸-硫酸铵纯化后的兔血清1.5ml，Buffer A 1.5mL混合，100µl留样，其余2.9ml上样。用胶头堵住层析柱下面点水孔，再用活塞密封层析柱口，摇荡20min。

柱体积1mL,注射器式，完全人工操作，无检测器
分段洗脱，每个浓度洗脱0.5mL，让溶液自然滴出，分别收集，重复一次。

SDS电泳图片如下
过柱前、flow、wash3上样5ul; BSA上样2ul，浓度为2mg/mL; 其余各样均上样16ul。

洗脱液中杂蛋白很多，实验室建立了很好的PROTEIN A纯化系统，但成本高，老板想用便宜的DEAE柱，坚持别人成功过，一定能纯出来。

后来在版内看到站友的帖子提到兔IgG 等电点是8.0，那么在7.8的体系中带正电，应该挂不上柱子的，穿透液才是要收集的，打电话问GE的技术部，也说以前有客户用阴离子流穿方法成功纯化过抗体，他的抗体等电点6.8-7.0，用的系统是7.2-7.4。

我今天又换了个PH7.0的系统，想说这样IgG带的正电更多，更不会和柱结合，能在穿透液中富集，减少洗脱中的损耗，但是洗脱还是很多，跑了胶，正脱色，稍后发上来。

现在发的是前几天用7.8系统纯化的效果图。
为了省Marker，用BSA对照的。

图片附件: 11781627.snap.jpg (2013-5-8 17:40, 25.62 KB) / 该附件被下载次数 17
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16099

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 17:41

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原帖由 qqq111 于 2013-5-8 17:40 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

附上我近期做的兔血清IgG纯化案例，请各位大侠指点。

辛酸-硫酸铵＋DEAE-SEPHAROSE Fash Flow（弱阴离子交换剂，GE出产）
辛硫纯化后，混有两种杂蛋白（高于70kDa），IgG轻链弥散非常严重。
所以又过DEAE弱阴离子交换柱，用PH7.8的系统 ...

你这样的方法出这样的结果是正常的，别太纠结哈

买点好的proteinA 填料，做IgG的亲和纯化吧，这样出来的抗体就会很纯

作者: ha111 时间: 2013-5-8 17:41

离子交换柱纯化抗体是可以的，但是收率和纯度就肯定要大大低于亲和方法。

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 17:42

我是很纳闷，现在rProteinA进口都只要几百块钱1ml了（鼠，兔，羊抗都能纯化），弄个注射器当柱子

1ml一次纯化出15-20mg 抗体纯度>90-95%

为什么还有那么多人要继续使用离子交换

作者: am10 时间: 2013-5-8 17:42

老板想大规模的纯化抗体，DEAE相对便宜，所以一定要用这个
我现在就一直在想办法优化DEAE的条件，让收率高一点儿。
先后试了PH7.0/7.8/8.3

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 17:43

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原帖由 am10 于 2013-5-8 17:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
老板想大规模的纯化抗体，DEAE相对便宜，所以一定要用这个
我现在就一直在想办法优化DEAE的条件，让收率高一点儿。
先后试了PH7.0/7.8/8.3

现在人家更大规模的抗体药物纯化也是用proteinA的

所以你就想想吧，消费比肯定是亲和法低，除非你对抗体纯度没要求

作者: ffooll 时间: 2013-5-8 17:44

我从1楼一直看了下来，蛮有收获的。有的问题，我还是不明白，请赐教。

我是用GE公司的HiTrap Protein G提取人血浆IgG.

按照GE的说明，我在样品上柱前进行了脱脂（硫酸右旋糖酐+CaCL2）,然后用超滤的方法脱盐，置换到PBS中，过柱，洗脱，收集。

脱脂过程中可以见到大量的沉淀（脂蛋白？）

在脱盐过程中，也可以在超滤管的内壁见到沉淀（这个又是什么？）

我看到您似乎推荐用PBS直接稀释血浆，然后高速离心，然后过柱。

我想采用您的这重PBS直接稀释的方法，免得脱脂还要脱盐。

PBS直接稀释的方法会不会堵塞柱子？或者多少倍的稀释最合适？血浆中IgG浓度大概在10mg/ml。

作者: mamamiya 时间: 2013-5-8 17:44

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原帖由 ffooll 于 2013-5-8 17:44 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我从1楼一直看了下来，蛮有收获的。有的问题，我还是不明白，请赐教。

我是用GE公司的HiTrap Protein G提取人血浆IgG.

按照GE的说明，我在样品上柱前进行了脱脂（硫酸右旋糖酐+CaCL2）,然后用超滤的方法脱盐，置换到PBS中，过柱，洗 ...

从血清里提取的吧

作者: mamamiya 时间: 2013-5-8 17:45

另外人IgG可以用rProteinA纯化

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 17:45

一般我们在纯化多抗时，都是从血清里面纯化IgG，很少纯化血浆

稀释的倍数完全取决于您的实验需要，2-10倍都行，通过稀释后的高速离心（12000RPM/30MIN），可以去掉很多杂质。

人的IgG确实建议用ProteinA来纯化。

proteinA G 的差别可以看这里，有所涉及

cuturl('http://protein.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=17545614&sty=1&tpg=1&age=0')

作者: yysr238 时间: 2013-5-8 17:46

我确实是从血浆中提取IgG。因为患者样本来源限制，血浆比血清更易获取。

我看了GE的说明，ProteinG比ProteinA对人IgG,尤其是IgG3的结合能力更强些。

是否用Protein A　（ｒProtein A）更好些？比如在洗脱的时候要容易些？

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 17:47

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我确实是从血浆中提取IgG。因为患者样本来源限制，血浆比血清更易获取。

我看了GE的说明，ProteinG比ProteinA对人IgG,尤其是IgG3的结合能力更强些。

是否用Protein A　（ｒProtein A）更好些？比如在洗脱的时候要容易些？ ...

载量高，洗脱容易，介质便宜

作者: yysr238 时间: 2013-5-8 17:47

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载量高，洗脱容易，介质便宜

这样说来，Protein G的优势在哪里呢？

protein A可以取代Protein G?

或者rProteinA可以取代Protein G？

作者: popo520 时间: 2013-5-8 17:48

G的优势就在于一些A抓不住的IgG种属亚型，它还能抓住，吸附力强，做IP的时候，有些情况下比A好，但是也见过很多实验室都是用A来代替G做IP了

作者: vera+ 时间: 2013-5-8 17:48

我只用过蛋白A

作者: kswl870 时间: 2013-5-8 17:49

我们用的GE的NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow柱子连接多肽纯化多抗，经过好多次纯化后，柱子的结合能力下降很多，想问一下，这个柱子还有重复利用的价值吗？还是只能重新换个新柱子？

作者: c86v 时间: 2013-5-8 17:49

抗体稀释后能放多长时间？

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 17:49

抗体最好高浓度保存，同时需要加甘油和叠氮化钠

在没有污染的情况下，稀释后4度放2，3天一般没问题

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 17:50

我们用的GE的NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow柱子连接多肽纯化多抗，经过好多次纯化后，柱子的结合能力下降很多，想问一下，这个柱子还有重复利用的价值吗？还是只能重新换个新柱子？

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其实我个人不建议用NHS,因为NHS偶联的配基不稳定，NHS的优势在于快速和偶联条件温和。

NHS偶联好的柱子用过几次后，载量下降会比较明显

所以我们一般情况下不用这种填料偶联多肽

作者: lgm 时间: 2013-5-8 17:50

其实我个人不建议用NHS,因为NHS偶联的配基不稳定，NHS的优势在于快速和偶联条件温和。

NHS偶联好的柱子用过几次后，载量下降会比较明显

所以我们一般情况下不用这种填料偶联多肽

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那我们纯化量比较大的情况下，应该用哪种方法偶联配基比较好呢？

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 17:50

这个要看你的抗原性质

作者: H2O 时间: 2013-5-8 17:51

学习了，不同的抗体在不同的环境下发生聚集的几率不同，如果出现沉淀不妨改变洗脱方式，用碱性溶液洗脱或者改用盐洗脱。

作者: ha111 时间: 2013-5-8 17:51

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原帖由 H2O 于 2013-5-8 17:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
学习了，不同的抗体在不同的环境下发生聚集的几率不同，如果出现沉淀不妨改变洗脱方式，用碱性溶液洗脱或者改用盐洗脱。

能详细讲一讲，碱性溶液或盐溶液各是指什么吗？

举个例子好不好，谢谢。

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 17:53

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能详细讲一讲，碱性溶液或盐溶液各是指什么吗？

举个例子好不好，谢谢。

硫氰酸钾或者钠

作者: huifeng0516 时间: 2013-5-8 17:57

小弟最近也在纯化抗体，从兔子的抗血清中。前几次是用proteinA beads，纯化的量还可以，够用，但是WB杂交的效果很差，很多非特异性带，于是换成膜吸附法，将抗原蛋白转到PVDF膜上，再和抗血清孵育，再洗脱，但是这种方法得到的抗体的量太少了，郁闷～～
后来看到别人的做法，将抗原蛋白纯化以后偶联到beads上（很多公司卖的，Invitrogen的Dynabeads® MyOne™ Carboxylic Acid，GE的CNBr-activated Sepharose™ 4B等），再将抗血清与其孵育，洗脱。由于抗原是通过共价键与beads偶联的，所以应该不会出现膜吸附法中的将抗原也洗脱下来的情况，而且得量多。还有就是如果抗原的蛋白中含有TAG，比如GST，可以在纯化前用连有GST的beads过一下，去掉GST抗体，或者换一个TAG再表达抗原蛋白就可以省去这步了。
我想必要的话，可以先用proteinA beads过下抗血清，再按照那样纯化。
以上说的我自己也没有做完，大家讨论一下，有什么建议不妨赐教啊，急切想得到好的抗体啊，呵呵

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 17:57

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小弟最近也在纯化抗体，从兔子的抗血清中。前几次是用proteinA beads，纯化的量还可以，够用，但是WB杂交的效果很差，很多非特异性带，于是换成膜吸附法，将抗原蛋白转到PVDF膜上，再和抗血清孵育，再洗脱，但是这种方法得到的抗体的量 ...

纯化血清，想要效果好，一般都使用抗原免疫亲和法纯化

简单的说就是把特异性的抗原共价偶联到填料基质上，这样纯化出来的抗体在WB时能够特异性的识别你的抗原

一般我们不建议用GST-TAG或者NI填料这种非共价亲和方式结合抗原（重组蛋白）来2次亲和抗原特异性抗体。

因为GST还是HIS标签有些时候在低pH洗脱抗体的时候，抗原也会有一定程度的洗脱

而不是非常理想化的，只洗脱抗体，不洗脱配位亲和在填料上的重组蛋白

作者: owanaka 时间: 2013-5-8 17:58

想问问做细胞上清液的蛋白的western，选什么内参合适呢？因为要半定量，实在是功底太弱了能不能给指点迷津？我看到文献有人用akt做内参，但我实在不明白这个信号通路的蛋白是能分泌到胞外的吗？还能稳定的表达吗？谢谢谢了······

作者: wood533 时间: 2013-5-8 17:59

想问问做细胞上清液的蛋白的western，选什么内参合适呢？因为要半定量，实在是功底太弱了能不能给指点迷津？我看到文献有人用akt做内参，但我实在不明白这个信号通路的蛋白是能分泌到胞外的吗？还能稳定的表达吗？谢谢谢了······

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呵呵，没事，来的都是客

不知道你所说的是细胞裂解上清，还是细胞培养分泌上清？

细胞裂解液的上清，有很多内参，常用的如beta-actin

蛋白浓缩的方法就更多了，但是如果是细胞裂解上清的话，一般需要稀释使用，而且加裂解液超声裂解细胞团块的时候是可以大致控制裂解液的浓度级别的。

发帖之前，可以先在丁香园里搜索一下

很多这种基础实验的提问和解答

祝顺利

作者: 66+77 时间: 2013-5-8 18:00

从1楼看下来，受益匪浅，感谢楼主的分享！
我有个问题想请问下大家。最近在纯化小鼠血清，大家都知道小鼠血清很难得到，一只老鼠也就能有0.5ml的血清就不错了。我们想要从三五毫升的血清中中纯化出尽可能多的抗体，方法如下：
血清用PBS稀释2倍，离心，过0.45um滤膜后上柱。填料：proteinG(GE) 1ml
平衡液：PBS；洗脱液：100mM Gly-HCl pH2.8
洗脱下来后用Tris调pH至7
结果纯度是蛮高的，但收率很低（1ml也就有1mg），有其它更好的方法么？需要改进什么？用离子交换、辛酸沉淀（这些方法都要试，血清又很少，不知道各位有没有较为通用的protocol）是不是能收率高一点？

另外，我试过用硫酸铵沉淀，沉下来都是红色的，很杂，电泳图上一大片，都看不到目的条带。没用分步沉淀可能是原因，但血清实在太少了。。。

大家有没有更好的方法（纯度可以适当降一点，收率要保证）？
太苦恼了。。。大家有纯化小鼠血清的不？1ml能拿到多少mg抗体啊？

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 18:01

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从1楼看下来，受益匪浅，感谢楼主的分享！
我有个问题想请问下大家。最近在纯化小鼠血清，大家都知道小鼠血清很难得到，一只老鼠也就能有0.5ml的血清就不错了。我们想要从三五毫升的血清中中纯化出尽可能多的抗体，方法如下：
血 ...

先测一下流穿里有没有活性抗体残留？

用direct elisa测一下，如果TITLE已经非常低了，那这样的血清流穿就直接扔掉吧。

另外纯化的介质用proteinG，我觉得可以用proteinA

请参看

cuturl('http://protein.dxy.cn/bbs/topic/17545614')

作者: mimili_901 时间: 2013-5-8 18:02

大肠杆菌的重组蛋白要去内毒素达标那是相当麻烦滴了

你镍柱下来后的样品内毒素检过没？在多少EU/ML的水平？

后期要去除高含量的内毒素，不是那么容易的，当初制定的工艺路线就有问题。

应该选择用细胞真核表达，全程控制内毒素的水平

我也遇到过一个内毒素的问题：
工艺中的一个层析柱在使用前用1N NaOH清洗、浸泡2天后再用纯水冲洗10CV，流出液检测内毒素还是＞10EU/ml，请问有没有好的办法解决。

作者: ladyhuahua 时间: 2013-5-8 18:03

请问楼主，有没有做过直接把抗体共价连接到agarose beads上呢？不通过protien A
谢谢！

作者: one 时间: 2013-5-8 18:04

我想请教一下鼠抗体IGM的纯化方法以及其得率问题。

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 18:05

大肠杆菌的重组蛋白要去内毒素达标那是相当麻烦滴了

你镍柱下来后的样品内毒素检过没？在多少EU/ML的水平？

后期要去除高含量的内毒素，不是那么容易的，当初制定的工艺路线就有问题。

应该选择用细胞真核表达，全程控制内毒素的水平

我也遇到过一个内毒素的问题：
工艺中的一个层析柱在使用前用1N NaOH清洗、浸泡2天后再用纯水冲洗10CV，流出液检测内毒素还是＞10EU/ml，请问有没有好的办法解决。

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最好用1M NAOH在位清洗，中间可以有一段NAOH循环使用

仅仅是浸泡，效果不会太好

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 18:05

请问楼主，有没有做过直接把抗体共价连接到agarose beads上呢？不通过protien A
谢谢！

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经常做,用一些偶联比较温和的活化填料就可以

不过建议抗体浓度最好再0.5-1mg/ml

偶联的填料种类比较重要

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 18:05

我想请教一下鼠抗体IGM的纯化方法以及其得率问题。

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IgM的纯化比较复杂多变

非特异性的可以用疏水的方法,可以用常规的phenol苯基疏水填料，也可以用GE和MERCK,以及TOSOH公司那种嗜硫+疏水的亲和填料，就是GE所谓的专门用来纯化IgM的填料。

另外可以用抗原亲和来试试，买点活化填料，把抗原共价结合上去，然后来亲和纯化IgM

作者: one 时间: 2013-5-8 18:06

我也遇到过一个内毒素的问题：
工艺中的一个层析柱在使用前用1N NaOH清洗、浸泡2天后再用纯水冲洗10CV，流出液检测内毒素还是＞10EU/ml，请问有没有好的办法解决。

最好用1M NAOH在位清洗，中间可以有一段NAOH循环使用

仅仅是浸泡，效果不会太好
——————
是我没表达得太明白。
我是用1M NaOH 在位清洗，然后浸泡48h，再用纯水冲洗10CV，结果流出液检测内毒素还是＞10EU/ml，这是我其中的某个层析柱遇到的情况。我的另外3个层析柱用0.5M NaOH 在位清洗，然后浸泡过夜却都能很轻松地去除完柱内内毒素。

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 18:06

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原帖由 one 于 2013-5-8 18:06 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我也遇到过一个内毒素的问题：
工艺中的一个层析柱在使用前用1N NaOH清洗、浸泡2天后再用纯水冲洗10CV，流出液检测内毒素还是＞10EU/ml，请问有没有好的办法解决。

最好用1M NAOH在位清洗，中间可以有一段NAOH循环使用

仅仅 ...

那我觉得是不是你的层析柱特异性结合了内毒素的某些基团

猜想你的层析柱是应该是离子交换或者疏水吧

建议你更改一下清洗液的组分和浓度，再试试

作者: zsxan1990 时间: 2013-5-8 18:07

由于前几天接种一批小鼠产生的腹水里含抗体量很低，已致用ProteinA 纯化洗脱时UV都在0.03左右甚至没有。所以在这里想问问关于小鼠接种单抗细胞的问题。
1. 小鼠致敏后几天进行接种细胞最佳？？？
2, 接种的细胞量多少最佳？需要计数吗？（别人告诉我是一平板接3只小鼠，但是这里面涉及密度问题），接种的体积多少最佳？？？
3.与接种用小鼠自身状态关系大吗？还有与小鼠性别有关吗？
求各位前辈能根据你们的经验帮我做个优化个方案，再此叩谢！！！

作者: IAM007 时间: 2013-5-8 18:07

楼主好，我想问用于精细纯化的柱子和填料有哪些，可以给我推荐几个吗？我用分子筛没做出来，现在不知道怎么纯化好了。之前用过离子交换柱和疏水柱，效果挺好。

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 18:07

由于前几天接种一批小鼠产生的腹水里含抗体量很低，已致用ProteinA 纯化洗脱时UV都在0.03左右甚至没有。所以在这里想问问关于小鼠接种单抗细胞的问题。
1. 小鼠致敏后几天进行接种细胞最佳？？？
2, 接种的细胞量多少最佳？需要计数吗？（别人告诉我是一平板接3只小鼠，但是这里面涉及密度问题），接种的体积多少最佳？？？
3.与接种用小鼠自身状态关系大吗？还有与小鼠性别有关吗？
求各位前辈能根据你们的经验帮我做个优化个方案，再此叩谢！！！

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细胞的状态和老鼠的状态，以及腹腔注射的好坏，影响很大

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 18:08

楼主好，我想问用于精细纯化的柱子和填料有哪些，可以给我推荐几个吗？我用分子筛没做出来，现在不知道怎么纯化好了。之前用过离子交换柱和疏水柱，效果挺好。

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你没讲具体的实验技术细节，很难帮你出什么好主意

作者: zsxan1990 时间: 2013-5-8 18:08

我是从一个工业制剂里面纯化一种酸性蛋白，杂蛋白比较多。我先后用了DEAE离子柱和疏水柱，效果还不错，第三步想尝试分子筛，结果没做出来。我本想着过完分子筛再找种另外一种离子柱，可能就成功了。如果真不行，请问能推荐几种柱子吗？我下一步不知道怎么办好了。
我的目标蛋白分子量40-220kD，只知道是酸性蛋白，其他性质不确定。DEAE的条件是，20mM PB，pH7.0缓冲液，大约0.4M NaCl洗脱。疏水柱是butyl，50mM PB,pH7.0缓冲液，1.5M硫酸铵，然后0.6M硫酸铵左右洗脱。另外我的样品已经10kD超滤过，小分子的杂质已去掉。

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 18:09

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我是从一个工业制剂里面纯化一种酸性蛋白，杂蛋白比较多。我先后用了DEAE离子柱和疏水柱，效果还不错，第三步想尝试分子筛，结果没做出来。我本想着过完分子筛再找种另外一种离子柱，可能就成功了。如果真不行，请问能推荐几种 ...

按我的理解

既然您提到的酸性蛋白是一类分子量的蛋白，在您的疏水洗脱产物中，除了这类酸性蛋白外，还有什么其他“杂蛋白”么？这些杂蛋白的分子量是多少？

一般我们认为在选分子筛的时候选择的孔径，能使杂蛋白和目标蛋白最好分别在外水和内水中，这样分离效果会比较好

如果目标蛋白和杂蛋白都能进入填料的内水，那就需要分辨率非常高的分子筛和柱效非常好的装填

作者: zsxan1990 时间: 2013-5-8 18:10

附上电泳图一张，1为过了离子柱的样品，2为过了两根柱子的样品。疏水洗脱后还是有一些杂蛋白的，但问题是我也不知道哪个才是我的目的蛋白。这些蛋白看分子量是几十到200多kD，不知道怎样才能分开？？

图片附件: 61560532.jpg (2013-5-8 18:10, 10.77 KB) / 该附件被下载次数 18
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16101

作者: NBA 时间: 2013-5-8 18:10

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附上电泳图一张，1为过了离子柱的样品，2为过了两根柱子的样品。疏水洗脱后还是有一些杂蛋白的，但问题是我也不知道哪个才是我的目的蛋白。这些蛋白看分子量是几十到200多kD，不知道怎样才能分开？？ ...

也来随便说一说，仅供参考
不知道哪个是目标蛋白的情况下，只有用高分辨率的分子筛，把混合组分，分成几个峰，然后分管收集后，再来鉴定，到底哪些峰是你想要的东西

GE有superdex 或者superose系列都是比较高分辨率的
但是高分辨率的分子排阻层析是比较难做的。

我倒是建议可以买一些不同截流孔径的超滤管，或许可以来进一步分分组

比如5K 10K 30K 50K 100K的超滤管，你买来分级离心，分分组分

作者: zsxan1990 时间: 2013-5-8 18:11

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也来随便说一说，仅供参考
不知道哪个是目标蛋白的情况下，只有用高分辨率的分子筛，把混合组分，分成几个峰，然后分管收集后，再来鉴定，到底哪些峰是你想要的东西

GE有superdex 或者superose系列都是比较高分辨率的
但是高分 ...

嗯，是难分，所以我用分子筛也没分出来。
我用过10K的超滤管，不过，有30K 50K 100K的吗？我用的millipore的没有哦，你是在哪里买的？谢谢啦

作者: NBA 时间: 2013-5-8 18:11

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嗯，是难分，所以我用分子筛也没分出来。
我用过10K的超滤管，不过，有30K 50K 100K的吗？我用的millipore的没有哦，你是在哪里买的？谢谢啦

赛托利斯

作者: zsxan1990 时间: 2013-5-8 18:11

有人给我推荐日本三菱的HP系列精细填料，有人用过吗？或者有相关的资料可以发给我吗？谢谢呀，我怎么都找不到

作者: moonlight45 时间: 2013-5-8 18:12

前辈，你好，我现在是在做IGG类型抗体的纯化，用的是GE的ProteinG的柱子，纯化后发现在40多KD的地方多出一条带，问了下其他人说可能是重链降解的，听说可以用疏水柱可以去除，现在正摸疏水柱的条件，我买的是GE的phenyl 的疏水柱，按它的说明书来摸条件一直分不开哦。。想向前辈请教下有没有好的方法，谢谢！

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 18:12

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前辈，你好，我现在是在做IGG类型抗体的纯化，用的是GE的ProteinG的柱子，纯化后发现在40多KD的地方多出一条带，问了下其他人说可能是重链降解的，听说可以用疏水柱可以去除，现在正摸疏水柱的条件，我买的是GE的phenyl 的疏水柱，按 ...

先买个特异性抗重链的一抗做个WB鉴定一下是不是重链

另外最好把纯化前后的各个留样的电泳图发上来

作者: ha111 时间: 2013-5-8 18:13

也来随便说一说，仅供参考
不知道哪个是目标蛋白的情况下，只有用高分辨率的分子筛，把混合组分，分成几个峰，然后分管收集后，再来鉴定，到底哪些峰是你想要的东西

GE有superdex 或者superose系列都是比较高分辨率的
但是高分辨率的分子排阻层析是比较难做的。

我倒是建议可以买一些不同截流孔径的超滤管，或许可以来进一步分分组

比如5K 10K 30K 50K 100K的超滤管，你买来分级离心，分分组分

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我来拍一砖头，呵呵。

用超滤来分级分离是完全不可能的，请先看看超滤截留分子量的定义。

超滤不同于固定孔径的筛分，没有那个固定的尺寸。

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 18:13

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也来随便说一说，仅供参考
不知道哪个是目标蛋白的情况下，只有用高分辨率的分子筛，把混合组分，分成几个峰，然后分管收集后，再来鉴定，到底哪些峰是你想要的东西

GE有superdex 或者superose系列都是比较高分辨率的
但是高分辨 ...

一般一个公司的超滤产品的孔径分布还是蛮等比的

虽然说10K的膜，实际孔径会在5-20之间

同样100K的膜的实际孔径会在50K-200K之间

实际膜上的孔径大小数值是以膜孔径数值为中心，呈枣核状向两边增大或者减小孔径分布

所以有时候也能用来纯化分离一些组分

我们有时经常用100K的膜来纯化分离抗体样品中的小分子物质

推荐用PES材质的超滤膜，滤速快，吸附也低，离心管式的经常用赛托利斯的

我发现现在连GE都OEM赛多这个管式超滤

作者: zsxan1990 时间: 2013-5-8 18:17

呵呵。。谢谢各位前辈指导，那我先把初步分离的一起跑个电泳看看。

作者: eric930 时间: 2013-5-8 18:18

请教一下应用分子生物学的方法，如何能提高蛋白的表达量？

作者: IAM007 时间: 2013-5-8 18:20

急！！！~~~请问有没有做过抗体SEC？我用的是安捷伦PL 40的色谱柱，聚合物填料，PBS buffer，做经过阴离子交换柱未脱盐的样品，没有出峰，可测得OD为3.7MG/ML，SDS-PAGE均看到明显蛋白条带，可在SEC上无法得到证实，是什么原因呢？还是样品未脱盐或柱子填料的原因？谢谢大侠了~~~

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 18:21

SEC应该是凝胶过滤层析或者叫分子排阻色潽吧

看你用安捷伦的色谱柱，应该是HPLC的柱子吧

一般做抗体都用中低压的色谱柱和色谱填料，比如琼脂糖或者是树脂

作者: INK 时间: 2013-5-8 18:26

急！！！~~~请问有没有做过抗体SEC？我用的是安捷伦PL 40的色谱柱，聚合物填料，PBS buffer，做经过阴离子交换柱未脱盐的样品，没有出峰，可测得OD为3.7MG/ML，SDS-PAGE均看到明显蛋白条带，可在SEC上无法得到证实，是什么原因呢？还是样品未脱盐或柱子填料的原因？谢谢大侠了~~~

抗体利用HPLC做SEC是没有问题的，你最好检查下你的柱子的分离范围是不是合适，毕竟抗体是比较大的。你用TSK SWXL3000的柱子试试看。
如果担心是柱子出问题了，走一针BSA看看能不能出峰

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-8 18:27

从理论上讲是没问题

但是常规的使用中，一般都是用HPLC做SEC来分析纯化好抗体的纯度和聚体

一般都用中低压液相色谱来纯化生产抗体

作者: 66+77 时间: 2013-5-8 18:28

从理论上讲是没问题

但是常规的使用中，一般都是用HPLC做SEC来分析纯化好抗体的纯度和聚体

一般都用中低压液相色谱来纯化生产抗体

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我以为他说的就是分析……纯化确实不建议用HPLC

作者: 89tongzijun 时间: 2013-5-9 11:52

想问一下我纯化杂交瘤细胞培养上清液，盐析后透析，然后用什么柱子纯化？我是小鼠的IgG1...

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-9 11:53

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想问一下我纯化杂交瘤细胞培养上清液，盐析后透析，然后用什么柱子纯化？我是小鼠的IgG1...

不太清楚你为什么要盐析，理论上培养上清应该可以直接上PROTEIN A，然后就能达到一个比较好的纯度了。

作者: 89tongzijun 时间: 2013-5-9 11:55

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不太清楚你为什么要盐析，理论上培养上清应该可以直接上PROTEIN A，然后就能达到一个比较好的纯度了。

我是跟着一个文献做的，用的proteinG，说A人的比较好鼠不行，柱子还没有买...

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-9 11:55

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原帖由 89tongzijun 于 2013-5-9 11:55 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我是跟着一个文献做的，用的proteinG，说A人的比较好鼠不行，柱子还没有买...

小鼠的IGG1确实应该用proteinG
既然你有文献，先参照文献做一下，再看看有什么问题

作者: biabiade 时间: 2013-5-9 11:57

请问HIS-TAG单克隆抗体是不是只对HHHHHH有特异性，还是对所有长度HIS都有反应？
公司的说明书是这样写的：

本His-tag抗体(His antibody)为进口分装，用经过适当修饰的人工合成6xHis作为抗原制备而成的抗His-tag小鼠单克隆抗
体。克隆号为AD1.1。
¾ 本His-tag抗体广泛地用于His-tag (HHHHHH)融合表达蛋白的检测。本抗体可以检测位于融合蛋白N-terminal的His-tag，也
可以检测位于融合蛋白C-terminal的His-tag。

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 11:58

我是跟着一个文献做的，用的proteinG，说A人的比较好鼠不行，柱子还没有买...

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移步
cuturl('http://protein.dxy.cn/bbs/topic/17545614')

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 11:58

请问HIS-TAG单克隆抗体是不是只对HHHHHH有特异性，还是对所有长度HIS都有反应？
公司的说明书是这样写的：

本His-tag抗体(His antibody)为进口分装，用经过适当修饰的人工合成6xHis作为抗原制备而成的抗His-tag小鼠单克隆抗
体。克隆号为AD1.1。
¾ 本His-tag抗体广泛地用于His-tag (HHHHHH)融合表达蛋白的检测。本抗体可以检测位于融合蛋白N-terminal的His-tag，也
可以检测位于融合蛋白C-terminal的His-tag。

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要看这个HIS抗体的专一性了
有些专一性不好的，对3个HIS 4HIS 5 HIS 6HIS 有可能都有反应

你这个抗体产品没讲QC时的WB数据，所以很难讲

作者: glass 时间: 2013-5-9 12:00

楼主，我现在在纯化小鼠的腹水，但是我不知道这个单抗是什么亚型的，我用proteinA/G、辛酸硫酸以前这个杂交瘤细胞产生的腹水，曾经用proteinG用纯化过1ml可以得到4mg的抗体，我怀疑柱子是不是坏了，那个protein G是不是用了一段时间就不能用了？大概可以用几次啊？可以重生吗？怎么重生？我们用的是GE公司的。
这批腹水跟以前的腹水相比，有个不同是杂交瘤细胞是以前那批杂交瘤的传代，请问传代后抗体分泌量会有差吗？是不是杂交瘤细胞不能传太多次代？而且这次比较怪的是小鼠注入杂交瘤细胞后很容易死，5天肚子就大了，7天后就有一半会死掉，这样是不是不太正常啊？

作者: fei1226com 时间: 2013-5-9 12:00

这里都是做抗体纯化的，能不能帮我解决一下我的问题，
我们的抗体现在经还原SDS-PAGE分析后在170kD以上出现条带，经质谱分析后是抗体重链的多聚体，没有轻链，想知道怎么能够把这个多聚体与我们的单抗分开来，我们的抗体重链的多聚体和单抗的混合物经HPLC-SEC分析后是一个峰，没有把他们分开，大家有没有什么好的办法，多谢！！

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-9 12:01

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原帖由 fei1226com 于 2013-5-9 12:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

这里都是做抗体纯化的，能不能帮我解决一下我的问题，
我们的抗体现在经还原SDS-PAGE分析后在170kD以上出现条带，经质谱分析后是抗体重链的多聚体，没有轻链，想知道怎么能够把这个多聚体与我们的单抗分开来，我们的抗体重链的 ...

你们的多聚体和单体如果用HPLC-SEC都无法分开？很少会有这种情况，你最好收集一下HPLC-SEC的峰，进行电泳，看看是否在电泳中是多条带？一般来说，分离多聚体，在实验室规模可以采用分子筛，而且多聚体的电荷比单体的多，可以采用离子交换层析，多聚体的疏水性也比单体强，也可以采用疏水层析。

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 12:13

楼主，我现在在纯化小鼠的腹水，但是我不知道这个单抗是什么亚型的，我用proteinA/G、辛酸硫酸以前这个杂交瘤细胞产生的腹水，曾经用proteinG用纯化过1ml可以得到4mg的抗体，我怀疑柱子是不是坏了，那个protein G是不是用了一段时间就不能用了？大概可以用几次啊？可以重生吗？怎么重生？我们用的是GE公司的。
这批腹水跟以前的腹水相比，有个不同是杂交瘤细胞是以前那批杂交瘤的传代，请问传代后抗体分泌量会有差吗？是不是杂交瘤细胞不能传太多次代？而且这次比较怪的是小鼠注入杂交瘤细胞后很容易死，5天肚子就大了，7天后就有一半会死掉，这样是不是不太正常啊？

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每次纯化前的样品，最好能和以前的留样，进行一个相对的定量，这样好后面估算得率。

动物实验也是门科学哇，细胞状态，饲养，注射都很关键呵呵，多多练习吧

proteinA/G柱子是将proteinA ProteinG蛋白联合重组表达然后偶联到填料上，或者是单独的A G蛋白一起偶联到填料上。

蛋白配基的填料也可以再生，不过再生的时候，请参考说明书里写的CIP条件或者再生条件

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 12:13

这里都是做抗体纯化的，能不能帮我解决一下我的问题，
我们的抗体现在经还原SDS-PAGE分析后在170kD以上出现条带，经质谱分析后是抗体重链的多聚体，没有轻链，想知道怎么能够把这个多聚体与我们的单抗分开来，我们的抗体重链的多聚体和单抗的混合物经HPLC-SEC分析后是一个峰，没有把他们分开，大家有没有什么好的办法，多谢！！

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这只能说明你的HPLC-SEC做的不是非常好，用高分辨率的柱子，再优化一下条件，应该能分出点差别。

上面兄弟说的离子交换和疏水都可以试试，蛋白纯化这个东西很难讲，因为真正微观条件下，两个分子量差不多的蛋白，电荷和疏水性的差别存在很多种可能。

另外的办法就是买一些只识别你这个单抗轻链的单抗（需要不少量起码0.5mg），然后偶联到填料上，做反向免疫亲和，代价是这样做比较贵。

多试试吧，纯化是门实践的科学，很多东西是试出来的（当然前提要有理论基础）

作者: xue258 时间: 2013-5-9 12:14

您好，我是刚刚进实验的学生，我想提取一种病号的单克隆抗体做蛋白结构分析，现在有几个问题，想请教下。
1。这种抗体血的含量是30~200mg/L，不同患者不同的，可是在血里，我不能抽取多少血的，这样的样本量能不能做后面的结构分析？
2。这个单抗的分子量是25单体，但是有二聚体的，我要从血里提纯的话用什么方法比较合理？我看到文献些的是2次SDS电泳在转PVDF膜，这个可行吗？
3。蛋白结构分析方面，老板是想做3级结构，可是样本量及要求我这样提取的可以吗？如果换为蛋白一级结构分析可行吗？
非常感谢回答啊

作者: hold住 时间: 2013-5-9 12:14

大家好，有谁知道填料配基脱落的检测验证方法？

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 12:15

您好，我是刚刚进实验的学生，我想提取一种病号的单克隆抗体做蛋白结构分析，现在有几个问题，想请教下。
1。这种抗体血的含量是30~200mg/L，不同患者不同的，可是在血里，我不能抽取多少血的，这样的样本量能不能做后面的结构分析？
2。这个单抗的分子量是25单体，但是有二聚体的，我要从血里提纯的话用什么方法比较合理？我看到文献些的是2次SDS电泳在转PVDF膜，这个可行吗？
3。蛋白结构分析方面，老板是想做3级结构，可是样本量及要求我这样提取的可以吗？如果换为蛋白一级结构分析可行吗？
非常感谢回答啊

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1，需要的抗体量完全取决你后面结构分析的实验
2，单抗的分子量应该150KD左右，不知道你的为什么是25单体？单条轻链？一般抗体的纯化都是用亲和法或者疏水层析，电泳分离也是可以，但是抗体会变性。你多查查这方面的资料
3，要做3级结构，我想应该要有空间结构了，那最好是亲和层析做的，尤其是用抗原去免疫亲和特异性的抗体出来，这样才能进行结构分析

一级结构的话，你用电泳分离的也可以

作者: fsdd817 时间: 2013-5-9 12:15

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原帖由 蒜泥面条 于 2013-5-9 12:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
您好，我是刚刚进实验的学生，我想提取一种病号的单克隆抗体做蛋白结构分析，现在有几个问题，想请教下。
1。这种抗体血的含量是30~200mg/L，不同患者不同的，可是在血里，我不能抽取多少血的，这样的样本量能不能做后面的结构分析？
2 ...

我要提取的就是单条轻链，现在最困惑我的事情就是能提出多少样本量，假设病人的FLC是200mg/L，我抽取血样为10ml的话，通过亲和柱能提出多少？导师说后面还要继续分析，到底分析什么就是师妹师弟的事情了，我是第一个，所以现在很迷茫，没人请教。谢谢你的回答，万分感激啊。

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 12:16

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原帖由 fsdd817 于 2013-5-9 12:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我要提取的就是单条轻链，现在最困惑我的事情就是能提出多少样本量，假设病人的FLC是200mg/L，我抽取血样为10ml的话，通过亲和柱能提出多少？导师说后面还要继续分析，到底分析什么就是师妹师弟的事情了，我是第一个，所以现在很迷 ...

单条轻链很难纯化，尤其是你的样本是血清，里面IgG浓度很高的情况下

我觉得你这个课题很麻烦…………

你电泳跑出来的结果也往往是25KD左右那个条带去，你的特异性条带混在众多的血清抗体的轻链中

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 12:17

有个理论上的思路是

你去买点用Immobilized Protein L琼脂糖或者磁珠把血清里的含有KAPPA轻链的东西都亲和下来（包括你的单体轻链和普通IgG抗体）,然后把亲和出来的，再用peotein A填料去亲和，流穿里的应该就是你的单链轻链了（因为没有FC，所以不会被protein A亲和走）

但这个实验的前提是，你的单链轻链的丰度足够高，你说有0.2mg/ml

但你要知道血清里的IgG是差不多20mg/ml的级别

两者差几乎100倍！

所以我说你这个实验很难，但是可以试试上面这个方案

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 12:17

Protein L has the unique ability to bind through kappa light chain interactions without interfering with the antibody's antigen-binding site.

这个是L蛋白的介绍

作者: moonlight45 时间: 2013-5-9 12:17

患者的轻链增多并不都是k型，还有L型，而且用我们医院的实验室检查其浓度多在30-100mg/L。
假设说，抽取血样进行超滤，去除分子量小于10kDa的物质，剩下20-50ul的样本（我看到那篇文献前期工作是这样描述的），这样轻链的丰度够了，这样的样本量能做您说的那个方法吗

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 12:19

QUOTE:

原帖由 moonlight45 于 2013-5-9 12:17 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

患者的轻链增多并不都是k型，还有L型，而且用我们医院的实验室检查其浓度多在30-100mg/L。
假设说，抽取血样进行超滤，去除分子量小于10kDa的物质，剩下20-50ul的样本（我看到那篇文献前期工作是这样描述的），这样轻链的丰度够了，这 ...

血清那么浓的样品是不能做超滤的

作者: Ao7 时间: 2013-5-9 12:19

您好。最近才开始做抗体纯化，我们将要对小鼠腹水进行纯化。已经买了GE的protien G柱子，我刚看了您的帖子，您一般用rprotienA纯化小鼠腹水，但是我看GE说明书里的A与G的比较，发现A对鼠的IgG1吸附很低，但IgG的亚型主要是IgG1，也就是说尽管proteinA吸附很强，但我要的东西却吸附不住，这个您如何解释呢？打扰了。

作者: 2541 时间: 2013-5-9 12:20

您好，我们最近在做兔血清中多抗的纯化，使用的是GE公司的1ml　HiTrap rProtein A FF预装柱。现在的问题是，洗脱下来以后的抗体浓度非常低，只有大概1.5mg/ml，跟未纯化的血清差不多，流穿里也有很多抗体。为什么纯化的抗体浓度这么低？有没有解决的办法呢？谢谢了。
bingding buffer是PBS，elution buffer是pH3.4的柠檬酸盐缓冲液。上样流速0.2ml/min，洗脱流速是1ml/min。

作者: zranqi_1 时间: 2013-5-9 12:20

很多实验技术，都是看起来原理简单，方法常规，但是真正做起来就会发现这样那样的问题和情况，你遇到过，就会知道实际情况比理论要复杂，这个就是所谓的经验了。

腹水里面和血清里面，有时经常有油脂类或者SKYKILLER提到的石蜡油，很讨厌，我们也经常遇到。

我们一般是使用稀释液把样品稀释，然后高速离心，然后小心拿出来，油脂类的会浮在液面上，然后就用棉签之类的挑去。样品稍微会有些损失，但是因为稀释过了，单位体积里的抗体损失比原液就少很多。

不知道还有没有什么更好的方法:p
期待路过的大侠们多发表意见

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可以用玻璃纤维纸来吸附油脂，效果不错！

作者: zranqi_1 时间: 2013-5-9 12:21

楼主，您好。刚开始纯化抗体，很多东西不懂。这是我纯化抗体后的图片，怎么和你纯化的不一样啊。中间第4条红带为70kd，下一条为55kd，第8条为22kd。是不是哪出问题了？

图片附件: 65289253.snap.jpg (2013-5-9 12:21, 15.97 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16111

作者: zranqi_1 时间: 2013-5-9 12:21

忘了说了，marker左边为穿流液，洗涤液，右边为洗脱1,2,3,4,5

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 12:22

您好。最近才开始做抗体纯化，我们将要对小鼠腹水进行纯化。已经买了GE的protien G柱子，我刚看了您的帖子，您一般用rprotienA纯化小鼠腹水，但是我看GE说明书里的A与G的比较，发现A对鼠的IgG1吸附很低，但IgG的亚型主要是IgG1，也就是说尽管proteinA吸附很强，但我要的东西却吸附不住，这个您如何解释呢？打扰了。

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我们用的不是GE的proteinA

proteinA 填料也有区别的，不同公司的PROTEIN A效果不一样，另外PROTEINA 还有r protinA 和n proteinA的区别

有些时候厂家出于商业利益的考虑，也可能会隐瞒一些ONVER LABEL的功能

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 12:22

楼主，您好，我们最近在做兔血清中多抗的纯化，使用的是GE公司的1ml　HiTrap rProtein A FF预装柱。现在的问题是，洗脱下来以后的抗体浓度非常低，只有大概1.5mg/ml，跟未纯化的血清差不多，流穿里也有很多抗体。为什么纯化的抗体浓度这么低？有没有解决的办法呢？谢谢了。
bingding buffer是PBS，elution buffer是pH3.4的柠檬酸盐缓冲液。上样流速0.2ml/min，洗脱流速是1ml/min。

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1ml那个柱子一次应该差不多能亲和20mg左右的兔IgG,前提是你上样的血清足够多，饱和柱子（大约5ml血清就可以饱和1ml的柱子）

你洗脱体积不超10ml，浓度应该在2mg/ml左右。

另外我不认为1.5mg/ml的浓度很低，而且多抗浓度过高会引起沉淀等其他问题，不见得是好事

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 12:23

您好。刚开始纯化抗体，很多东西不懂。这是我纯化抗体后的图片，怎么和你纯化的不一样啊。中间第4条红带为70kd，下一条为55kd，第8条为22kd。是不是哪出问题了？

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您的样品看着像上清单抗

不知道是不是鼠抗

杂带稍微多了一些，可能是纯化过程需要优化，但问题不大

您的洗脱1,2,3,4,5

1里面带有杂蛋白是因为你洗脱前的平衡清洗没有彻底，初始洗脱混有杂蛋白
2管应该是浓度最高的收集，但是因为您的抗体样品在电泳时，样品处理不好，或者其他原因导致重链聚集了，跑电泳时拖曳了，所以看起来发现轻链比重链都粗。

我觉得这个纯化问题不是很大，平衡液里加点TRITON-X100 0.5% 和0.5M NaCl,平衡个10-20倍柱体积

然后跑电泳的时候，LOADING BUFFER要新鲜，样品按标准时间煮沸，然后上样前彻底离心，加样时注意避免鼻涕样的样品加到电泳孔里

另外洗脱最好用pH3,除非是确认的工艺，明确知道能用更高的PH

作者: zranqi_1 时间: 2013-5-9 12:23

一直在刷新，总算看到您的回复了。确实是鼠单抗，洗脱2确实很奇怪，都是轻链。不知道是煮胶的问题还是纯化过程中出现的问题。（彻底离心，加样时注意避免鼻涕样的样品加到电泳孔里）这个不是很懂，对电泳有影响么？洗脱液pH值是按照说明书配置的

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 12:23

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原帖由 zranqi_1 于 2013-5-9 12:23 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

一直在刷新，总算看到您的回复了。确实是鼠单抗，洗脱2确实很奇怪，都是轻链。不知道是煮胶的问题还是纯化过程中出现的问题。（彻底离心，加样时注意避免鼻涕样的样品加到电泳孔里）这个不是很懂，对电泳有影响么？洗脱液pH值是按 ...

你判断你的重链在的，只是电泳的问题没有跑出来

而其从洗脱1来看，重链也是在的，所以没有道理洗脱2的重链会无缘无故消失，就是电泳的原因

作者: u234 时间: 2013-5-9 12:24

您好，我使用DEAE-BULE柱子做抗体纯化，胶会出现块状是怎么回事啊？

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 12:24

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原帖由 u234 于 2013-5-9 12:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
您好，我使用DEAE-BULE柱子做抗体纯化，胶会出现块状是怎么回事啊？

有杂蛋白或者脂质吸附了，用碱和盐酸胍和酒精，清洗一下，最好是重悬一下填料

作者: BOSS2011 时间: 2013-5-9 12:27

各位前辈求救！！
最近从小鼠腹水中纯化单抗，洗脱液用的是3.0的甘氨酸，中和液用的是9.0的Tris-HCl。洗脱下的浓度也不是很高（0.5mg/ml左右），但很快就有絮状析出，透析离心澄清后放4℃又会缓慢析出……
以前纯化多种单抗均没有这种现象，现在情况很严重，望高人指点！！！

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 12:27

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原帖由 BOSS2011 于 2013-5-9 12:27 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
各位前辈求救！！
最近从小鼠腹水中纯化单抗，洗脱液用的是3.0的甘氨酸，中和液用的是9.0的Tris-HCl。洗脱下的浓度也不是很高（0.5mg/ml左右），但很快就有絮状析出，透析离心澄清后放4℃又会缓慢析出……
以前纯化多种单抗均没有这 ...

单抗发生聚集沉淀的案例启示不多，多抗多

你可以考虑加5%-10%的甘油，如果对你的抗体后续使用没影响的话

作者: BOSS2011 时间: 2013-5-9 12:28

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原帖由 蒜泥面条 于 2013-5-9 12:27 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

单抗发生聚集沉淀的案例启示不多，多抗多

你可以考虑加5%-10%的甘油，如果对你的抗体后续使用没影响的话

感谢回复！
本来也考虑加甘油，但是可能会影响以后的冻干步骤，而且单抗要进行动物实验，怕有影响。
这种析出能复溶么？试了甘油、DMSO均不能复溶……现在正找原因，几个月的劳动啊……

刚才测了一下浓度，貌似析出后浓度没有降低多少啊……费解……

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 12:28

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原帖由 BOSS2011 于 2013-5-9 12:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

感谢回复！
本来也考虑加甘油，但是可能会影响以后的冻干步骤，而且单抗要进行动物实验，怕有影响。
这种析出能复溶么？试了甘油、DMSO均不能复溶……现在正找原因，几个月的劳动啊……

刚才测了一下浓度，貌似析出后浓度没有降 ...

是的，我们当初也发现过类似的情况，把沉淀离心掉，发现浓度并没有损失多少，大概5-10%

作者: xyw5 时间: 2013-5-9 12:29

我最近刚开始做单链抗体的纯化 proteinA亲和纯化的 Elisa检测发现有很多都没有挂柱
前面看到你们讨论说单链抗体亲和力较弱不稳定
请问有没有什么办法可以改善一下挂柱的能力或者是提高它的稳定性呢？
多谢~~~

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 12:29

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我最近刚开始做单链抗体的纯化 proteinA亲和纯化的 Elisa检测发现有很多都没有挂柱
前面看到你们讨论说单链抗体亲和力较弱不稳定
请问有没有什么办法可以改善一下挂柱的能力或者是提高它的稳定性呢？
多谢~~~ ...

你的单链抗体是 “两部分轻链”还是“一半重链一半轻链”的？

作者: xyw5 时间: 2013-5-9 12:30

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你的单链抗体是 “两部分轻链”还是“一半重链一半轻链”的？

这个抗体包含了VH、CH1和VL，外加一个Fc的标签

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 12:30

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原帖由 xyw5 于 2013-5-9 12:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

这个抗体包含了VH、CH1和VL，外加一个Fc的标签

不知道你的抗体是什么属源
如果ProteinA 亲和力弱的话，可以试试PROTEIN G，protein G虽然载量远不及A，但是对不同属源的抗体广谱性比较好。
另外换个公司的Protein A也可以试试，现在不同公司的重组proteinA的效果也有很大差异的。

另外你可以试试不是很常见的 Protein L，这个是特异吸附轻链的

作者: u234 时间: 2013-5-9 12:31

大家好，我现在正在做一个抗体的纯化，第一步用的proteinA亲和层析，在上完样后换用平横缓冲液冲洗了3个柱体积后，加了一步中间洗涤，缓冲体系是20mM NaAC Ph5.0，一个柱体积左右uv280nm就开始出峰了，经液相检测保留时间与目标抗体一致，收率占20%左右，不知道是什么原因，请大家帮忙分析一下。这次一个交接的工艺，也不是每次纯化都这样，目前共做了10次，有3次出现了这种情况。

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 12:31

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原帖由 u234 于 2013-5-9 12:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

大家好，我现在正在做一个抗体的纯化，第一步用的proteinA亲和层析，在上完样后换用平横缓冲液冲洗了3个柱体积后，加了一步中间洗涤，缓冲体系是20mM NaAC Ph5.0，一个柱体积左右uv280nm就开始出峰了，经液相检测保留时间与目标抗 ...

正常，有些结合的不是非常紧密的抗体会被弱酸缓冲液清洗下来

我们经常用PH3的缓冲液洗脱，其实很多抗体在PH4,5的时候也会有脱落解离。

作者: lixi559 时间: 2013-5-9 12:32

楼主老师好，我也在做抗体纯化。
我用的是His标签的全蛋白做免疫抗原，送到公司注射的兔子，一共boost了三次，三次取的血清均用重做的蛋白做了dot blot，显示的结果是信号越来越强。
然后我用Affi-gel 10和纯化的重组蛋白做抗体纯化，纯化后跑胶能看到明显的重链和轻链，再次做dot blot也能看到纯化后抗体依然可检测重组的蛋白，但无论用纯化前的血清还是用纯化后的抗体都无法检测到我要的带？而杂带却有很多，我都要被这个抗体整崩溃了。
请问我该怎么解决这个问题呢？

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 12:32

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原帖由 lixi559 于 2013-5-9 12:32 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
楼主老师好，我也在做抗体纯化。
我用的是His标签的全蛋白做免疫抗原，送到公司注射的兔子，一共boost了三次，三次取的血清均用重做的蛋白做了dot blot，显示的结果是信号越来越强。
然后我用Affi-gel 10和纯化的重组蛋白做抗 ...

我来理一下你的实验：
1，你用含6-his标签的重组蛋白免疫兔子（boost是指打兔子的静脉，为了让抗原直接到达脾脏，刺激B淋巴细胞，为单抗的制备服务，如果你只是做多抗，不需要静脉注射，否则会大大中和掉你血清里的阳性抗体）
2，重组蛋白而且还是用血清做dot-blot这个不靠谱，血清和蛋白之间很容易起假阳性反应，你不如用重组蛋白包被ELISA板，然后用一个无关的重组蛋白做阴性对照，看ELISA的结果比较靠谱！一般稀释度到达1:10000以上OD还能大于0.3，那说明你的抗原还是起到免疫反应了。
3，bio-rad公司的AFFI-GEL是用来偶联抗原（就是你的重组蛋白，不知道你的蛋白是可溶还是包涵体），去亲和纯化血清中的特异性抗体的，纯化洗脱出来的抗体，你最好用A280作一个浓度的定量还有ELISA也要做，光是一个SDS-PAGE看到重链和轻链还不足以说明问题。

4，你说的用血清和纯化好的抗体在做WB时，都没有发现阳性目标条带。
可能的原因有2
一是你的血清根本就没有阳性抗体，你DOT-BLOT出来的结果是假阳性的，你可以用ELISA方法来复合确认
二是你的WB实验没做好，不知道你是否是用细胞裂解液跑胶做的WB膜，有些天然蛋白在组织裂解液里含量微乎其微，有可能WB做不出来；建议你用重组蛋白跑个胶转膜后再做一次WB，作为阳性对照。如果你的抗原确实免疫产生对应的抗体了，那你在用抗原做的WB膜上应该能得到阳性的结果，你可以用血清和纯化后的抗体并行上样做对照。

不知道我说的是不是够清楚，花点时间好好理解下

作者: lixi559 时间: 2013-5-9 16:05

QUOTE:

原帖由 蒜泥面条 于 2013-5-9 12:32 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我来理一下你的实验：
1，你用含6-his标签的重组蛋白免疫兔子（boost是指打兔子的静脉，为了让抗原直接到达脾脏，刺激B淋巴细胞，为单抗的制备服务，如果你只是做多抗，不需要静脉注射，否则会大大中和掉你血清里的阳性抗体）
2，重组蛋 ...

对于您提到的问题，1，我把纯化好的带His标签的重组蛋白送到公司做多克隆抗体，他们给我的回馈单上写的是Boost，我也不知道是怎么boost的。2，收到血清后，我用boost前的血清和之后的血清分别做了dot blot（以重组蛋白为标本），之前的血清没有信号，只有之后的有。3，用bio－rad公司的affi－gel 10偶联我的重组蛋白时，我的重组蛋白是从包涵体中纯化出来的，这个有很大影响吗？4，也是最主要的问题，没有目的条带，我用过转染的293细胞的裂解液做阳性对照，能看到很强的目的条带，也用血清和纯化的抗体上样进行对照，能看出纯化后的抗体背景带少了。可是当用这个抗体做细胞或组织裂解液时，就是不能在正确的位置看到带，或者有一个非常弱的带，根本无法分析，但膜上有一个较大的蛋白很强，有可能是我的抗体太不特异了吗？我用的全长的蛋白大约25KD，但是blast的时候没发现这个蛋白和其他蛋白有非常同源的序列。我接下来该怎么做呢？

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 16:46

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原帖由 lixi559 于 2013-5-9 16:05 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

对于您提到的问题，1，我把纯化好的带His标签的重组蛋白送到公司做多克隆抗体，他们给我的回馈单上写的是Boost，我也不知道是怎么boost的。2，收到血清后，我用boost前的血清和之后的血清分别做了dot blot（以重组蛋白为标本），之前 ...

1，先和做抗体的人确认下，BOOST的具体实验方案，希望别影响到抗体的丰度
2，建议做WB和ELISA，放弃DOT-BLOTTING
3，你提到是包涵体中纯化出来的，那必然是变性蛋白了，不知道之后你是用复性的方法复溶后进行偶联，还是直接就是在变性剂的条件下偶联。这项对偶联的效果有影响
4，阳性对照有条带（假设这个阳性是可信的，实验操作和结果必须正确没有疑问），那说明抗体还是在的。
那就是说你的细胞裂解液中的天然目的蛋白含量比较少，可以考虑增加以下跑胶的上样蛋白总量，但是这样也有副作用，就是非特异性的条带可能会随着杂蛋白的上样增加而增加

建议每一步实验你都重复下，每次实验，阴性和阳性的对照都要并行做

生物实验就是不确定因素和干扰因素太多，每一步都要确认了才能往下继续，不然回头来找原因等于要全部推倒重来

祝好运

作者: jujuba 时间: 2013-5-9 16:48

您好！请教一个问题，我用G-100装GE16/40柱装了31cm，用1mL的1MNaCL测柱效，结果显示塔板数为44257，G-100的塔板数有这么高吗？

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 16:50

为什么用NACL 不用丙酮

感觉你的结果有问题

作者: glass 时间: 2013-5-9 16:51

您好！我现在做一个鼠源的IgG1抗体，抗体和P-G结合力弱除了降低流速和增高柱长还有其他的办法吗？pH8.0和7.0都试过还是有穿透，还有就是现在的Mabselect能和IgG1结合吗？GE的资料写着IgG1增加结合缓冲液的盐浓度能提高结合力，这个需要上清中也加盐吗？

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 16:53

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您好！我现在做一个鼠源的IgG1抗体，抗体和P-G结合力弱除了降低流速和增高柱长还有其他的办法吗？pH8.0和7.0都试过还是有穿透，还有就是现在的Mabselect能和IgG1结合吗？GE的资料写着IgG1增加结合缓冲液的盐浓度能提高结合力， ...

proteinG如果结合不好，建议试试proteinA,可以在上清中加500mM的 Nacl

作者: utt0989 时间: 2013-5-9 16:54

我用GE公司的Protein A纯化血清（1ml）中的抗体，纯化后定容到1ml，为什么SDS-PAGE显示纯化后的抗体条带比纯化前要粗的多？

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 17:21

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我用GE公司的Protein A纯化血清（1ml）中的抗体，纯化后定容到1ml，为什么SDS-PAGE显示纯化后的抗体条带比纯化前要粗的多？

你检查下你电泳时的实验操作，是不是有稀释和上样不同的地方

另外还有可能是你血清里的蛋白浓度高，在加loading buffer时的还原作用弱了，导致有部分IgG在加热煮沸时沉淀，离心后上样的IgG含量就少了

作者: kuaizige 时间: 2013-5-9 17:23

实验室的岛津HPLC闲着没用，配的是C18的柱子，老板说正好检测一下纯化出的单抗的纯度吧。可我在网上查了一下，有人说不能用C18跑蛋白质，有的又说能，目前纠结中……望高手指教！！

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 17:24

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实验室的岛津HPLC闲着没用，配的是C18的柱子，老板说正好检测一下纯化出的单抗的纯度吧。可我在网上查了一下，有人说不能用C18跑蛋白质，有的又说能，目前纠结中……望高手指教！！ ...

用HPLC SEC来检单抗的纯度，还有单体和聚体的比例

作者: kuaizige 时间: 2013-5-9 17:25

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用HPLC SEC来检单抗的纯度，还有单体和聚体的比例

感谢指导！C18不行么？再买柱子投入太大了……

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 17:26

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感谢指导！C18不行么？再买柱子投入太大了……

反相的有机溶剂不适合用来分析活性蛋白

作者: www.1 时间: 2013-5-9 17:30

我是用腺病毒载体构建的一个全长人源化抗体X，即Ad5-X，按理说可以直接转染细胞表达抗体直接做细胞实验，我一个老师非要我先纯化出这个抗体再做，请问这个抗体纯化具体怎么做啊？

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 17:32

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我是用腺病毒载体构建的一个全长人源化抗体X，即Ad5-X，按理说可以直接转染细胞表达抗体直接做细胞实验，我一个老师非要我先纯化出这个抗体再做，请问这个抗体纯化具体怎么做啊？ ...

不知道你这个表达载体是胞内表达还是胞外表达，如果是胞内表达的需要人为加信号肽分泌到胞外

不过作为严谨的实验，即使是能胞外表达，也要检测下胞内的残留水平

一般这种瞬转表达的表达量都不会太高，所以纯化后出来的抗体做其他检测实验时，干扰和背景都会小很多，实验数据也更可信

作者: yonger 时间: 2013-5-9 17:33

请问LZ，有没有做过IP-WB；；；我最近纯化的一批抗体在做IP时遇到问题~！~！

作者: zzzz 时间: 2013-5-9 17:34

这里都是做抗体纯化的，能不能帮我解决一下我的问题，
我们的抗体现在经还原SDS-PAGE分析后在170kD以上出现条带，经质谱分析后是抗体重链的多聚体，没有轻链，想知道怎么能够把这个多聚体与我们的单抗分开来，我们的抗体重链的多聚体和单抗的混合物经HPLC-SEC分析后是一个峰，没有把他们分开，大家有没有什么好的办法，多谢！！

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可以试试加点还原剂将聚集体打开，然后再分离。我在做抗体时也发现有部分聚集体可以通过还原剂去除的，说明存在由二硫键引起的聚集体。另外，部分单体通过还原也会产生片段。这部分研究还在继续中。

作者: yonger 时间: 2013-5-9 17:34

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这里都是做抗体纯化的，能不能帮我解决一下我的问题，
我们的抗体现在经还原SDS-PAGE分析后在170kD以上出现条带，经质谱分析后是抗体重链的多聚体，没有轻链，想知道怎么能够把这个多聚体与我们的单抗分开来，我们的抗体重链的多 ...

是用上清直接纯化，属于IgG1，是人源性的全长抗体，应该选择哪一个柱子？r proteinA还是？哪个公司的好一点？

还有是不是我买了这个柱材料还要在重新买柱子吗？多谢啊

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 17:35

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是用上清直接纯化，属于IgG1，是人源性的全长抗体，应该选择哪一个柱子？r proteinA还是？哪个公司的好一点？

还有是不是我买了这个柱材料还要在重新买柱子吗？多谢啊 ...

最近有点忙，回复晚了

人的全长抗体好纯化，你就用RproteinA吧，哪家的都没太大问题，比较成熟的

你可以买散装的PROTEIN A，然后回来自己搞个空柱子装一下

买预装柱也行，就是贵点

作者: duoduo 时间: 2013-5-9 17:35

您好，我使用DEAE-BULE柱子做抗体纯化，胶会出现块状是怎么回事啊？

有杂蛋白或者脂质吸附了，用碱和盐酸胍和酒精，清洗一下，最好是重悬一下填料

DEAE-bule 的再生系统就是2M盐酸胍，但是清洗效果不好，即使是重悬都不能把结块的胶打散，我咨询过伯乐技术支持，一点用都没有，别人介绍我用6M盐酸胍去洗，好了许多，如果要用碱，酒精去洗的话，使用什么浓度去洗？

DEAE-BULE的预处理液是异丙醇的，是否能用酒精去洗？

我们的腹水原材料的杂志太多了，用45%硫酸铵处理过上柱，用平衡液洗，高盐洗，都会有20-30%的蛋白是在柱子上下不来的。

我们的DEAE-BULE柱子还有一个问题就是在处理过一升严重溶血的腹水后出现腥味（没办法我们现在进货的腹水都是溶血的），一直是没有办法处理掉的，这个有什么办法处理没有？

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 17:35

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您好，我使用DEAE-BULE柱子做抗体纯化，胶会出现块状是怎么回事啊？

有杂蛋白或者脂质吸附了，用碱和盐酸胍和酒精，清洗一下，最好是重悬一下填料

DEAE-bule 的再生系统就是2M盐酸胍，但是清洗效果不好，即使是重悬都不能把结块 ...

伯乐的胶用的不是很多，也不是很流行

对于一种填料的化学耐受，最好还是看本身的说明书，一般填料的资料里都附带这个化学耐受品和浓度。

当然有些时候厂家会稍微保守一点，比如盐酸胍，2M的他说能常洗，你6M的偶尔洗洗也许没问题。

酒精一般70%-20%我们都会去尝试。

你要是觉得不保险，可以找一小份填料来做测试，用高浓度的有机溶剂或者化学品来清洗。然后再来用一下，看性能是否下降。

纯化是门实验的科学，很多国内卖填料的进口公司不一定都是专家，对于自己的产品也不尽然，还是自己多试吧。

对于有杂蛋白在填料上吸附，洗不下来，你洗脱完后应该配一个清洗液来再生柱子，不知道那个填料说明书里有没有提到。你也可以加点去垢剂，SDS TRITON-X100之类

或者索性换填料

不知道你要从腹水里纯化什么，如果是纯化抗体，你直接用protein A 或者G亲和就完事了，何必用离子交换

作者: duoduo 时间: 2013-5-9 17:36

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伯乐的胶用的不是很多，也不是很流行

对于一种填料的化学耐受，最好还是看本身的说明书，一般填料的资料里都附带这个化学耐受品和浓度。

当然有些时候厂家会稍微保守一点，比如盐酸胍，2M的他说能常洗，你6M的偶尔洗洗也许没 ...

我们公司是生产HCG和LH胶体金法检测试纸的，DEAE-BULE主要是纯化HCG抗β亚基的胶体金标记抗体的，

关于DEAE-BULE说明书上都没有介绍化学耐受品和浓度的，找过他们的技术支持他们也不知道，很晕。

再生液就是2M盐酸胍，没有什么用。

后来从加拿大那弄了个洗液，0.5KG800美金，太贵了，又舍不得……

这套方案是老板从一个加拿大人那里弄来的，他比较相信人家，我们之前只过DEAE-sepharose和SP-sepharose的，但是柱子用的久了坏了，又由于我们现用腹水的质量比较差，老板不相信的腹水的原因，说是我们的纯化工艺有问题，所以就弄了那个DEAE-BULE，做这套工艺我都做了很久。结果现在说是腹水的原因，老板也没有办法了。

想过用proteinA或G，老板说成本高，再说我们抗体是什么亚型我们都不知道，更别说抗原了，问老板老板也不说，很晕。

想做ELISA检测一下腹水都是要啥没啥的……

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 17:37

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我们公司是生产HCG和LH胶体金法检测试纸的，DEAE-BULE主要是纯化HCG抗β亚基的胶体金标记抗体的，

关于DEAE-BULE说明书上都没有介绍化学耐受品和浓度的，找过他们的技术支持他们也不知道，很晕。

再生液就是2M盐酸胍，没有 ...

神马洗液啊500ml 要800美元，真是坑爹啊

你是纯化抗HCG beta亚基的抗体是吧？是小鼠腹水吧？

r proteinA填料现在的价格很便宜了，散装的800-1000块人民币一ml足够纯化出10-25mg的单抗

你说用ELISA检测腹水都没有阳性值，那还纯化啥啊，要先确定腹水中有抗体，才好纯化，然后再测经过纯化后的原液中还有多少抗体残留，估计一个得率

作者: yonger 时间: 2013-5-9 17:38

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原帖由 蒜泥面条 于 2013-5-9 17:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

神马洗液啊500ml 要800美元，真是坑爹啊

你是纯化抗HCG beta亚基的抗体是吧？是小鼠腹水吧？

r proteinA填料现在的价格很便宜了，散装的800-1000块人民币一ml足够纯化出10-25mg的单抗

你说用ELISA检测腹水都没有阳性值， ...

那个洗液就是坑人的，所以我在想办法不去用那个。

是纯化抗HCG beta亚基的抗体小鼠腹水

我纯化抗体都是按2L为一个单位的，DEAE-BULE的优点就是处理量大，我450ml的柱子，一次能上10g左右的抗体，今年到现在我已经处理了三四十升腹水了。

我说测ELISA要什么没有什么的意思是：我们没有一套ELISA检测原腹水的方案，我对酶标这块不熟悉，以前测过一次，结果是酶标二抗不对，测出来没有结果，二抗和我们抗体再结合HCG时的位点相同了，结果没有曲线，从其他公司拿来的抗体却很好。那个二抗也是对我们保密的

唉，都是老板更换腹水供应商，但是也没有通知我们要做什么评估，后期在使用过程中发现抗体越来越不好，找老板问的时候，才说由于成本问题换了供应商了。去年一年买了一百五六十升，不好却退不了货。

现在做的我都没劲……抗体产量低，活性差，整体被质检抱怨……

作者: duoduo 时间: 2013-5-9 17:38

最近有点忙，回复晚了

人的全长抗体好纯化，你就用RproteinA吧，哪家的都没太大问题，比较成熟的

你可以买散装的PROTEIN A，然后回来自己搞个空柱子装一下

买预装柱也行，就是贵点

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非常感谢，我现在准备选用GE公司的预装柱，我准备纯化十几ml的细胞培养液，能帮我看下哪个稍微好点吗？HiTrap rProtein A FF 2x1ml ，HiTrap Protein A HP 2x1ml ，HiTrap Protein A HP 5x1ml ，HiTrap Protein A HP 1x5ml ，HiTrap Protein A HP 5x5ml ，HiTrap Protein G HP 2X1ml，还有HP和FF有很大区别吗？

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 17:39

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最近有点忙，回复晚了

人的全长抗体好纯化，你就用RproteinA吧，哪家的都没太大问题，比较成熟的

你可以买散装的PROTEIN A，然后回来自己搞个空柱子装一下

买预装柱也行，就是贵点

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HP是指high performance FF是指FAST FLOW

一个载量高，颗粒细，一个是流速快，粒径大，孔径也大。

不知道你的十几毫升的培养液抗体总量会有多少

一般1ml proteinA填料或者预装柱的载量在20-30mg

1X5ml是指一盒装一根5ml的预装柱

5X5ml自然就是5根5毫升的预装柱，一盒

GE的r ProteinA质量还行，就是价格贵。

rProetinA 第一个字母R指的是指铰链在填料基质上的A蛋白是重组的（Recombinant），不是天然金黄色葡萄球菌提取的

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 17:39

我感觉您这个抗体定量有点问题，如果不对，请别介意

2L的腹水能产10G抗体

那1L就是5G

1ml就是5mg

这个腹水产量是很高了的，而且您这个是大批量的腹水，要每个老鼠都能产那么高浓度的腹水，我感觉少见啊

我感觉您用离子交换纯化下来的抗体并不纯，所以导致你蛋白定量的值偏高，不过也许您的产品里对抗体纯度要求也并不高，呵呵

作者: duoduo 时间: 2013-5-9 17:44

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原帖由 蒜泥面条 于 2013-5-9 17:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

HP是指high performance FF是指FAST FLOW

一个载量高，颗粒细，一个是流速快，粒径大，孔径也大。

不知道你的十几毫升的培养液抗体总量会有多少

一般1ml proteinA填料或者预装柱的载量在20-30mg

1X5ml是指一盒装一根5ml ...

多谢，我是临时想纯化下抗体，实验室也没有什么相关设备！还要麻烦下，我需要什么别的设备吗出了预装柱！？

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 17:45

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原帖由 duoduo 于 2013-5-9 17:44 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

多谢，我是临时想纯化下抗体，实验室也没有什么相关设备！还要麻烦下，我需要什么别的设备吗出了预装柱！？

临时做下，就用注射器来推推就行了

还有什么相应的检测手段，比如ELISA SDS-PAGE WB等

作者: hustwb 时间: 2013-5-9 17:45

想请教各位做抗体的老师，最近想买一个sigma的单抗，准备用来做western和免疫荧光，发现目录上写得是腹水形式，没有用过腹水形式的，请问和一般的纯化过的商品化抗体有何不同，在使用中稀释、保存有什么需要注意的地方吗？

作者: duoduo 时间: 2013-5-9 17:46

临时做下，就用注射器来推推就行了

还有什么相应的检测手段，比如ELISA SDS-PAGE WB等

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不需要紫外分光仪之类的吗？OD值是不是不用管？

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 17:47

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原帖由 duoduo 于 2013-5-9 17:46 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
临时做下，就用注射器来推推就行了

还有什么相应的检测手段，比如ELISA SDS-PAGE WB等

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不需要紫外分光仪之类的吗？OD值是不是不用管？ ...

一般都是10-20倍填料体积平衡，10倍填料体积洗脱就行，分管收洗脱液

如果没有注射器，用离心法也行，看我以前发的一个帖子

cuturl('http://protein.dxy.cn/bbs/topic/17545614')

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 17:47

想请教各位做抗体的老师，最近想买一个sigma的单抗，准备用来做western和免疫荧光，发现目录上写得是腹水形式，没有用过腹水形式的，请问和一般的纯化过的商品化抗体有何不同，在使用中稀释、保存有什么需要注意的地方吗？

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如果这个单抗写着是腹水的形式而不是purified or pure antibody

那就是说这个单抗的溶液里还有其他腹水的组分，不过腹水一般是经过稀释后再卖的，浓度都会比较稀，不管是抗体还是杂蛋白。

一般敢直接卖腹水的，除非是低档次产品，不然一般都是WB或者ELISA背景控制的非常好，阳性特异性信号非常强的，才敢直接卖腹水

保存么就加点甘油和NaN3了，你看看原始的液体中有没有甘油的组分，你看看说明书

作者: 831226 时间: 2013-5-9 17:48

可以试试加点还原剂将聚集体打开，然后再分离。我在做抗体时也发现有部分聚集体可以通过还原剂去除的，说明存在由二硫键引起的聚集体。另外，部分单体通过还原也会产生片段。这部分研究还在继续中。

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这个倒是以前没考虑过感谢提供思路
sds处理后不都应该分散成亚型吗

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 17:49

理论上是这样，但是仅仅是理论上

很多时候，并不一定全部能还原成压型

除了跟蛋白的性质有关，有时和还原剂的浓度，还原剂的类型都会差别

作者: avi317 时间: 2013-5-9 17:49

在条件有限的情况下，如何分离纯化脂蛋白（脱脂）得到APOA

作者: vcve 时间: 2013-5-9 17:49

看楼主挺专业，挺有经验，正好可以帮忙解决一下目前的麻烦。

我想问个问题，现在用抗原亲和纯化兔多抗，可是总觉得得到的抗体浓度不够高，希望能够提高抗体的得率，在孵育血清的时候加点什么，听说可以加EDTA，不知道用什么浓度，能否给点意见，或者加其他的试剂，或有什么好的洗脱液，我用的是普通的ph2.5 HCL，150mmNacl。

谢谢了！

作者: vcve 时间: 2013-5-9 17:51

用PBS或TBS稀释血清，有用吗？怎么稀释？为什么呢？

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 17:52

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原帖由 avi317 于 2013-5-9 17:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

在条件有限的情况下，如何分离纯化脂蛋白（脱脂）得到APOA

好像以前大学的时候做过类似的

先是蔗糖超速离心，然后是过分子筛

最好能加个例子交换

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 17:53

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原帖由 vcve 于 2013-5-9 17:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
用PBS或TBS稀释血清，有用吗？怎么稀释？为什么呢？

血清一般都是稀释以后上样，降低粘稠，同时也可以稀释后离心可以去掉点杂质

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 17:54

看楼主挺专业，挺有经验，正好可以帮忙解决一下目前的麻烦。

我想问个问题，现在用抗原亲和纯化兔多抗，可是总觉得得到的抗体浓度不够高，希望能够提高抗体的得率，在孵育血清的时候加点什么，听说可以加EDTA，不知道用什么浓度，能否给点意见，或者加其他的试剂，或有什么好的洗脱液，我用的是普通的ph2.5 HCL，150mmNacl。

谢谢了！

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不知道你的得到的抗体浓度不够高是什么原因引起

1，可能是抗体总量本来就少，表现出来的情况是，你一次纯化后，得到的抗体浓度低，但是流穿经过第2次再纯化也没什么特异抗体了

2，是你的亲和效率低，就是一次纯化出来抗体浓度低，拿流穿来第二次纯化，还是洗脱出差不多的浓度和总量的抗体。

针对以上情况，你应该也知道该怎么解决问题了吧

作者: greenbee 时间: 2013-5-9 17:54

对于浓度的问题,我的意思是,同一个血清用来做亲和纯化,怎么能够提高纯化后抗体的得率.

比方说,10ml血清纯化后得到抗体是3ml,200ug/ml的浓度, 算下来总量是600ug 抗体, 原理是10ml血清应该有1-5mg的特异性抗体,那我怎么能够让纯化后的抗体得到更多? 通过实验方法的改进

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 17:55

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原帖由 greenbee 于 2013-5-9 17:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

对于浓度的问题,我的意思是,同一个血清用来做亲和纯化,怎么能够提高纯化后抗体的得率.

比方说,10ml血清纯化后得到抗体是3ml,200ug/ml的浓度, 算下来总量是600ug 抗体, 原理是10ml血清应该有1-5mg的特异性抗体,那我 ...

首先确认你预估1-5mg抗体是否是正确

其次把第一遍纯化过的血清（流穿），再过一遍柱子，看还能纯化出多少抗体

我前面的帖子都帮你分析过了

作者: ritou1985 时间: 2013-5-9 17:59

请教你一个问题，非常奇怪的事情，我用辛酸硫酸铵法纯化小鼠的腹水，其中有一种腹水在加完辛酸离心后，上面漂了一层油状的东西，在加硫酸铵之前，就不澄清透明，样子就像是加了硫酸铵之后有沉淀析出来似的。之后我添加了硫酸铵，也能观察到越来越浑浊。第二天离心后用PBS重悬沉淀，透析的时候，就发现洗出了很多沉淀。你能帮我分析一下这是什么原因吗？当时我一共纯化两种腹水，另外一个就很正常，应该不是试剂的问题。

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 18:00

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原帖由 ritou1985 于 2013-5-9 17:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请教你一个问题，非常奇怪的事情，我用辛酸硫酸铵法纯化小鼠的腹水，其中有一种腹水在加完辛酸离心后，上面漂了一层油状的东西，在加硫酸铵之前，就不澄清透明，样子就像是加了硫酸铵之后有沉淀析出来似的。之后我添加了硫酸铵，也能 ...

可能是腹水中类似脂蛋白和油脂类物质，在盐析后，除了蛋白质沉淀外，因为溶液的亲水性改变了，这些物质也沉淀出来，但是因为比重比水轻，所以是浮在上面

作者: uuooii 时间: 2013-5-9 18:00

有人用pull down技术做过人组织的RAC1活性吗？

作者: ritou1985 时间: 2013-5-9 18:01

楼主您好，我是个新手，在纯化一个抗原，表达载体是pLLp-stII，只带有HIS标签，经过两次镍柱纯化后纯度还是不行，试过分子筛层析，离子交换，纯度都上不去，我的目的蛋白是32kd，主要的杂带是比目的蛋白小些的。我想能不能通过免疫亲和层析来纯化呢，将我的目的蛋白的抗体挂到预活化基质上，不知楼主有何好的建议？

作者: TAT 时间: 2013-5-9 18:01

我想请教您一个问题，一般来说抗体是很稳定的，但是我做个项目的抗体，第一次拿到了活性和特异性都都很好的单抗，但是3株细胞复苏后打小鼠后得到的抗体活性下降5倍，特异性也变差了，我两次都是用蛋白A的亲和纯化的单抗，现在我不明白问题出在哪里,抗体纯度越高特异性越好吗?现在这种情况到底是纯化原因呢，还是小鼠原因呢？

作者: one 时间: 2013-5-9 18:02

楼主，有问题向您请教。

用ProteinA纯化小鼠腹水的IGg，柠檬酸洗脱液，pH值2.5，洗脱下来的抗体电泳是一条带，没有杂带，但是用HPLC检测发现有两个主峰。没想明白为什么会这样。难道是部分抗体聚集了？

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 18:03

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原帖由 one 于 2013-5-9 18:02 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼主，有问题向您请教。

用ProteinA纯化小鼠腹水的IGg，柠檬酸洗脱液，pH值2.5，洗脱下来的抗体电泳是一条带，没有杂带，但是用HPLC检测发现有两个主峰。没想明白为什么会这样。难道是部分抗体聚集了？ ...

恩，应该是聚体，而且你的聚体还是容易被还原开的，这算是比较理想的了

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 18:03

我想请教您一个问题，一般来说抗体是很稳定的，但是我做个项目的抗体，第一次拿到了活性和特异性都都很好的单抗，但是3株细胞复苏后打小鼠后得到的抗体活性下降5倍，特异性也变差了，我两次都是用蛋白A的亲和纯化的单抗，现在我不明白问题出在哪里,抗体纯度越高特异性越好吗?现在这种情况到底是纯化原因呢，还是小鼠原因呢？

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单抗每次的腹水质量会参差不齐

这个和很多因素有关，杂交瘤细胞状态，注射的质量，成瘤的环境，小鼠的体质……

抗体纯化失活的情况也有，但是很少出现，一般而言浓度高的抗体更容易保存

特异性一般而言当然是纯度越好，特异性越好

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 18:03

楼主您好，我是个新手，在纯化一个抗原，表达载体是pLLp-stII，只带有HIS标签，经过两次镍柱纯化后纯度还是不行，试过分子筛层析，离子交换，纯度都上不去，我的目的蛋白是32kd，主要的杂带是比目的蛋白小些的。我想能不能通过免疫亲和层析来纯化呢，将我的目的蛋白的抗体挂到预活化基质上，不知楼主有何好的建议？

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你要用特异性的抗体来钓对应的蛋白

理论上是可行的，但是实际操作的时候，会面临很多问题

1，一般而言，偶联固话抗体来亲和抗原蛋白，特异性多抗比特异性单抗效果好，但本身特异性的多抗就需要用特异性的蛋白来亲和纯化。

2，所用来偶联的抗体最好是用同批次蛋白免疫的

3，所需用来偶联的抗体量比较大，起码也要1mg级别，然后偶联出来1ml左右的亲和柱的柱效才有保证

所以综合以上几点，用特异性抗体来亲和纯化抗原蛋白，不是不可以，但是难度和限制条件太多

一般都会选用目标蛋白C端或者N端得氨基酸序列，合成多肽来作为抗原，制备特异性的多抗和单抗

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 18:06

楼主您好，我是个新手，在纯化一个抗原，表达载体是pLLp-stII，只带有HIS标签，经过两次镍柱纯化后纯度还是不行，试过分子筛层析，离子交换，纯度都上不去，我的目的蛋白是32kd，主要的杂带是比目的蛋白小些的。我想能不能通过免疫亲和层析来纯化呢，将我的目的蛋白的抗体挂到预活化基质上，不知楼主有何好的建议？

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我觉得你这个实验，都走到这一步了

比较可行的方法还是优化一下镍柱亲和纯化的效果吧

比如说变性纯化，有时虽然蛋白没有了空间结构，但是纯度也许会好一些

作者: IAM007 时间: 2013-5-9 18:08

恩，应该是聚体，而且你的聚体还是容易被还原开的，这算是比较理想的了

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目前测得的活性还比较高，好像聚合的抗体还是有活性。有没有好的方法可以防止聚体的产生，是需要改变洗脱条件？还是换个柱子试试？还是在上柱时加些保护剂？

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 18:09

目前测得的活性还比较高，好像聚合的抗体还是有活性。有没有好的方法可以防止聚体的产生，是需要改变洗脱条件？还是换个柱子试试？还是在上柱时加些保护剂？

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聚体行程有两部分原因

一种是表达的时候就生产了

另一种确实有可能是洗脱的时候，因为各种原因聚合

可以在洗脱液里加不超过5%的甘油，防止聚集

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 18:09

目前测得的活性还比较高，好像聚合的抗体还是有活性。有没有好的方法可以防止聚体的产生，是需要改变洗脱条件？还是换个柱子试试？还是在上柱时加些保护剂？

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另外关于活性的问题，有时候具体的活性比单体还会更高，有时有些IGM的活性也有比IgG高的，这个不用担心，正常的。

如果是抗体药物研发，聚体的问题再药典里记得有规范说明，好像是不超过3%还是5%

重组表达出来的抗体，有聚体很正常

作者: hold住 时间: 2013-5-9 18:10

楼主您好，我们从公司制定了一个rabbit多抗，在做over-express的时候，WB效果很好，几乎没有杂带，但是感觉该抗体浓度很低，需要用1:200。最大的问题是该抗体不能做出内源性表达的蛋白，我想可能是抗体浓度太低了。

我们用proteinA/G IP，粗略定量了，大概50ug/ml，见图。

该抗体中，已经被公司加了BSA和甘油，浓度大概10%-20%吧。抗体是经过了抗原亲和纯化过的，每次都给我们大约15-20ml。

如果我想提高抗体的浓度，应该怎么办？是用分子筛，protenA柱，还是什么好？谢谢！

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作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 18:11

QUOTE:

原帖由 hold住 于 2013-5-9 18:10 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
楼主您好，我们从公司制定了一个rabbit多抗，在做over-express的时候，WB效果很好，几乎没有杂带，但是感觉该抗体浓度很低，需要用1:200。最大的问题是该抗体不能做出内源性表达的蛋白，我想可能是抗体浓度太低了。

我们用protein ...

有几个问题：

1，这个多抗，免疫的时候的抗原是什么？多肽还是你们提供的重组蛋白

2，over-express过表达的时候，你是在细胞株培养的时候刺激细胞或者是转染诱导细胞过表达？

另外我初步的看法是

内源性的WB做不出来，有可能是抗体的问题，也有可能是抗原（你内源性表达的细胞裂解液）的问题，甚至是你WB的问题（需要加阳性和阴性的对照）

如果你想浓缩抗体，又不想提高BSA和甘油的浓度，那就用protein A 吧

但是你最好问清楚多抗公司给你制备多抗的时候的一些数据和工艺，按道理如果是抗原特异性免疫亲和纯化出来的多抗再怎么稀，也不会1:200的用

作者: hold住 时间: 2013-5-9 18:12

QUOTE:

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有几个问题：

1，这个多抗，免疫的时候的抗原是什么？多肽还是你们提供的重组蛋白

2，over-express过表达的时候，你是在细胞株培养的时候刺激细胞或者是转染诱导细胞过表达？

另外我初步的看法是

内源性的WB做不出来，有可能是 ...

抗原用的是多肽。 WB是转染的质粒。在WB方面，我觉得问题至多是裂解方法的问题，也许每个蛋白有不同的裂解方法吧，我们也试了很多方法，内源性就是不行，而over的很容易做出来。

抗体公司好像和我们说是用40ml血清，最后得到20ml的抗体溶液。另外一个组也让这个公司做抗体，最后拿到的抗体浓度连15 ug/ml都没有。

我是觉得这个抗体浓度太低了，另外由于内源性蛋白表达可能低，所以做不出来。我现在的目的就是想提高抗体的浓度。

用proteinA纯化可以得到0.5 mg/ml 吗？需要用多少我现在的抗体溶液？我现在也就只有15ml吧。

在洗脱的时候有什么需要注意的吗？比如洗脱体积谢谢！！

作者: hold住 时间: 2013-5-9 18:12

有几个问题：

1，这个多抗，免疫的时候的抗原是什么？多肽还是你们提供的重组蛋白

2，over-express过表达的时候，你是在细胞株培养的时候刺激细胞或者是转染诱导细胞过表达？

另外我初步的看法是

内源性的WB做不出来，有可能是抗体的问题，也有可能是抗原（你内源性表达的细胞裂解液）的问题，甚至是你WB的问题（需要加阳性和阴性的对照）

如果你想浓缩抗体，又不想提高BSA和甘油的浓度，那就用protein A 吧

但是你最好问清楚多抗公司给你制备多抗的时候的一些数据和工艺，按道理如果是抗原特异性免疫亲和纯化出来的多抗再怎么稀，也不会1:200的用

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另外，纯化后我怎么保存抗体？加甘油，分装放-80度？谢谢！

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 18:13

抗原用的是多肽。 WB是转染的质粒。在WB方面，我觉得问题至多是裂解方法的问题，也许每个蛋白有不同的裂解方法吧，我们也试了很多方法，内源性就是不行，而over的很容易做出来。

抗体公司好像和我们说是用40ml血清，最后得到20ml的抗体溶液。另外一个组也让这个公司做抗体，最后拿到的抗体浓度连15 ug/ml都没有。

我是觉得这个抗体浓度太低了，另外由于内源性蛋白表达可能低，所以做不出来。我现在的目的就是想提高抗体的浓度。

用proteinA纯化可以得到0.5 mg/ml 吗？需要用多少我现在的抗体溶液？我现在也就只有15ml吧。

在洗脱的时候有什么需要注意的吗？比如洗脱体积谢谢！！

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如果WB 操作本身确认没问题

那要么就是天然目标蛋白表达太微量，有些时候这样可以增加抗体的浓度来增强信号。

另外还有一种可能，如果你用过表达的细胞株做没问题，做天然的细胞株就有问题，有没有考虑过天然蛋白和你质粒表达的重组蛋白也许有些差异，尤其是你用多肽打的抗体。

至于你的抗体能够浓缩到多少浓度，那就取决于你总量有多少了

如果想提高最终的洗脱浓度，可以用浸润填料，然后定体积洗脱液，离心法洗脱，这样就容易控制洗脱出来的浓度（前提是你知道结合在proteinA上的抗体总量，proteinA填料的载量很高的，一般都在10-30mg/ml的结合能力，就你这个案例中不需要考虑过载饱和）

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 18:13

另外，纯化后我怎么保存抗体？加甘油，分装放-80度？谢谢！

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除了甘油最好再加点叠氮化钠

作者: hold住 时间: 2013-5-9 18:14

QUOTE:

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另外，纯化后我怎么保存抗体？加甘油，分装放-80度？谢谢！

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除了甘油最好再加点叠氮化钠

甘油和叠氮化钠浓度分别多少？ 4度，-20还是-80度保存？还需要加BSA（浓度）吗？

不好意思，对于这个我一点也不懂。

作者: hold住 时间: 2013-5-9 18:20

如果WB 操作本身确认没问题

那要么就是天然目标蛋白表达太微量，有些时候这样可以增加抗体的浓度来增强信号。

另外还有一种可能，如果你用过表达的细胞株做没问题，做天然的细胞株就有问题，有没有考虑过天然蛋白和你质粒表达的重组蛋白也许有些差异，尤其是你用多肽打的抗体。

至于你的抗体能够浓缩到多少浓度，那就取决于你总量有多少了

如果想提高最终的洗脱浓度，可以用浸润填料，然后定体积洗脱液，离心法洗脱，这样就容易控制洗脱出来的浓度（前提是你知道结合在proteinA上的抗体总量，proteinA填料的载量很高的，一般都在10-30mg/ml的结合能力，就你这个案例中不需要考虑过载饱和）

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然蛋白和你质粒表达的重组蛋白也许有些差异，尤其是你用多肽打的抗体？

我们考虑过这个问题。事实上对这个蛋白我们分别做了N和C端得抗体，而且做了三个plasmid（FLAG，myc，no tag），用这些抗体都能做的出来（over-expression）。所以理论上我们的抗体应该能识别内源性的。

浸润填料是怎么做？谢谢~

为什么不能用分子筛离心的方法？这个方法能去掉甘油和BSA吗？难道是因为甘油和BSA多了，液体粘稠不适合？

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 18:21

QUOTE:

原帖由 hold住 于 2013-5-9 18:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
如果WB 操作本身确认没问题

那要么就是天然目标蛋白表达太微量，有些时候这样可以增加抗体的浓度来增强信号。

另外还有一种可能，如果你用过表达的细胞株做没问题，做天然的细胞株就有问题，有没有考虑过天然蛋白和你质粒 ...

你的意思是做了两个抗体，分别选取的是目的蛋白的两端氨基酸序列

然后你在重组过表达的时候在这个重组蛋白的两端加了三个标签蛋白

做WB的时候，标签蛋白都能被有效识别

我的理解正确么？

但这和内源性的蛋白有什么关系呢？

内源性的蛋白是自身基因组表达的，而且有可能经过修饰，这个和你重组的还是会有差别

不是说变性后拉成直线就会变一样。

理论上仍然存在这种可能性，这种是最不希望的情况

另外就是内源性的目的蛋白本底表达量实在是稀少，你在提取裂解液和转印的时候，要么没提到多少，要么就丢失（或者分解了），这种情况下，你只能加大一抗的孵育浓度试试了

抗体你最好是高浓度，然后放-80度

叠氮化钠0.5%就够了，防腐的作用

甘油30%-50%都可以

作者: hold住 时间: 2013-5-9 18:21

谢谢你。

另外，为什么不能用分子筛离心的方法？这个方法能去掉甘油和BSA吗？难道是因为甘油和BSA多了，液体粘稠不适合？

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 18:22

QUOTE:

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谢谢你。

另外，为什么不能用分子筛离心的方法？这个方法能去掉甘油和BSA吗？难道是因为甘油和BSA多了，液体粘稠不适合？

分子筛用普通的脱盐柱确实能去掉甘油，BSA还不一定好去除，你得用分辨率高的合适孔径的凝胶。不是脱盐柱那么简单了

分子筛的缺点是1，上样量少，一般是柱体积的10-30% ；2会稀释样品，你本来就想浓缩的东西，再去稀释下，这不是南辕北辙了么

另外要去甘油的话，超滤也可以，买那种离心式的超滤管，赛托利斯的50ml外管（15ml内体积）的离心管我以前一直用，大概是50-80一根，你选30K孔径的，置换缓冲液效果最好了，既快又省钱。

proteinA 亲合法纯化，能起到浓缩作用，又能去掉BSA和甘油，一举三得，为什么不用，呵呵

另外proteinA也不贵，1ml几百块钱，可以反复用好几次

作者: hold住 时间: 2013-5-9 18:25

分子筛用普通的脱盐柱确实能去掉甘油，BSA还不一定好去除，你得用分辨率高的合适孔径的凝胶。不是脱盐柱那么简单了

分子筛的缺点是1，上样量少，一般是柱体积的10-30% ；2会稀释样品，你本来就想浓缩的东西，再去稀释下，这不是南辕北辙了么

另外要去甘油的话，超滤也可以，买那种离心式的超滤管，赛托利斯的50ml外管（15ml内体积）的离心管我以前一直用，大概是50-80一根，你选30K孔径的，置换缓冲液效果最好了，既快又省钱。

proteinA 亲合法纯化，能起到浓缩作用，又能去掉BSA和甘油，一举三得，为什么不用，呵呵

另外proteinA也不贵，1ml几百块钱，可以反复用好几次

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是我记错了，我以前实验室应该用的是millipore的离心超滤管，因为不是我做的，忘记了。

因为离心超滤管非常的方便，浓缩的效果还是不错的。
离心超滤管按照你的分析去甘油是可以的。但是由于BSA分子量大概66KD，而IgG大概150kd，所以在不丢失IgG的情况下可能不容易去掉BSA？我看到好像有30K，50K， 100K的规格。下图是millopore的图。用100K好像还行。不过我不知道100K是否能去掉BSA?(不增加BSA浓度就行)

proteinA 我有些担忧，一是它是否能90%以上把我的IgG截留下来，因为我现在的抗体本来就不多（主要原因是浓度低）。二是在洗脱的时候要分好像5步加入洗脱液，我关心的不是最后所有洗脱液的总抗体量，而是其中的一步的最高浓度液体。（按照你的经验好像是第二次洗脱最高吧）

如果离心超滤管不能用，我才会用proteinA。

[ 本帖最后由 hold住于 2013-5-9 18:26 编辑 ]

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作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 18:26

QUOTE:

原帖由 hold住 于 2013-5-9 18:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
分子筛用普通的脱盐柱确实能去掉甘油，BSA还不一定好去除，你得用分辨率高的合适孔径的凝胶。不是脱盐柱那么简单了

分子筛的缺点是1，上样量少，一般是柱体积的10-30% ；2会稀释样品，你本来就想浓缩的东西，再去稀释下，这不是南辕 ...

理论上讲，超滤的安全孔径一般是你要截留的目的蛋白的分子量的1/3，也就是说你150KD的IgG,应该选50KD的超滤膜

为什么要除以3呢，因为超滤膜标称50KD，实际上它是一个枣核型分布的孔径，也许孔径从10KD到100KD都有。50KD只是一个平均值。

但是实际操作的时候呢，我用过30KD 50KD 100KD的超滤膜超滤抗体，30KD 50KD的膜滤起来速度慢点，回收率高点；100KD的么快点，就是回收率会低一点。

但是最终会损失多少回收率，这个和你的样品属性，操作手法都有关系

如果你很在意回收率的，那就用30或者50KD的吧，我也用过millipore的，但是感觉回收率和管子的质量批次还是赛托利斯的好一点

如果你是浓度很低，总量又是很少的抗体，那我也建议你用超滤管吧

作者: hold住 时间: 2013-5-9 18:27

好的，那我就用赛托利斯的离心管试试。谢谢~

作者: cwcwcww 时间: 2013-5-9 18:29

CHO细胞表达抗体，怎么把二聚体和三聚体分离出来只保留四聚体

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-9 18:31

QUOTE:

原帖由 cwcwcww 于 2013-5-9 18:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

CHO细胞表达抗体，怎么把二聚体和三聚体分离出来只保留四聚体

这个只能试试高分辨率的分子筛或者疏水

作者: 2541 时间: 2013-5-9 18:31

高手，你好，同时从血液里提取转铁蛋白和白蛋白有什么好的方法吗，转铁蛋白等电电位5.3 白蛋白为4.6

作者: 831226 时间: 2013-5-10 10:45

QUOTE:

原帖由 2541 于 2013-5-9 18:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

高手，你好，同时从血液里提取转铁蛋白和白蛋白有什么好的方法吗，转铁蛋白等电电位5.3 白蛋白为4.6

白蛋白你可以用蓝胶亲和一下

转铁蛋白，没做过，不过是不是可以用金属螯合的填料先螯合上铁离子，然后来亲和转铁蛋白呢

作者: kuohao17 时间: 2013-5-10 10:46

你好：我用400ul protein L磁珠纯化50ml杂交瘤上清，最后用400ul体积洗脱，怎么浓度只有0.1mg/ml？说明书上说这个磁珠的结合能力是2.5mg/ml，我50ml上清中抗体浓度是30ug/ml，回收率怎么这么低呢？谢谢。

作者: PINK 时间: 2013-5-10 10:46

楼主你好，我对纯化仅有一些理论知识，实践经验基本没有，现在准备主攻纯化，有没有好点的纯化资料传我一点？我的邮箱：285638073@qq.com

谢谢楼主了

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-10 10:47

你好：我用400ul protein L磁珠纯化50ml杂交瘤上清，最后用400ul体积洗脱，怎么浓度只有0.1mg/ml？说明书上说这个磁珠的结合能力是2.5mg/ml，我50ml上清中抗体浓度是30ug/ml，回收率怎么这么低呢？谢谢。

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首先你把纯化过的上清（流穿）废液，跑个电泳，或者做个ELISA反应，看看还油木油你的特异性抗体，如果是做ELISA的话，你可以把原液也做一排，流穿一排，再纯化出的抗体一排，对应起来看就可以了

回收率“低”的可能性有好几种原因，但首先你要确认，确实是纯化出的抗体很少

1，有可能你原液的定量有问题

2，有可能抗体没结合在磁珠上

3，有可能没洗下来

4，有可能在纯化的过程中失误操作丢失了

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-10 10:47

楼主你好，我对纯化仅有一些理论知识，实践经验基本没有，现在准备主攻纯化，有没有好点的纯化资料传我一点？

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恕我直言

纯化不是一天两天就能成专家的，也不是看一本两本书就能很懂，国内真正纯化的专家也是少之又少。

慢慢在学习和工作中积累吧，实践很重要

至于书籍，我觉得一些基础的书籍很重要，首先你要懂纯化的东西，比如蛋白质，核算，疫苗，病毒。。。。

纯化的主要方法就是根据这些物质的不同特性来分离，电荷，分子量大小以及表观外形，疏水性，配体受体。。。

作者: shenkunjie 时间: 2013-5-10 10:48

请问我们用细胞上清纯化抗体，用核酸蛋白检测仪纯化时一个样品会出现两种峰，第一条峰值一般在50到60多，上去快下来也快，然后接着还有一条峰，能到100左右，上去就不容易下来，我是分开来接的，我觉得虽然是同一样品，但只是第一个峰接出来的才是我想要的抗体，用BCA法检测时也正明第一个峰接的东西有浓度，我想问问为什么我第二个峰接的东西在纯化仪上峰值高但检测时浓度反而是负值？那后来接的是什么成份？谢谢

作者: glass 时间: 2013-5-10 10:49

嗨，楼主，我想问下，有关疫苗的纯化。想了解一下具体过程。怎么着手？？

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-10 10:50

请问我们用细胞上清纯化抗体，用核酸蛋白检测仪纯化时一个样品会出现两种峰，第一条峰值一般在50到60多，上去快下来也快，然后接着还有一条峰，能到100左右，上去就不容易下来，我是分开来接的，我觉得虽然是同一样品，但只是第一个峰接出来的才是我想要的抗体，用BCA法检测时也正明第一个峰接的东西有浓度，我想问问为什么我第二个峰接的东西在纯化仪上峰值高但检测时浓度反而是负值？那后来接的是什么成份？谢谢

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这个描述缺乏很多要素

你用什么层析手段纯化上清中的抗体？
第一个峰和第二个峰之间有间距么？还是部分重叠？

重复性如何，有没有重复过一遍，证明不是偶然因素？

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-10 10:59

嗨，楼主，我想问下，有关疫苗的纯化。想了解一下具体过程。怎么着手？？

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疫苗的纯化总体上都是粗分的多

有用超滤的，有过大孔径分子筛的

多查查相关的文献吧，会有个大致的方向

作者: yueban-1147 时间: 2013-5-10 11:00

我想请教各位，我在用GE protein G亲和层析法纯化腹水单抗时后，glycine-HCl（0.1M, pH 2.7）洗脱后，纯化后抗体中的Tris-HCl和glycine-HCl一定要除去才能保存吗？不除去对抗体有没有影响？

作者: H2O 时间: 2013-5-10 11:00

我现在只得到4ml腹水，怕浪费其中的单抗，想得到一个明确可行的方案。
我的具体方案是： 4ml腹水加等量的PBS（稀释），高速离心（10000G），取中间的腹水过一次性滤膜，直接过protein G resin柱子。（我也不清楚这种1ml的柱子能结合多少抗体的量，您的经验呢？）
实验室也人是先饱和硫酸铵沉淀，再经透析，最后过柱子。
请问哪种较好？

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-10 11:01

我想请教各位，我在用GE protein G亲和层析法纯化腹水单抗时后，glycine-HCl（0.1M, pH 2.7）洗脱后，纯化后抗体中的Tris-HCl和glycine-HCl一定要除去才能保存吗？不除去对抗体有没有影响？

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tri-HCL可以不去除，但是洗脱液是酸性，一定要中和到中性状态下保存，另外如果担心沉淀，降解，失活，可以加甘油，N3Na,甚至是BSA，就看你的抗体后面的要用于什么地方。

另外顺便说下：为什么总是用G来纯化鼠单抗呢？rproteinA 载量高，又容易洗脱。

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-10 11:01

我现在只得到4ml腹水，怕浪费其中的单抗，想得到一个明确可行的方案。
我的具体方案是： 4ml腹水加等量的PBS（稀释），高速离心（10000G），取中间的腹水过一次性滤膜，直接过protein G resin柱子。（我也不清楚这种1ml的柱子能结合多少抗体的量，您的经验呢？）
实验室也人是先饱和硫酸铵沉淀，再经透析，最后过柱子。
请问哪种较好？

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如果你量少，就更不能硫酸铵沉淀了，直接稀释离心下上rPROTEIN A就行，G的吸附太强（洗脱麻烦），载量也低

rproteinA的实际动态载量一般在20mg/ml填料

作者: glass 时间: 2013-5-10 11:02

tri-HCL可以不去除，但是洗脱液是酸性，一定要中和到中性状态下保存，另外如果担心沉淀，降解，失活，可以加甘油，N3Na,甚至是BSA，就看你的抗体后面的要用于什么地方。

另外顺便说下：为什么总是用G来纯化鼠单抗呢？rproteinA 载量高，又容易洗脱。

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我是用PH 2.7的glycine-HCl洗脱，但不知道在准备收集管中预先加入Tris-HCl的量如何确定才能保证中和到中性。
我在抗体纯化后，实验室还建议用PBS透析置换成PBS，有也不清楚有没有这个必要性？
我还有一个问题想问一下laboy兄，如用硫酸铵沉淀之后，一定要透析后才能上柱吗？
另外，我看protein G 与小鼠IgG结合都很高，所以就选G了。

作者: yjf1026 时间: 2013-5-10 11:04

太谢谢了。我只有protein G resin，没有protein A 的柱子，那我洗脱时候要该注意些什么呢？

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-10 11:06

我是用PH 2.7的glycine-HCl洗脱，但不知道在准备收集管中预先加入Tris-HCl的量如何确定才能保证中和到中性。
我在抗体纯化后，实验室还建议用PBS透析置换成PBS，有也不清楚有没有这个必要性？
我还有一个问题想问一下laboy兄，如用硫酸铵沉淀之后，一定要透析后才能上柱吗？
另外，我看protein G 与小鼠IgG结合都很高，所以就选G了。

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ph9的tris-HCL 1:9 抗体洗脱液，可以预加好。

置换不置换完全看你后面的实验使用中，tris-HCL有没有影响，对抗体的保存本身TRIS没有什么影响，而且TRIS还是一种缓冲剂，防止蛋白质酸解。

腹水其实高速离心后，直接可以上样，不需要硫酸铵沉淀，多一个步骤，多一份损失。

G吸附IGG后，洗脱很讨厌，会有拖尾

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-10 11:07

太谢谢了。我只有protein G resin，没有protein A 的柱子，那我洗脱时候要该注意些什么呢？

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就像下面那个帖子里谈到，G对IgG的吸附很强，洗脱的时候会有拖尾的情况，就会增大抗体洗脱的体积，获得低浓度的抗体，另外就是柱子上残留的抗体要清洗干净，预防下次做别的抗体时交叉污染。

其他没什么，G的载量，没有A高

作者: yjf1026 时间: 2013-5-10 11:07

说的没有错，我就是用G 柱，1m柱洗脱到6-7ml之后还有抗体的存在，真是郁闷！不知道A 柱的话，1m柱用多少ml就完全洗脱下来了？

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-10 11:08

QUOTE:

原帖由 yjf1026 于 2013-5-10 11:07 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

说的没有错，我就是用G 柱，1m柱洗脱到6-7ml之后还有抗体的存在，真是郁闷！不知道A 柱的话，1m柱用多少ml就完全洗脱下来了？

这个就和你的抗体和A填料的吸附力，和你的洗脱液的效率有关了

一般2-3毫升都可以洗脱80-90%，5毫升洗脱能95%干净

作者: yjf1026 时间: 2013-5-10 11:08

请教各位高手：
我在做单抗纯化时，使的G柱，在1ml柱中上了两只老鼠的全部腹水7ml左右，在洗的时候用了30ml PBS后，测洗出液还是含有蛋白，不知这时的蛋白是杂蛋白还是目的IgG呀？
还有一个问题是：抗体在最后透析时出现了大量沉淀，抗体纯化时是用glycine-HCl（0.1M, pH 2.7）洗脱的，用Tris-HCl（1M, pH 9.0）中和后透析的，如何避免或消除沉淀呀？
不知道大家有没有遇到我这样的情况没有？请教一下，让我以后如何改进?
太感谢了！

作者: bamboo16 时间: 2013-5-10 11:09

我今天听您的方法过了柱子，只想简单看，让同学带了两孔，没有marker。我只是试了不到一毫升的腹水。纯化后的浓度是0.68mg，您看我这样的结果可以大量的纯化了吗？再次感谢您，我用的是proteinG resin

图片附件: 17189512.jpg (2013-5-10 11:09, 8.02 KB) / 该附件被下载次数 45
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16137

作者: ha111 时间: 2013-5-10 11:10

nti FGF 21 (Human) IgG, Biotinylated [Detection AB] A00145-12-100B 100 ug 495.00
Anti FGF 21 (Human) IgG, Biotinylated [Detection AB] A00145-12-50B 50 ug 395.00
Anti FGF 21 (Human) Monoclonal Antibody (2E1E7) [Capture AB] A00145-01-100 100 ug 395.00
Anti FGF 21 (Mouse) IgG A00145-03-100 100 ug 220.00
Anti FGF 21 (Human) Monoclonal Antibody (1D9A1)
A00145-09-100

100 ug

$260
Anti FGF 21 (Human) Monoclonal Antibody (1E8F2)
A00145-08-100

100 ug

$260
Anti FGF 21 (Human) Monoclonal Antibody (1F10A3)
A00145-05-100

100 ug

$260
Anti FGF 21 (Human) Monoclonal Antibody (1F10A3D7)
A00145-07-100

100 ug

$260
Anti FGF 21 (Human) Monoclonal Antibody (2A10F5)
A00145-06-100

100 ug

$260
Anti FGF 21 (Human) Monoclonal Antibody (2C4B2)
A00145-04-100

100 ug

$260
Anti FGF 21 (Human) Monoclonal Antibody (2E1E7H3)
谁能帮我看看，这些抗体的区别在哪？谢谢各位高手

作者: lgm 时间: 2013-5-10 11:10

lz我也请教一个问题，抗体纯化好怎么保存的问题，因为后续还要做抗体在细胞上的功能实验，加入甘油或者叠氮钠都会对细胞产生毒性，请问还有其它的保存方法吗？

作者: jrwyyplt 时间: 2013-5-10 11:11

大致情况是这样的：
小弟分离HCG的a和b亚基，用MORGEN方法，
即10M尿素PH4.5，水浴40度，1小时裂解HCG；裂解后重新调PH至7.5
用8M尿素（PH7.5）溶液平衡DEAE sepharose FF 胶；
上样，收集未结合的蛋白,为alpha-hcg;
用高盐洗脱可收集到beta-hcg.

此方法可以说是很成熟的方法，小弟已经用了很多年都没有出过问题，但是今年初在分离时候发现
alpha-hcg也结合在柱子上了，所有的条件都是一样的，而且我重复了多次，都出现同一现象，也购买
过新批次胶和HCG干粉进行比对，一样都出现相同的状况。

现在实在不知道问题出在哪里，因为对hcg 干粉电泳检测是正常的alpha,beta两个条带，我想只有两个
原因：1. 是不是hcg干粉不纯导致离子状况有问题。
2. 是否尿素没有把蛋白裂解开。
不知道有没有碰到过类似问题可以帮忙解答下，在下不甚感激。如果有什么细节要询问，本人一定
详细作答，只希望尽快解决问题，谢谢！

作者: gogo 时间: 2013-5-10 11:12

蒜泥面条老师好！各位同仁好！请教各位如下几个问题：
1、兔子免疫获得多克隆抗体一般效价达到多少可以做抗原亲和纯化？
2、我免疫的兔子在1.02×10^5请问大概每只兔子（5斤左右）能拿到多少mg亲和纯的多抗？
3、间接ELISA测滴度偶尔会遇到阴性对照（免疫前血清）非常高的情况，请问这时候怎么来评定其效价的高低？感觉我的ELISA 结果还是很好，但是由于我们用的判定标准是阴性对照平均值的2.1倍，一旦阴性对照一高，我就觉得效价如此判定会不准，结果偏低！
4、是不是一定要先过了proteinG以后才能做抗原亲和纯化，可否直接用抗原柱进行多抗的纯化呢？
谢谢！

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-10 11:12

我今天听您的方法过了柱子，只想简单看，让同学带了两孔，没有marker。我只是试了不到一毫升的腹水。纯化后的浓度是0.68mg，您看我这样的结果可以大量的纯化了吗？再次感谢您，我用的是proteinG resin

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这没有标识的图，实在是为难我。

我猜一下，你左边一道是原液？右边一道是洗脱液？你的流穿液呢？

流穿液应该是和原液上一样的体积，因为流穿液就是原液被抓掉了一些蛋白后的产物。

一般你想比较纯化的效率：
应该
第1道原液，空第2道，第3道流穿，空第4道，第5道抗体（稀释到和原液一样的体积比，比如你10ml的原液，洗脱出1ml的抗体，那你原液电泳时上了20ul,你的抗体只能上2ul，这样能比较看纯化出多少抗体）

理想的话，流穿液的图谱重叠上抗体的图谱，就等于原液的图谱

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-10 11:13

请教各位高手：
我在做单抗纯化时，使的G柱，在1ml柱中上了两只老鼠的全部腹水7ml左右，在洗的时候用了30ml PBS后，测洗出液还是含有蛋白，不知这时的蛋白是杂蛋白还是目的IgG呀？
还有一个问题是：抗体在最后透析时出现了大量沉淀，抗体纯化时是用glycine-HCl（0.1M, pH 2.7）洗脱的，用Tris-HCl（1M, pH 9.0）中和后透析的，如何避免或消除沉淀呀？
不知道大家有没有遇到我这样的情况没有？请教一下，让我以后如何改进?
太感谢了！

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你说的“还是含有蛋白”，是抗体还是杂蛋白难道没有检测过？这个问题只有你自己能通过实验来验证。

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-10 11:13

QUOTE:

原帖由 gogo 于 2013-5-10 11:12 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
蒜泥面条老师好！各位同仁好！请教各位如下几个问题：
1、兔子免疫获得多克隆抗体一般效价达到多少可以做抗原亲和纯化？
2、我免疫的兔子在1.02×10^5请问大概每只兔子（5斤左右）能拿到多少mg亲和纯的多抗？
3、间接ELISA测滴度偶 ...

1，血清1:32000稀释的时候OD能大于0.1-0.3，但是这个也不一定准，只是经验值，因为有的抗体亲和力特别强，但是浓度就很低，而且能不能做抗原亲和，和你做抗原亲和的水平也有关系。

2，这个没有实验数据，谁都说不好

3，一般鉴定抗体都是ELISA 加WB，而且WB的时候可以用加抗原BLOCK的方法来反证是不是假阳性

4，可以直接过抗原亲和纯化，一般你是多肽做的抗原吧，偶联好一点，直接过没问题。
以前我们，连硫酸铵沉淀都不做，血清直接稀释下，就上抗原亲和柱。

作者: wood533 时间: 2013-5-10 11:14

对抗体纯化是门外汉，请各位高人赐教：

我打算从血清中纯化λ游离轻链（不需要结合的λ轻链）。查询到有种Anti-Lambda Free Light Chain antibody可以做AP，但是不能做IP。
我想请教下：
1.这AP需要将抗体偶联到agrose上，我没有这方面的经验，不知道整个过程复杂吗？

2.抗原抗体结合后应该用什么方法洗脱，还需要经过protein A吗？
3.或者换种方法，利用SDS-PAGE分离、浓缩和部分纯化单克隆免疫球蛋白游离轻链，不知道可行不？不过貌似纯度没有AP的高。
多谢指导！

作者: xueyouzhang 时间: 2013-5-10 11:26

你说的“还是含有蛋白”，是抗体还是杂蛋白难道没有检测过？这个问题只有你自己能通过实验来验证。

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洗出液我只做了一下ELISA检测了，但发现值都在3以上，随后我对我的所有处理液都做了ELISA检测，以下是我的OD450读数结果：
不同株过柱流出液洗涤柱子流出液 1:1000稀释洗脱后的抗体
1 1.749 3.192 2.973
株 1.518 3.199 2.703
2 2.68 3.151 2.802
株 2.512 3.194 2.921
3 1.734 2.803 2.92
株 1.715 2.747 2.87

过柱流出液：用腹水高速离心后取上清进行上柱后的流出液
洗涤柱子流出液：在腹水上完柱后用PBS（20mM, pH7.0）进行洗柱子后的流出液（洗杂蛋白）
1:1000稀释洗脱后的抗体：用glycine-HCl（0.1M, pH 2.7）洗脱后的抗体进行的稀释（洗脱抗体）

像这样是不是PBS把抗体的都洗掉一部分了？还有一个问题，请教蒜泥兄，抗体在透析时出现了大量的沉淀如何进行消除与减少？

[ 本帖最后由 xueyouzhang 于 2013-5-10 12:21 编辑 ]

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-10 12:24

对抗体纯化是门外汉，请各位高人赐教：

我打算从血清中纯化λ游离轻链（不需要结合的λ轻链）。查询到有种Anti-Lambda Free Light Chain antibody可以做AP，但是不能做IP。
我想请教下：
1.这AP需要将抗体偶联到agrose上，我没有这方面的经验，不知道整个过程复杂吗？

2.抗原抗体结合后应该用什么方法洗脱，还需要经过protein A吗？
3.或者换种方法，利用SDS-PAGE分离、浓缩和部分纯化单克隆免疫球蛋白游离轻链，不知道可行不？不过貌似纯度没有AP的高。
多谢指导！

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用来做ab亲和ag的话，用来偶联到填料上的ab的量需要比较大，你如果买试剂包装（用于WB IP AP）的Anti-Lambda Free Light Chain antibody，往往量是不够的。

抗体抗原结合的洗脱就用改变PH，一般是酸性

SDS-PAGE变性电泳分离的话，一般就没有空间结构了

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-10 12:25

洗出液我只做了一下ELISA检测了，但发现值都在3以上，随后我对我的所有处理液都做了ELISA检测，以下是我的OD450读数结果：
不同株过柱流出液洗涤柱子流出液 1:1000稀释洗脱后的抗体
1 1.749 3.192 2.973
株 1.518 3.199 2.703
2 2.68 3.151 2.802
株 2.512 3.194 2.921
3 1.734 2.803 2.92
株 1.715 2.747 2.87

过柱流出液：用腹水高速离心后取上清进行上柱后的流出液
洗涤柱子流出液：在腹水上完柱后用PBS（20mM, pH7.0）进行洗柱子后的流出液（洗杂蛋白）
1:1000稀释洗脱后的抗体：用glycine-HCl（0.1M, pH 2.7）洗脱后的抗体进行的稀释（洗脱抗体）

像这样是不是PBS把抗体的都洗掉一部分了？还有一个问题，请教laboy兄，抗体在透析时出现了大量的沉淀如何进行消除与减少？

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原液呢？
不知道你的ELISA为什么这样做

一个株用一块板
第一道阴性对照空一道第2道原液空一道第3道流穿（样品过柱子以后）空一道第4道低PH洗脱产物杂蛋白洗液
1:100 稀释度雷同
1:300
1:900
1:2700
1:8100
1:24300
1:72900

作者: fsdd817 时间: 2013-5-10 12:25

用来做ab亲和ag的话，用来偶联到填料上的ab的量需要比较大，你如果买试剂包装（用于WB IP AP）的Anti-Lambda Free Light Chain antibody，往往量是不够的。

抗体抗原结合的洗脱就用改变PH，一般是酸性

SDS-PAGE变性电泳分离的话，一般就没有空间结构了

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谢谢答复。
还想请教下：从你做的实践看，试剂包装的ab大概需要多少量呢？有没有个估算的方法，或者实例？

SDS-PAGE变性电泳分离，如果提取的蛋白做测序的话，应该和空间结构没什么关系了，就是有点怀疑这样分离的蛋白纯度，这个和测序有关系的。

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-10 12:26

QUOTE:

原帖由 fsdd817 于 2013-5-10 12:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
用来做ab亲和ag的话，用来偶联到填料上的ab的量需要比较大，你如果买试剂包装（用于WB IP AP）的Anti-Lambda Free Light Chain antibody，往往量是不够的。

抗体抗原结合的洗脱就用改变PH，一般是酸性

SDS-PAGE变性电泳分离的 ...

试剂包装的一支抗体一般都是100ul或者200ul

至于其中纯抗体的总量那是很不一样的，看亲和力的高低，商业化的产品一般都是提供ELISA和WB的稀释度为QC指标

SDS-PAGE分离的好，纯度还是蛮高的

作者: jujuba 时间: 2013-5-10 12:26

你好。我们从抗体公司定了抗体，他们除了提供抗原亲和纯化好的抗体外，还提供了Final Bleed。目前来看，他们纯化好的抗体做IP效果不好，所以老板建议我们自己从Final Bleed里纯化抗体试试。我在这方面是个外行，所以想请教一些基础的问题。基于我的情况，你觉得是用Protein A纯化出IgG，然后再用抗原亲和纯化好，还是直接用抗原亲和纯化？还有个问题就是公司给我们的兔多抗是保存在10%甘油的PBS中，浓度标注是0.5mg/ml，实验室接手的同事分装后保存在-20度，当我取出使用时，复融后，发现有透明片状的结晶，几乎每管都有，所以很可能是分装后析出来的，这会是抗体吗？谢谢。

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-10 12:32

QUOTE:

原帖由 jujuba 于 2013-5-10 12:26 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你好。我们从抗体公司定了抗体，他们除了提供抗原亲和纯化好的抗体外，还提供了Final Bleed。目前来看，他们纯化好的抗体做IP效果不好，所以老板建议我们自己从Final Bleed里纯化抗体试试。我在这方面是个外行，所以想请教一些 ...

final bleed是最后一次取的血吧？不知道有没有做过boost？

如果没有做过BOOST，那最后一次取血的血清，应该是效价最高的了

如果你的抗原是多肽，数量足够多，能够保证10mg多肽（纯度越高越好）/ml偶联的活化胶，然后偶联的效果又能有保证，那你的免疫亲和效果是不会差的，直接用PBS对倍稀释血清，直接就可以做亲和纯化

一般抗体冻过有沉淀，也不会是结晶，一般是絮状，不过最终决定是不是，你取点结晶，跑个SDSPAGE不就知道了么

作者: jujuba 时间: 2013-5-10 12:33

QUOTE:

原帖由 蒜泥面条 于 2013-5-10 12:32 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

final bleed是最后一次取的血吧？不知道有没有做过boost？

如果没有做过BOOST，那最后一次取血的血清，应该是效价最高的了

如果你的抗原是多肽，数量足够多，能够保证10mg多肽（纯度越高越好）/ml偶联的活化胶，然后偶联的效果又能 ...

谢谢。Final Bleed是最后一次的血，BOOST做过。关于结晶，因为跑过溶液里面的抗体，浓度正常，Western也很顺利，所以没有去深入分析，看帖子里说抗体会沉淀，所以就顺便问问，多谢了。
我的抗原是多肽，之前他们给我的抗体也是拿抗原亲和纯化的，做Ｗｅｓｔｅｒｎ是没有问题，但我做IP总是不成功，根据你的经验，我这样的抗体适合做IP吗？按道理，既然抗体是抗原纯化出来的，用抗体来IP也不该成问题呀，我知道问题没那么简单，你能否给我科普科普？再次感谢。

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-10 12:34

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原帖由 jujuba 于 2013-5-10 12:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢。Final Bleed是最后一次的血，BOOST做过。关于结晶，因为跑过溶液里面的抗体，浓度正常，Western也很顺利，所以没有去深入分析，看帖子里说抗体会沉淀，所以就顺便问问，多谢了。
我的抗原是多肽，之前他们给我的抗体也是拿抗原 ...

用来做纯化的血清，最好不要是BOOST以后取的血，用抗原BOOST会中和血清里的很多抗体。

WB 成功，IP不成功，这里有几种可能性
1，你有没有目的蛋白的标准品阳性对照？有可能你的样品中目的蛋白就非常少，不足以被检测出来
2，IP实验有问题，可能没有抓住目的蛋白，或者抓住了，但是在操作的过程中丢失了，需要一个普通阳性对照能平行做来判断

3，就算你的含目的蛋白的样品没问题，你的IP也非常成功，WB也能成功，但是就是这样，IP还是有可能做不出来。
因为用多肽做抗原，打的抗体，一般也就是15-20个左右的氨基酸，这样的多肽一般是没有什么空间结构的。

如果你选的表位刚好是天然蛋白的表面暴露部分，那还有比较大的希望，那玩意你选的那段氨基酸序列刚好被天然蛋白质本身的折叠或者螺旋，或者其他什么构象给遮盖了呢？

WB能成功，是因为跑胶的时候天然蛋白被变性成相对的线型，但是IP的时候，如果你是用天然蛋白的样品，那是有结构的蛋白。

不知道我这样说的够不够详细，希望对你有所帮助

作者: ladyhuahua 时间: 2013-5-10 12:34

我是刚接触单克隆抗体纯化不久，遇到了一些问题！
在用 rProteinA纯化单克隆抗体(个别）细胞上清时，纯化获得的抗体elisa检测无活性！！！
结合缓冲液是1.5M Gly ,3M NaCl.pH 9.0;
洗脱液时0.1M Gly pH3.0;
中和用1M tris-HCL pH 9.0;
细胞上清elisa检测活性很高，滤过液活性也很高；而且收集的抗体浓度在1mg\ml以上，电泳条带也正常。
如果换较高pH的话洗脱势必减少，有起到保护洗脱抗体活性的物质嘛？是否是收集的抗体在pH 3.0变性？也用过pH 4.0效果不佳！！！希望能解答

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-10 12:35

QUOTE:

原帖由 ladyhuahua 于 2013-5-10 12:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我是刚接触单克隆抗体纯化不久，遇到了一些问题！
在用 rProteinA纯化单克隆抗体(个别）细胞上清时，纯化获得的抗体elisa检测无活性！！！
结合缓冲液是1.5M Gly ,3M NaCl.pH 9.0;
洗脱液时0.1M Gly pH3.0;
中和用1M tris-HCL pH ...

你原始上清和流穿液（是不是就是你说的滤过液）的活性比较如何？

ELISA差不多呢，还是差几个数量级？

如果是差不多，那说明你的抗体没有纯化出来
如果差好几个数量级，那说明抗体被纯化出来了，但是在纯化中丢失活性，比如洗脱时失活。

但是很奇怪，你说你纯化出来的抗体浓度有1mg/ml，那是非常不错的一个抗体浓度，电泳图最好能上一个，不然不好判断

如果就就像你猜测那样是因为低PH的原因，导致抗体活性的丢失，以我的经验来看PH3是一个非常保守的PH，极少有抗体会在这个PH失活

需要更多的线索或者信息才能帮你进一步分析

作者: ladyhuahua 时间: 2013-5-10 12:36

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原帖由 蒜泥面条 于 2013-5-10 12:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你原始上清和流穿液（是不是就是你说的滤过液）的活性比较如何？

ELISA差不多呢，还是差几个数量级？

如果是差不多，那说明你的抗体没有纯化出来
如果差好几个数量级，那说明抗体被纯化出来了，但是在纯化中丢失活性，比如洗脱时失 ...

1.你原始上清和流穿液（是不是就是你说的滤过液）的活性比较如何？
差别比较明显，与可以纯化出来的抗体情况基本一致，唯独elisa检验不出。
电泳图我这两天再重新跑一个！
我验证过，在原上清中加洗脱液，使pH大约于为3.0，elisa检验效价明显降低。
就拿ckb细胞上清来说，重复出现几株。我是单克隆挑选的！

作者: veiwu 时间: 2013-5-10 12:36

老师，我现在面临的问题不是外在因素对样品污染导致内毒素偏高，是样品本身就含大量内毒素（大肠杆菌包涵体）要通过疏水和弱阳离子交换（CM）两步层析去除样品中的内毒素。内毒素的理化性质我不是很清楚，能跟我讲解一下吗还有请问PH对内毒素的理化性质有什么影响吗

作者: veiwu 时间: 2013-5-10 12:37

老师，我现在面临的问题不是外在因素对样品污染导致内毒素偏高，是样品本身就含大量内毒素（大肠杆菌包涵体）要通过疏水和弱阳离子交换（CM）两步层析去除样品中的内毒素。内毒素的理化性质我不是很清楚，能跟我讲解一下吗还有请问PH对内毒素的理化性质有什么影响吗

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-10 12:37

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原帖由 veiwu 于 2013-5-10 12:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

老师，我现在面临的问题不是外在因素对样品污染导致内毒素偏高，是样品本身就含大量内毒素（大肠杆菌包涵体）要通过疏水和弱阳离子交换（CM）两步层析去除样品中的内毒素。内毒素的理化性质我不是很清楚，能跟我讲解一下吗还有请 ...

如果有内毒素控制要求的，一般都不会选择大肠杆菌这种细菌表达体系的

这是一条不归路，大肠杆菌本身就是内毒素的来源，没有什么好方法

改用哺乳动物表达体系吧

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-10 12:38

1.你原始上清和流穿液（是不是就是你说的滤过液）的活性比较如何？
差别比较明显，与可以纯化出来的抗体情况基本一致，唯独elisa检验不出。
电泳图我这两天再重新跑一个！
我验证过，在原上清中加洗脱液，使pH大约于为3.0，elisa检验效价明显降低。
就拿ckb细胞上清来说，重复出现几株。我是单克隆挑选的！

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你的测试非常好，用低PH来测试原始上清，不知道你PH3保持了多久？有没有中和后再去测ELISA？

作者: ladyhuahua 时间: 2013-5-10 12:38

你的测试非常好，用低PH来测试原始上清，不知道你PH3保持了多久？有没有中和后再去测ELISA？

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今天我突然也想到了差一个中和再测elisa！
今天我用pH4.5, pH5.0, pH5.5去洗脱都收集到浓度大于1mg/ml的蛋白质（不敢说是抗体了），elisa检测稀释100倍就没效价了，用0.5mg/ml之间测效价不高。
现在，分析认为可能不是变性原因！但是不知纯化春来的是什么？？
现在，正在用NHS-activated sepharose 4 试试！还有什么好方法推荐嘛？？？

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-10 12:39

今天我突然也想到了差一个中和再测elisa！
今天我用pH4.5, pH5.0, pH5.5去洗脱都收集到浓度大于1mg/ml的蛋白质（不敢说是抗体了），elisa检测稀释100倍就没效价了，用0.5mg/ml之间测效价不高。
现在，分析认为可能不是变性原因！但是不知纯化春来的是什么？？
现在，正在用NHS-activated sepharose 4 试试！还有什么好方法推荐嘛？？？

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呵呵，那么高的浓度，我的经验判断应该不是抗体失活的问题，再从头到尾想想实验中有没有问题

作者: ladyhuahua 时间: 2013-5-10 12:40

呵呵，那么高的浓度，我的经验判断应该不是抗体失活的问题，再从头到尾想想实验中有没有问题

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我们的上清还有1%小牛血清！会友影响吗？从跑胶的条带看很不纯，好像有BSA！但是重组蛋白A不应该有这些杂质吧！！

作者: moonlight45 时间: 2013-5-10 12:40

你好，我现在用杂交瘤细胞表达一个单抗，主要是纯化出来做HRP标记，现在培养液体积有500ml，我在培养的时候加了10%的小牛血清，本来我打算直接过rproteinA 捕获纯化，然后看其纯度再决定是否过其他层析柱，但想到里面加了10%的血清，而且抗体浓度又非常低，直接过proteinA是否会对proteinA 填料损害很大，血清白蛋白是否会影响其结合？这个鼠源的igg貌似和proteinA结合力不太好，但手上又没有proteinG，担心因为白蛋白的影响会使收率更低？所以我就考虑先用50%饱和度的硫酸铵沉淀下，然后用0.7M 硫酸铵溶解沉淀过一步phenyl hp，直接pb洗脱，再过proteinA，但是phenyl洗脱的样品里面仍有硫酸铵的存在，我不想透析，不知道硫酸铵会不会影响igg与proteinA的结合？
另外这种杂交瘤细胞培养液来源的单抗纯化，抗体浓度非常低，用硫酸铵沉淀是否合理？是否以细胞培养来表达的抗体纯化，第一步都是首选亲和？

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-10 12:40

我们的上清还有1%小牛血清！会友影响吗？从跑胶的条带看很不纯，好像有BSA！但是重组蛋白A不应该有这些杂质吧！！

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呵呵，小牛血清里有牛IgG和其他蛋白组分

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-10 12:41

你好，我现在用杂交瘤细胞表达一个单抗，主要是纯化出来做HRP标记，现在培养液体积有500ml，我在培养的时候加了10%的小牛血清，本来我打算直接过rproteinA 捕获纯化，然后看其纯度再决定是否过其他层析柱，但想到里面加了10%的血清，而且抗体浓度又非常低，直接过proteinA是否会对proteinA 填料损害很大，血清白蛋白是否会影响其结合？这个鼠源的igg貌似和proteinA结合力不太好，但手上又没有proteinG，担心因为白蛋白的影响会使收率更低？所以我就考虑先用50%饱和度的硫酸铵沉淀下，然后用0.7M 硫酸铵溶解沉淀过一步phenyl hp，直接pb洗脱，再过proteinA，但是phenyl洗脱的样品里面仍有硫酸铵的存在，我不想透析，不知道硫酸铵会不会影响igg与proteinA的结合？
另外这种杂交瘤细胞培养液来源的单抗纯化，抗体浓度非常低，用硫酸铵沉淀是否合理？是否以细胞培养来表达的抗体纯化，第一步都是首选亲和？

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1，proteinA填料，只要原始样品离心彻底，纯化完洗脱和清洗彻底，是不会受什么影响的，工业上proteinA做单抗药物，规范的CIP清洗，使用次数可以达到50-100次以上，载量不会丢失超过90%

2，你这样含有牛血清的样品，用A蛋白纯化，肯定一堆的牛IGG

3，纯化做的好，BSA是不会被proteinA纯化出来，至于BSA（或者说你添加的10%的小牛血清）会不会对你的抗体纯化有影响，那就看你的目的抗体的丰度有多好了，这个没有绝对的数值或者比例。

4，好的rProteinA亲和填料对小鼠的IGG亲和也很好，请参看
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/topic/17545614')

5，业界比较常用的工艺是，用无血清的培养基，培养细胞上清，然后proteinA作为第一步的捕获，纯度可以达到95-99%以上.

至于你这种加了牛血清的，确实比较麻烦，尤其是在目的抗体丰度比较低的时候。

如果丰度高的话，还可以选择用抗原偶联到填料上，去特异性免疫亲和纯化

作者: moonlight45 时间: 2013-5-10 12:41

1，proteinA填料，只要原始样品离心彻底，纯化完洗脱和清洗彻底，是不会受什么影响的，工业上proteinA做单抗药物，规范的CIP清洗，使用次数可以达到50-100次以上，载量不会丢失超过90%

2，你这样含有牛血清的样品，用A蛋白纯化，肯定一堆的牛IGG

3，纯化做的好，BSA是不会被proteinA纯化出来，至于BSA（或者说你添加的10%的小牛血清）会不会对你的抗体纯化有影响，那就看你的目的抗体的丰度有多好了，这个没有绝对的数值或者比例。

4，好的rProteinA亲和填料对小鼠的IGG亲和也很好，请参看
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/topic/17545614')

5，业界比较常用的工艺是，用无血清的培养基，培养细胞上清，然后proteinA作为第一步的捕获，纯度可以达到95-99%以上.

至于你这种加了牛血清的，确实比较麻烦，尤其是在目的抗体丰度比较低的时候。

如果丰度高的话，还可以选择用抗原偶联到填料上，去特异性免疫亲和纯化

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多谢蒜泥老师，搜索了下帖子，除了疏水，现在还有什么比较有效的方法能够将牛igg给去除的？另外样品中含有硫酸铵，直接上proteinA，有影响吗？

作者: mod=8048 时间: 2013-5-10 12:43

你好！请问我们用色谱纯抗体所使用的待纯化的抗体样品以及缓冲液都是要经过0.45微米滤膜的过滤才能使用吗？

作者: 131415 时间: 2013-5-10 12:43

大家好！这里好热闹。laboy哥象雷锋一样，积极的回答帮助大家！问下，有没有同胞是做phage display 筛选单克隆抗体的，做了两年多的这方面的工作，筛选了600多个抗原，有好多问题想跟同行交流下。

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-10 12:44

搜索了下帖子，除了疏水，现在还有什么比较有效的方法能够将牛igg给去除的？另外样品中含有硫酸铵，直接上proteinA，有影响吗？

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你的样品里既有牛的IGG 又有你的目的IGG

除了用抗原，没有任何其他方法能把牛的IGG和你的目的IGG分开

你用疏水，也会把你的目的抗体和牛IGG一起给吸附

btw:硫酸铵浓度不高的话，proteinA是不受影响的

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-10 12:44

你好！请问我们用色谱纯抗体所使用的待纯化的抗体样品以及缓冲液都是要经过0.45微米滤膜的过滤才能使用吗？

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如果你用的书预装柱，那最好是能过一下0.45um

如果不过的话，那最好10000RPM离心个半个小时，然后小心取上清

当然最保险的是离心后再过0.45，呵呵

如果你不是预装柱，自己装的，那离心一下就行，一般而言，你离心过后，杂质就少多了，对柱子的阻塞作用几率就小了很多。

不是预装柱，即使堵了，还有最后一招，拆了柱子，清洗下，然后重新装，哈哈哈

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-10 12:44

大家好！这里好热闹。laboy哥象雷锋一样，积极的回答帮助大家！问下，有没有同胞是做phage display 筛选单克隆抗体的，做了两年多的这方面的工作，筛选了600多个抗原，有好多问题想跟同行交流下。

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呵呵，过奖了，虽然我现在也已经不直接从事抗体方面的工作了，但是对于以前自己积累的一点点经验，还是希望能够帮助到大家，尤其是刚接触纯化和抗体的学弟学妹们。

曾经差点要接手当时噬菌体展示的事，文库都从美国寄给我了。

看了一些资料，后来因为各种原因，没有继续下去。

家里电脑上还有一本《phage display》，很好的一本书，有空发上来

作者: damingxia0904 时间: 2013-5-10 12:45

大家好！我想问下几个与装柱有关的问题，希望能得到大家的帮助，在此谢过了！
过去从没接触过装柱，如今实验需要自己装柱，周围没有做此类实验的人，我也查过相关资料，但在下还是有很多困惑～～
昨天刚装了根柱子，柱子是1.6×20cm的，带了转换接头和带夹套的高压柱，我怕浪费填料（填料是Q-琼脂糖凝胶FF），所以只填了6ml (不知这体积对这柱子是否合理)，然后用0.45ml/min的流速压柱，然后将转换接头打到贴近填料上方，固定。
现有几个问题想请教下大虾们：
1.离子交换填料的装法和分子筛填料的装法，后者操作是不是要更小心？后者是不是更容易引进气泡？
2.离子交换填料装之前是否有必要在G3砂芯漏斗中用清水洗去20%乙醇贮液？可否装好再通过恒流泵用纯水在线清洗？
3.柱子装好之后，由于我们没有进样器，是否需要将转换头插下来，再将样品加入填料上？还是可以直接用注射器通过柱上的管加入柱内？
4.另外，我昨天装好柱后，在流缓冲液的时候，发现，在流速3ml/min或1ml/min时，靠近填料上方有水溢出来到转换器与玻璃珠内壁之间，有时还有水溢到柱头外面，请问，这是哪里没有装好吗？还是我的流速大了？

问题有点多哈，在下弱弱。希望得到大家的帮助。

作者: purrr 时间: 2013-5-10 12:45

搜索了下帖子，除了疏水，现在还有什么比较有效的方法能够将牛igg给去除的？另外样品中含有硫酸铵，直接上proteinA，有影响吗？

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这种情况，除了蒜泥兄说的之外，还有一些不同的方法，补充如下：
1，Protein L 亲和纯化
Protein L可以对Human和mouse的多数IgG产生很好的亲和作用，但是对于牛IgG不结合，这样，一步亲和即可达到所需的纯度。
2，如果目标是human的IgG，还可以使用IgSelect进行亲和纯化，Igselect采用特异的亲和配基，只结合huamn的IgG，不解和其他种属IgG。

作者: purrr 时间: 2013-5-10 12:46

大家好！我想问下几个与装柱有关的问题，希望能得到大家的帮助，在此谢过了！
过去从没接触过装柱，如今实验需要自己装柱，周围没有做此类实验的人，我也查过相关资料，但在下还是有很多困惑～～
昨天刚装了根柱子，柱子是1.6×20cm的，带了转换接头和带夹套的高压柱，我怕浪费填料（填料是Q-琼脂糖凝胶FF），所以只填了6ml (不知这体积对这柱子是否合理)，然后用0.45ml/min的流速压柱，然后将转换接头打到贴近填料上方，固定。
现有几个问题想请教下大虾们：
1.离子交换填料的装法和分子筛填料的装法，后者操作是不是要更小心？后者是不是更容易引进气泡？
2.离子交换填料装之前是否有必要在G3砂芯漏斗中用清水洗去20%乙醇贮液？可否装好再通过恒流泵用纯水在线清洗？
3.柱子装好之后，由于我们没有进样器，是否需要将转换头插下来，再将样品加入填料上？还是可以直接用注射器通过柱上的管加入柱内？
4.另外，我昨天装好柱后，在流缓冲液的时候，发现，在流速3ml/min或1ml/min时，靠近填料上方有水溢出来到转换器与玻璃珠内壁之间，有时还有水溢到柱头外面，请问，这是哪里没有装好吗？还是我的流速大了？

问题有点多哈，在下弱弱。希望得到大家的帮助。

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一般来讲，分子筛对柱效要求较高，对于离子交换等吸附层析，如果不是做线性梯度洗脱，一般来讲对于柱效要求不高，如果柱效不高，造成的后果最多也就是洗脱体积增加一些。
对于你的应用，16的柱子装Q FF，0.45ml/min的装柱流速显然是过低的，但如果纯化对速度要求不高，或者样品黏度不大，实验室规模也可以使用了，如果不是为了今后的工艺放大，可以先这样做好了。
不管装什么柱子，气泡肯定是要避免的。不同的填料的packing solution不同，对于Q FF，可以用水来装，乙醇容易有气泡。AKTA和superloop是实验室纯化进样的常用设备。漏液有几个原因，1，柱子质量。2，Adaper的O-ring没有拧紧密封好，3，adapter的白色部分和红色部分没有拧紧装好。BTW, 是Pharmacia的XK柱吗？国产的空柱有时候密封圈质量不好，柱子内管有时加工精度不好，可能也会有漏液。
装柱的理论可以讲的非常深，很难在这里几句话说得清楚。不同的填料，不同的柱高，不同的内径，不同的工艺流速等等，都会有不同的装柱方法和参数，具体需要做实验。当然，任何方法的理论核心就是压力-流速曲线，看你怎理解了，一般的实验室纯化没必要太深入，如果你非常感兴趣，我们可以私下探讨，谢谢

作者: purrr 时间: 2013-5-10 12:46

一般来讲，分子筛对柱效要求较高，对于离子交换等吸附层析，如果不是做线性梯度洗脱，一般来讲对于柱效要求不高，如果柱效不高，造成的后果最多也就是洗脱体积增加一些。
对于你的应用，16的柱子装Q FF，0.45ml/min的装柱流速显然是过低的，但如果纯化对速度要求不高，或者样品黏度不大，实验室规模也可以使用了，如果不是为了今后的工艺放大，可以先这样做好了。
不管装什么柱子，气泡肯定是要避免的。不同的填料的packing solution不同，对于Q FF，可以用水来装，乙醇容易有气泡。AKTA和superloop是实验室纯化进样的常用设备。漏液有几个原因，1，柱子质量。2，Adaper的O-ring没有拧紧密封好，3，adapter的白色部分和红色部分没有拧紧装好。BTW, 是Pharmacia的XK柱吗？国产的空柱有时候密封圈质量不好，柱子内管有时加工精度不好，可能也会有漏液。
装柱的理论可以讲的非常深，很难在这里几句话说得清楚。不同的填料，不同的柱高，不同的内径，不同的工艺流速等等，都会有不同的装柱方法和参数，具体需要做实验。当然，任何方法的理论核心就是压力-流速曲线，看你怎理解了，一般的实验室纯化没必要太深入，如果你非常感兴趣，我们可以私下探讨，谢谢

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我买的空柱是上海华美实验仪器厂的产品，不是进口的。
另外，我对柱子的结构名称还是模糊的，所以，您说的adapter是指上面的那几个螺帽一样的东西吗？请问，什么书籍会详细的阐述这些知识的呢？

作者: purrr 时间: 2013-5-10 12:47

问一个与辛酸沉淀法纯化抗体有关的问题：
前段时间，我用辛酸纯化小鼠腹水（含一种药物的抗体），结果所得到的抗体特异性不好，采用竞争ELISA检测效价，与腹水相比，显色效果差不多，不同的是加入药物标准品后，没有抑制，最后查看了些文献，说辛酸法纯化IgG3亚型的单抗，会使它产生不可逆的沉淀，我用小鼠抗体分型试剂盒测了一下我的单抗，结果确是该亚型的，我想请问，有没有人用过辛酸法纯化过IgG3的，它真的不能存华IGG3吗？谢谢。

作者: jkobn 时间: 2013-5-10 12:47

请问我从杂交瘤细胞培养液里面纯化了大概10mg左右的单抗，大约1个月后需要做hrp标记，在这段时间内，纯化的单抗如何保存呢？直接放4℃行吗？冻的话又怕失活~

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-10 12:48

请问我从杂交瘤细胞培养液里面纯化了大概10mg左右的单抗，大约1个月后需要做hrp标记，在这段时间内，纯化的单抗如何保存呢？直接放4℃行吗？冻的话又怕失活~

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加甘油放-80度吧

你这个时间说长不长，说短不短。

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-10 12:48

问一个与辛酸沉淀法纯化抗体有关的问题：
前段时间，我用辛酸纯化小鼠腹水（含一种药物的抗体），结果所得到的抗体特异性不好，采用竞争ELISA检测效价，与腹水相比，显色效果差不多，不同的是加入药物标准品后，没有抑制，最后查看了些文献，说辛酸法纯化IgG3亚型的单抗，会使它产生不可逆的沉淀，我用小鼠抗体分型试剂盒测了一下我的单抗，结果确是该亚型的，我想请问，有没有人用过辛酸法纯化过IgG3的，它真的不能存华IGG3吗？谢谢。

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为什么不用亲合法？

要用辛酸那么古老的方法？

作者: feima+ 时间: 2013-5-10 12:48

IgM纯化起来好象很难，大家有没有IgM纯化的标准操作方法，如果有请发给我一份，万分感谢,急求！
info.abmaking@gmail.com 恩必美生物：cuturl('www.abmaking.com')

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-10 12:49

QUOTE:

原帖由 feima+ 于 2013-5-10 12:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

IgM纯化起来好象很难，大家有没有IgM纯化的标准操作方法，如果有请发给我一份，万分感谢,急求！
info.abmaking@gmail.com 恩必美生物：cuturl('www.abmaking.com')

IgM的纯化，方法没有固定的哪种

有专门的IGM 纯化试剂盒，也可以用抗原去免疫亲和

也有用疏水的

作者: tuomu45 时间: 2013-5-10 12:49

蒜泥兄真热心，一直积极的回答各位战友的问题，我也有个问题想请教一下，
我纯化后的抗体需要浓缩，但浓缩之后里面的甘油含量太多，粘度很大，用什么办法才能使甘油减少又不影响抗体的浓缩？

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-10 12:50

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原帖由 tuomu45 于 2013-5-10 12:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
蒜泥兄真热心，一直积极的回答各位战友的问题，我也有个问题想请教一下，
我纯化后的抗体需要浓缩，但浓缩之后里面的甘油含量太多，粘度很大，用什么办法才能使甘油减少又不影响抗体的浓缩？ ...

用超滤法浓缩，甘油的浓度是不会增加的，如果还是嫌高，一边浓缩的时候，一边加PBS这种无机缓冲液来稀释甘油

作者: mod=8048 时间: 2013-5-10 12:50

为什么不用亲合法？

要用辛酸那么古老的方法？

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蒜泥面条你好，我不是光为了得到最纯的抗体，现在主要是做方法比较性研究的，所以辛酸法也会用的。
另外，我会用到层析的方法，想请问下，我用的填料粒径是90微米，那么低压的恒流泵是否可以满足要求啊？流速和压力之间有没有换算公式啊？

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-10 12:51

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原帖由 mod=8048 于 2013-5-10 12:50 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
为什么不用亲合法？

要用辛酸那么古老的方法？

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蒜泥面条你好，我不是光为了得到最纯的抗体，现在主要是做 ...

用心酸法和亲合法，想比较研究啥？

不巧当年偶们部门也搞过这个研究，结果是亲合法胜出

亲和的流速范围很宽泛，你想结合率高就流速慢点，如果是1ml的柱子，那你10-1ml/min都可以

作者: okhaha 时间: 2013-5-10 12:52

楼主你好。用抗原柱亲和纯化多抗的时候，将血清过柱之后，用PBS冲洗，我看还有人加1M NaCl冲洗，以你的经验，觉得有必要吗？还是只用PBS就可以了。
我的抗原柱是大约1mg抗原结合到1ml的Beads上，我有大约40ml的血清，那么我我应该用多少ml的Beads比较合适呢？过柱的问题，基本上都是直接上柱，我买的Beads说明上建议Load2次，你觉得2次足够吗？我把Beads倒出来跟血清样品混合，在Rotator上孵育一段时间，让抗体跟抗原有更充分的接触时间，再倒入层析柱里让Beads沉降，然后冲洗，你觉得这么做好还是直接多次将血清过柱子好呢？谢谢。

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-10 12:52

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原帖由 okhaha 于 2013-5-10 12:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼主你好。用抗原柱亲和纯化多抗的时候，将血清过柱之后，用PBS冲洗，我看还有人加1M NaCl冲洗，以你的经验，觉得有必要吗？还是只用PBS就可以了。
我的抗原柱是大约1mg抗原结合到1ml的Beads上，我有大约40ml的血清，那么我我应该 ...

用高盐清洗是为了防止血清里的杂蛋白吸附在填料上，不过0.5M Nacl就足够了

血清你最好用PBS稀释一倍，至于加多少beads取决与你的血清丰度，如果血清里特异性的抗体多，你beads就要多加，但是beads多加了，残留就大了，所以如果血清少，抗体又多，如果要追求回收率，你混匀法其实不是很合适

以前我们一直用这个,如果做抗原免疫亲和的，都可以参考下这个protocol
cuturl('http://www.epitomics.com/products/portals/epimax')

作者: kswl870 时间: 2013-5-10 12:53

楼主，你好。我想把抗体偶联到Pierce的NHS-activated agarose上，然后做IP。用到的Agarose的量都比较少，比如我可能把200ug的抗体偶联到50ul的Beads上来做IP。我有个疑问，你觉得是把Beads跟样品混合放在小的EP管里摇晃孵育好，还是把Beads先倒入一个层析柱里，然后让样品慢慢流过柱子好呢？我的理解是可能后者会好些，因为抗体的浓度相对较高，可能有利于抗原的结合，这也是一般抗体或抗原亲和纯化的方式。不知道你的意见如何？如果第二个制备抗体柱的方案好，抗体柱越长是否更有利结合？像我的Beads比较少，要想制成较长的柱，势必要用小直径的柱子，上样的压力可能会比较大，所以我想请问楼主是否知道Agarose一般可承受的压力会有多大？谢谢。

作者: IAM007 时间: 2013-5-10 12:53

一个很急的问题：
由于要制备一批单抗腹水，昨天下午去打佐剂，不完全佐剂用完后，我没仔细看，有几只小鼠打成完全佐剂了！请教一下，用完全佐剂制备腹水会有影响吗？打了完全佐剂的小鼠与打不完全佐剂的小鼠已经混在一起无法区分了，很着急！还请指教！万分感谢！

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-10 12:53

楼主，你好。我想把抗体偶联到Pierce的NHS-activated agarose上，然后做IP。用到的Agarose的量都比较少，比如我可能把200ug的抗体偶联到50ul的Beads上来做IP。我有个疑问，你觉得是把Beads跟样品混合放在小的EP管里摇晃孵育好，还是把Beads先倒入一个层析柱里，然后让样品慢慢流过柱子好呢？我的理解是可能后者会好些，因为抗体的浓度相对较高，可能有利于抗原的结合，这也是一般抗体或抗原亲和纯化的方式。不知道你的意见如何？如果第二个制备抗体柱的方案好，抗体柱越长是否更有利结合？像我的Beads比较少，要想制成较长的柱，势必要用小直径的柱子，上样的压力可能会比较大，所以我想请问楼主是否知道Agarose一般可承受的压力会有多大？谢谢。

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做IP你还是用proteinA来亲和抗体比较好，抗体用量少，浓度要求也低

你如果用NHS来偶联固化抗体，效率没有proteinA亲和来的高。
只是做IP，直接把抗体和BEADS混合就行，50ul那么点beads怎么装柱？而且你还要考虑分布浓度问题。

agarose的抗压能力，取决于不同的AGAROSE的基质本身，很多时候agarose都是一个模糊的叫法，现在用的填料基质基本上都是化学铰链过的琼脂糖凝胶或者是树脂类，当然还有其他一些玻璃基质，羟基磷灰石，磁珠等等……

如果你买的是大包装的填料，一般什么会写推荐的线性流速，只要不超过这个线性流速太多，一般填料是不会碎的

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-10 12:54

一个很急的问题：
由于要制备一批单抗腹水，昨天下午去打佐剂，不完全佐剂用完后，我没仔细看，有几只小鼠打成完全佐剂了！请教一下，用完全佐剂制备腹水会有影响吗？打了完全佐剂的小鼠与打不完全佐剂的小鼠已经混在一起无法区分了，很着急！还请指教！万分感谢！

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最好先学习下不完全佐剂和完全佐剂有什么具体的成分差别

不是经验性的东西，很多都可以从书上得到答案

作者: ukonptp 时间: 2013-5-10 12:54

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原帖由 蒜泥面条 于 2013-5-10 12:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
一个很急的问题：
由于要制备一批单抗腹水，昨天下午去打佐剂，不完全佐剂用完后，我没仔细看，有几只小鼠打成完全佐剂了！请教一下，用完全佐剂制备腹水会有影响吗？打了完全佐剂的小鼠与打不完全佐剂的小鼠已经混在一起无法区分了， ...

免疫佐剂（immunoadjuvant）又称非特异性免疫增生剂。本身不具抗原性，但同抗原一起或预先注射到机体内能增强免疫原性（见抗原）或改变免疫反应类型。种类很多，目前尚无统一的分类方法，常用的佐剂可分为4类：无机佐剂，如氢氧化铝，明矾等；有机佐剂，微生物及其产物如分枝杆菌（结核杆菌、卡介苗）、短小杆菌、百日咳杆菌、内毒素、细菌提取物（胞壁酰二肽）等；合成佐剂，如人工合成的双链多聚核苷酸（双链多聚腺苷酸、尿苷酸）、左旋咪唑、异丙肌苷等；油剂，如费氏佐剂、花生油乳化佐剂、矿物油、植物油等。费氏佐剂目前在实验动物中最常用，又可分为费氏不完全佐剂和完全佐剂两种。不完全佐剂是油剂（石蜡油或植物油）与乳化剂（羊毛脂或吐温（Tween）80）相混合而成，当其再与抗原混合，即成油包水乳剂，可用于免疫注射。在不完全佐剂中加入死的分枝杆菌，即成为费氏完全佐剂。完全佐剂的免疫强度大于不完全佐剂。该佐剂主要用于动物实验，不适宜于人类使用。而且动物多次注射后也常会发生佐剂病。免疫佐剂的生物作用包括：（1）抗原物质混合佐剂注入机体后，改变了抗原的物理性状，可使抗原物质缓慢地释放，延长了抗原的作用时间；（2）佐剂吸附了抗原后，增加了抗原的表面积，使抗原易于被巨噬细胞吞噬；（3）佐剂能刺激吞噬细胞对抗原的处理；（4）佐剂可促进淋巴细胞之间的接触，增强辅助T细胞的作用；（5）可刺激致敏淋巴细胞的分裂和浆细胞产生抗体。故免疫佐剂的作用可使无免疫原性物质变成有效的免疫原；（6）可提高机体初次和再次免疫应答的抗体滴变；（7）改变抗体的产生类型以及产生迟发型变态反应，并使其增强。

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-10 12:55

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原帖由 ukonptp 于 2013-5-10 12:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

免疫佐剂（immunoadjuvant）又称非特异性免疫增生剂。本身不具抗原性，但同抗原一起或预先注射到机体内能增强免疫原性（见抗原）或改变免疫反应类型。种类很多，目前尚无统一的分类方法，常用的佐剂可分为4类：无机佐剂，如氢氧化铝， ...

上面这段话里最主要的一句话就是：完全佐剂的免疫强度大于不完全佐剂

也就是说完全佐剂是加了外源抗原物质（一般用灭火的卡介苗）的不完全佐剂，免疫的强度更大，对动物的刺激也越大。
但是并不会大到致死或者其他严重的后果。除非你打过量了。

免疫是个混合因素的试验，动物的个体差异，实验操作差异，等等都会影响免疫的最终效果

我的感觉是不会有太大影响，或许免疫结果差一点，或许免疫结果会好一点。
如果你现在还有没打的最后几次加强免疫，改回不完全佐剂就行。

作者: ukonptp 时间: 2013-5-10 12:55 标题: 回复 #388 蒜泥面条的帖子

<1>.现在正在做抗体的酶切，IgG抗体用胃蛋白酶处理，目标物是F(ab)2'，酶切后的产物经非还原SDS-PAGE发现，除了有110kd F(ab)2'，40kd Fc'，还有一个60多kd的带，不知道是什么东西，会是F(ab)’吗？但是它应该是55kd啊。
<2>.另外，得到的产物我想只保留F(ab)2'，有些文献说可以过Protein A柱子来除去Fc'片断，但是感觉效果不是很理想，过了柱子后，40kd的带还有。。后来想到超滤，在网上查了millipore的超滤离心管有50kd的，那样应该可以除去40kd的片断吧？但是还有一个60多kd的未知物啊！还有什么更好的办法来纯化目标物F(ab)2'呢？
谢谢！

作者: standbyme 时间: 2013-5-10 12:56

我现在做的是多抗IgY，我想问下，粗提的抗体有许多杂带，抗体的分子量是180kda，能用透析袋透析纯化吗？选择的规格是多少？

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-10 12:56

<1>.现在正在做抗体的酶切，IgG抗体用胃蛋白酶处理，目标物是F(ab)2'，酶切后的产物经非还原SDS-PAGE发现，除了有110kd F(ab)2'，40kd Fc'，还有一个60多kd的带，不知道是什么东西，会是F(ab)’吗？但是它应该是55kd啊。
<2>.另外，得到的产物我想只保留F(ab)2'，有些文献说可以过Protein A柱子来除去Fc'片断，但是感觉效果不是很理想，过了柱子后，40kd的带还有。。后来想到超滤，在网上查了millipore的超滤离心管有50kd的，那样应该可以除去40kd的片断吧？但是还有一个60多kd的未知物啊！还有什么更好的办法来纯化目标物F(ab)2'呢？
谢谢！

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1,最好看你的胃蛋白酶的说明书上怎么说的

2，如果你的酶切是真的很理想，切成了FAB + FC，那proteinA是最好的方法。
不要期望50KD的超滤膜能精确的分离40KD 和50KD

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-10 12:57

我现在做的是多抗IgY，我想问下，粗提的抗体有许多杂带，抗体的分子量是180kda，能用透析袋透析纯化吗？选择的规格是多少？

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如果杂带所处的分子量区和180KD相去甚远，那你透析也行，最好还是超滤或者是分子筛

如果分子量区和180KD相近，那就做个疏水层析吧

作者: qiangren789 时间: 2013-5-10 12:58

我们用CHO-K1细胞表达的RAT-IgG2a Fc 融合蛋白上清，加入5%体积的1M tris-hcl （pH 8.0 & pH 9.0）后过GE protein G 预装柱，目的蛋白均不挂柱。我们又将少量RAT-IgG2a Fc 融合蛋白上清直接用pH 7.2-7.4的PBS透析后过protein G 预装柱，仍然不结合。

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-10 12:58

QUOTE:

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我们用CHO-K1细胞表达的RAT-IgG2a Fc 融合蛋白上清，加入5%体积的1M tris-hcl （pH 8.0 & pH 9.0）后过GE protein G 预装柱，目的蛋白均不挂柱。我们又将少量RAT-IgG2a Fc 融合蛋白上清直接用pH 7.2-7.4的PBS透析后过protei ...

信息很少

我觉得可以试试proteinA

另外纯化前后的各个样品组分（原液，流穿，上样后洗柱子的平衡液，洗脱液）跑个电泳，有条件再做个ELISA看下

抗体究竟都在哪

作者: qianqin1977 时间: 2013-5-10 12:58

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信息很少

我觉得可以试试proteinA

另外纯化前后的各个样品组分（原液，流穿，上样后洗柱子的平衡液，洗脱液）跑个电泳，有条件再做个ELISA看下

抗体究竟都在哪 ...

我们对过柱后上清进行了ELISA检测，可以确定绝大部分蛋白未能挂柱，仍在过柱后上清里面。

同时尝试使用proteinA预装柱进行实验，蛋白依旧未能挂柱。

目前的主要症结是不结合柱子，是否需在过柱上清里加些Nacl？请教楼主

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-10 12:59

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我们对过柱后上清进行了ELISA检测，可以确定绝大部分蛋白未能挂柱，仍在过柱后上清里面。

同时尝试使用proteinA预装柱进行实验，蛋白依旧未能挂柱。

目前的主要症结是不结合柱子，是否需在过柱上清里加些Nacl？请教楼主 ...

假设你的试验本身都没问题，如果连A和G都挂不了柱，那说明你表达的蛋白的FC结构有问题，要么是异构错构，要么是被蛋白折叠遮挡。

为什么不表达完整IgG蛋白?

如果没有发生这种悲剧的根本性错误，那就是试验操作本身吧

但是proteinA的亲和纯化是一种很宽容的实验，随便FC都能挂住的，制药FC是完好正确的，如果基本挂不住的，你加什么都没用。

作者: greenbee 时间: 2013-5-10 12:59

您好，我最近刚开始看IgY的资料，想问一个问题，所有产蛋鸡都可以用于表达IgY多抗吗？还是像小鼠多抗制备一般用BALB/c ，IgY制备也有比较常用或特定的蛋鸡品系。

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-10 13:00

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您好，我最近刚开始看IgY的资料，想问一个问题，所有产蛋鸡都可以用于表达IgY多抗吗？还是像小鼠多抗制备一般用BALB/c ，IgY制备也有比较常用或特定的蛋鸡品系。 ...

上学那会做过这个玩意，就是用普通家养的鸡，所谓的笨鸡哈

不记得有什么特别的讲究，不过可以查下文献资料

作者: PINK 时间: 2013-5-10 13:01

我有一个抗体，真核分泌表达，用分泌上清测亲和力比用proteinA纯化后的要高，这是什么原因啊？是不是洗脱过程中失活了？先谢谢啦~

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-10 13:02

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我有一个抗体，真核分泌表达，用分泌上清测亲和力比用proteinA纯化后的要高，这是什么原因啊？是不是洗脱过程中失活了？先谢谢啦~

失活有可能

不过我另外更担心的是：你的抗体所在的缓冲液内是不是有某种组分对你的测活有直接影响，比如tris

作者: PINK 时间: 2013-5-10 13:02

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失活有可能

不过我另外更担心的是：你的抗体所在的缓冲液内是不是有某种组分对你的测活有直接影响，比如tris

哦，tris会影响抗体的活性吗？我确实用的是tris的缓冲液，那我换PBS试试
还有就是我甘氨酸洗脱后用了pH8.5的tris中和了，这个会不会有影响呀

作者: xingyi08 时间: 2013-5-10 13:03

你好。有个问题请教：
单抗经过胃蛋白酶酶切后，产物经非还原SDS-PAGE如下:

左边三个孔分别是不同的上样浓度，左边最高，依次递减，MARKER在最右边，分子量已在图上标出。
我的目标物是110kd左右的F(ab)2片断，但还有很多其他的杂带(70多kd，50kd左右，40kd左右)，用分子筛(sephadex G-200)可以吗？可否推荐一个适用的纯化分离的方法？谢谢！

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16145

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-10 13:04

哦，tris会影响抗体的活性吗？我确实用的是tris的缓冲液，那我换PBS试试
还有就是我甘氨酸洗脱后用了pH8.5的tris中和了，这个会不会有影响呀

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tris 本身对抗体没什么影响，但是有些测活反应需要在合适的缓冲体系下，比如合适的盐离子种类，浓度，pH.

tris不一定就是合适的那个

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-10 13:04

你好。有个问题请教：
单抗经过胃蛋白酶酶切后，产物经非还原SDS-PAGE如下:

左边三个孔分别是不同的上样浓度，左边最高，依次递减，MARKER在最右边，分子量已在图上标出。
我的目标物是110kd左右的F(ab)2片断，但还有很多其他的杂带(70多kd，50kd左右，40kd左右)，用分子筛(sephadex G-200)可以吗？可否推荐一个适用的纯化分离的方法？谢谢！

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为什么跑电泳的时候不加一个没有酶切过的阴性对照呢？
如果有可能买到阳性对照，那就更好了

做实验的时候，把阴性对照和阳性对照放在一起比较，就容易看出问题

作者: summerxx 时间: 2013-5-10 13:05

想问下楼主，我准备用DEAE-sephadexA-50纯化IgY，可是我的柱子是比较粗的，可以先拿来使用吗？如果不行的话，我应该选择什么规格的层析柱。还有我应该选择怎样的平衡液和洗脱液比较好呢？

作者: 89tongzijun 时间: 2013-5-10 13:05

抗体纯化，历久弥新，

作者: ritou1985 时间: 2013-5-10 13:07

搜索了下帖子，除了疏水，现在还有什么比较有效的方法能够将牛igg给去除的？另外样品中含有硫酸铵，直接上proteinA，有影响吗？

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Protein L填料不结合牛的IgG，对于你的应用比较适合。

作者: hyuu 时间: 2013-5-10 13:07

rproteinA有时候会结合在抗体的Fab片段上，是否是在VH3区域。如果VH3是单链状态，是否还是可以结合呢？

作者: ritou1985 时间: 2013-5-10 13:08

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原帖由 hyuu 于 2013-5-10 13:07 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
rproteinA有时候会结合在抗体的Fab片段上，是否是在VH3区域。如果VH3是单链状态，是否还是可以结合呢？

我想应该是可以结合的，但暂时没有数据。

作者: 2541 时间: 2013-5-10 13:08

请问一下蒜泥兄，为什么腹水做WB合格后，再用ProteinG 进行纯化，用纯化的抗体作WB的效果反而没有腹水好呢？抗体纯化后SDS-PAGE检测，纯度很高，浓度大概有2mg/ml左右，作WB时按1：1000稀释的。望解答，多谢

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-10 13:09

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原帖由 2541 于 2013-5-10 13:08 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请问一下蒜泥兄，为什么腹水做WB合格后，再用ProteinG 进行纯化，用纯化的抗体作WB的效果反而没有腹水好呢？抗体纯化后SDS-PAGE检测，纯度很高，浓度大概有2mg/ml左右，作WB时按1：1000稀释的。望解答，多谢 ...

理论上说不通

protein A或者G纯化腹水都是为了提纯IgG本身

我有两个看法，供你参考
1，抗体如果是2mg/ml的纯特异性单抗，1:1000做的WB，条带应该是强到一大团，一般人家卖的商业化单抗，一般弄得浓度都是x-xxx ug/ml级别的

2，如果纯化后的单抗，做WB效果不如腹水好，排除WB实验本身的原因，那应该是在后续的样品处理，纯化，样品保存着几个环节出了问题

自己好好回想下实验过程，把每个步骤的样品都留起来，一起做WB或者ELISA对照

祝好运

作者: 2541 时间: 2013-5-10 13:09

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原帖由 蒜泥面条 于 2013-5-10 13:09 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

理论上说不通

protein A或者G纯化腹水都是为了提纯IgG本身

我有两个看法，供你参考
1，抗体如果是2mg/ml的纯特异性单抗，1:1000做的WB，条带应该是强到一大团，一般人家卖的商业化单抗，一般弄得浓度都是x-xxx ug/ml级别的

...

抗体浓度大但不一定活性高啊，在公司我是专门负责抗体纯化的，一般同时纯化几种腹水，当然腹水WB都是合格后才纯化的，纯化后的抗体有的做WB效果是比腹水效果好，但有些确不如腹水，所以我们公司有些抗体也只能以腹水的形式卖了，谢谢你的回答，我也会做相关原因的排除，再次感谢

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-10 13:10

抗体浓度大但不一定活性高啊，在公司我是专门负责抗体纯化的，一般同时纯化几种腹水，当然腹水WB都是合格后才纯化的，纯化后的抗体有的做WB效果是比腹水效果好，但有些确不如腹水，所以我们公司有些抗体也只能以腹水的形式卖了，谢谢你的回答，我也会做相关原因的排除，再次感谢
"抗体浓度大但不一定活性高啊"

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理论上同一个特异性抗体的浓度和活性成正比，这是定律，如果事实不是这样，那肯定是实验有问题了

建议把上柱前的腹水原液，过柱后的流穿液，纯化出的抗体，阴性，阳性对照，这些排在一起做WB和ELISA

比对结果后就比较分析

作者: daod 时间: 2013-5-10 13:10

你好。有个问题请教：
单抗经过胃蛋白酶酶切后，产物经非还原SDS-PAGE如下:

左边三个孔分别是不同的上样浓度，左边最高，依次递减，MARKER在最右边，分子量已在图上标出。
我的目标物是110kd左右的F(ab)2片断，但还有很多其他的杂带(70多kd，50kd左右，40kd左右)，用分子筛(sephadex G-200)可以吗？可否推荐一个适用的纯化分离的方法？谢谢！

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Phenyl 疏水是通用方法

作者: kuohao17 时间: 2013-5-10 13:11

最近要做抗原亲和纯化，请问蒜泥兄有相关资料吗？主要是关于如何将抗原偶联到树脂的相关资料

作者: ladyhuahua 时间: 2013-5-10 13:11

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原帖由 kuohao17 于 2013-5-10 13:11 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
最近要做抗原亲和纯化，请问蒜泥兄有相关资料吗？主要是关于如何将抗原偶联到树脂的相关资料

建议使用NHS偶联，条件温和，相比溴化氰活化，NHS形成的化学键稳定性更好，同时避免非特异离子作用。

作者: 蒜泥面条 时间: 2013-5-10 13:12

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NHS 环氧活化的填料都可以使用

具体还是要看你的抗原的属性

作者: 上海丰核 时间: 2014-9-5 21:13 标题: 回复 #1 蒜泥面条的帖子

抗体纯化方面，看来楼主经验很丰富！

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