标题:
【求助】双分子荧光互补(BiFC)的荧光蛋白的选择
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作者:
birdfish
时间:
2013-5-13 16:28
标题:
【求助】双分子荧光互补(BiFC)的荧光蛋白的选择
各位战友,
最近想做双分子荧光互补检测蛋白相互作用,查了些文献,荧光蛋白基本选用的都是黄色荧光蛋白(YFP),由于我这里没有此载体且观察条件不具备,所以想用GFP或红色荧光蛋白代替,不知可否?那么应该怎么选择荧光蛋白的切割位点呢?请做过的战友指教。谢先!
作者:
birdfish
时间:
2013-5-13 16:28
这两天又仔细看了几篇文献,我就说说我的看法吧,也请大家帮我参考一下。
02年Molecular Cell一篇文章首先介绍了这种方法,主要是用来检测转录因子的相互作用。它用的是EYFP的1-154和155-238aa片段分别连在欲检测蛋白一端(还进行了一系列的试验寻找最佳可行的分割片段),如果蛋白相互作用,两个YFP片段靠近,激发产生荧光。其后的几篇文章大多均采用此文章的方法。只有在04年PNAS的一篇文章,介绍了用BiFC的方法观察泛素化蛋白的方法(的确是好方法!),他用的是YFP的1-172aa和CFP(蓝色荧光蛋白cyan)155-238(搞不懂哪来这么多荧光蛋白!)两个片段共同激发荧光。
我根据Molecular Cell的那篇文章提供的几个特定位点氨基酸找到了他们所用的YFP是clonetech公司的pLP-EYFP载体上的YFP,与pEYFP载体的YFP不同!
然后拿这个序列跟GFP比对发现他们竟然有90%多的一致!再仔细看他们的载体说明,晕!原来YFP是GFP的变体蛋白,只改造了几个aa。
通过它们的三维结构看,1-154aaYFP包含了整个桶装蛋白片层结构的大部分,且最后约10多个aa片层在另外四个片层之间。GFP如果按此进行分割则具有同样的特征。
所以我想,GFP是不是应该可以按照YFP的分割方式进行?它的三维结构是不是能够说明这样的分割方式最佳?
抛砖引玉,希望诸位战友能够提些建议。
YFP:蓝色部分是1-154AA,第154aa用红色显示。
图片附件:
56317340.gif
(2013-5-13 16:28, 15.21 KB) / 该附件被下载次数 12
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16207
作者:
youyou99
时间:
2013-5-13 16:29
我也有做一下BiFC的打算,请问您现在决定怎么做了么?
作者:
birdfish
时间:
2013-5-13 16:30
我就说说我现在的情况把,希望对你有用。
现在再回头看当时的想法,的确是有很多不完善的地方,主要原因还是当时文献查的不充分。
我首先是按照当时的想法构建了GN154和GC155,但结果并没有预期的荧光出现,于是又重新仔细查了文献才发现,nature在03年又有一篇同一作者的文章,是介绍多重双分子荧光的,那篇文章对GFP、YFP、CFP等几种荧光蛋白均作了不同切割方式的组合,其中就已经发现GFP不论怎样分割都不会有荧光出现的。看到这篇文献后,我狂吐血!
于是,我根据那篇文章的结果重新构建了载体,还是由于没有YFP的原因,我采取了GN173和CC155的组合,CC155与GC155仅在N端不远处仅有一氨基酸不同,我采用了定点突变的方法从GFP获得CC155(我也没有CFP,晕!),构建好载体之后,原本以为可以了,转染细胞之后才发现还是不行。无奈之下,给作者发了个Mail询问原因顺便也想直接要点质粒,老外说GN173和CC155的组合的确可以发荧光,但是会很弱(produces very low signal),建议我采用YN173和YC173组合。看了之后,我又是狂吐血!近两个月啊。。。。。
所以,至今我还在为这事犯愁。。。
如果你想做,建议你还是采用老外的建议,以免重蹈浪费时间精力的覆辙。如果哪位战友能慷慨提供YFP或CFP(Clontech)质粒,那本人更是感激不尽!
有时间我会再把那篇03年文献传上来,以供参考!
2003 Simultaneous visualization of interactions between multiple proteins in living cells using multicolor bimolecular fluorescence complementation analysis
1.15M,好大,传不上来,可以通过NCBI查得到。
作者:
wood533
时间:
2013-5-13 16:31
我看了那篇paper 了,xray19你可以和老外要一下那些质粒。谢谢你的经验和教训!
作者:
birdfish
时间:
2013-5-13 16:31
问问题,老外很热心,一提到要载体,就没信儿了。
还是自己再想想办法吧
作者:
66小飞侠
时间:
2013-5-13 16:32
你好,gfp只能在157和158之间切。
作者:
ffooll
时间:
2013-5-13 16:32
你好,
谢谢你的建议!我要到了YFP,准备构建YN173和YC173,再看看吧
不成功便成仁了。。。呵呵
作者:
ffooll
时间:
2013-5-13 16:33
有诸多战友翻到这篇老贴,短信问我BiFC的情况,由于这个账号目前较少使用,导致有些战友的问题没有及时解答,现将当时实验的结果简要解释下,希望能对需要的战友有帮助。
荧光蛋白的选择,建议先看看这篇综述 Fluorescence complementation: an emerging tool for biological research,这几年这方面发展很快,已有多种荧光蛋白证实可用于BiFC。
我当时用的是yfp,分别在173位置和155位置切割,173构建入 pCMV-HA载体,155为老外赠送。所用细胞主要为293FT,后来也在HeLa,AML12, CV1等细胞进行验证,有相互作用的蛋白均可以发出明显荧光。
一般是转染后30h,将细胞由37度培养箱转移至30度,继续孵育3-4h,这样大大会增强荧光的产生。不过,近来发展的利用VFP等荧光蛋白,对温度的要求大大降低。
图片附件:
88808233.snap.jpg
(2013-5-13 16:33, 24.46 KB) / 该附件被下载次数 23
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16209
作者:
yonger
时间:
2013-5-13 16:33
我做BiFC是找国外人要的!
作者:
yueban-1147
时间:
2013-5-13 16:37
最近也得做,为什么lz说GFP不能做呢,看的确很多文章用的是v,y,c等等倒是也有文章也是用到了啊,条件限制只有绿色的 望指导
作者:
huifeng0516
时间:
2013-5-13 16:38
谁说GFP不能做了。楼主看文章不仔细啊。这个技术最早的时候就是用GFP做出来的,只是没有命名为双分子荧光互补技术而已。是2000年发表的一篇文章,详情见cuturl('http://www.yale.edu/reganlab/index.html')。
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