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标题: 【求助】Western blot实验加入发光底物后未见光... [打印本页]

作者: flower@@ 时间: 2013-5-11 10:57 标题: 【求助】Western blot实验加入发光底物后未见光...

高人求助！

最近做western blot总是很不稳定，同样条件有时出有时不出结果，不知道什么原因？

前几天做了一便，曝光后结果很好。昨天又做了一遍，今天曝光后白板，很郁闷~

具体步骤如下：

目标蛋白：38kd

1,12%分离胶， 5%浓缩胶
2，电泳浓缩胶 80V电泳10min

分离胶120V电泳1h20min
3，电转 120V电转1h
5,封闭 5%脱脂牛奶室温封闭1h
6,一抗 0.5%脱脂牛奶(TBST配) 1: 1000 (推荐浓度为1:2000）稀释 4°摇床过夜
TBST 10min x2,TBS10min x1

7，二抗 0.5%脱脂牛奶(TBST配) 1: 2000 室温1h

TBST 10min x2,TBS10min x1

发光液1:1混合后覆盖于膜上，暗室曝光，结果:胶片无任何条带影像，白板一块，原因不明？

附注：一次跑的四块胶，转四张膜，一抗二抗四张膜都同时进行。之前做过一批四张膜结果很好，这次按上次同样流程走，却结果什么都没有。发光底物反应后暗室下未见荧光，另外排除二抗及发光底物，以及显影定影胶片的问题。转膜估计问题也不大，本然猜测是不是在封闭-一抗-二抗或者哪个没有注意到的细节上出了问题，请高人指点！

作者: fei1226com 时间: 2013-5-11 10:58

你一抗过夜是怎么弄的？是不是抗体效价降低了？

作者: flower@@ 时间: 2013-5-11 11:00 标题: 回复 #2 fei1226com 的帖子

一抗孵育连同摇床一起放在4°冰箱过夜。前两天一抗也按这个比例做的，结果挺好，不知道怎么再同样条件做就出不了

作者: yonger 时间: 2013-5-11 11:00

是不是转膜没转过去啊？

作者: yonger 时间: 2013-5-11 11:01

可能是没封闭好！

作者: ritou1985 时间: 2013-5-11 11:02

跟封闭没关系，如果没封闭好的话应该是黑板，而不是白板。只有两个原因，要么是转膜，要么是一抗

作者: flower@@ 时间: 2013-5-11 11:03

跟封闭没关系，如果没封闭好的话应该是黑板，而不是白板。只有两个原因，要么是转膜，要么是一抗

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转膜应该问题不大吧，预染Marker也转过去了啊。TBST是酸性的会有影响吗？我买的TBST是配好的10x的，稀释10倍用的。

作者: wmp1234 时间: 2013-5-11 11:04

我师兄也是这样~~~后来找到问题了,是一抗的事. 我们一抗回收用的，但是储存在4度，坏了~~

用了新的一抗，出片了。

作者: 66+77 时间: 2013-5-11 11:07

有可能是你用的一抗是回收抗体，效价不行了，

也有可能是你的蛋白降解了，你转完膜以后用丽春红染过膜没有？看你的蛋白是不是转膜成功？

作者: flower@@ 时间: 2013-5-11 11:09

我师兄也是这样~~~后来找到问题了,是一抗的事. 我们一抗回收用的，但是储存在4度，坏了~~

用了新的一抗，出片了。

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希望是吧，今天重新配了一抗孵育了，明天看结果。

作者: flower@@ 时间: 2013-5-11 11:09

有可能是你用的一抗是回收抗体，效价不行了，

也有可能是你的蛋白降解了，你转完膜以后用丽春红染过膜没有？看你的蛋白是不是转膜成功？

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转膜没问题，用丽春红染过，转膜效果很好。今天重新配一抗孵育，明天看看结果。

作者: flower@@ 时间: 2013-5-11 11:11

昨天重新加大一抗浓度孵育了，今天曝光结果还是白板，天理何在呀？！！

作者: greenbee 时间: 2013-5-11 11:11

建议还是再检查下二抗吧，白板的话多半还是抗体的问题

作者: H2O 时间: 2013-5-11 11:12

总结下，几种情况：

一抗的问题，不建议回收使用，如果连续做可以。

蛋白丰度太低，如果目标蛋白是非磷酸化蛋白也比较好做，建议改用Dura显色试试，提高检测灵敏度。

检测TBST的PH值，过高会导致曝光出白板。

祝你好运！

作者: flower@@ 时间: 2013-5-11 11:15

建议还是再检查下二抗吧，白板的话多半还是抗体的问题

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二抗没问题的，稀释后的二抗与ECl工作液能立即发光，做了一抗二抗点杂交也没有问题的。

作者: flower@@ 时间: 2013-5-11 11:18

总结下，几种情况：

一抗的问题，不建议回收使用，如果连续做可以。

蛋白丰度太低，如果目标蛋白是非磷酸化蛋白也比较好做，建议改用Dura显色试试，提高检测灵敏度。

检测TBST的PH值，过高会导致曝光出白板。

祝你好运！

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一直怀疑是TBST的ph值问题，我测得的我的TBST是酸性的，之前有听说过这个会曝出白板，不知道是不是。给调了PH值重新做了，等结果。

作者: IAM007 时间: 2013-5-11 11:18

酸性不会影响很大，要是碱性偏大的话很大程度上会是白板的，再试试吧。

作者: flower@@ 时间: 2013-5-11 11:18

TBST的ph值调了，重做，仍然白板，连可曝光的Marker也没出，何故？究竟何故？？？

作者: jkobn 时间: 2013-5-11 11:21

你试试降低一抗的稀释比（从1:1K降到1:500到1:250到。。。），摸索到一个可以标出信号的条件。此时，由于一抗浓度过高，背景可能非常高，但背景的问题可以再调整，有没有特异性条带却没办法改变；实在没有靶蛋白的信号，只能更换别的公司生产的抗体。

顺便问下，你做的是什么目标蛋白？

作者: flower@@ 时间: 2013-5-11 11:22

QUOTE:

原帖由 jkobn 于 2013-5-11 11:21 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你试试降低一抗的稀释比（从1:1K降到1:500到1:250到。。。），摸索到一个可以标出信号的条件。此时，由于一抗浓度过高，背景可能非常高，但背景的问题可以再调整，有没有特异性条带却没办法改变；实在没有靶蛋白的信号，只能更换别的公 ...

做的是线粒体中的一个蛋白，MT-CO1，买的abcam公司的，推荐稀释比为1:2000,之前预实验1:2000出过，后来正式试验1:1000也做出来过挺好。但最近就一直不出了。而且曝光的片子都是白板，连背景都没有。

作者: redbutterfly 时间: 2013-5-11 11:23

做的是线粒体中的一个蛋白，MT-CO1，买的abcam公司的，推荐稀释比为1:2000,之前预实验1:2000出过，后来正式试验1:1000也做出来过挺好。但最近就一直不出了。而且曝光的片子都是白板，连背景都没有。

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你的抗体实验间隔时间长么，会不会由于长菌效价降低太多了，你再试试看看最小稀释比例能否出条带，先把黑板做出来再降低背景吧。

作者: redbutterfly 时间: 2013-5-11 11:33

做的是线粒体中的一个蛋白，MT-CO1，买的abcam公司的，推荐稀释比为1:2000,之前预实验1:2000出过，后来正式试验1:1000也做出来过挺好。但最近就一直不出了。而且曝光的片子都是白板，连背景都没有。

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你现在提取蛋白的方式和你之前做的提取的蛋白是一样的么，线粒体中的蛋白要不要特别的提取方法的？

作者: flower@@ 时间: 2013-5-11 11:34

QUOTE:

原帖由 redbutterfly 于 2013-5-11 11:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
做的是线粒体中的一个蛋白，MT-CO1，买的abcam公司的，推荐稀释比为1:2000,之前预实验1:2000出过，后来正式试验1:1000也做出来过挺好。但最近就一直不出了。而且曝光的片子都是白板，连背景都没有。

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是一样的，都是买的专门的试剂盒提的，线粒体蛋白提取方法跟全细胞蛋白是不太一样。这个抗体因为后来一直不出，已经用的差不多了，之前做过一个1:500也没出。稀释比再降低的话，估计就不过用了。还是有点怀疑TBST的问题，不知道这个问题大不大。TBST之前是酸性的6.8，后来换了之后，做了后也没出来，测PH值发现调过了到7.8了。我猜想是不是TBST的PH值这个原因？另外我不知道PVDF膜是不是有赝品，或者说有好多类型的？

作者: redbutterfly 时间: 2013-5-11 12:41

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原帖由 flower@@ 于 2013-5-11 11:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

是一样的，都是买的专门的试剂盒提的，线粒体蛋白提取方法跟全细胞蛋白是不太一样。这个抗体因为后来一直不出，已经用的差不多了，之前做过一个1:500也没出。稀释比再降低的话，估计就不过用了。还是有点怀疑TBST的问题，不知 ...

PVDF膜正式公司买的话一般不会有什么问题的，就是你将TBST的Ph值再好好调准做一下，如果还是不行的话就是抽提试剂盒和一抗的问题了。

作者: flower@@ 时间: 2013-5-11 12:41

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原帖由 redbutterfly 于 2013-5-11 12:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

PVDF膜正式公司买的话一般不会有什么问题的，就是你将TBST的Ph值再好好调准做一下，如果还是不行的话就是抽提试剂盒和一抗的问题了。

今天又重做了，从转膜开始，除了一抗二抗其他全部试剂缓冲液都用的我一个同学的，这个同学之前做出过结果。明天看结果。

作者: KGZ564 时间: 2013-5-11 12:42

ABcam的抗体已经另人伤心很多次了。我先前一个抗体，说明书推荐1:1000，到最后连阳性对照蛋白都要1:250才能做出来，严重怀疑抗体效价。从此以后就尽量不买abcam了

作者: flower@@ 时间: 2013-5-11 12:43

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原帖由 KGZ564 于 2013-5-11 12:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

ABcam的抗体已经另人伤心很多次了。我先前一个抗体，说明书推荐1:1000，到最后连阳性对照蛋白都要1:250才能做出来，严重怀疑抗体效价。从此以后就尽量不买abcam了 ...

abcam好像相对还行，你要买了santa的就会发现更无语了。不过这个估计跟批次和不同的抗体有关系吧，也不能一概而论！

作者: flower@@ 时间: 2013-5-11 12:43

今天中午western blot曝光了，出结果了，目标条带出来了。虽然背景不怎么好看，但总算不是白板了。转膜缓冲液和TBST都是用的同学的，初步推测就是PH值的问题。缓冲液的PH很重要！还有对于那些及其不严谨的试剂公司表示强烈鄙视和严厉指责！害人不浅啊！

作者: zranqi_1 时间: 2013-5-11 12:43

真不容易，那看来是试剂的问题了？我现在也面临相似的问题。我刚开始做western，先显actin 练手，开始一直是白板，偶尔压10分钟会有浅浅的一条带，开始怀疑TBS的PH 问题，换了我师兄的试剂做结果还是不稳定，后来偶然发现我跟他们用的ECL不是一套，我的那个可能时间长了效价降低了。但现在我用新的ECL做，所有的条件跟我师兄的都是一样的，我的actin还是浅，结果也不稳定，老板很不满意，我自己更是相当郁闷，真是不明白。我师兄也帮我重复过实验，用的条件都是一样的，他们能显出来，说明一抗、二抗应该没问题。但其实我一直怀疑是一抗的问题，因为这个一抗是08年分装的，每管5ul，而且最终应用液是1:100万稀释。但既然人家都能做出来，应该就不是这个原因了。真的很崩溃。

作者: flower@@ 时间: 2013-5-11 12:44

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原帖由 zranqi_1 于 2013-5-11 12:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

真不容易，那看来是试剂的问题了？我现在也面临相似的问题。我刚开始做western，先显actin 练手，开始一直是白板，偶尔压10分钟会有浅浅的一条带，开始怀疑TBS的PH 问题，换了我师兄的试剂做结果还是不稳定，后来偶然发现我跟他们用 ...

你的actin的一抗稀释比是1:100万吗，不知道是什么公司的，我没听说过用这么大稀释比做的。白板或者条带浅的原因很很多：

1，蛋白浓度不够或者说总蛋白目的蛋白含量不够,

2，转膜不充分，

3，封闭过度，

4，一抗或者二抗失效或者稀释比太大

5，ECL发光底物效价降低或者失效

6，缓冲液及TBST的PH值问题也值得注意，这个好像比较少有人提到。洗膜也不要太过度。另外显影液定影液用的次数过多过久失效，也会出现条带很浅的情况，我自己以前也出过这个问题。

根据你的说法，我觉着你师兄能做出来，你没出，那么条件肯定有不一样的地方。内参还是比较好做的，你自己仔细想想找找不同的地方，一定能做出来的，加油！

作者: u234 时间: 2013-5-11 12:45

你的skim-milk里面有没有加其他成分？

作者: flower@@ 时间: 2013-5-11 12:45

老问题又来了！好久没有出白板了，今天做又出白板了。条件没有变，可以什么都没有做出。打电话给抗体技术支持，解答得比较官方。说可能是封闭或者抗体浓度不够，但问题是我同意的条件做出来过呀。蛋白转膜我相信都是没有问题的，有些怀疑蛋白一抗二抗之间的结合问题，但非常不明白，为什么同意的条件，有时候有有时候没有。没有的时候白板，背景都没有。我想是不是还有哪些操作细节没有注意到忽略了，还是有其他原因？课题时间紧张，拜求高人指点！

作者: rxcc33 时间: 2013-5-11 12:46

技术问题，有专人带下最好。既然是白板，就有必要把一抗二抗浓度提升一倍试试看吧。

作者: mamamiya 时间: 2013-5-11 12:47

我也遇到和楼主相同的问题，但是相同的条件，仪器，液体，一抗，二抗。。。别人都能跑出来，我一个月前也能跑出来，但是现在好多次都是白板。。。求解的啊~~~~~

作者: flower@@ 时间: 2013-5-11 12:47

技术问题，有专人带下最好。既然是白板，就有必要把一抗二抗浓度提升一倍试试看吧。

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这个蛋白我做出来过，同样的条件。以前也出过白板，调一抗不起作用，一旦出了白板，这张膜striping后再做内参或者任何其他蛋白也不会出，都是白板。

作者: flower@@ 时间: 2013-5-11 12:48

我也遇到和楼主相同的问题，但是相同的条件，仪器，液体，一抗，二抗。。。别人都能跑出来，我一个月前也能跑出来，但是现在好多次都是白板。。。求解的啊~~~~~

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同一个问题，我想各自答案可能不一样，一方面高人求解，一方面自己分析找原因吧，毕竟自己的实验操作步骤自己最了解，加油！

作者: zwsyrt 时间: 2013-5-11 12:48

这个蛋白我做出来过，同样的条件。以前也出过白板，调一抗不起作用，一旦出了白板，这张膜striping后再做内参或者任何其他蛋白也不会出，都是白板。

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一般来讲，白板的原因很多，但其中最可能的原因有下面几个，依次为：
1，二抗浓度不够
2，一抗浓度不够
3，转膜出了问题
4，ECL出了问题

你也说了，自己的实验自己清楚，你自己去排查吧。

作者: junhun 时间: 2013-5-11 12:49

按照Lz的说法，结合我们这边的经验分析，认为应该是转膜的问题的。38kd的目的蛋白，为什么要120v转1h。很是不明白LZ是根据什么条件选择的这样的转膜条件。
跟大家分享下，我们的做法。半干转的话，1KD转1min，以此类推，15v。湿转的话。12v过夜。
另外，没有条带的原因还有蛋白样品存放时间过长或者反复冻融次数过多造成蛋白降解、上样量太少，蛋白量低于检测抗体的检测低限、洗涤时间过长、抗体效价过低和加入显色底物和观察曝光结果的间接时间过长等等，都会造成无条带的现象。
以上仅供LZ参考。

作者: flower@@ 时间: 2013-5-11 12:49

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原帖由 junhun 于 2013-5-11 12:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
按照Lz的说法，结合我们这边的经验分析，认为应该是转膜的问题的。38kd的目的蛋白，为什么要120v转1h。很是不明白LZ是根据什么条件选择的这样的转膜条件。
跟大家分享下，我们的做法。半干转的话，1KD转1min，以此类推，15v。湿转 ...

感谢分析，最近也在怀疑转膜的问题。我们是湿转，过夜转没有试过，兄台的意思任何分子量的湿转都是可以12V过夜是吗？

作者: 101010 时间: 2013-5-11 12:50

感谢分析，最近也在怀疑转膜的问题。我们是湿转，过夜转没有试过，兄台的意思任何分子量的湿转都是可以12V过夜是吗？

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我们这这边现在大部分都是湿转。另外，就是要根据你的蛋白大小选择膜的孔径。

作者: INK 时间: 2013-5-11 12:50

我的情况和楼主相似，白板，而且结果不稳定

作者: INK 时间: 2013-5-11 12:52

把一抗，二抗再加一遍，说不定可以

作者: 987789 时间: 2013-5-11 12:52

我也是刚做western,做了大概5次，我是同时做两个分子量的蛋白，一个106kd,一个33kd,切胶以后，同时转膜，电泳65v 30min ,120 1.5h,转膜条件是250ma 1.5h ,配的是12%的分离胶和5%的浓缩胶，转膜以后marker也比较清楚啊，但就是目的蛋白是白板，两个都是，内参很清楚，不知是什么原因啊，抗体是刚到的，应该没问题吧，急人啊，***高人帮助

作者: flower@@ 时间: 2013-5-11 12:54

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原帖由 987789 于 2013-5-11 12:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我也是刚做western,做了大概5次，我是同时做两个分子量的蛋白，一个106kd,一个33kd,切胶以后，同时转膜，电泳65v 30min ,120 1.5h,转膜条件是250ma 1.5h ,配的是12%的分离胶和5%的浓缩胶，转膜以后marker也比较清楚啊，但就是目 ...

感觉电泳和转膜条件应该是没什么问题的，切胶可以改到转完膜后切膜，250ma也可以调到300ma，不过应该问题不大。具体原因：1，蛋白提取问题，可能总蛋白含量还行，但目的蛋白含量太少。可以提高上样量试一试。2，一抗浓度是否足够，做几个梯度。加大浓度试一试。3，一抗二抗抗原抗体性质别弄错了。一抗二抗结合问题可以在封闭前点一个一抗点试一试。4其他原因，孵育时间充分否，TBST别洗得太长了，还有可以延长曝光时间。

作者: u76mp 时间: 2013-5-11 12:54

我也出现了同样问题希望快点有高人来指点一下

作者: 我佛慈悲 时间: 2013-5-11 12:55

我也很悲催，同时孵育4种不同抗体，全部都是白板，我就不相信是我一抗或二抗同时都出了问题（二抗用两种，也是才配没多久），换了三种ECL都曝光不出来，为了这个结果是耗时又耗钱啊！

作者: 04906 时间: 2013-5-11 12:55

我也很悲催，同时孵育4种不同抗体，全部都是白板，我就不相信是我一抗或二抗同时都出了问题（二抗用两种，也是才配没多久），换了三种ECL都曝光不出来，为了这个结果是耗时又耗钱啊！

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把你的抗体货号，条件说下

作者: H2O 时间: 2013-5-11 12:55

LZ 你确定PVDF膜的反正面没有搞混么？如果搞混把ECL放到另一面基本就是白板，要不多多少少会有些背景的。

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