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标题: 【讨论帖】western blotting试验技术讨论 [打印本页]

作者: ukonptp 时间: 2013-5-13 18:04 标题: 【讨论帖】western blotting试验技术讨论

to 各位群友：

麻烦大家就Western blotting实验原理、试剂准备、操作流程、注意事项、经验总结和各种疑难问题解答等内容进行讨论，谢谢。

作者: ukonptp 时间: 2013-5-13 18:06

我先来谈谈Western blotting 试验原理吧，算是抛砖引玉哦！！

蛋白免疫印迹（Western blotting、Western blot 或Immunoblotting）是先将组织样品通过电泳使不同分子量的蛋白质跑到一个横断面上，然后将蛋白质转移到膜上，再通过膜上蛋白抗原与一抗、标记二抗反应，最后用化学发光法检测，再用X胶片显影，拍照后量化，从而间接反映组织中蛋白含量。与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛地应用于定量检测蛋白的表达水平。

简单技术路线流程：

组织样品制备——垂直电泳——转膜（和丽春红染色）——牛奶封闭——一抗孵育——二抗孵育——ECL化学发光——X胶片显影——拍照和用图像分析染件定量。

作者: ukonptp 时间: 2013-5-13 18:08

试剂准备：

1、组织样品制备：RIPA裂解液、PMSF;

2、灌胶：去离子水（可用三蒸水代替）、Acr/Bis、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、10%SDS、10%Ap和TEMED；

3、垂直电泳：4度电泳缓冲液、冰块、考马斯亮蓝及其洗脱液；

4、转膜：4度转移缓冲液、冰块、去离子水、自来水、丽春红染液、考马斯亮蓝及其洗脱液；

5、封闭：5%脱脂牛奶、DPBS；

6、抗体反应：一抗、二抗、抗体稀释液、5%脱脂牛奶、DPBS和PBST；

7、化学发光：ECL发光剂（A液和B液，分pg和fg级）；

8、X胶片显影：显影液、定影液、自来水。

作者: ukonptp 时间: 2013-5-13 18:10

欢迎大家就Western blotting试验技术操作流程、注意事项、常见问题及其解答进行热烈交流，谢谢。

作者: mimili_901 时间: 2013-5-13 18:11

关于灌胶：
1．注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。

2．分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.7~0.8:100, 分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000）即可，如室温较低可升高10%AP及TEMED浓度到《分子克隆》建议浓度。

3．封胶：
灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。封胶后切记，勿动。
待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴。片刻后倒掉SDS，将玻璃板倒立放置片刻控净。

4．灌好浓缩胶后1h拔除梳子，注意在拔除梳子时宜边加水边拔，以免有气泡进入梳孔使梳孔变形。拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶，随后用0.1%的SDS封胶。若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正；若变形严重，可在去除残胶后用较薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。30min后即可上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。

ps: 10%的AP最好现配现用，如在4℃存放勿超过两周。30%的丙烯酰胺如有沉淀，最好弃掉。

作者: finger 时间: 2013-5-13 18:12

我刚做不久，有一下几点体会：
1.根据目的蛋白分子量选择合适的实验条件：如分离胶的浓度，转膜的电压设置
2.抗体的优化：如果实验室没人用过，则新买的抗体一般要做预实验，摸索一下合适的稀释浓度
3.显影时曝光时间，由于对样品中目的蛋白浓度不是很清楚，为得到好的效果，一般需要做几个时间的片子，我们采用是2-3张底片叠一起曝光，最上面的底片就相当于曝光时间短。
4.封闭：一般用脱脂牛奶，但有人说抗羊抗体的话用FBS比较好
5.抗体分装，避免反复冻融
6.信号灵敏度：一抗可4度过夜，二抗则要2h即可。
大家指正

作者: fei1226com 时间: 2013-5-13 18:12

做了1个多月的WB，有几点体会：
1.玻璃板用两个星期左右可以泡次酸，这样很容易洗干净；
2.浓缩胶一定要等1小时左右再拔梳子，特别是现在天冷，凝得慢，急不得；
3.AP配置分装后-20度冻存，两周内使用都有效；
4.TEMED不是越高越好，提高用量胶是凝得快，但是胶很脆，易碎；
5..丽春红染色并不是金标准，有时候做小分子量的蛋白用丽春红染膜就不太明显，这时不要认为失败了，继续做下去，同样会有结果；
6.NC膜不用泡甲醇，泡甲醇的NC膜会出现皱缩的现象；（自己误操作）
7.一抗37度过夜也能出条带，且有非特异性的条带出现；这个现象自己不清楚原因，此后都是按照标准的4度过夜。思考，如果说在37度的条件下抗体更容易结合，那么孵一抗的时间可以适当缩短。
8.用脱脂奶粉的封闭液一定要现用现配。
大家多多交流

作者: kuaizige 时间: 2013-5-13 18:12

关于显示：个人认为用碱性磷酸酶系统显示更直观，更好控制，更简单方便。

作者: 987789 时间: 2013-5-13 18:13

那我就谈谈试验中要注意的一些问题

一、样品的处理
1、若蛋白需保持活性，那么全部操作需在冰上进行，并且在裂解液中加入蛋白酶抑制剂，防止蛋白降解。
2、如果需要检测磷酸化的蛋白，那么裂解液中必须加入磷酸酶抑制剂。
3、样本定量时注意选择受buffer成分影响的方法，或者尽量降低溶剂成分对定量结果的干扰，以保证蛋白定量的准确。
4、样本如果需长期保存，可以放于-80度冰箱中，切记反复冻融。
5、样本上样需适宜，过少会检测不到所需要的蛋白，过多可能导致背景升高。

作者: 987789 时间: 2013-5-13 18:14

二、蛋白分离
1、分离胶不要倒得太满，需要有一定浓缩胶的空间，否则起不到浓缩效果。
2、PAGE胶在0.5-1h内凝聚最好，过快表示TEMED、APS用量过多，胶太硬易龟裂；太慢则说明两种试剂用量不够或系统试剂不纯或者失效。
3、混合搅拌速度太快产生气泡影响聚合，太慢不均匀，都能导致电泳带畸形。

作者: 987789 时间: 2013-5-13 18:15

三、转膜
1、膜的选择从结合蛋白的能力上看，PVDF膜（100-200微克/平方厘米）比硝酸纤维素膜（80-100微克/平方厘米）高；就物理强度而言，硝酸纤维素膜较脆，易破碎，而PVDF膜韧性较强；但是硝酸纤维素膜的背景较PVDF膜要低。另外，对于小分子量的蛋白（小于20kDa）一般用0.2微米孔径的膜，而大分子量的蛋白一般用0.45微米孔径的膜。
2、戴上手套接触油纸、凝胶和膜，因为手上有油脂会阻断转移。
3、排去滤纸、胶和膜之间的气泡，因为气泡会产生短路。
4、转移后效果的鉴定：染胶：考马斯亮蓝检测极限可达1.5微克
染膜：一般采用丽春红，染色后，色素可以被洗掉，膜可以用做进一步分析。

作者: 987789 时间: 2013-5-13 18:15

四、封闭和杂交
1、常见的封闭液有BSA和脱脂奶粉，脱脂奶粉的封闭能力比较强，一般我们采用5%的脱脂奶粉溶于TBST中作为封闭液。
2、一抗与二抗我们用5%的BSA或TBST进行稀释；一抗我建议4度过夜，这样抗原抗体结合更充分。
3、0.1%Tween-20溶于TBS中配成洗涤液，在一抗与二抗结合完毕后洗膜三次，减少由于抗体粘附而引起的非特异性显色。

作者: 喇叭花 时间: 2013-5-14 12:29

我做了半年的western blotting，从一个新手到基本完成western blotting试验，也谈一些个人的经验，仅供同学们参考学习：
1：灌胶：现在到冬天了，气温低，胶不容易凝，可开启空调提高室温，或则加大TEMED的量。
2：玻璃板第一次用可以泡酸过夜，以后就用洗衣粉洗干净即可然后在烘箱里烤干就可以灌胶了
3：加样的时候，未加样的孔加SDS上样缓冲液，避免边缘效应
4：一抗稀释液我用的是0.5%BSA，用TBS稀释，二抗稀释液用的是3%脱脂奶粉效果不错
5：膜接触了金属(比如镊子等)，容易导致荧光淬灭，和膜接触的东西最好保持干净比如保鲜膜，曝光夹等

作者: standbyme 时间: 2013-5-14 12:29

做了三个月的western blot，有些心得想和大家一起分享。
1、组织蛋白提取
组织蛋白提取方面得明确自己所要提的蛋白定位在细胞的哪个位置，胞浆、细胞膜、细胞核，不同位置的蛋白提取方法是不一样的。本人检测的指标是大鼠肾脏组织核蛋白，刚开始直接采用碧云天裂解液P0013B来提取蛋白质，说明书介绍说裂解核蛋白能力相当强，就按照说明书提蛋白的步骤提取总蛋白，可是提取的总蛋白经电泳后发现蛋白在浓缩胶压缩的很不理想，估计是直接提取肾脏组织总蛋白浓度太高的原因（BCA定量显示 180000ug/ml），因而不合适，后来采用专门的核蛋白裂解液配方才成功提取了核蛋白。因此，我觉得碧云天的裂解液并不是万金油，还是得根据具体情况选择最佳的蛋白提取液。
2、灌胶
首先一定要将玻璃板清洗干净。早晨清洗玻璃板时，可用洗洁精或者洗衣粉等清洗玻璃板，然后在60℃的烤箱里把水分烤干。烤干的玻璃板再装上，一般就不会漏。检测是否会漏胶我是先灌蒸馏水，5min内若蒸馏水的液面不下降或者只降低一点点那就不影响灌胶了，可放心配胶。分离胶加的量不可太多，否则上样泳道就过浅，减少了上样量。分离胶的聚合时间最好保证有40min的聚合时间，虽然多加了过硫酸铵和TEMED的话可以加快聚合速度，但是我不推荐。认真做好一块胶是做好后续实验的基础。
3、电泳
从历届师兄以及个人实验，我觉得蛋白样品在浓缩胶时的电压为80V，时间为20min左右，在分离胶时可以提升到110V，直至溴酚蓝将抛出为止，整个电泳时间大概在120min左右，当然分离胶浓度不同的话时间会有所差别。
4、转膜
多次的实验摸索让我对转膜颇有心得。有条件的话最好用新鲜配制的转移缓冲液，最好不要超过三次，否则缓冲液的成分发生改变，你用同样的转膜条件就不一定能有一样好的转膜效果了。个人觉得似乎恒压转膜要强于恒流转膜，虽然有人说采用恒压转膜可能会因为甲醇的挥发导致电流不平稳，不利于转膜，但我采用恒压效果还是相当不错的。
5、封闭
我们实验室采用10%的脱脂奶粉封闭，时间一般为2~3h，但是我是封闭过夜，效果不错，背景淡，特异条带突出。当然这跟一抗、二抗的稀释度也是有关系的。背景很深的园友可以考虑4℃封闭过夜。
6、一抗
刚开始一抗稀释度的摸索可以按说明书上限的两倍来摸索，比如说明书说1：100~1：500，我们可以从1：1000来摸索，我的指标就是这样子，其他人也很多这种情况，好的结果一抗的稀释度不一定在说明书的稀释范围。
一抗的孵育时间最好是室温摇床2h后再放入4℃冰箱过夜，利于抗原抗体结合。
7、二抗
二抗的孵育时间为1.5h~3h，不想等的话1.5h就够了，一般是2h
8、漂洗
用TBST漂洗PVDF膜 15min*3次 TBST最好两天换一次，放置过久，吐温失效。
9、曝光
在暗室里曝光时若能看到目的蛋白的荧光条带最好不过，若是不能看到也不要气馁，可以压片10min，再看看曝光效果。另外胶片从显影液取出放置定影液之前时先过一下水可以延长定影液的使用时间。我观察到用久了的定影液定影时间显著长于新配的定影液，若你发现定影得花上2min时间时，说明你的显影液定影液都得换了。。。。
不足之处，请其他战友多多补充，一起交流。。。。

作者: hold住 时间: 2013-5-14 12:29

把WB的步骤和注意事项贴出来吧，供大家参考：
1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。
1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。
2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。
3）将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。
4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。
5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。
6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。
2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。
3. 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。
4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。
5. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。
6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。
7．袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧。
8．混合：NGS(100微升)，印迹缓冲液中的抗体（10毫升），加在装薄膜的袋中，于室温下摇动2小时（或4℃过夜）
9．用总体积300ml PBS-Tween缓冲液，分4次在一浅盘中洗涤薄膜，每次75ml。
10. 将连接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升 NGS）加在袋内，于室温下摇动1小时。
11．按步骤9洗涤。
12．加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升 NGS），于室温下摇动。

作者: flower-201 时间: 2013-5-14 12:30

现在天气冷，我们做胶曾经1.5个小时都不凝，后来将胶加水封后放入37度隔水式培养箱，很快就凝了（约25分钟），而且胶的质量也不错，经实验证实没有差别。
需要注意的是放入培养箱内动作要轻，且保持水平，否则做出来的胶是斜的且后面加浓缩胶后交界线不平整。

作者: 3N4G 时间: 2013-5-14 12:30

我是新手，发现显影之后有些带有点朦胧不清晰，而且有时候带呈现弯曲状态，有的好像连跑胶的时候的泳道也显出来了，这是什么原因呢？

作者: 3N4G 时间: 2013-5-14 12:36

MARKER显出来是怎么回事呢?

作者: orangecake 时间: 2013-5-14 12:37

现在天气冷，我们做胶曾经1.5个小时都不凝，后来将胶加水封后放入37度隔水式培养箱，很快就凝了（约25分钟），而且胶的质量也不错，经实验证实没有差别。
需要注意的是放入培养箱内动作要轻，且保持水平，否则做出来的胶是斜的且后面加浓缩胶后交界线不平整。

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请问你的胶中AP浓度是多少？通过增加AP的量可以促进胶凝固，但不能太大否则很快凝固。我们分离胶一般10ml胶中加10%AP为80-100ul即可；而浓缩胶一般6ml中加10%AP为60ul左右即可。

作者: 天蝎座 时间: 2013-5-14 12:37

我是新手，我来谈谈我的经验和教训：
1，膜一定要标好蛋白面，否则实验多了，特别是膜放久了，stripping后重新做时容易搞不清蛋白面。我一般常规在蛋白面朝下的左上角上剪缺。
2，电泳时间：浓缩胶时的电压为100V，时间为20min左右，在分离胶时可以提升到200V，直至溴酚蓝将跑出止，或者目的条带到板子下三分之一就可以了。整个电泳时间大概在60min左右，当然分离胶浓度不同的话时间会有所差别。
3，转膜建议湿转，较半干转效率高，而且不容易转过。

作者: zzzz 时间: 2013-5-14 12:38

是啊 western blotting 追常用了

作者: wu11998866 时间: 2013-5-14 12:39

我做的蛋白条带间总是有连接,不好看.有的还弯弯曲曲的.是因为加样时太满溢出来的原因吗?上样量一共14微升,多吗?大家有什么好办法可以使条带之间有空隙,怎样做才能又直又齐呢?

作者: huifeng0516 时间: 2013-5-14 12:39

上样量一共14微升多不多要看你的目的蛋白浓度啊。
蛋白条带间总是有连接,不好看.有的还弯弯曲曲的，原因可能是胶的问题，要不然就是你的蛋白多了，减少点试试

作者: wu11998866 时间: 2013-5-14 12:40

谢谢楼上，蛋白条带显色后脱尾是什么原因?

作者: wu11998866 时间: 2013-5-14 12:40

图附上,内参有的拖尾,条带之间有连接,不齐,大家有什么建议吗?谢谢.

图片附件: 71750349.snap.jpg (2013-5-14 12:40, 17.72 KB) / 该附件被下载次数 16
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16225

作者: douding66 时间: 2013-5-14 12:41

我正做Western blot，C-JUN，但是跑出的带在70Kd，而C-JUN的分子量是43kd,已经重复了3次，结果1都一样，我的分离胶浓度10%。为什么会这样？请各位前辈帮我分析原因何在？多谢

作者: douding66 时间: 2013-5-14 12:42

我的经验如下:
1.蛋白抽取后最好分装成5次左右的量,这样以后再用的时候就不要反复冻融了,反复冻融蛋白会降解.
2.配胶:首先玻璃一定要洗干净,同时根据你的目的基因的大小决定胶的浓度,要想得到漂亮的图片,配好后最好用针头冲洗干净加样孔.
3.电泳:初次做实验蛋白上样量最好做不同梯度的,同事不要为了省事就120V跑到底,最好分离胶的时候用80V跑半小时左右.
4.转膜:熟能生巧,不要用气泡,必要是可以湿转.
5.染色,标记膜.同时转几张膜时Marker可以上样在不同的位置,以示区分.
6.封闭和一抗:抗体很关键.我们曾经因为抗体不好做了半天的都有.买抗体的时候如果BD, Cell signaling等公司有,就不要选择Santa Cruz 的.新的抗体要摸最佳稀释浓度.
7.二抗和显影.

Good luck!

作者: ukonptp 时间: 2013-5-14 12:42

我做的蛋白条带间总是有连接,不好看.有的还弯弯曲曲的.是因为加样时太满溢出来的原因吗?上样量一共14微升,多吗?大家有什么好办法可以使条带之间有空隙,怎样做才能又直又齐呢?

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结合自身经历，原因分析如下：

1、蛋白条带间总是有连接，提示蛋白上样量是否过高？降低蛋白量看看有无改善。14微升量不算多，主要看你加上的蛋白量的多少。我加过15ul的条带都是分开的。

2、蛋白条带弯弯曲曲的，可能与电泳缓冲液配制、PH值和电泳设备有无质量问题等相关。建议重新配制电泳缓冲液试试看（也可把配方发出来我们来分析一下组分），若效果不佳的话，更换电泳仪试试看。

作者: mimili_901 时间: 2013-5-14 12:44

最近要做WB了，在提的胞核蛋白中要同时跑三种不同的蛋白，对于一抗的选择很是苦恼啊。我做大鼠的，已经订了一种一抗，是兔抗大鼠的，不知道另外两个能否也订兔抗大鼠的，那样就能用同一个二抗了。希望各位能多多指教。

作者: ukonptp 时间: 2013-5-14 12:44

QUOTE:

原帖由 mimili_901 于 2013-5-14 12:44 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

最近要做WB了，在提的胞核蛋白中要同时跑三种不同的蛋白，对于一抗的选择很是苦恼啊。我做大鼠的，已经订了一种一抗，是兔抗大鼠的，不知道另外两个能否也订兔抗大鼠的，那样就能用同一个二抗了。希望各位能多多指教。 ...

我的观点是：

1、若三种蛋白的分子量相差较大，可以通过一次电泳和混合一抗反应进行。那么一抗都可以用兔抗大鼠的。但是条件摸索的确有点费时。

2、若混合一抗反应效果不佳，也可先用同一张膜进行一种抗体反应，做好后，用抗体去除液进行去除后再用另一种抗体进行反应，依次进行即可。

3、若三种蛋白的分子量相差较近，那就不能同时进行抗体抗原反应，那就不存在这个选择问题，但建议还是用同一个来源的一抗，这样二抗就买一种就可以了。

作者: rxcc33 时间: 2013-5-14 12:45

我觉得ＷＢ最关键的是抗体～有一个好的特异性强的抗体比什么都重要～
近来备受一个血清抗体的折磨，唉，痛苦中

作者: ukonptp 时间: 2013-5-14 12:47

只要你做过WB试验，你一定会有成功的经验或者失败的教训；只要你言之有物，我就会投你一票的，版主也会加你一分的。这可能对你不重要的，更重要的是每一个人都这样把自己懂得的知识都分享出来，这就是一本用钱买不到的专著（现实中的太偏见了）。

作者: gmjghh 时间: 2013-5-14 12:48

这里主要谈谈封闭、孵育和洗涤：
一.封闭（block）封闭是为了使我们的抗体仅仅只能跟特异的蛋白质结合而不是和膜结合。常用的封闭液有bovine serum albumin(BSA)，non-fat milk，casein，gelatin，tween-20等，我们一般用non-fat milk。
在转移结束前配好5%的Milk(TBST溶解)。转移结束后将膜放入milk中block(一定要放在干净的容器里，避免污染而且要足以覆盖膜)，并清洗整理好用过的滤纸，以便下次使用。 Block 4°C O/N，或 RT 1小时。
二.(1).孵育一抗:
A.先将需要检测的抗体准备好，并决定好它们的稀释度。
B.配好5%的Milk(TBST溶解)，按要求稀释好抗体。注意，如需高比例稀释，最好采用梯度稀释。
C.将稀释好的抗体和膜一起孵育。一般采用RT 1小时，可根据抗体量和膜上抗原量适当延长或缩短时间。
注意：为了便于后面分析结果，我们一般会选用已确定分子量大小而且纯度高的抗体作为marker与一抗同时孵育。
(2).孵育二抗:
孵育 RT1 小时。一般采用HRP标记的二抗，稀释比例为1:5000。二抗的稀释比例不能太低，否则容易导致非特异性的结合。注意二抗的选择有多种，要根据一抗来选择抗兔、抗鼠或者抗羊的二抗，以及根据后面的显色条件来选择HRP、AP或者GOD（葡萄糖氧化酶）酶链的二抗或者标志其他探针（如核素等）的。
三.洗涤:
一般用 TBST先快速洗三次，把milk尽快的wash掉。然后5mins *5。洗涤是为了洗去二抗的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅，所以洗涤一定要干净。

作者: ukonptp 时间: 2013-5-14 12:48

显影问题请教：

我最近做了一次WB，结果发现：同一张膜，我在孵育3min后，分别压了两张胶片（上右为图1，压片 2min和上左为图2，压片8min）；然后又继续再压了5min（见下右图3）。请教各位战友，这三张图出现了不同趋势的结果（同一张膜），哪一张图片更加可靠，请多多指教，谢谢！！！

图片附件: 64481768.snap.jpg (2013-5-14 12:48, 19.84 KB) / 该附件被下载次数 20
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16226

作者: rxcc33 时间: 2013-5-14 12:49

我做的蛋白条带间总是有连接,不好看.有的还弯弯曲曲的.是因为加样时太满溢出来的原因吗?上样量一共14微升,多吗?大家有什么好办法可以使条带之间有空隙,怎样做才能又直又齐呢?

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可能是上样量过多或者加样时太快，蛋白溢出来了。如果做0.75的板子，可能出现这种情况，建议上样量大时做1.5的板子。弯弯曲曲可能是你配胶时没有摇匀，我的经验是加AP,TEEMED前后都要摇匀，这样做出来的胶跑出来的条带才漂亮。还要注意SDS出现混浊也不要用了。

作者: rxcc33 时间: 2013-5-14 12:49

还要提醒大家一点：
大家看抗体说明书时，除了抗体稀释度，作用条件，时间以外，还要注意不同的抗体，洗膜时也可能不同。前段时间做P-ERK时，说明书上就写明洗膜时用水洗两遍，PBST洗2-3min,再用水漂几遍就可以了。我用这个方法条带出来了，背景也很干净。

作者: rxcc33 时间: 2013-5-14 12:50

还有个问题，有没有做磷酸化蛋白的啊？
今天看一个师姐做磷酸化的蛋白时她在封闭液里面也加了磷酸酶抑制剂，大家觉得有必要吗？

作者: rxcc33 时间: 2013-5-14 12:51

显影问题请教：

我最近做了一次WB，结果发现：同一张膜，我在孵育3min后，分别压了两张胶片（上右为图1，压片 2min和上左为图2，压片8min）；然后又继续再压了5min（见下右图3）。请教各位战友，这三张图出现了不同趋势的结果（同一张膜），哪一张图片更加可靠，请多多指教，谢谢！！！

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你的蛋白是有两个条带的吗？如果不是，建议你压多张片子时下面的片子用双面胶固定，不然拿上面的片子可能挪动下面的片子，造成重影。

作者: tangxin_80 时间: 2013-5-14 12:53

1.我们用的转膜缓冲液都重复了很多次了，效果没有什么不好。原来电泳缓冲液不敢重复用，后来有个经验丰富的老教授说，用一次就扔掉太浪费了，现在重复用三次，电泳的结果也不错。
2.一抗重复，尝试过，有时效果不受影响，有时就根本出不来，由于是用5%脱脂奶粉稀释一抗，奶粉即使4度放置时间久了也会变质，所以现在不再重复用了。有一次竟然闻到奶粉有异味，毅然决定不用重复的一抗了，不过如果用其他的稀释液可以重复试试，没有经验。
3.磷酸化蛋白检测比较麻烦，有的要求蛋白变性时要用温和些的条件，比如降低变性温度等。如果蛋白丰度低或者磷酸化蛋白，推荐piecer(貌似拼写的不对，：）)的敏感型发光底物，一次对比就有感觉啦。

作者: rxcc33 时间: 2013-5-14 12:54

QUOTE:

原帖由 tangxin_80 于 2013-5-14 12:53 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

1.我们用的转膜缓冲液都重复了很多次了，效果没有什么不好。原来电泳缓冲液不敢重复用，后来有个经验丰富的老教授说，用一次就扔掉太浪费了，现在重复用三次，电泳的结果也不错。
2.一抗重复，尝试过，有时效果不受影响，有时就根本 ...

我们转膜常规重复使用三次。电泳液是下缓冲液倒掉，上缓冲液保留，下次使用时做下缓冲液用。

作者: ukonptp 时间: 2013-5-14 12:55

QUOTE:

原帖由 rxcc33 于 2013-5-14 12:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我们转膜常规重复使用三次。电泳液是下缓冲液倒掉，上缓冲液保留，下次使用时做下缓冲液用。

我们一般两侧都用回收的垂直电泳缓冲液，而中间的加一半回收+一半新鲜的电泳缓冲液。

作者: ukonptp 时间: 2013-5-14 12:55

讨论主题之一：

ECL发光多长时间及其后显影和压片条件如何把握到X胶片最佳状态（背景浅、条带较深且体现出真实结果）？

——因为实践中发现，ECL孵育时间的不同，条带的完整性和亮浅可能不同；压片时间的长短和在ECL孵育后不同时间压片均可能出现不同结果；显影时间长短和温度均对背景、条带深浅有影响？

作者: bring 时间: 2013-5-14 12:55

做过一年的WB，现在已经洗手不干了，说一下自己关于ECL压片时间的经验教训
ECL的压片时间，首先如果暗室中能够看到亮带，时间要短一点，一般1-2分钟压一张先看一下，其次看要做的是什么蛋白，如果是B-actin，时间一般要短一点，因为含量比较高，最后要看是用的哪一中ECL，我只用过一种，是国内联科代理的国外的一个品牌，孵育时间3分钟的。

作者: avi317 时间: 2013-5-14 12:56

ECL的孵育时间不是由自己决定的，说明书有规定，大部分是孵育一分钟时间后就可以沥干，用保鲜膜包好放入暗盒固定。不同的ECL结合HRP出现荧光的时间不一样。我用过两种ECL ，一种是碧云天生产的AB液，每瓶各6.25ml，价格一百多，挺贵的；另外一种是北京全式金生产的，ABC液，AB各50ml，C瓶75ul，对比之后发现全是金的效果似乎更好一些，价格也是一百多。在暗室中大概要过30S到1min左右才开始出现荧光条带，越来越强。因此，关上暗盒前你得先观察清楚荧光条带的强弱再判断曝光时间。一般如果能明显看到条带的话，可以从30s开始摸索，1min、3min作对照；看不到荧光的话的确很令人沮丧，但不要轻易放弃，你可以压片10min，有时候也是能出结果的。因为我在没有红灯的环境中操作，显影时间没特别关注，每次显影时间大概在2min左右，定影后感觉效果还可以。不知道其他战友情况是怎么样的

作者: 8princess8 时间: 2013-5-14 12:56

我是新手，发现显影之后有些带有点朦胧不清晰，而且有时候带呈现弯曲状态，有的好像连跑胶的时候的泳道也显出来了，这是什么原因呢？

根本原因是你loading的蛋白太多了（overloading），不管你上样多少微升，实际上样的蛋白总量不能太多，过量的蛋白在孔里面是跑不好的。
建议你蛋白样品先稀释下，比如5倍，然后再上样。
自己在摸索下吧，估计就是这个问题。

作者: 8princess8 时间: 2013-5-14 12:57

相关疾病：
雀斑

我最近做了一次 WB，结果发现：同一张膜，我在孵育3min后，分别压了两张胶片（上右为图1，压片 2min和上左为图2，压片8min）；然后又继续再压了5min（见下右图3）。请教各位战友，这三张图出现了不同趋势的结果（同一张膜），哪一张图片更加可靠，请多多指教，谢谢！！！

先不说你的条带本身的问题。你认为这三种图片有本质区别吗？
我认为没什么不一样，三张都可信，就看你想看那条带了。曝光强了，弱带自然出来了，很正常啊。
打个比方：如果你打老远看到一个人长得很漂亮，这没错。然后你带上眼镜走进仔细看，发现原来他脸上隐隐有些雀斑，如果你用放大镜贴到他脸上再看，有发现原来他的皮肤也有些粗糙。
那你说这三个看到的结果你相信哪个？

作者: gogo 时间: 2013-5-14 13:05

我在做抗体杂交袋的时候，一做好，马上就加膜和抗体稀释液进去，后来发现袋子是漏的．所以我建议大家在做好杂交袋的时候最好先装ＰＢＳＴ试下袋子是不是漏的，否则抗体就浪费了．我们用的抗体最贵的一只价格５０００多，量还不多．很浪费啊！

作者: finger 时间: 2013-5-14 13:05

由于我的实验内容只有我一人做，组内其它人不同。受资金所困，我做的其它两种蛋白只能买国产的一抗了，请大家推荐一个国内相对一个比较好的公司吧。谢谢各位了！另外有人知道核因子Nrf2的抑制剂是什么吗？

作者: ququer787 时间: 2013-5-14 13:06

正在做大鼠心肌细胞原代培养，准备检测一个蛋白表达情况，请问，细胞如何保存？

作者: rxcc33 时间: 2013-5-14 13:06

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原帖由 ququer787 于 2013-5-14 13:06 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

正在做大鼠心肌细胞原代培养，准备检测一个蛋白表达情况，请问，细胞如何保存？

预冷的PBS洗两遍，去上清后，放负20度或者负70度。

作者: duoduo 时间: 2013-5-14 13:09

电泳缓冲液可以重复用,只是会延长电泳时间.
BSA比脱脂奶贵很多,一般我们尽量用后者代替.
上样量均衡,样品就不会跑斜.
想要带型漂亮,低压,长时.
胶的浓度很重要.
预染marker对转膜很有帮助.

作者: DNA 时间: 2013-5-14 13:10

刚做western blot 不久，跟坛子的大家们相比还是新手小菜，这里就自己的一些教训及trouble shooting过程写出来，和大家一起讨论学习。
1）从公司order的胶不可靠，即便biorad也如此。而自己做胶，Tris-HCL的PH值比较重要，配制时间比较长的液体，比如超过1月，最好应该重新调PH值，不然就会增加band不够sharp的可能性
2）一抗可重复利用，不过要稀释在TBST里面，可以维持15天到1个月，内参可到2月
3）二抗要便宜的多，可以相对过量一些，不重复使用

作者: lgm 时间: 2013-5-14 13:10

现在低温。
前一天晚上在实验室做预示，室温24度，20分钟凝
晚上降温，第二天上实验课，教室温度太低，1个小时没凝。开空调，20分钟搞掂。

作者: queen 时间: 2013-5-14 13:10

谈起显影与压片，呵呵，正好刚搞好。
暗室操作：15W小红灯，经测试，没问题，不会曝光
压片：用片盒啦，反正一般我们是把膜用保鲜膜一包，然后把底片放在上面，曝光十分钟后，打开片盒，把底片转的方向，再用原来没曝过的地方再曝光一次，个人不喜欢把底片切来切去。
显影：我买的现成显影粉，定影粉，溶解后避光保存。使用时有温度要求，25度左右显影效果最好，低些温度的话，显影时间延长。另外，显定影时一定要多加些显影液与定影液，一定要使底片在里面能漂起来，否则底片有一面不会显影，最后结果是黑片。在显影后与定影前用水漂5-10分钟，可以使定影效果更好，而且延长定影液使用时间。定完影后，水洗20分钟，晾干。
显影与定影液都是可以回收的，反正我是回收好几次使用。

作者: 101010 时间: 2013-5-14 13:11

目的蛋白的一抗可以和内参的一起加吗？

作者: memory 时间: 2013-5-14 13:12

做了1个多月的WB，有几点体会：
1.玻璃板用两个星期左右可以泡次酸，这样很容易洗干净；
2.浓缩胶一定要等1小时左右再拔梳子，特别是现在天冷，凝得慢，急不得；
3.AP配置分装后-20度冻存，两周内使用都有效；
4.TEMED不是越高越好，提高用量胶是凝得快，但是胶很脆，易碎；
5..丽春红染色并不是金标准，有时候做小分子量的蛋白用丽春红染膜就不太明显，这时不要认为失败了，继续做下去，同样会有结果；
6.NC膜不用泡甲醇，泡甲醇的NC膜会出现皱缩的现象；（自己误操作）
7.一抗37度过夜也能出条带，且有非特异性的条带出现；这个现象自己不清楚原因，此后都是按照标准的4度过夜。思考，如果说在37度的条件下抗体更容易结合，那么孵一抗的时间可以适当缩短。
8.用脱脂奶粉的封闭液一定要现用现配。
大家多多交流

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NC膜不泡甲醇吗？我不过甲醇做不出来，膜总像坏了似的

作者: she 时间: 2013-5-14 13:13

ECL发光：
1.涂发光剂后数十秒即有很强荧光出现，而且持续很长时间，这是最好的现象，有时压片一个小时仍能看到强而稳定的荧光；
2.荧光很强但很快淬灭，说明二抗浓度太大，很快将底物耗竭，需要稀释；另外可能与环境温度有关，温度高酶活性就高，荧光也容易淬灭；
3.荧光弱但是可以持续发光，可能与上样量、蛋白浓度、一抗二抗稀释倍数都有关系；4.不发光，延长压片时间试试，若显影后仍未见条带，则需要从头开始分析原因了。

发光剂最好分装，避光保存，可延长有效期，孵育应在暗室中进行，A\B液1：1混合，我们一般用移液枪均匀涂于膜上，正好将膜覆盖即可，迅速盖上保鲜膜。压片及显影时间根据荧光强度及第一张胶片的结果调整，压片时双手和片盒保持干净干燥可避免胶片的上龙飞凤舞

我们所用的胶片来自医院放射科，牌子不记得了，感觉这种胶片灵敏度较高，弱信号仍能压出清晰的条带，而且对信号的获取速度也较快，可减少压片时间。

作者: xue258 时间: 2013-5-14 13:13

很羡慕楼上，弱信号仍能压出清晰的条带。我觉得我的条带荧光觉得已经比较强了，反而没有做出来，很是郁闷。
荧光淬灭的事情我很好奇。因为昨天做的好好的，突然拿镊子夹起来膜，把ECL液体用滤纸吸走的时候，突然发现条带看不见了。。。以前做没这样过哦。。不知道各位有没有遇到过类似的情况。
还有就是我买碧云天的东西，每瓶50ml，AB液，总共好像是285还是258。可能跟楼上的说的不完全一样。
谈谈我自己曝光的感觉。条带荧光强，压片的时间就相应缩短，我一般很强的就压30s，然后延长时间，条带很弱的话，就压片时间久点甚至压24个小时，呵呵，因为条件所限，没有暗室，只能每天晚上把PCR室占用了。。。

作者: PPT 时间: 2013-5-14 13:14

很羡慕楼上，弱信号仍能压出清晰的条带。我觉得我的条带荧光觉得已经比较强了，反而没有做出来，很是郁闷。
荧光淬灭的事情我很好奇。因为昨天做的好好的，突然拿镊子夹起来膜，把ECL液体用滤纸吸走的时候，突然发现条带看不见了。。。以前做没这样过哦。。不知道各位有没有遇到过类似的情况。
还有就是我买碧云天的东西，每瓶50ml，AB液，总共好像是285还是258。可能跟楼上的说的不完全一样。
谈谈我自己曝光的感觉。条带荧光强，压片的时间就相应缩短，我一般很强的就压30s，然后延长时间，条带很弱的话，就压片时间久点甚至压24个小时，呵呵，因为条件所限，没有暗室，只能每天晚上把PCR室占用了。。。

作者: 89tongzijun 时间: 2013-5-14 13:14

蛋白条带间总是有连接,不好看问题。谈谈自己的经验：
之前有做过一个蛋白，因为表达丰度比较低，所以上样量相应加大，最后就导致在目的蛋白条带能清楚显示的时候，内参条带间有连接，明显影响图片质量。
最后的解决办法：上样的时候不要连续上样，各间隔一个孔上样，最后图片就很漂亮了，个条带都是独立清晰明显。可以尝试一下。

作者: rxcc33 时间: 2013-5-14 13:15

最近要做WB了，在提的胞核蛋白中要同时跑三种不同的蛋白，对于一抗的选择很是苦恼啊。我做大鼠的，已经订了一种一抗，是兔抗大鼠的，不知道另外两个能否也订兔抗大鼠的，那样就能用同一个二抗了。希望各位能多多指教。

显影后可以洗脱液把抗体洗掉，就可以再用不同的抗体孵育了。

作者: rxcc33 时间: 2013-5-14 13:15

ECL发光多长时间及其后显影和压片条件如何把握到X胶片最佳状态（背景浅、条带较深且体现出真实结果）？

在暗室中能够看到亮带，时间要短一点，一般1-2分钟，还有在显影液中也不能太久，不然显影出模糊的背景，然后根据第一张显影的结果再进行调整，是可以获得最佳的结果的。

作者: INK 时间: 2013-5-14 13:16

很羡慕楼上，弱信号仍能压出清晰的条带。我觉得我的条带荧光觉得已经比较强了，反而没有做出来，很是郁闷。
荧光淬灭的事情我很好奇。因为昨天做的好好的，突然拿镊子夹起来膜，把ECL液体用滤纸吸走的时候，突然发现条带看不见了。。。以前做没这样过哦。。不知道各位有没有遇到过类似的情况。
还有就是我买碧云天的东西，每瓶50ml，AB液，总共好像是285还是258。可能跟楼上的说的不完全一样。
谈谈我自己曝光的感觉。条带荧光强，压片的时间就相应缩短，我一般很强的就压30s，然后延长时间，条带很弱的话，就压片时间久点甚至压24个小时，呵呵，因为条件所限，没有暗室，只能每天晚上把PCR室占用了。。。

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有荧光却没有做出来，是因为荧光淬灭吗？如果不是那胶片是否曝光，显影剂是否失效呢？
你所提到的荧光淬灭我也遇到过，有时不小心将盖PVDF膜的保鲜膜掀起，荧光就会突然淬灭，而有时候即使将PVDF膜夹起，荧光也不会淬灭。我觉得可能还是跟二抗浓度，二抗与底物反应时间以及当时的反应条件有关。
我们用的发光剂是中杉金桥的，也是AB液，每瓶50ml，还不错
太佩服你的耐心了，24个小时也压过，强！

作者: any333 时间: 2013-5-14 13:17

在提取核蛋白时的DTT用水溶解还是用乙酸钠溶解，二者有什么区别吗，对提核蛋白有什么影响吗？

作者: wawa 时间: 2013-5-14 13:18

我最近的WB条带也是弯弯曲曲波浪状的，不知有什么办法可以改变这种情况？

作者: rxcc33 时间: 2013-5-14 13:18

请教各位大侠：Tween20稀释成20%的后4°能放多久啊？

作者: ukonptp 时间: 2013-5-14 13:19

QUOTE:

原帖由 wawa 于 2013-5-14 13:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我最近的WB条带也是弯弯曲曲波浪状的，不知有什么办法可以改变这种情况？

我认为极有可能是胶的问题，因为不均匀或凝固不全或含有气泡等原因引起。建议配制胶时要充分混匀，且注意AP和TEMED的含量（与室温有关）。

作者: ALALA 时间: 2013-5-14 13:20

我正在准备做WESTERN，请师兄师姐们介绍一显影效果好又不贵的显影试剂盒。听说碧云天的效果不好，又不想太贵，请大家指点啊。

作者: plaa 时间: 2013-5-14 13:20

有哪位高手可以提供一下转膜时的选择标准，比如说：
小于10KDa的建议用多大的电压/电流转多长时间？
10-30KDa的建议用多大的电压/电流转多长时间
以此类推，有没有这样的标准或经验呢？

作者: zhezhe 时间: 2013-5-14 13:21

我们实验室用5%的脱脂牛奶稀释一抗，配的时候每一毫升抗体加10微升10%的叠氮钠，我们的一抗用好几个月（大约3个月）都可以，大家没有这么用的吗？

作者: 鲇鱼少爷 时间: 2013-5-14 13:21

做核蛋白的有用GAPDH做内参的吗？

作者: nut6694 时间: 2013-5-14 13:22

有哪位高手可以提供一下转膜时的选择标准，比如说：
小于10KDa的建议用多大的电压/电流转多长时间？
10-30KDa的建议用多大的电压/电流转多长时间
以此类推，有没有这样的标准或经验呢？

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我也在学习中，我们做的Caspase-3，17~19KD，说说我们的条件：5%积层胶，12%分离胶，积层胶20mA稳流，跑至溴酚蓝呈一条直线，大约40分钟；分离胶120V稳压，一直到溴酚蓝将至玻璃板底部，大约1.5h。具体时间与电泳液的使用次数有关。
转膜用孔径0.22微米的PVDF膜，半干转，电压10V，转25min，转膜效果还不错。
30KD的Bcl-2，我们用0.45微米的膜，10V，25min。
40,60KD的ERK，AKT，0.45微米PVDF膜，10V,30min。

作者: nut6694 时间: 2013-5-14 13:22

我们实验室用5%的脱脂牛奶稀释一抗，配的时候每一毫升抗体加10微升10%的叠氮钠，我们的一抗用好几个月（大约3个月）都可以，大家没有这么用的吗？

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我们也这么用，我们稀释一抗用5%BSA，不过不加叠氮钠，毒性太大，有点怕。放在4度冰箱避免反复冻融，孵一抗也在4度冰箱孵，可以反复使用一个月。并且我觉得用过几次的抗体最好用，不知大家有没有这种感觉。

作者: am10 时间: 2013-5-14 13:23

压片心得：
一开始老是掌握不好，不过现在总结的经验是：
进去荧光很亮，三秒钟搞定
如果隐约可见，10秒钟
如果没看到，第一张片子30s一般都会压出条带，实在不行，第二张要3分钟数200下。
还有二抗是可以重复使用，以前不敢，不过试过了蛮好了哈哈，省钱啊。

作者: XYZQ 时间: 2013-5-14 13:23

实验心得:

1.如果采用过夜封闭方法，时间比较长，但是一定要注意封闭液是否盖过了全部的膜!

2.封闭时最好使用BSA或专用的脱脂奶粉进行封闭，虽然贵点，但还是有个好点的结果!

3.转膜时的温度比较重要,最好保持在10度以下,可以用冰浴,也可以在转膜液中放入合适的事先准备的冰袋(-70度>3小时)(Bio-Rad),这样既可以降温又可以节约Buffer

作者: 我佛慈悲 时间: 2013-5-14 13:24

自己做了几十个wb，说下体会
1，样品：样品处理很重要，如果样品处理不好，导致目的蛋白丢失，你后面再怎么wb，也出不来结果，所以蛋白获得，这部非常重要。
2，灌胶：千万不要有杂质，这样你的带就容易微笑，灌胶加梳子后，可以再梳子上方再加点浓缩胶，这样可以减少胶凝后产生的塌陷
3，上样，样品得煮，而且loadingbuffer，也要配好，别出现颗粒，而且若有多余孔，得用loading buffer 补齐，要不带会往两边开
4，跑胶，理论上电压越小，分离得越好。我一般，浓缩80，分离120。根据实际情况而定吧，自己摸索。
5，转膜，我用的是半干转，剪裁的时候戴手套，不要摸膜，也不要用油性笔去做记号，裁滤纸，膜。三明治各层之间不要有起泡，
6，封闭，5%的脱脂或者3%的bsa ，室温两小时，或者浓度小点4度过夜
7，孵育，很重要的步骤，我一般将96孔板的盖子上面蒙层保鲜膜，再将膜放上去，然后直接将抗体滴在上面。一抗，二抗，比例得自己摸索，一般推荐比例内稀释。
8，洗脱，一般10min*3次，TBST
9，显影，做了上面这么多，就为了好的曝光结果，多花点心思，曝光多几张，你会有收获的，园里有曝光相关问题的帖子，大家搜索看
就这么多了，谁有好的拿出来分享吧

作者: 菠萝喵 时间: 2013-5-14 13:25

比较一下western所用的几种膜特性及优缺点：NC膜尼龙膜 PVDF膜

图片附件: 51334328.snap.jpg (2013-5-14 13:25, 57.82 KB) / 该附件被下载次数 26
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16227

作者: ukonptp 时间: 2013-5-14 13:26

每次做出来都是微笑条带，为什么呢？

作者: ukonptp 时间: 2013-5-14 13:26

请教各位大侠：Tween20稀释成20%的后4°能放多久啊？

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像Tween20，TritonX100等非离子型去垢剂我们实验室均为室温储存，时间不超过2个月，时间久了就会失效的，切记！！！

作者: ukonptp 时间: 2013-5-14 13:30

我们实验室用5%的脱脂牛奶稀释一抗，配的时候每一毫升抗体加10微升10%的叠氮钠，我们的一抗用好几个月（大约3个月）都可以，大家没有这么用的吗？

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如果要求较为严格的话，其实一抗配好后只可以使用一次的，因为会污染膜上脱落的小分子蛋白等，另外，抗体成分会随着杂交次数的增加而变化，因为PVDF膜以及膜上转移的蛋白会非特异地吸附很多抗体成分，还有就是抗体自身会发生一定程度的降解。

我们室通常使用抗体2-5次就更换（第一次通常背景较高），最好不超过1个月

作者: bananapeople 时间: 2013-5-14 13:31

蛋白免疫印迹（Western blotting 或 Immunoblotting）一般由凝胶电泳、样品的印迹和
免疫学检测三个部分组成。第一步是做 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，使待测样品中的蛋白质
按分子量大小在凝胶中分成带。第二步把凝胶中已分成条带的蛋白质转移到一种固相支持物
上，用得最多的材料是硝酸纤维素膜(NC 膜)和 PVDF 膜，蛋白转移的方法多用电泳转移（转移电泳），它又有半干法和湿法之分，现在大多用湿法。第三步是用特异性的抗体检测出已经印迹在膜上的所要研究的相应抗原。免疫检测的方法可以是直接的和间接的。现在多用间
接免疫酶标的方法，在用特异性的第一抗体杂交结合后，再用酶标的第二抗体（碱性磷酸酶
（AP）或辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗第一抗体的抗体）杂交结合，再加酶的底物显
色或者通过膜上的颜色或 X 光底片上暴光的条带来显示抗原的存在。该技术被广泛应用于
蛋白表达水平的检测中。

作者: 鸽子不哭 时间: 2013-5-14 13:32

楼主好啊：
我是做WB的新手，最近做的几次，目的蛋白条带不是所有样品孔都会发光，一般九个条带只有四五个会亮，把膜做了丽春红染色没问题，同一张膜做了内参也没问题，不知是怎么回事啊！在线坐等楼主的指点！！！

作者: 969 时间: 2013-5-14 13:33

我上的样品在堆积胶里压不成一条线，只有加大电压后在分离胶才能压成一条，这是为什么呢请高人指点！

作者: ladyhuahua 时间: 2013-5-14 13:33

电泳和转膜都没有问题，可是就是显色不行，不知道为什么，试剂也都重新换过了。可是还是不行，不知道哪位有高见啊！！！急急急急！！！1

作者: seven7 时间: 2013-5-14 13:33

我只想说两个问题

一.Western blot 结果做的好不好,转印这关很重要,转印液最好现配,或在一定时间内更换,因为里面的含有甲醇,还是容易挥发的.

二.显色,除了一抗二抗比例匹配之外,AP标记的二抗,要用AP显影液,我主要想说的是此是膜用NC膜比较好,条带更为清晰,HRP标记的二抗,要用ECL显影液,不推荐用DAB显色的方式,DAB显色主要用在ELISA上比较合适.AP显色时间不宜过长,否则背景会比较深

作者: pou 时间: 2013-5-14 13:34

1-4为样品泳道，5为加样缓冲液做的对照，其中无蛋白样品，但是在做杂交的时候却有条带产生，，做了多次都是这样的很困惑，希望高人指点。（能保证加样缓冲液没有被蛋白污染）

图片附件: 46398015.jpg (2013-5-14 13:34, 7.63 KB) / 该附件被下载次数 13
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16228

作者: hustwb 时间: 2013-5-14 13:34

条带怎么会这样的呀，中间少，两边粗

图片附件: 85347431.gif (2013-5-14 13:34, 1.78 KB) / 该附件被下载次数 22
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16229

作者: zwsyrt 时间: 2013-5-14 13:35

现在做b-actin出现怪异现象，总是在55kd和43kd出现条带。这个b-acitn，我实验室其他人用时只出现在43kd的。有没有人碰到过这种情况，是什么原因造成的。

作者: @花开花落@ 时间: 2013-5-14 13:36

我有两个相差1kD的目的蛋白（假设为a,b），二抗均为抗羊，先杂a再杂b的话，b的条带很弱但是a的条带还很强，先杂b再杂a则a的条带会很弱，总之二抗会累积而且很难洗掉一样，我试着增加一抗浓度，降低二抗浓度，结果好一些但仍然不够理想。用洗膜液洗了之后，残留的抗体是没了但是蛋白好像也被洗掉了。急求各位大侠帮忙。

作者: dreaming 时间: 2013-5-14 13:36

3、电泳
从历届师兄以及个人实验，我觉得蛋白样品在浓缩胶时的电压为80V，时间为20min左右，在分离胶时可以提升到110V，直至溴酚蓝将抛出为止，整个电泳时间大概在120min左右，当然分离胶浓度不同的话时间会有所差别。
4、转膜
多次的实验摸索让我对转膜颇有心得。有条件的话最好用新鲜配制的转移缓冲液，最好不要超过三次，否则缓冲液的成分发生改变，你用同样的转膜条件就不一定能有一样好的转膜效果了。个人觉得似乎恒压转膜要强于恒流转膜，虽然有人说采用恒压转膜可能会因为甲醇的挥发导致电流不平稳，不利于转膜，但我采用恒压效果还是相当不错的。
转膜时间有没有什么好的建议
我做的是92KD及44KD左右的蛋白

作者: @花开花落@ 时间: 2013-5-14 13:37

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3、电泳
从历届师兄以及个人实验，我觉得蛋白样品在浓缩胶时的电压为80V，时间为20min左右，在分离胶时可以提升到110V，直至溴酚蓝将抛出为止，整个电泳时间大概在120min左右，当然分离胶浓度不同的话时间会有所差别。
4、转膜
...

我用的恒流转膜，根据膜面积来确定转膜时间，比如面积为8.5x10.5cm2，200mA，转膜30分钟即可，另外要更加精确的话，建议只将目的蛋白处的胶转膜，因为整张膜转的话分子量小的会先转完，大的则需要较长的时间，等大的全部转完小的可能已转至滤纸上了。我转过43KD的，膜面积12cmx5cm,96mA,32',基本可以。

作者: dreaming 时间: 2013-5-14 13:37

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我用的恒流转膜，根据膜面积来确定转膜时间，比如面积为8.5x10.5cm2，200mA，转膜30分钟即可，另外要更加精确的话，建议只将目的蛋白处的胶转膜，因为整张膜转的话分子量小的会先转完，大的则需要较长的时间，等大的全部转完小的可能 ...

谢谢您的回复
这种方法还可以省膜，下次试试看
那92KD那个应该转多久呢

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-14 13:38

算起来我做WESTERN也有一年了，中间经历了很多，下面我也来谈谈；
自己做了近100次wb，说下体会
1，样品：样本一定要好，也就是说造模型一定要严格控制条件，只有模型成功了才能有好的结果，否则后面即使WESTERN条带做得再好看也得不到好的趋势图。再次就是提蛋白，一定要注意在冰上操作，使用的裂解液我用过biyuntian的RIPA(强，中，弱）还有p0013b,c都用过，有时蛋白做不出来我一个样同时用好几种裂解液提蛋白，分别作western,看那种裂解液效果好，然后找到一个相对好的就一直用了。
2.定量：开始做western时每次都做BCA蛋白定量，后来发现做得曲线拟合度特别好，做完后内参还是不一致。后来干脆都不定量了，开始时对组织一定要称量，以前不称量发现有的发光后相差好几倍，所以一定要称量，这也相当于定量，使数量级一样。现在我基本上不定量，每次提完样先每个加5ul做一次内参，然后根据内参曝光结果再做微调。不过有时调2，3次还调不奇，最郁闷的是同样的上样量，今天做和明天做都不太一样。有时候一起跑的二块胶结果都不一样。所以得到一个一致的内参真是可遇不可求。可能是我的方法不成熟，或是westernt体系不稳定，欢迎大家指点如何调内参一致。
3，灌胶：用过博士德的AR0138很便宜，也很好用，也用过碧云天的配胶试剂盒，稍微比博士德贵点，康为世纪的相对很贵，300多，听说他们的定位是中国的abcam,定位为高端产品，质量不错，由于考虑价格，我还没用过，不过听别人说很不错，因为他们的东西都是用进口的。
4，上样，样品我现在一般煮10min,效果不错，用得是碧云天的5乘上样缓冲液
5，跑胶，理论上电压越小，分离得越好。我一般，浓缩80，分离120。也试过90，130，或者100V跑完全程，效果都可以，我觉得关键在于胶要配好，电泳液要配好。
6，转膜，半干转，湿转我都做过，由于湿转花的时间太长，我现在一般半干转，开始时我们科一般用恒压25v,30min做100KD，用得是0.45PVDF膜，但是特别容易转过，有时转20min都转过了，后来一次偶然的机会一个同学发现0.2um的PVDF转的效果特别好，转不过，后来我们就一直用0.2的了。为了摸转膜条件，我经常25V,分别转30min,45min.60min,75min，分别试分别染胶染膜看效果，也是过30v,35v恒压转30min,45min,50min,虽然伯乐半干转要求不能超过25V,但实际上超过了也没事，但就是转完后膜有一些发热。后来一次机会到别的科师姐那做半干转（她们用的是六一半干转），他们做了很多100以上的分子，都是横流，膜面积*5，做得都不错，我在我们科做130左右的蛋白一直做不好，那次用他们的转膜方法作出条带了，所以他别高兴，后来就一直用横流了，他们m膜面积*5用的是普通滤纸，我们用的是伯乐超厚滤纸，后来我在伯乐半干转上用普通滤纸，横流膜面积*5,50min,也能作出130左右的蛋白了，现在我又做了一些改进，用超厚滤纸，横流，膜面积*5,35min做100一下的蛋白，效果不错。三明治各层之间不要有起泡，
7，封闭，5%的脱脂或者3%的bsa ，我现在一般37°，90min,效果不错，背景很少，但背景与一抗好不好，洗膜等有关
8 孵育，有封口袋加静音混合器4度过夜摇法，以及膜倒扣法，有时想快点出结果，我试过一抗RT90,60min,都可以，但4°过夜效果好一些
9洗脱，一般6in*3次，PBST
10,显影，用的是伯乐的曝光系统，很方便The immunoblotting was visualized with ChemiDocXRS (Bio-Rad Laboratory, Hercules,CA
欢迎大家指正

作者: @花开花落@ 时间: 2013-5-14 13:39

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原帖由 dreaming 于 2013-5-14 13:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢您的回复
这种方法还可以省膜，下次试试看
那92KD那个应该转多久呢

92KD的带我没单独转过，只是以前整张膜转的时候转过，大概10cmX12cm,200mA,45-50min,具体的只能自己摸索了，如果不需要整张转的话建议只转目的带大小的胶，不过切胶的时候注意别把目的带切掉了。可以隔一段时间掀开看下，看胶上marker还有不。

作者: @花开花落@ 时间: 2013-5-14 13:40

确定胶上蛋白转完与否，可以转膜之后对胶做个考染，看目的蛋白处还有条带不，也可以更好地确定转膜时间。

作者: 89tongzijun 时间: 2013-5-14 13:41

最近做western比较郁闷，目的条带背景较高，不清楚，而内参条带清楚，请大家帮忙分析下原因。
我们实验室是半干转，封闭3h后一抗孵育4度过夜，二抗一般孵育半小时。
还有就是压片时看着条带清楚，怎么压出片来看却很模糊呢？
请高手指点。谢谢！急！急！急！

作者: @花开花落@ 时间: 2013-5-14 13:42

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原帖由 89tongzijun 于 2013-5-14 13:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

最近做western比较郁闷，目的条带背景较高，不清楚，而内参条带清楚，请大家帮忙分析下原因。
我们实验室是半干转，封闭3h后一抗孵育4度过夜，二抗一般孵育半小时。
还有就是压片时看着条带清楚，怎么压出片来看却很模糊呢？
请高手 ...

背景高有几个原因：二抗浓度高；洗二抗时间不够；在显影液中显影时间长；胶片曝光了。
压片时如果看到荧光很强，曝光时间就要降低，我有一次只曝了15秒，显影后条带还很黑，条带模糊是压片时间过长，导致荧光也把条带周围的区域曝光了。用灵敏度低一点的蓝色胶片会好一点。

作者: #甜# 时间: 2013-5-14 13:43

两种蛋白分子量相差多大可以进行一次电泳或是混合一抗？

作者: flower-201 时间: 2013-5-14 13:44

WB，我要用到LC3抗体，想知道LC3A/B/C是怎么回事啊？

作者: H2O 时间: 2013-5-14 13:44

问大家个问题：
如果同一批蛋白，做几个不同的指标，每次上样量都一样，每一次做目的蛋白的同时都要做内参嘛，还是内参只做一次就可以了，或者内参做个2-3次如果重复性很好以后的其他目的蛋白就不用做内参了？因为看好多文献做许多目的蛋白但是只给一次内参条带，不知道是为了节省文章容量少放点图还是实际实验操作中就是只做一次内参的。

作者: ququer787 时间: 2013-5-14 13:45

问大家个问题：
如果同一批蛋白，做几个不同的指标，每次上样量都一样，每一次做目的蛋白的同时都要做内参嘛，还是内参只做一次就可以了，或者内参做个2-3次如果重复性很好以后的其他目的蛋白就不用做内参了？因为看好多文献做许多目的蛋白但是只给一次内参条带，不知道是为了节省文章容量少放点图还是实际实验操作中就是只做一次内参的。

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如果实验条件比较稳定，同一批样品做一次内参即可。做不同的指标，如果分子量差异较大，尽量争取在一张或者两张膜上解决，我一般就是这样，一张膜最多可以解决4-5种抗体，加上strip一次，很多时候都是一张膜搞定。

作者: wood533 时间: 2013-5-14 13:47

那我就谈谈试验中要注意的一些问题

一、样品的处理
1、若蛋白需保持活性，那么全部操作需在冰上进行，并且在裂解液中加入蛋白酶抑制剂，防止蛋白降解。
2、如果需要检测磷酸化的蛋白，那么裂解液中必须加入磷酸酶抑制剂。
3、样本定量时注意选择受buffer成分影响的方法，或者尽量降低溶剂成分对定量结果的干扰，以保证蛋白定量的准确。
4、样本如果需长期保存，可以放于-80度冰箱中，切记反复冻融。
5、样本上样需适宜，过少会检测不到所需要的蛋白，过多可能导致背景升高。

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如何确定上样蛋白量？？

作者: ffooll 时间: 2013-5-14 13:50

如何确定上样蛋白量？？

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BCA assay

作者: ffooll 时间: 2013-5-14 13:51

问大家个问题：
如果同一批蛋白，做几个不同的指标，每次上样量都一样，每一次做目的蛋白的同时都要做内参嘛，还是内参只做一次就可以了，或者内参做个2-3次如果重复性很好以后的其他目的蛋白就不用做内参了？因为看好多文献做许多目的蛋白但是只给一次内参条带，不知道是为了节省文章容量少放点图还是实际实验操作中就是只做一次内参的。

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每一张膜上都需要一个control
文章中人家没有放上去而已,你要是做了,审稿人就不能挑这里的毛病了

作者: ffooll 时间: 2013-5-14 13:51

两种蛋白分子量相差多大可以进行一次电泳或是混合一抗？

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一抗尽量不要混在一起用,因为很多抗体有非特异条带,运气不好就在你的target protein附近,到时候你不知道哪条带是你真正的信号
最好的办法是把转好的膜切开,分别用不同的一抗

作者: ffooll 时间: 2013-5-14 13:52

我用的恒流转膜，根据膜面积来确定转膜时间，比如面积为8.5x10.5cm2，200mA，转膜30分钟即可，另外要更加精确的话，建议只将目的蛋白处的胶转膜，因为整张膜转的话分子量小的会先转完，大的则需要较长的时间，等大的全部转完小的可能已转至滤纸上了。我转过43KD的，膜面积12cmx5cm,96mA,32',基本可以。

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还要看你用百分之多少的胶,胶的厚度是多少
我的条件是900mA 50min 12% 1.5mm的胶,基本上从10kD 到180kD的都挺清楚,当然,protein越大越不好转
我的条件80kD以上就不能转完全了,但是对我来说足够检测,实际使用的时候可以适当增加转膜时间

作者: redbutterfly 时间: 2013-5-14 13:52

有杂带的情况下各位怎么确定目的条带？

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-5-14 13:54

各位师兄老师们好，小弟最近要做WESRTN bolt,用试剂盒提取的细胞的膜蛋白，但是不知道用什么作为内参，请各位师兄指点下，谢谢

作者: 米囡 时间: 2013-5-14 13:55

超级新手提问，我想做植物的western，不知道抗体是不是有物种的特异性，必须是同一种属的才能用吗？还是其他植物可以使用拟南芥的抗体呢？如果针对某一特别的植物公司没有现成卖的是不是要自己制备抗体了啊？谢谢各位啦

作者: uaubc 时间: 2013-5-14 13:55

我们也这么用，我们稀释一抗用5%BSA，不过不加叠氮钠，毒性太大，有点怕。放在4度冰箱避免反复冻融，孵一抗也在4度冰箱孵，可以反复使用一个月。并且我觉得用过几次的抗体最好用，不知大家有没有这种感觉。

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mark 抗体的反复使用

作者: nn255 时间: 2013-5-14 13:56

不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上，转移效率低怎么样解决？
　　可以考虑：转移缓冲液中加入20%甲醇（是指终浓度）(优化的转移缓冲液，可以参考《蛋白质技术手册》)，因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交联；低浓度胶，如低至6％。太大时还可以考虑用琼脂糖胶；提高转移电压／电流；增加转移时间

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