分析测试百科

标题: 【求助】杆状病毒——昆虫细胞蛋白表达系统... [打印本页]

作者: ffaa 时间: 2013-5-11 15:33 标题: 【求助】杆状病毒——昆虫细胞蛋白表达系统...

相关疾病：
感染
不知道有多少人成功用杆状病毒——昆虫细胞表达系统成功进行过蛋白表达？我最近表达一段病毒的非结构蛋白nsp-6，构建的重组Bacmid质粒经PCR鉴定正确，可是进行表达时，却未见蛋白表达，同时进行的试剂盒对照（含CAT基因的重组细胞中则有较好的表达。
我听说约有70%的蛋白在原核表达系统中是不表达的，但不知道这样的情况会不会发生在我用的昆虫细胞表达系统，除了实验操作失误方面的原因，还有什么因素是不使蛋白表达的，请大家讨论一下。

下面是我的实验过程，请高手指教，同时希望也给新手一个指导吧（我使用的是Invitrogen的产品，具体说明书大家可以参照Invitogen操作手册cuturl('http://www.invitrogen.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf')）：

The genes of nsp-6 was cloned into BamHI and EcoRI sites of the pFastBac HTA vector, then the ligation reaction was transformed into DH10B and selected for ampicillin-resistant transformants (LB plates, ampicillin 100μg/ml); The constructed pFastBac vector was transformed into DH10Bac E.coli for transposition into the bacmid,  blue/white selection was used to identify colonies containing the recombinant bacmid and the bacmid was also analyzed by PCR with the M13 primers. Once the recombinant bacmid was confirmed, it was ready to transfect insect cells.
Sf9 were maintained in TNH-SFM complete medium。
抱歉该段未翻译成中文。

实验材料：
1.  重组杆状病毒质粒：Bacmid/nsp-6及阳性对照Bacmid/CAT，已构建成功。
2.  昆虫细胞Sf9、High Five及其相关培养基、转染试剂均购自Invitrogen公司。抗His单克隆抗体购自Oncogene公司，CAT-ELISA试剂盒购自 Roche。
实验步骤：
一、  昆虫细胞转染：
1．  Sf9细胞计数，取6孔板中的两孔，每孔加入9×10 5个细胞(其中一孔设为正常对照)，并以全培培养至少1小时，使细胞贴壁。
2．  准备重组质粒和细胞转染试剂的混合物：
a.  溶解1μg纯化重组杆状病毒重组质粒于100μl 无添加成分的Grace’s Medium。
b.  转染试剂充分摇匀后取6μl加入100μl 无添加成分的Grace’s Medium，混匀。
c.  将上述稀释好的质粒及稀释好的转染剂混匀，室温孵育20min。
3．  重组质粒与转染剂混合液孵育的同时，以2ml无添加成分的Grace’s Medium洗涤待转染的一孔细胞并弃去洗液。
4．  取0.8ml无添加成分的Grace’s Medium加入质粒与转染剂的混合液中，轻轻混匀后，总体积约为1ml。加入上步洗涤后的细胞孔中，27℃继续培养5h。
5．  移除质粒、转染剂混合物，加入2ml全培。27℃湿盒孵育，直到病变现象产生。
二、  病毒贮液的制备：
1.  病毒感染晚期（正常24-72h）可见细胞停止生长、黏附，呈颗粒状外观。即收集含病毒的培养上清，500g离心5min，去除细胞和碎片。
2.  上清即为P1病毒贮液，移入新的离心管中4℃避光保存。长期保存分装冻存于-80℃。
3.  病毒贮液的扩增，按以下公式进行所需病毒P1贮液的量：

感染所需病毒贮液量(ml)=
[MOI(pfu/cell) ×细胞数÷病毒贮液效价(pfu/ml)]
注：若不进行病毒空斑测定，P1贮液效价按照1×10 6到1×10 7计。

4.  扩增P1液制备P2病毒贮液方法如下：
a.  转染当天，取2×106个细胞/孔加入六孔板中，贴壁生长至少1h。
b.  每孔加入适量的P1贮液，27℃湿盒孵育48h。
c.  根均细胞病变情况（约48h后）收集各孔中的病毒上清液，500g离心5min取上清，即为P2病毒贮液。4℃避光保存。长期保存分装冻存于-80℃。
d.  制备了高效价的P2液后，按上述方法扩增P3贮液，用于高效表达。

三、  病毒贮液初步鉴定
1.  SDS-PAGE蛋白电泳：取P2或P3病毒贮液浓缩后上样（或直接上样）进行SDS-PAGE蛋白电泳，初步根据分子量对表达蛋白进行鉴定。 CAT-his融合蛋白分子量约为28KDa，nsp6-his融合蛋白分子量约为34KDa。
2. western blot：以小鼠抗his单克隆抗体鉴定在相应条带出是否有his标记。
3.  以CAT-ELISA检测试剂盒检测Bacmid/CAT对照的蛋白表达情况。方法详见CAT-ELISA试剂和说明书。

结果
1. CAT-ELISA检测试剂盒成功检测出对照CAT质粒在细胞中的表达，同时可测于上清和细胞中。
2. 蛋白电泳和免疫印迹均看见对照his-CAT蛋白表达，但不见我想表达的非结构蛋白his-nsp-6。

在接下来的这段时间里，一直在进行条件的摸索，现在把这段时间的结果报告一下：
1. 利用细胞DNA提取试剂盒提取感染细胞的DNA，用针对目的基因的特异性引物以PCR的方法鉴定，发现结果呈阳性，表明该质粒成功转染，但为何不表达，仍需摸索。
2.根据上述结果，在后续的实验当中发现用感染的细胞涂片，使用特异性针对目的蛋白的抗体做免疫荧光鉴定，发现呈阳性，这一点证实转染的质粒成功且有蛋白表达，问题是为什么表达量如此低，以至于免疫印迹检测不出来？

下一步将要进行的工作是，摸索如何提高蛋白表达量的方法，使用空斑纯化获得较纯的病毒不知道能不能提高蛋白表达量？这一点，也请有经验的站友给与指导，谢谢！

作者: remenb 时间: 2013-5-11 15:34

你的实验过程我没有发现问题，具体原因真的难说。在BEVS系统中，Bac-to-Bac不是最有效的,我觉得没必要选择穿梭，效率低。你可以用pBacPAK或者诸如此类的载体，直接用线性化野生病毒去转染。
你的实验过程绝对没问题，重组Bacmid你也鉴定了，那说明转座没有问题。而后的共转染也没问题，因为你的sf细胞看到了明显的病变，多角体也出现了。最好，你把p1和p2的病毒上清液以100 000 g超速离心30min并取其沉淀，用TE缓冲液悬浮后经蛋白酶K 37 ℃消化2 h，再经酚、酚-氯仿、氯仿抽提后用乙醇沉淀浓缩，以其为模板进行PCR鉴定。这样就可以完全放心，排除这之前的问题。
如果鉴定正确，你就只从SDS-PAGE排除问题就可以了。是不是低表达的缘故？我觉得你SDS-PAGE技术肯定没有问题，因为你对照已经出来了。你可以增加sample量看看。最好一个个排除，试验就是这样，别急。
如果有什么其它问题，我们可以在这里讨论。祝顺利，早日得到结果。

作者: ffaa 时间: 2013-5-11 15:35

顺便问一下P1或P2液取多少进行DNA抽提，方便的话，能不能将抽提具体方法在这里贴出来，让我和其它站友多一个学习的机会。

作者: remenb 时间: 2013-5-11 15:35

我不知道你病毒的滴度，至于体积我想不成问题。你可以多制备点，反正是病毒繁殖，3天肯定发病，一般10毫升就行了。8000rpm离心10min，上清液用sw-27转子（Bechman）24000rpm超离30min，将沉淀的病毒粒子悬于1ml TE中，加蛋白酶K至终浓度50微克/微升，50度水浴2小时，再加Sarkosel至终浓度1%(根据本人经验，没有就可以不加），50度水浴2小时；用等体积饱和酚，氯仿/异戊醇各抽提一次，12000rpm离心5min,上清液加入2.5倍95%冷乙醇，DNA沉淀后，3000rpm离心10min,70%乙醇洗，溶于0.1乘TE中，电泳检查，4度放置。

作者: dongdongqiang 时间: 2013-5-11 15:36

我正在用Invitrogen公司Bac-to-Bac® Baculovirus Expression System表达目的蛋白,构建好穿梭质粒pBACmid后,在转染入昆虫细胞sf21时碰到极大困难,经多次试验仍然无法成功转染.所用转染试剂CELLFECTIN、细胞sf21、需血清培养基Grace’s Insect Cell Culture Medium（PAA公司"GOLD" defined Foetal Bovine ）、无血清培养基Sf-900 II SFM都为Invitrogen公司新购产品（FBS除外，为PAA公司）。
转染完全按照公司所推荐方案进行：
1. In a 6-well or 35 mm tissue culture plate, seed 9 00000 Sf9 cells per well in 2 ml of growth medium containing antibiotics (e.g. 2 ml of Sf-900 II SFM containing 50 units/ml penicillin and 50 µg/ml streptomycin final concentration).
2. Allow cells to attach at 27°C for at least 1 hour.
3. For each transfection sample, prepare bacmid DNA:Cellfectin® Reagent complexes as follows in 12 x 75 mm sterile tubes.
a. Dilute 1 µg of purified bacmid DNA in 100 µl of unsupplemented Grace’s Medium. b. Mix Cellfectin® Reagent thoroughly before use by inverting the tube 5-10 times. Remove 6 µl of Cellfectin® Reagent and dilute in 100 µl of unsupplemented Grace’s Medium.
c. Combine the diluted bacmid DNA with the diluted Cellfectin® Reagent (total volume
is ~210 µl). Mix gently and incubate for 15 to 45 minutes at room temperature.
4. While DNA:lipid complexes are incubating, remove the media from the cells and wash once with 2 ml of unsupplemented Grace’s Medium. Remove the wash media.
5. Add 0.8 ml of unsupplemented Grace’s Medium to each tube containing the DNA:lipid complexes. Mix gently and add the DNA:lipid complexes to each well containing cells.
6. Incubate the cells in a 27°C incubator for 5 hours.
7. Remove the DNA:lipid complexes and add 2 ml of complete growth media (e.g. Sf-900 II SFM containing antibiotics) to the cells.
8. Incubate the cells in a 27°C humidified incubator for 72 hours or until you start to see signs of viral infection.
穿梭质粒pBACmid的提取起先是用Invitrogen公司推荐的手工方法，后来是用Promega公司Wizard® PlusMinipreps DNA Purification System；昆虫细胞的培养是用含10%FBS的Grace’s Insect Cell Culture Medium，转染时换为无血清培养基Sf-900 II SFM（不含抗生素或其它添加剂）。所有试验都无法成功转染，故特来请教，望不吝赐教。

作者: sunshine039 时间: 2013-5-11 15:36

您的操作过程若是完全按照上述protocol进行，应该是不会有问题的。穿梭质粒的提取我们目前也是用Invitrogen公司推荐的手工方法，结果很好，没出现什么问题。

问题应该发生在以下这一步：

==========================================================================================================

昆虫细胞的培养是用含10%FBS的Grace’s Insect Cell Culture Medium，转染时换为无血清培养基Sf-900 II SFM（不含抗生素或其它添加剂）。

===========================================================================================================

参考：
1. 10%FBS的Grace’s Insect Cell Culture Medium是否含有L-谷氨酰胺，状态如何（要求细胞存活率应达到97%，才能达到较好的转染效果），首先排除转染前的细胞问题。
2. 另外就是转染后你更换了培养基（从Grace’s Insect Cell Culture Medium到Sf-900 II SFM），我觉得问题最有可能出现在这一步，昆虫细胞一直是在10%FBS的Grace’s Insect Cell Culture Medium中培养，可转染后突然换成无血清培养基Sf-900 II SFM，对细胞生长是不利的。不知道你加入Sf-900 II SFM培养后的细胞状态如何。此处建议转染后仍然使用10%FBS的Grace’s Insect Cell Culture Medium培养，扩增P1、P2、P3病毒贮液，正式表达蛋白之前按照Invitrogen公司推荐的方法，让细胞先适应无血清的环境，方可进行大量感染及表达。

作者: BOSS2011 时间: 2013-5-11 15:37

1. 关于L-谷氨酰胺,所购Grace’s Insect Cell Culture Medium(powder)中是含有的,贮藏过程中及配成溶液后在-20度和接下来的4度存放到底有无分解就不清楚了,但昆虫细胞的生长状态良好,这方面的问题应该不大.
2.有一点我描述有误，虽然转染时我改用无FBS、无抗生素的Sf-900 II SFM，但转染后我又换回10%FBS的Grace’s Insect Cell Culture Medium，之后细胞没有出现病毒感染迹象，细胞不停在生长。

接下来我想对试验方案做以下改变:
1.用promega公司Wizard® PlusMiniprepsDNA Purification System多提取pBACmid用以转染,因为所需DNA量是专指pBACmid,DH10BAC中的质粒除pBACmid外还有helper plasmid,pBACmid只占一部分。
2.转染前一天接种细胞，但涉及到用何种培养基的问题，即接种后至转染这段时间是用不完全培养基还是完全培养基（转染前再用不完全培养基洗）。
3、转染时不用Sf-900 II SFM 而改用不完全Grace’s Insect Cell Culture Medium（不含FBS和抗生素，但含lactoalbumin 和yeastolate）。
不知以上考虑是否符合实际？

作者: jujuba 时间: 2013-5-11 15:37

另外,我用Invitrogen公司推荐的手工方法提取的穿梭质粒常混有RNA，我认为是操作方案中RNAaseA的作用温度为室温引起的,因为其它提取方法是在55度反应10分钟.而且该方案提取的质粒成分复杂，给穿梭质粒的定量也带来问题，你所说的穿梭质粒的量是如何精确度量的？

作者: wood533 时间: 2013-5-11 15:38

我感觉remenb的说法是有道理的。Bac-to-Bac系统不是最有效的,往往表达的效率不高，我所在的实验室的师兄表达蛋白占4—5％左右；而我用的是用线性化野生病毒，载体是pMelBac，转染表达是近20％，目前我所在实验室都已经用此载体了。不妨试一下。另外，在表达物基因和表达系统间似乎还有某种相关性的联系，我也想请教各位前辈。谢谢！

作者: ffaa 时间: 2013-5-11 15:42

关于L-谷氨酰胺,所购Grace’s Insect Cell Culture Medium(powder)中是含有的,贮藏过程中及配成溶液后在-20度和接下来的4度存放到底有无分解就不清楚了,但昆虫细胞的生长状态良好,这方面的问题应该不大.

===========================================================================================================

一般L-谷氨酰胺在培养基中，4度可以稳定存在一个月左右，超过时间最好补加。另外不推荐将该培养基冻存于-20度，最好现配现用。但是既然你的细胞状态不错，那么应该不是培养基的原因。

作者: ffaa 时间: 2013-5-11 15:44

有一点我描述有误，虽然转染时我改用无FBS、无抗生素的Sf-900 II SFM，但转染后我又换回10%FBS的Grace’s Insect Cell Culture Medium，之后细胞没有出现病毒感染迹象，细胞不停在生长。

===============================

和正常细胞比较，72h后，没有任何变化？

作者: ffaa 时间: 2013-5-11 15:44

接下来我想对试验方案做以下改变:
1.用promega公司Wizard® PlusMiniprepsDNA Purification System多提取pBACmid用以转染,因为所需DNA量是专指pBACmid,DH10BAC中的质粒除pBACmid外还有helper plasmid,pBACmid只占一部分。

===========================================================================================================

我也觉得用试剂盒提取会更好，只不过目前我们没有购买专门的提取试剂盒。但是我觉得这里的helper plasmid不会有太大影响，否则invitrogen 的protocol上也不会说可以用手工法提取了。而且我们就是用手工提取法做的，效果不错，就是不知道会不会对下一步蛋白表达的量有影响（这个问题还需进一步探讨）。

作者: ffaa 时间: 2013-5-11 15:45

2.转染前一天接种细胞，但涉及到用何种培养基的问题，即接种后至转染这段时间是用不完全培养基还是完全培养基（转染前再用不完全培养基洗）。

===========================================================================================================

我不建议提前一天接种细胞，因为细胞会进行增殖，这样转染的量可能会不准。至于培养基，我还是觉得用完全培养基好，这样可以保证转染前的细胞状态是最佳的。而且我们这样做，效果也是很明显的。

作者: ffaa 时间: 2013-5-11 15:45

3、转染时不用Sf-900 II SFM 而改用不完全Grace’s Insect Cell Culture Medium（不含FBS和抗生素，但含lactoalbumin 和yeastolate）。
不知以上考虑是否符合实际？

===========================================================================================================

我们转染一直使用的是Grace’s Insect Cell Culture Medium, unsupplemented(Cat No.11595-030)，效果不错，而且我建议你不要使用抗生素，只要操作注意，不会造成污染，这样也不会让抗生素对转染造成可能的影响。

作者: ffaa 时间: 2013-5-11 15:45

另外,我用Invitrogen公司推荐的手工方法提取的穿梭质粒常混有RNA，我认为是操作方案中RNAaseA的作用温度为室温引起的,因为其它提取方法是在55度反应10分钟.而且该方案提取的质粒成分复杂，给穿梭质粒的定量也带来问题，你所说的穿梭质粒的量是如何精确度量的？

===========================================================================================================

我们通常采用紫外分光光度计对其定量。个人经验是：由于Bacmid比较大（>100Kb），提取出来的质粒要用水或者TE溶解，所使用的液体量是溶解常规质粒（5kb左右）体积的2倍，这样定量结果才准确。我提取的质粒OD260/OD280=2.0左右，说明还是比较纯的。（一般10ml菌液提取的bacmid 用150-180ul液体来溶解。）

另外，你没有使用pFastBacHTCAT作对照吗？若这个也不行，可能是你的转染试剂有问题。

作者: utt0989 时间: 2013-5-11 15:46

您好，我也用该系统表达蛋白。转染步骤是按invitrogen 的protocol做的，细胞72h病变非常明显。但表达时细胞是用SF900-II SFM（含10%FBS，1%F-68，青链霉素各100单位/毫升）培养的，然后细胞收集超声后上清浓缩做WESTERN没有条带出现。
是不是表达时培养基中的FBS的影响？请多指教。

作者: ffaa 时间: 2013-5-11 15:46

QUOTE:

原帖由 utt0989 于 2013-5-11 15:46 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

您好，我也用该系统表达蛋白。转染步骤是按invitrogen 的protocol做的，细胞72h病变非常明显。但表达时细胞是用SF900-II SFM（含10%FBS，1%F-68，青链霉素各100单位/毫升）培养的，然后细胞收集超声后上清浓缩做WESTERN没有条带出 ...

细胞病变，自然转染是成功的。不知道有否进行测序，请排除读码框错误的可能性。
细胞超声后的上清应该是没什么FBS，不会对目的蛋白的检测有影响吧。表达的培养基中加入FBS可以防止目的蛋白的降解。但是可能对蛋白表达量有影响。可以和我一样，用细胞涂片做个免疫荧光鉴定一下目的蛋白。
表达条件我们仍在摸索中，请继续关注并参与讨论。

作者: utt0989 时间: 2013-5-11 15:47

谢谢.我的目的片段测序是正确的.您说
"建议转染后仍然使用10%FBS的Grace’s Insect Cell Culture Medium培养，扩增P1、P2、P3病毒贮液，正式表达蛋白之前按照Invitrogen公司推荐的方法，让细胞先适应无血清的环境，方可进行大量感染及表达。"
我在扩增P1、P2、P3病毒贮液时是用SF900-II SFM（含10%FBS，1%F-68，青链霉素各100单位/毫升）,表达时是不是就按Invitrogen公司推荐的方法?您是怎么做的啊?

作者: ffaa 时间: 2013-5-11 15:47

相关疾病：
感染

前一段时间一直是按照protocol和上面我所说明的那样，用10%FBS的Grace’s Insect Cell Culture Medium培养，扩增P1、P2、P3病毒贮液，然后取P3贮液，按MOI=5进行感染。细胞裂解液或细胞培养上清中一直无法用his单抗检测到蛋白（我们在考虑会不会是his标记被包裹在蛋白内部，无法暴露其抗原位点？可是除了his单抗，我们没有针对目的蛋白的特异性抗体〈仅有些效价不是很高的抗血清〉，也无法进一步用western blot鉴定，最后还是通过免疫荧光鉴定出有表达），当然我们用的一直是有血清的培养基，所以我说有血清的条件下可能对表达会有影响。

我们做了病毒空斑纯化实验，并以pFastBacHTc-CAT转化的Bacmid-CAT作为阳性对照，以正常细胞做阴性对照，但是由于没什么经验，感染十天后，无法断定很明显的空斑，也没办法进行下一步的空斑纯化。当然这里也可能是我们操作的问题，这个实验就暂且停住了。

另外，我们正准备在high five细胞中表达，即用无血清培养基培养的high five细胞在旋转培养瓶中进行感染表达，但目前实验设备刚准备好，细胞也长得较好，表达实验还没有开始，有了结果我会继续在这发帖。

作者: jujuba 时间: 2013-5-11 15:48

斗胆发表一下看法：
1.构建好穿梭质粒后，有没有测序证实序列的正确性呢？因为一直没有看到coffejumps 提到读框的正确性问题;
2.抗体是针对WB还是细胞免疫荧光？还是WB更为特异;
3.High five细胞的表达量是最高的。

作者: ffaa 时间: 2013-5-11 15:48

1.构建好穿梭质粒后，有没有测序证实序列的正确性呢？因为一直没有看到coffejumps 提到读框的正确性问题;

===========================================================================================================

这也是一个问题，其实我在同时做四段目的基因的表达，虽然都进行了测序，但仅有两个是可以测出并核实正确的。其它两个经过反复测序提供了质粒、菌液（而且试了两家公司），但公司的回复是有复杂结构，信号有干扰，无法正常测序。

但是目前免疫荧光的结果是同时几个都为阳性（当然绝对是做了阴性对照的），我想这个结果是可靠的。毕竟测序正确并且荧光检测阳性的结果是有的，说明构建质粒不可能都存在问题。

我也想弄清楚究竟测序中的复杂结构，是不是会影响蛋白表达，实验进行中……

作者: ffaa 时间: 2013-5-11 15:49

2.抗体是针对WB还是细胞免疫荧光？还是WB更为特异;

=================================================================================================

我说过我们只有抗血清，效价不高，故免疫印迹无法正常检测，由于是使用DAB显色而非曝光，所以检测灵敏度是低于免疫荧光的。

由于同时进行了正常细胞和无关细胞、抗血清和无关抗体的多种对照，我想免疫荧光的特异性还是可以肯定的。

作者: ffaa 时间: 2013-5-11 15:49

3.High five细胞的表达量是最高的。

=============================================

同意，至少protocol是这么说的，故这也是下步的实验重点。

作者: gemei0115 时间: 2013-5-11 15:49

相关疾病：
感染
刚才看到这些贴子，我也是做这个的。表达了几个蛋白，觉得这个系统的表达很subtle。有些蛋白就那么好表达，有些就怎么也弄不出来。因而经常去生化所吴老师组去讨教，了解了一些，与大家分享、讨论。

不知道coffejumps表达的蛋白有多大？是否是膜蛋白？膜蛋白不好做，蛋白太大不好做。很佩服你，用BamH I和EcoR I来做Hta。这两个酶靠得很近，我有好几次想用他俩（酶的效率比较高），都没敢用，怕切不彻底。His Tag不应该会被包在内部，因为一般做的蛋白质电泳应该是变性胶吧。

另外，我觉得转染前后不应该更换培基种类，那样会影响细胞状态的。我在做转染的时候只将FBS去除，protocol上说血清中的成分会对脂质体包埋DNA有影响，其他添加剂的影响应该不大吧。Grace’s培养基属于基础培养基，对这两株细胞（SF9 & High Five）都不是最适培基。sf细胞株以前使用Gibco的TC100，后来停产了，选用他们的SFM 900II，虽然说是无血清培基，我们还是加了10%的FBS。High Five 应该也有与它相适应的培基，好象是Express Five SFM。SF细胞适于悬浮培养，High Five好像偏向贴壁表达。

我在做转染前，细胞通常贴壁过夜（让它适应一下），至少也要贴壁两个小时以上。转染后用封口膜将dish封闭放置四到五天（比说明书上的时间长）。扩毒的时间也比说明书上的时间长（视细胞状态，通常也是四到五天）。这样细胞向培基中释放出的病毒能多一些。我们这边有人做表达的时候，竟然染毒后一星期收细胞，见到她的蛋白表达那么大一坨！汗~~

免贵姓何：我们也采用手抽Bacmid，试剂盒贵了些吧。在solution I中加入RNAse A，结果没见到很多的RNA呀。Help质粒是有的，不大影响转染。

再发表一些我自己的愚见：转染效率不高对收获病毒影响很大么？只要有Bacmid DNA进入细胞，她不就能释放出来有感染活性的病毒么？不就可以感染周围的细胞么？比较蠢的想法。

作者: ffaa 时间: 2013-5-11 15:50

图中已经成功纯化的蛋白是病毒结构蛋白，非糖蛋白。这次表达量比较高，sf9和highfive细胞中均有较高的表达量，不过这次的纯化工作都是用highfive细胞完成的，感觉纯化比较简单。

另外有个糖蛋白也成功进行了表达，但是表达量不高（不过好歹SDS-PAGE可以看到了），纯化过程也遇到了麻烦，发现同样的条件，根本不合Ni-NTA珠结合，条件还在摸，估计该糖蛋白经过糖基化修饰，折叠，his-tag被阻挡。郁闷ing!

小结一下：目前的实验结果说明上述的实验方法没有问题，大家可以放心参考！
证明免疫荧光阳性的结果是可信的，只是细胞表达量很低。
前段时间开了个会，同一位老师交流了一下，他说他的一个蛋白也是表达量很低，每次纯化要培养大概100多毫升细胞，才能纯化出一点蛋白。
所以该表达系统也不是万能的，虽然该系统是真核表达，但针对不同的蛋白，其表达量可有10-1000倍的差异，大家选用之前一定要想好。
病毒空斑试验不做可以，但是由于不能确定病毒液的滴度，会影响表达量，但决不会影响表达

图片附件: 69920009.snap.jpg (2013-5-11 15:50, 49.9 KB) / 该附件被下载次数 10
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16182

作者: mickeylin 时间: 2013-5-11 15:51

不知道coffejumps表达的蛋白有多大？是否是膜蛋白？膜蛋白不好做，蛋白太大不好做。很佩服你，用BamH I和EcoR I来做Hta。这两个酶靠得很近，我有好几次想用他俩（酶的效率比较高），都没敢用，怕切不彻底。

======================================================================================================

我目前纯化出来的这个蛋白，表达量大约在2-3mg/1*10^8个细胞，还不是很满意。呵呵，这两个酶的效率比较高，放心用！反正后面要鉴定嘛

作者: mickeylin 时间: 2013-5-11 15:51

我在做转染前，细胞通常贴壁过夜（让它适应一下），至少也要贴壁两个小时以上。转染后用封口膜将dish封闭放置四到五天（比说明书上的时间长）。扩毒的时间也比说明书上的时间长（视细胞状态，通常也是四到五天）。这样细胞向培基中释放出的病毒能多一些。我们这边有人做表达的时候，竟然染毒后一星期收细胞，见到她的蛋白表达那么大一坨！汗~~

==========================================================

这个状态怎么控制？谈谈你的经验如何？
放一个星期都可以？？？晕！细胞破裂死亡不会导致表达蛋白降解吗？
你们通常都表达什么性质的蛋白，稳定性如何，表达膜蛋白成功的例子多么？

作者: sr9971 时间: 2013-5-11 15:51

相关疾病：
感染头痛
个人认为没有必要太拘泥于转染效率的问题. 其实如果严格按照protocol来做的话,一般都会得到可以的转染. 偶用普通的miniprep kit来提取Bacmid,浓度通常比较低,但是量是足够做转染了,所以偶也不太care啦. 转染效率低的话,后果就是P1的滴度低.但是这没关系,因为偶从未指望用P1来做什么实验. 在P1的基础上继续扩增P2,P3, 偶一般是感染4,5天后收集上清. P3的滴度都能达到10^8.

在使用这个系统中,偶感到最为头疼的是培养sf-9细胞. 细胞状态老是不好. 传代的时候用一般的移液管根本就把细胞吹不下来. 换巴斯德细玻管也得费老半天劲才能下来,下来的细胞估计是受到创伤,状态总是不太好. 不知众位站友是怎么做的?

作者: ffaa 时间: 2013-5-11 15:52

在使用这个系统中,偶感到最为头疼的是培养sf-9细胞. 细胞状态老是不好. 传代的时候用一般的移液管根本就把细胞吹不下来. 换巴斯德细玻管也得费老半天劲才能下来,下来的细胞估计是受到创伤,状态总是不太好. 不知众位站友是怎么做的?

===========================================================================================================

细胞状态不好？还贴壁这么牢？

我们使用10%胎牛血清的Grance全培，细胞状态很好，但是也是贴壁很牢，我们一直使用胰酶消化，效果不错，好像对结果没有影响，对细胞状态也没有影响。

作者: DONT 时间: 2013-5-11 15:53

细胞状态不好的时候,当然是飘起来的. 本来状态很好,费老劲搞下来传代以后,好多就飘起来啦. 每次就只好让它贴一小时,再扔掉不贴的. 浪费偶好多细胞.
可以用胰酶消化吗? 偶试过一次,没下来,就再没试过.可以说说你用胰酶的浓度和时间吗? 谢谢楼上的兄弟.

作者: ffaa 时间: 2013-5-11 15:53

我们使用的胰酶过了有效期，浓度是0.5%（1640配制），一般0.25%就好了。消化很快呀（3-5min），你再试试。

You are welcome. Good luck!

作者: mamamiya 时间: 2013-5-11 15:53

我也在做sf9细胞表达蛋白，但是蛋白表达量没有你的高。目的蛋白分泌到上清中。纯化蛋白时，100ml细胞上清液仅能纯化约100ug蛋白。我的纯化方法是：细胞上清用PBS透析几次，然后过NTA-Ni柱。能否将你的蛋白纯化方法共享一下，谢过！

作者: KGZ564 时间: 2013-5-11 15:54

QUOTE:

原帖由 mamamiya 于 2013-5-11 15:53 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我也在做sf9细胞表达蛋白，但是蛋白表达量没有你的高。目的蛋白分泌到上清中。纯化蛋白时，100ml细胞上清液仅能纯化约100ug蛋白。我的纯化方法是：细胞上清用PBS透析几次，然后过NTA-Ni柱。能否将你的蛋白纯化方法共享一下，谢 ...

以前做过杆状病毒分泌表达的纯化工作，提供你一些意见，稍作参考。你的表达量还是很可以的，就分泌表达而言，完全能够纯化出来。我的实验技术路线如下：以1L的培养液上清为对象，先用阴离子交换层析柱富集，然后脱盐柱除掉部分色素，再直接上样于Ni-NTA上，条件成熟，大半天时间就可完成1L的纯化，我最终1L培养基中获得1.5mg的目的蛋白，纯度在90%以上。

作者: qhyu 时间: 2013-5-11 15:54

请教：你的Bacmid是如何提取的，怎么纯化的？转染剂量是否严格遵守操作手册的推荐剂量？你所说的“病毒感染晚期（正常24-72h）可见细胞停止生长、黏附，呈颗粒状外观”能否详细描述一下？不胜感激！！！
菜鸟一只

作者: okhaha 时间: 2013-5-11 15:55

不知道coffejumps表达的蛋白有多大？是否是膜蛋白？膜蛋白不好做，蛋白太大不好做。

==========================================================================================================

深表赞同啊，我就是用bac-to-bac系统表达膜蛋白的，作了一年。一开始也是前面的步骤都没问题，就是最后的western做不出来，一直以为是序列有移码，测序存在问题。反反复复测了很多次结果都不一样，汗啊～～后来才发现是蛋白表达量太低，western没有检测到（因为当时的阳性对照是一直以为表达量应该差不多的蛋白，结果哪知道差那么多！）。最近提高一抗的稀释度4倍，就检测到了，提膜蛋白做纯度就更高了。

这么做下来，也是觉得，转染纯度什么的都不是问题，有的话就可以了。我们也是手工提的。至于细胞状态，我们用的是sf9细胞，一般过夜就一定能贴壁的不错，传代的时候就用吹管吹下就下来了，很容易，不需要用消化液消化的，而且我记得sf9好像应该是半贴壁细胞吧？？
感染的迹象：做病毒P1扩增的时候，不是很明显的，也就是细胞一开始还是长的，后来停住，变大变透明的感觉。如果是用高滴度病毒做表达的时候，好的情况（国外一位老师说）应该是像“气球”一样浮起来，然后变大变通透，如果是有要裂掉的那个样子我觉得是养的太久了吧。一般我作的话，病毒扩增都是3天的，表达4天，如果真要表达7天，我在想是不是蛋白都要被水解光了？

感觉做滴度是最麻烦最费时间的事情，很容易污染，不知道大家是不是这样的？要么就是一个噬斑都没，反正成功率不高。但觉得病毒滴度对优化表达条件提高蛋白表达量又是很重要的，不知道有没有什么好建议或是做的好的同志的心得，可以分享一下？那天有看到基因公司在代理BD的滴度测定试剂盒（BacPAK rapid titer kit），2天就可以测完，就是太贵，3700RMB就没几次好用，奢侈啊～～

作者: star#room 时间: 2013-5-11 15:55

相关疾病：
感染
我是用Baculogold 来做蛋白表达的，做了一年多了，始终没有检测的到，细胞是sf9。

我的蛋白是膜蛋白，140kD，国外都表达出来了，但是我用我自己构建的病毒来做，怎么都没有做出来，听说膜蛋白很难表达，我想到底是什么问题？表达量文献上的很高，而我的western 都基本上看不出来。

我所怀疑的各个步骤都没有问题，包括病毒都是由感染性的，MOI试过n多次，我每次感染都是在72h或更长时间，后收细胞的，细胞病变很明显，对于这么大的蛋白，是不是时间短了阿，

不过在细胞的培养方面还是有很多经验的，希望和大家交流，也希望大家能在蛋白表达这方面给我指导，郁闷中

作者: star#room 时间: 2013-5-11 15:55

还有，sf9的细胞电泳，你们都是怎么处理细胞的？
我的细胞量不是很多，如果提膜来检测膜蛋白的话，就很少了，我试过跑全细胞电泳，但是结果考染后整条带都兰呼呼的，而且带形很难看，不知道是由于脂太多，还是由于核算的干扰？

你们都是怎么处理细胞的，来检测蛋白的？

作者: ffooll 时间: 2013-5-11 15:56

我目前纯化出来的这个蛋白，表达量大约在2-3mg/1*10^8个细胞，还不是很满意。呵呵，这两个酶的效率比较高，放心用！反正后面要鉴定嘛

这个状态怎么控制？谈谈你的经验如何？
放一个星期都可以？？？晕！细胞破裂死亡不会导致表达蛋白降解吗？
你们通常都表达什么性质的蛋白，稳定性如何，表达膜蛋白成功的例子多么？

===========================================================================================================

就我自己做的来说吧，扩毒时，一般加毒后到第五天收毒，收毒前如果细胞漂起来的不多，就再等一到两天收毒。表达蛋白就不同了，要摸索时相和加的病毒量，蛋白不同表达时相会不一样。
我自己做的一个分泌型蛋白表达还行，不过我用的培基加有FBS，想试试把血清去掉再做做表达。另做了个膜蛋白90kD左右，表达的量很低，正在郁闷中。

作者: ffooll 时间: 2013-5-11 15:57

这么做下来，也是觉得，转染纯度什么的都不是问题，有的话就可以了。我们也是手工提的。至于细胞状态，我们用的是sf9细胞，一般过夜就一定能贴壁的不错，传代的时候就用吹管吹下就下来了，很容易，不需要用消化液消化的，而且我记得sf9好像应该是半贴壁细胞吧？？

感染的迹象：做病毒P1扩增的时候，不是很明显的，也就是细胞一开始还是长的，后来停住，变大变透明的感觉。如果是用高滴度病毒做表达的时候，好的情况（国外一位老师说）应该是像“气球”一样浮起来，然后变大变通透，如果是有要裂掉的那个样子我觉得是养的太久了吧。一般我作的话，病毒扩增都是3天的，表达4天，如果真要表达7天，我在想是不是蛋白都要被水解光了？

感觉做滴度是最麻烦最费时间的事情，很容易污染，不知道大家是不是这样的？要么就是一个噬斑都没，反正成功率不高。但觉得病毒滴度对优化表达条件提高蛋白表达量又是很重要的，不知道有没有什么好建议或是做的好的同志的心得，可以分享一下？那天有看到基因公司在代理BD的滴度测定试剂盒（BacPAK rapid titer kit），2天就可以测完，就是太贵，3700RMB就没几次好用，奢侈啊～～

=======================================================================================================

我也觉得挺好吹的，好像消化液处理对细胞状态会有一些影响的。
滴度一定要做么？我觉得好麻烦，总不想去做。反正表达的时候不是要做时相跟MOI的么？条件摸好了表达的时候用同一个病毒stock不行么？

作者: windy+++ 时间: 2013-5-11 15:57

我也在用昆虫细胞sf9和baculovirus表达一个蛋白，蛋白要么是不合histag结合，要么是没有活力。试验室里的人说我表达的是分泌型蛋白，他们只用细胞培养上清做分离纯化，可我怀疑上清中蛋白不够多，也许大部分都在细胞里，怎么确定蛋白是分泌表达还是胞浆表达呢，是不是是由蛋白本身的特性决定的。另外我对你的纯化过程非常感兴趣，我最近对一个蛋白进行了几次纯化，过了histag 的bead,还是有很多条带，能不能介绍介绍纯化过程，非常感谢。

作者: 33号 时间: 2013-5-11 15:58

本人用BEVS系统在昆虫细胞中表达了一种外源性蛋白酶．从目的基因的克隆，转移表达载体的构建及细胞转染都逐一攻克，positive　control是自己构建的GFP系统，在荧光显微镜下看到了绿色荧光．进一步对表达产物进行生化反应也检测到了生物学活性．但是现在面临产物的分离纯化，毕竟我对蛋白质这块很陌生，简直感觉到无所适从，好象这方面的资料很难找，所以特此向广大战友求助，若有这方面的资料（movie，flash，动画都好）望提供一份，不胜感激

作者: 33号 时间: 2013-5-11 15:58

附上GFP表达情况：

图片附件: 59461294.snap.jpg (2013-5-11 15:58, 51.04 KB) / 该附件被下载次数 14
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16183

作者: ffaa 时间: 2013-5-11 15:59

我也在用昆虫细胞sf9和baculovirus表达一个蛋白，蛋白要么是不合histag结合，要么是没有活力。试验室里的人说我表达的是分泌型蛋白，他们只用细胞培养上清做分离纯化，可我怀疑上清中蛋白不够多，也许大部分都在细胞里，怎么确定蛋白是分泌表达还是胞浆表达呢，是不是是由蛋白本身的特性决定的。另外我对你的纯化过程非常感兴趣，我最近对一个蛋白进行了几次纯化，过了histag 的bead,还是有很多条带，能不能介绍介绍纯化过程，非常感谢。

===========================================================================================================

分泌性表达是会分泌到上清之中的，所以你检测到上清中有蛋白，就是分泌表达了，如果表达量低，你可以试着将上清浓缩。

杆状病毒表达的蛋白比较奇怪，有的很好纯化，有的很难，就是不和Ni-珠结合。可能是因为膜蛋白经表达修饰影响了histag的结合位点。但是如果你的蛋白可以结合，但是有杂带，你可以试着提高wash buffer 中咪唑的浓度，这样可以洗掉杂蛋白，当然随着咪唑浓度的提高，目的蛋白可能也会有一定的损失。

作者: ffaa 时间: 2013-5-11 15:59

我是用Baculogold 来做蛋白表达的，做了一年多了，始终没有检测的到，细胞是sf9。

我的蛋白是膜蛋白，140kD，国外都表达出来了，但是我用我自己构建的病毒来做，怎么都没有做出来，听说膜蛋白很难表达，我想到底是什么问题？表达量文献上的很高，而我的western 都基本上看不出来。

我所怀疑的各个步骤都没有问题，包括病毒都是由感染性的，MOI试过n多次，我每次感染都是在72h或更长时间，后收细胞的，细胞病变很明显，对于这么大的蛋白，是不是时间短了阿，

不过在细胞的培养方面还是有很多经验的，希望和大家交流，也希望大家能在蛋白表达这方面给我指导，郁闷中

==================================================

建议你用RT-PCR鉴定一下是否有转录，排除序列及质粒构建的原因

作者: ffaa 时间: 2013-5-11 15:59

还有，sf9的细胞电泳，你们都是怎么处理细胞的？
我的细胞量不是很多，如果提膜来检测膜蛋白的话，就很少了，我试过跑全细胞电泳，但是结果考染后整条带都兰呼呼的，而且带形很难看，不知道是由于脂太多，还是由于核算的干扰？

你们都是怎么处理细胞的，来检测蛋白的？

===========================================================================================================

关于sf9细胞的处理，我提供一种方法：

可以用PH8.0 20mM Tris-HCl 2%triton X-100裂解细胞（RT, 30min, 有条件加入蛋白酶抑制剂），分别取裂解的上清和剩下的细胞沉渣（以适当盐水重悬，取混悬液）进行电泳鉴定。

效果会好一些。

作者: 2541 时间: 2013-5-11 16:00

您好，我也是用该系统表达纯化蛋白，现在出现的问题是破胞后，我所需的目的蛋白大部分都在离心后的沉淀里，用了Ni-NTA柱洗脱后，跑PAGE胶，基本上就看不到目的条带，在全裂解液和沉淀里条带特别浓，我想请教一下，这是怎么回事，是不是裂解液的PH不对，还有盐浓度是不是有问题？

图片附件: 63194214.jpg (2013-5-11 16:00, 60.21 KB) / 该附件被下载次数 11
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16184

作者: lgm 时间: 2013-5-11 16:00

想问下哪个公司有卖载体PBacPAK、线性化病毒和家蚕BMN细胞？我想在家蚕细胞里面表达蛋白，谢过！

作者: ffaa 时间: 2013-5-11 16:13

您好，我也是用该系统表达纯化蛋白，现在出现的问题是破胞后，我所需的目的蛋白大部分都在离心后的沉淀里，用了Ni-NTA柱洗脱后，跑PAGE胶，基本上就看不到目的条带，在全裂解液和沉淀里条带特别浓，我想请教一下，这是怎么回事，是不是裂解液的PH不对，还有盐浓度是不是有问题？

=====================================================================

这个要看你表达的蛋白，可能本身结构的问题无法溶解；或者裂解液条件过于剧烈使蛋白变性。

作者: ritou1985 时间: 2013-5-11 16:14

I have a protein with 2000bp to construct in pFastBac1 Vector. How the white-blue screen in transposition step is very low. I can't find any white colon. How to increase the effect of transposition?
Thanks very much!

作者: qqq111 时间: 2013-5-11 16:15

相关疾病：
感染
我最近也在做杆状病毒表达，发现这个系统不是太稳定，相同条件下的感染，有时目的蛋白在考马斯染色下就能看出来，有时只有western才能检测到。
目前正在摸索条件，以后会和各位多多交流

作者: vivian4123 时间: 2013-5-11 16:15

关于该话题,我现有个问题,希望能得到回复.
我构建的质粒测序没有问题,转化DH10Bac后也有蓝白斑,挑取的白斑抽提杆粒后酶切竟然没有我的目的片段.why?
没有pcr鉴定的原因是当时引物设计不合理,P不出来,后来就直接酶切后和pFastBac I 载体进行了连接.

作者: ffaa 时间: 2013-5-11 16:16

QUOTE:

原帖由 vivian4123 于 2013-5-11 16:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
关于该话题,我现有个问题,希望能得到回复.
我构建的质粒测序没有问题,转化DH10Bac后也有蓝白斑,挑取的白斑抽提杆粒后酶切竟然没有我的目的片段.why?
没有pcr鉴定的原因是当时引物设计不合理,P不出来,后来就直接酶切 ...

转化得到的重组bacmid质粒片断太大（100多kb），是没办法用酶切进行鉴定的，可以用通用引物M13进行鉴定（详见invitrogen操作手册），不过还是建议设计自己的特异性引物。

作者: yes4 时间: 2013-5-11 16:16

我最近也在用这个系统表达蛋白，我想请教各位师兄，你们大概用多少细胞裂解上样跑SDS-PAGE？
　　我之前用２５CM２的培养瓶，收集一瓶的细胞用４００ul的裂解液裂解后，取上清用２X的上样液上样，可是跑胶后，大分子量的蛋白可见，下面小分子的蛋白不可见，我在同一块胶上用细胞裂解碎片跑电泳下面的小分子量部分可见，但我不能确定这就是我要的蛋白．是不是用裂解上清跑出来才能确定我的蛋白啊？
我想是不是说明我的上清中蛋白量很少，所以我的胶上才跑不出来呢？我应该怎样优化条件呢？
　　要多少的细胞裂解才够呢？我想增加裂解的细胞量，又怕裂解液不能完全裂解，另外用细胞超声时，怎样的状态说明细胞已经超声好了呢？
　　我是新手，渴望得到各位有经验的师兄指点迷津？

作者: xyw5 时间: 2013-5-11 16:17

相关疾病：
感染
请教一个问题,我前面做个两个蛋白的表达,可是第三个蛋白却出现这样的问题:1.以前是用SF9包装病毒,现在换用TN细胞,是不是对病毒包装有影响;2.包装的病毒感染TN细胞后,细胞提取RNA做RTPCR有强阳性,但western做了两次没有结果.是不是表达量太低;3.我用的TN细胞一直都用SF900II,感觉感染后细胞病变效应没有SF9明显,是不是一定要像说明书上说的感染前用10%FBS+GRACE培养基养细胞,感染后换用无血清的SF900II,希望得到大家的指点,谢谢

作者: star#room 时间: 2013-5-11 16:17

我也在做杆状病毒表达, 转染前测序证实序列和ORF没问题,SF9感染征象很明显,细胞免疫荧光约60%细胞阳性.但上清和细胞裂解液中WESTERN均测不到目的蛋白,看完您所有帖子就想请教您一下,您是如何提高蛋白产量的?"这次表达量比较高，sf9和highfive细胞中均有较高的表达量" 经过怎样的改进达到的?我目前只有SF9细胞,以往用于制作裂解液的转染细胞大约传代40代左右,代数太多会是蛋白不分泌,胞内表达量也低的原因吗?急盼指点迷津!谢谢!

作者: vera+ 时间: 2013-5-11 16:18

我在用sf21表达蛋白时，需要在细胞未病变，没有溶菌的情况下结束表达，让蛋白保留在胞浆中，请问这个过程该怎么控制？一般需要多少时间，而不让蛋白因为破菌分泌到培养液中呢？
另外，培养结束收集细胞的离心条件是1怎样的？1000g，10min会不会离破细胞？
有没有做过超声破菌的高手，请问条件是怎样的？这个一直没有查到很准确的资料。
谢谢，请指点

作者: ffaa 时间: 2013-5-11 16:18

我最近也在用这个系统表达蛋白，我想请教各位师兄，你们大概用多少细胞裂解上样跑SDS-PAGE？
　　我之前用２５CM２的培养瓶，收集一瓶的细胞用４００ul的裂解液裂解后，取上清用２X的上样液上样，可是跑胶后，大分子量的蛋白可见，下面小分子的蛋白不可见，我在同一块胶上用细胞裂解碎片跑电泳下面的小分子量部分可见，但我不能确定这就是我要的蛋白．是不是用裂解上清跑出来才能确定我的蛋白啊？
我想是不是说明我的上清中蛋白量很少，所以我的胶上才跑不出来呢？我应该怎样优化条件呢？
　　要多少的细胞裂解才够呢？我想增加裂解的细胞量，又怕裂解液不能完全裂解，另外用细胞超声时，怎样的状态说明细胞已经超声好了呢？
　　我是新手，渴望得到各位有经验的师兄指点迷津？

=========================================================================================================

我做得一般都是1×10^6细胞，直接用100ul ２XSDS上样buffer重悬，直接跑胶（无需先裂解，电泳结果有目的蛋白再考虑如何裂解，如何纯化）

对于电泳结果无法判断的，建议做western blot来确定是否为目的蛋白及其相应的分子量。

如果选用超声破碎，可以在显微镜下观察，找不到完整细胞，超声就可以了。

作者: ffaa 时间: 2013-5-11 16:19

请教一个问题,我前面做个两个蛋白的表达,可是第三个蛋白却出现这样的问题:1.以前是用SF9包装病毒,现在换用TN细胞,是不是对病毒包装有影响;2.包装的病毒感染TN细胞后,细胞提取RNA做RTPCR有强阳性,但western做了两次没有结果.是不是表达量太低;3.我用的TN细胞一直都用SF900II,感觉感染后细胞病变效应没有SF9明显,是不是一定要像说明书上说的感染前用10%FBS+GRACE培养基养细胞,感染后换用无血清的SF900II,希望得到大家的指点,谢谢

===========================================================================================================

当然，首先要考虑更换sf9细胞后，是否有影响，还是最好能做个sf9细胞对照。或者把你成功表达的这两个蛋白，在新的TN细胞中表达一下，确定是否是细胞的问题。

另外，目的蛋白的性质，重组Bacmid的纯度，可能都会有影响，在确定确有蛋白表达的情况下，最好做一下空斑纯化，再选用适合该蛋白表达的细胞系。

个人觉得培养基不会有很大影响（当然，除非对细胞状态有影响），后面更换的无血清培养基，主要是方便目的蛋白的纯化。

作者: ffaa 时间: 2013-5-11 16:19

我也在做杆状病毒表达, 转染前测序证实序列和ORF没问题,SF9感染征象很明显,细胞免疫荧光约60%细胞阳性.但上清和细胞裂解液中WESTERN均测不到目的蛋白,看完您所有帖子就想请教您一下,您是如何提高蛋白产量的?"这次表达量比较高，sf9和highfive细胞中均有较高的表达量" 经过怎样的改进达到的?我目前只有SF9细胞,以往用于制作裂解液的转染细胞大约传代40代左右,代数太多会是蛋白不分泌,胞内表达量也低的原因吗?急盼指点迷津!谢谢!

====================================================================================

sf9细胞养到30代以后，表达能力就会下降，建议30代以后的细胞就不要用了。

你只鉴定了细胞培养上清和裂解液？是否鉴定了裂解后的渣子中有没有蛋白？？？
你的蛋白很有可能以不溶的形式存在于渣子中。

所以建议不要先裂解，直接取细胞用上样buffer重悬，跑胶鉴定，先看是否有表达，接下来再考虑裂解、复性、纯化。

作者: ffaa 时间: 2013-5-11 16:19

我在用sf21表达蛋白时，需要在细胞未病变，没有溶菌的情况下结束表达，让蛋白保留在胞浆中，请问这个过程该怎么控制？一般需要多少时间，而不让蛋白因为破菌分泌到培养液中呢？
另外，培养结束收集细胞的离心条件是1怎样的？1000g，10min会不会离破细胞？
有没有做过超声破菌的高手，请问条件是怎样的？这个一直没有查到很准确的资料。
谢谢，请指点

===========================================================================================================

首先想说，并不是在sf21细胞中表达的蛋白都会分泌表达的，所以对于有些蛋白，它就是胞浆内表达的，你就不用考虑怎么控制了。
对于分泌表达的蛋白，除了对基因进行改造，可能控值表达时间，也许有用。
一般细胞在400g以内离心是不会有事的，1000g，细胞很有可能裂解。

超声条件对于不同的仪器，功率可能不同，原则是在降低发热量，保证蛋白稳定的情况下，选用合适的功率。脉冲一般是超声5秒，停5-10秒，总共超声10次左右，镜下观察是否存在完整的细胞来判断超声的程度。

作者: misswu61 时间: 2013-5-11 16:20

相关疾病：
白血病淋巴瘤

谢谢指点，我做过裂解物沉淀SDS-PAGE,没有与重链轻链对应的条带，上清也没有（我用的是分泌型载体）。但细胞裂解液至少有相对应的条带。现在复苏20余代的细胞准备重新表达（我拿来的细胞已经20代），并加做空白对照，准备再做SDS-PAGE和WESTERN。我的载体启动子是P10和Polyhedrin，请问这两个启动子能在哺乳动物细胞中起作用吗？我想试着在CHO细胞中表达。不知哪里可以买到HIGH 5细胞或低传代的SF9细胞？我们实验室有多种白血病和淋巴瘤及神经母细胞瘤细胞系，如果有战友愿意交换也可以。

作者: jujuba 时间: 2013-5-11 16:20

在invitrogen的protocal中写到关于摸索最佳MOI。他们给出的是几个值：1，2，5，10，20。现在假设最佳MOI=5（蛋白表达量最高）。可以说MOI=1时蛋白表达量应该是比较低的或者说不表达，那么MOI=10或者20时，蛋白表达量是比MOI=5时低呢还是说与MOI=5时蛋白表达量一样？有哪位做过这方面的，能不能给个图，看着直观一些。
再一个，大家的蛋白表达量一般为多少，比如说：10的6次方个细胞能产生多少蛋白？（很多因素影响表达量，各有各的差异，只想知道大家的蛋白表达量怎样，好用来参考一下）我的蛋白是分泌表达，带组氨酸标签，还有个问题：纯化对目的蛋白有没有损失？损失的量？
最佳收蛋白时间：假设蛋白在48小时才表达，在72 小时达到最高，那么在96小时蛋白表达量可能比72小时的低或者相同，120 小时的蛋白量应该降低，因为细胞裂解产生的酶将其降解（我在接毒后72小时以后细胞飘起来了将近一半）。这是我个人看法，因为我没有具体算过72小时后的蛋白量，我是在72小时收的。哪位具体算过？最好有个直观的图。谢谢！

作者: hot_hot_hot 时间: 2013-5-11 16:22

我目前在用终点稀释法测定重组杆状病毒的滴度，但96孔板接毒细胞只见裂解，但不脱落，不知是什么原因，是否96孔板细胞有特殊成分限制细胞及碎片脱落？另外，我想对两种重组病毒进行精确定量，不知选哪种方法更好，谢谢！

作者: bling 时间: 2013-5-11 16:22

您好!现在我也用杆状病毒-昆虫细胞这个系统表达蛋白质,表达量也很低,请问你是怎样提高表达量的啊?十分感谢!!!

作者: loli 时间: 2013-5-11 16:23

你好，我也正做杆状病毒表达，蛋白80多KD，不是分泌性的，细胞直接做WESTERN已经检出，但是无法在电泳中看见蛋白，请教如何改进能提高表达量，得到蛋白。谢谢帮助！

作者: idea2011 时间: 2013-5-11 16:23

为什么有病变,但是就是没有蛋白表达呢.
最近在用BAC-TO-BAC表达一个蛋白,大概180KD.以前师兄做过,现在再用到这个蛋白.一开始老板要求从新构建穿梭质粒,PCR鉴定成功,没有构建目的蛋白特异性引物.转染细胞有病变,P3后提蛋白,SDS-PAGE没有发现目的条带,WB也没有发现,后用师兄几年前做的病毒上清(-80保存)从新扩,再次感染,有病变,提蛋白仍然没有发现目的蛋白,敬请各位师兄帮我分析问题可能出在什么地方.
最起码我师兄以前用过的病毒上清不可能都框移啊.
多谢.

作者: tangxin_80 时间: 2013-5-11 16:25

你好，我用bac-to-bac系统表达了一个病毒的结构蛋白，之前感觉表达量很高，可以用WB检测出来，但是最近又共表达了该蛋白和另一个蛋白，用间接免疫荧光可以检测到目的蛋白，但用WB就是做不出来（阳性对照有带），不知道怎么回事.希望有人给予解答，谢谢！

作者: nn255 时间: 2013-5-11 16:25

我也正在做杆状病毒的昆虫表达，我表达的蛋白大约60KD，用His单抗做WB的时候结果是阳性，但是SDS-PAGE分辨不出目的蛋白，在做蛋白纯化的时候由于用的是含牛血清Grace培养基，牛血清蛋白是68KD，跟我的目的蛋白差不了多少，而且我发现牛血清蛋白也能挂Ni柱，导致我的蛋白纯化结果很糟糕。现在正在尝试使用无血清培养基，改用传代较少的细胞，看看表达量能不能提高。我提蛋白的目的是为了做单克隆抗体，不知道这一步能不能克服。有做相关研究的大家经常交流一下！

作者: nn255 时间: 2013-5-11 16:26

急请教各位大侠：
是不是昆虫细胞传代次数太多了会影响蛋白表达？传代次数太多了会不会也影响转染啊？

作者: yjf1026 时间: 2013-5-11 16:26

向大虾们求助：

目前在做昆虫的杆状病毒蛋白表达，想要做空斑试验来检测病毒滴度。

请问在此试验中使用的是哪种琼脂糖？

有很多参考上是说，4%琼脂糖，但是不知道这个所谓的琼脂糖是否必须是特殊的低熔点的琼脂糖，考虑的是昆虫细胞生长的温度为27℃，而且不耐压。
如果您实验室曾经做过此试验，望告知你们所使用的琼脂糖是哪种？是低熔点的还是普通型的？

非常感谢！望能及时回复！

作者: chenshuanhe 时间: 2013-5-11 16:26

我也在用杆状病毒体系表达蛋白（细胞是sf9），出现了明显的细胞病变，从SDS-PAGE看没有明显的表达，用anti-his tag的单克隆单体做western blot也没有出现，请问是什么原因呢，请高手指点

作者: veiwu 时间: 2013-5-11 16:27

请问大家都是表达什么蛋白呢？有做植物蛋白的吗？

作者: chenshuanhe 时间: 2013-5-11 16:27

我也在用杆状病毒体系表达蛋白（细胞是sf9），出现了明显的细胞病变，从SDS-PAGE看没有明显的表达，用anti-his tag的单克隆单体做western blot也没有出现，请问是什么原因呢，请高手指点

==========================================================================

有时候P1，P2是检测不到自己的目的蛋白的。一般用P2做表达优化时，WB检测了就一目了然了。

作者: gmjghh 时间: 2013-5-11 16:28

P2-P6代病毒，病变都很明显，用His单抗做WB就是检测不到蛋白的表达，这蛋白是一截短的蛋白。
表达完整的蛋白，用His单抗做WB就可以检测到蛋白的表达了，但表达量很低。
为什么看到明显的病变而检测不到蛋白呢？

作者: star#room 时间: 2013-5-11 16:28

挑白斑后提取的rbacmid,只用外源基因本身的特异性引物做PCR能说明外源基因正确重组了么？
M13引物对太难扩出来了。

作者: NBA 时间: 2013-5-11 16:29

有时候P1，P2是检测不到自己的目的蛋白的。一般用P2做表达优化时，WB检测了就一目了然了。

================================

表达优化要从何入手？
呵呵，问了一个比较泛的问题。
谢谢^-^

作者: ladyhuahua 时间: 2013-5-11 16:30

大家好！还有人在做昆虫细胞表达吗？我现在做到表达阶段啦，SDS-PAGE电泳检测一直没目的蛋白呢，转染有病变产生。希望大家能讨论下，帮帮忙！十分感谢！

作者: qiangren789 时间: 2013-5-11 16:30

相关疾病：
感染
各位战友们：
我也是做昆虫细胞的感染表达实验的，但是我的感染后细胞病变不是很明显，我感染的时候没有加抗生素，但是6小时以后就又换成抗生素和FBS的培养基了，之前做过没有加抗生素，但是后来有污染，所以就加了抗生素，是不是抗生素对细胞感染有很大的影响呢？还有细胞在怎样的状态的时候感染效率是最高的？请各位战友们帮帮忙，谢谢！！！
还特别请问coffejumps
感染后上清浓度太低的话是怎么浓缩的呢？谢谢谢谢！

作者: duoduo 时间: 2013-5-11 16:31

我们使用的胰酶过了有效期，浓度是0.5%（1640配制），一般0.25%就好了。消化很快呀（3-5min），你再试试。

You are welcome. Good luck!

================================

想请假下sf9和sf21哪个细胞更好一点儿？

作者: ffaa 时间: 2013-5-11 16:31

QUOTE:

原帖由 duoduo 于 2013-5-11 16:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我们使用的胰酶过了有效期，浓度是0.5%（1640配制），一般0.25%就好了。消化很快呀（3-5min），你再试试。

You are welcome. Good luck!

================================

想请假下sf9和sf21哪个细胞更好一点儿？ ...

最好都试一下，还有highfive细胞。哪种好就用哪个来表达，扩增病毒通常用sf9，高效表达通常用highfive。

作者: duoduo 时间: 2013-5-11 16:32

QUOTE:

原帖由 ffaa 于 2013-5-11 16:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

最好都试一下，还有highfive细胞。哪种好就用哪个来表达，扩增病毒通常用sf9，高效表达通常用highfive。

哦，好的，非常感谢！您有这方面的材料吗，可否给我发一些，我邮箱:dongwuyixue217@163.com,细胞说明书上只说sf9比sf21传的代次低一些，至于在培养病毒和表达蛋白方面的差异没有说！

作者: ffaa 时间: 2013-5-11 16:32

QUOTE:

原帖由 duoduo 于 2013-5-11 16:32 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

哦，好的，非常感谢！您有这方面的材料吗，可否给我发一些，我邮箱:dongwuyixue217@163.com,细胞说明书上只说sf9比sf21传的代次低一些，至于在培养病毒和表达蛋白方面的差异没有说！ ...

您好，不知道您使用的杆状表达系统是invitrogen还是merk公司的产品？关于产品的说明，官方网站上都有比较详细的资料。如果您还没有开始做，推荐您使用merk公司最新一代的表达载体，个人觉得会比帖子中讨论的invitrogen公司的这套系统要好。

我手头上的一些文献都是针对我所研究的相关病毒蛋白表达情况，可能并不适用于您。

另外想说明的一点，杆状病毒表达系统并不是可以随心所欲的表达目的蛋白，真核表达、可溶解，这些都是建立在对拟表达蛋白所对应的目的基因的了解和改造，包括做一些稀有密码子的优化，基因5‘端二级结构的消除，加上一段促分泌的肽，或者3’段加上一段帮助蛋白折叠的蛋白标签等等。

作者: duoduo 时间: 2013-5-11 16:32

QUOTE:

原帖由 ffaa 于 2013-5-11 16:32 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

您好，不知道您使用的杆状表达系统是invitrogen还是merk公司的产品？关于产品的说明，官方网站上都有比较详细的资料。如果您还没有开始做，推荐您使用merk公司最新一代的表达载体，个人觉得会比帖子中讨论的invitrogen公司的 ...

您好！非常感谢您的回复，从您的回复来看您对BEVS表达系统非常熟悉，我们用的是invitrogen公司的表达系统，而且我本人没有做过真核表达载体的构建工作，只是拿别人构建好的载体也就是重组杆毒接种了悬浮培养的sf21细胞，然后得到纯化的目的蛋白，对这个纯化的目的蛋白作为亚单位疫苗的免疫效果进行一系列的评估。不过我对这个系统比较感兴趣，所以想多了解一下。您最后一段讲的我至听说过密码子优化的问题，其他一些基本都没有听过，可能我们做这个东西做个还是少没有考虑过这么复杂的问题！再次感谢您的回复，希望有机会和您多多交流！

作者: wsll 时间: 2013-5-11 16:33

各位大侠，我目前也在做Bac-to-Bac，一直拯救不出来P1代病毒，希望大侠指点啊。Q

作者: dalian0725 时间: 2015-11-20 13:03 标题: 回复 #1 ffaa 的帖子

我想问一下，你说的无添加成分是不是只有Grace粉溶于水中就行，不用添加水解乳蛋白，酵母浸出液，碳酸氢钠？
转染试剂用脂质体转染试剂行吗？
你质粒是用什么方法提取的？

作者: dalian0725 时间: 2015-11-20 13:07 标题: 回复 #20 jujuba 的帖子

我想问你一下你手提质粒的方法是什么

作者: dalian0725 时间: 2015-11-20 13:11 标题: 回复 #24 gemei0115 的帖子

我也是手提质粒，但RNA浓度老高了，我想问一下你的具体方法是什么

作者: dalian0725 时间: 2015-11-20 13:21 标题: 回复 #32 mamamiya 的帖子

同学我想问你一下你的提取质粒的具体方法和转染方法。
因为我用碱裂解的方法提取杆粒包括出样口有三四条带并且在最底下还含有一条特别亮的RNA带，脂质体转染sf9，没啥病变？转染时培养液用Grace培养液（Grace培养液用Grace粉，水解乳蛋白，酵母浸出液，碳酸氢钠来配制），却一直没有病变

作者: dalian0725 时间: 2015-11-20 14:45 标题: 回复 #35 okhaha 的帖子

我现在也在做这方面的，质粒用碱裂解的方法提，但是从上到下有四五条带，包括出样口的带还有最底下应该是RNA 带，脂质体转染sf9培养液用的是Grace（Grace培养液是由Grace粉，水解乳蛋白，酵母浸出液，碳酸氢钠）但是没啥病变。
就想借助于你们的提取质粒和转染的方法来进行实验

作者: dalian0725 时间: 2015-11-20 15:53 标题: 回复 #84 wsll 的帖子

亲你现在做出来了吗？我想借助你提取质粒和转染昆虫细胞的方法
因为我是用碱裂解的方法来提取质粒，大概有四五条带，包括出样口有带，最底下有RNA带。通过脂质体转染sf9，培养液用Grace（Gracce培养液由Grace粉，水解乳蛋白，酵母浸出液，碳酸氢钠配制）
但是老失败，所以想问你一下

作者: 932819102 时间: 2017-4-7 13:16

普健生物杆状病毒-昆虫表达系统蛋白表达目前还没有失败案例。提供从合成,亚克隆,制备,转染,表达,纯化,检测,大规模制备一站式服务,可以提供整套BEVS技术服务,对客户提供的基因序列分析测试,提供免费密码子优化,以提高蛋白表达量;同时,我们可以提供大规模BEVS蛋白生产,并根据客户需求进行纯化及生物活性测试。
杆状病毒-昆虫表达系统，凭借其易于筛选、具有翻译后修饰功能及高表达水平的优势，成为当今应用较广泛的真核表达系统之一，普健生物的杆状病毒-昆虫蛋白表达服务，采用经典的Bac-to-Bac 表达体系，并加以改进。在表达方式（胞内或分泌），信号肽选择，细胞培养方式及细胞选择（Sf9、Sf21、Hi5）方面有着丰富的案例经验。可为国内外药企，高校及科研客户提供高达200L的蛋白表达纯化服务。
普健生物杆状病毒-昆虫表达系统优势
1. 高成功率：普健生物杆状病毒-昆虫表达系统蛋白表达目前还没有失败案例。
2. 成熟的设计方案及条件筛选体系：根据蛋白性质选择胞内表达或分泌表达，针对分泌表达可为客户选择高效分泌信号肽。表达细胞：Sf9、Sf21、Hi5，通过测试不同时间的MOI，摸索最佳表达条件以达到最优表达量。
3. 大规模生产：可同时进行200 L体系的表达及纯化。
4. 一站式服务：基因设计及优化、病毒生产、蛋白表达条件优化、蛋白纯化及后续加工处理、数据及报告整理。

表达案例：
该蛋白服务订单，包含1L 表达及纯化。由于表达量达到了368mg/L（纯化后），纯化测试即可获得足量的蛋白。经客户验证，证明其活性良好，我们即刻交付约60mg 蛋白，该订单在纯化测试阶段结束。1L 放大及纯化费用退还予客户。

图片附件: qqqqqq.jpg (2017-4-7 13:16, 90.24 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=69000

作者: 932819102 时间: 2017-4-7 13:19

[qq]932819102[/qq]

QUOTE:

原帖由 932819102 于 2017-4-7 13:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
普健生物杆状病毒-昆虫表达系统蛋白表达目前还没有失败案例。提供从合成,亚克隆,制备,转染,表达,纯化,检测,大规模制备一站式服务,可以提供整套BEVS技术服务,对客户提供的基因序列分析测试,提供免费密码子优化,以提高 ...

www.atagenix.com

作者: 932819102 时间: 2017-4-7 13:19

[qq]932819102[/qq]

QUOTE:

www.atagenix.com

作者: flarebio 时间: 2017-4-13 16:01

我之前在武汉金开瑞生物做过细胞蛋白表达，价格比较划算，你可以搜下

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)