分析测试百科

标题: 【求助】蛋白的点杂交 [打印本页]

作者: bohe221 时间: 2013-5-11 13:22 标题: 【求助】蛋白的点杂交

求助！蛋白的点杂交。
只能搜到DNA和RNA的点杂交protocol，求教如何做蛋白的点杂交。
请各位指教，谢谢！

作者: hulu呼噜 时间: 2013-5-11 13:22

不知道战友求助的是哪方面，如果是研究mRNA表达蛋白的点杂交，少量的话要用到His-tag以及地高辛抗体，这个在分子克隆指南里面有，就不多说了，大量的话要用蛋白芯片，即多个蛋白的点杂交，这个现在相关文献也很多。
如果研究蛋白和它抗体的点杂交的话，那就是DIBA（dot immune blot assay），就是把你的蛋白点到NC膜上，然后加一抗，加二抗，其实就是一个Dot-ELISA，用DAB显色，效果很好的。
希望可以解决你部分问题

作者: yes4 时间: 2013-5-11 13:23

我也正需要了解这方面的内容，请问点样至NC膜后，如何干燥和固定好呢？

作者: 7437654 时间: 2013-5-11 13:23

将待检蛋白用包被液稀释，用微量加样器点于硝酸纤维素膜（NC）上，置于37℃（此步要干燥备用的话可以用70°）经1h，将NC浸于1％BSA－PBS中封闭，室温摇荡1小时，洗涤3次，加抗体，37°1h后洗涤3次，加二抗，1小时后，洗涤3次后，加DAB

作者: yes4 时间: 2013-5-11 13:24

谢谢。还请问这里的包被液指的是一般ELISA使用的包被液吗？还有，封闭液用加BSA的TBST可以吗？

作者: pengke1983 时间: 2013-5-11 13:24

是的，就是这些东西。
不过，我也直接把溶解的蛋白质点到膜上过，室温下干燥，以后步骤相同，结果也杂出来了。

==================================================================

谢谢。还请问这里的包被液指的是一般ELISA使用的包被液吗？还有，封闭液用加BSA的TBST可以吗？

作者: bamboo16 时间: 2013-5-11 13:24

我们的方法是先把NC膜在转膜缓冲液中泡15min，然后室温晾干15min,把蛋白直接点在膜上，晾干10min,封闭、孵一抗二抗，曝光，就可以了

作者: xueyouzhang 时间: 2013-5-11 13:25

将待检蛋白用包被液稀释，用微量加样器点于硝酸纤维素膜（NC）上，置于37℃（此步要干燥备用的话可以用70°）经1h，将NC浸于1％BSA－PBS中封闭，室温摇荡1小时，洗涤3次，加抗体，37°1h后洗涤3次，加二抗，1小时后，洗涤3次后，加DAB

=============================================================

请问：一抗二抗的配制液体是否和封闭液一样？还有，封闭用5%脱脂奶粉行吗？

作者: bohe221 时间: 2013-5-11 13:26

请问：一抗二抗的配制液体是否和封闭液一样？还有，封闭用5%脱脂奶粉行吗？

====================================================================================

一抗二抗的配制液体可以用TBS-T，也可用10%脱脂奶粉（注意奶粉容易变质，影响结果），封闭液是10%脱脂奶粉。

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)