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标题: 【分享帖】秀出你的western转膜条件 [打印本页]

作者: woshiduiyan 时间: 2013-5-16 16:51 标题: 【分享帖】秀出你的western转膜条件

除了抗体原因，转膜是怕是western成败的最关键因素。
看到园子里好多好多人在求助转膜时间，园子为何总结出一系列分子量蛋白转膜的时间呢？少说这对于大多数新手来说，是极好的礼物，说大点，借助丁香园的强势人气，此举可以提高我国一线科研人员WB水平也未必。我认为不用摸转摸条件的话,WB的效率提高数倍不成问题。

请大家多多提供一线转膜经验
也请园子里管事的兄弟姐妹多思量，我希望可以发起一个全园子的征集计划，由本板块版主负责筛选归纳。

[ 本帖最后由 woshiduiyan 于 2013-5-16 17:39 编辑 ]

作者: orangecake 时间: 2013-5-16 16:51

对这个方向不大熟悉，但我想应该包括下列几个方面，请战友们费心了，谢谢。

蛋白来源：
蛋白名称（可保密）：
蛋白分子量：
WB用膜类型、孔径：
转膜方式（恒压、恒流）：
转膜时间：
转膜设备:
转膜液的配制：（如甲醇的比例和是否加SDS以及多大质量浓度等）

图片（可选）：
建议改进方向（可选）：

作者: zwsyrt 时间: 2013-5-16 16:52

蛋白来源：肌肉细胞膜
蛋白名称（可保密）： ***
蛋白分子量： 50--80 kDa
WB用膜类型、孔径： NC膜/PVDF膜(本次试验的结果选用的是NC膜)
转膜方式（恒压、恒流）：半干转恒流50mA
转膜时间： 70 min

图片（可选）：
建议改进方向（可选）：

作者: 9900 时间: 2013-5-16 16:52

蛋白来源：RAW264.7 总蛋白
蛋白名称（可保密）：一些转录因子
蛋白分子量：40~70KD
WB用膜类型、孔径：0.45 NC
转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒流400mA
转膜时间：60~90min

PS.其实吧，以我的经验来看，除非目的蛋白特别小，或者特别大，不然转膜时间真的不是那么重要
曾经因为失误，转了15min就拆下来了，但从丽春红染色来看，跟平常实验也没有太大的区别

作者: one 时间: 2013-5-16 16:52

蛋白来源：内皮细胞总蛋白
蛋白名称（可保密）：occludin & AKT
蛋白分子量：65KD & 56KD
WB用膜类型、孔径：0.45 PVDF
转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压 100V
转膜时间：60~70min
同意“ycwzq”所说的“除非目的蛋白特别小，或者特别大，不然转膜时间真的不是那么重要”。
鉴于“wcm123_1980”版主所提的意见，我把目的蛋白名字也秀出来了，设备名字是“Bio-Rad mini”。

作者: 2541 时间: 2013-5-16 16:53

蛋白来源：乳鼠心肌细胞和成年鼠心肌组织总蛋白和核蛋白
蛋白名称（可保密）：保密
蛋白分子量：65KD & 55KD
WB用膜类型、孔径：PVDF（预先用甲醇处理）
转膜方式（恒压、恒流）：半干转恒压 12V
转膜时间：30-40min
设备：“Bio-Rad mini”
建议：最开始做过湿转（过夜的那种），太费事费时，效果也不如半干转；

作者: 9900 时间: 2013-5-16 16:54

蛋白来源：293T细胞
蛋白名称（可保密）：
蛋白分子量：95KD & 35KD
WB用膜类型、孔径：PVDF
转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压 90V-110V,控制电流不要超过300mA。
转膜时间：70min

作者: eric930 时间: 2013-5-16 16:55

相关疾病：
肿瘤
蛋白来源：肿瘤手术标本
蛋白名称（可保密）：转录因子
蛋白分子量：33KDa
WB用膜类型、孔径：PVDF膜
转膜方式（恒压、恒流）：350mA 恒流
转膜时间：150 min
转膜设备: 湿转 Bio-Rad

说明：相同条件曾用于数个30-70KDa的蛋白，都能成功转上，不过没有试缩短时间效果如何；
实验时没为转膜条件苦恼，倒是电泳时胶的浓度及时间根据不同分子量而有区别。

作者: eric930 时间: 2013-5-16 16:55

蛋白来源：成纤维细胞
蛋白名称（可保密）：smad3
蛋白分子量：54KDa
WB用膜类型、孔径：PVDF膜
转膜方式（恒压、恒流）：350mA 恒流
转膜时间：150 min
转膜设备: 湿转 Bio-Rad

作者: IAM007 时间: 2013-5-16 16:55

蛋白来源：胰腺癌细胞
蛋白名称（可保密）：
蛋白分子量：16KDa and 42KDa
WB用膜类型、孔径：PVDF膜
转膜方式（恒压、恒流）：120V 恒压
转膜时间：90 min
转膜设备: 湿转 Bio-Rad

作者: 98776langtao 时间: 2013-5-16 16:56

蛋白来源：大鼠血管平滑肌细胞
蛋白名称（可保密）：保密
蛋白分子量：72KD，42KD 和22KD
WB用膜类型、孔径：一般的PVDF膜
转膜方式（恒压、恒流）：湿转，恒流一张膜0.26A，两张膜0.3A. 转膜时间: 90min
设备：“Bio-Rad mini”
建议：转膜缓冲液最多用3次，最好现用现配，我们用的没有加SDS，转的时候最好能用冰块一类的东西降一下温，这样转的效果要好一些，转的时候一定要把三明治每层之间的气泡除去，同时使滤纸大于膜，膜大于胶，以免烧坏电极。

作者: windy+++ 时间: 2013-5-16 16:56

蛋白来源：大鼠PBMC
蛋白名称（可保密）：保密
蛋白分子量：55KD
WB用膜类型、孔径：0.22的PVDF膜
转膜方式（恒流）：湿转，转膜时间: 60-90min
设备：“Bio-Rad mini”
建议：转膜液用过两三次之后转膜效果就很差了其它按照常规就好了
其实0.22的膜一般不怕转过头以我们的经验，转膜时间、电压其实
也有很大范围的调整，并不是非要固定于哪一个最合适，曾经做过
一张膜转，17KD的和170KD的，按照170KD的条件，17KD的转膜也很好的
（没有过头）

作者: 49888 时间: 2013-5-16 16:57

蛋白来源：人非小细胞肺癌细胞系
蛋白名称（可保密）：保密
蛋白分子量：大于250kD
WB用膜类型、孔径：millipore PVDF膜 0.45um
转膜方式（恒压、恒流）：湿转，恒流0.3A. 转膜时间: 180min
设备：“Bio-Rad ”
建议：电转保持电压在70V以上，保持低温，如果电压低过70就需要换缓冲液了。
附一张图，是用数码相机微距拍的。

图片附件: 26704049.snap.jpg (2013-5-16 16:57, 5.35 KB) / 该附件被下载次数 18
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16279

作者: 04906 时间: 2013-5-16 16:57

蛋白来源：白血病细胞
蛋白名称（可保密）：保密
蛋白分子量：28KD
WB用膜类型、孔径：0.45的NC膜
转膜方式（恒流）：湿转，90min，0.25A
设备：“Bio-Rad ”
建议：海绵厚度要合适，一次转磨用的海绵太薄，导致三明治没夹紧，转膜后拿出来一看，marker都变得七扭八歪。但是有前辈说垫的海绵太厚可能将胶压断，没经历过，不知道是不是会有这种情况

作者: tianmei001 时间: 2013-5-16 16:58

蛋白来源：肿瘤细胞
蛋白名称（可保密）：磷酸化蛋白
蛋白分子量：10-200KDa
WB用膜类型、孔径：millipore PVDF膜 0.45um
转膜方式（恒压、恒流）：120v 恒压
转膜时间：120 min
转膜设备: 湿转 Bio-Rad

建议：转膜缓冲液只用2次，基本都转上，5%BSA封闭，减少背景

作者: viviwang1987 时间: 2013-5-16 16:58

蛋白来源：胰腺β细胞
蛋白名称（可保密）：******
蛋白分子量：90-130KDa
WB用膜类型、孔径：PVDF膜
转膜方式（恒压、恒流）：250mA 恒流
转膜时间：150 min
转膜设备: 湿转

作者: bamboo16 时间: 2013-5-16 16:59

蛋白来源：原核表达
蛋白名称（可保密）：保密
蛋白分子量：38KD
WB用膜类型、孔径：0.45 NC
转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压：100V
转膜时间：120min

作者: pengke1983 时间: 2013-5-16 16:59

蛋白来源：心脏
蛋白名称（可保密）：
蛋白分子量：220kDa，130kDa，70kDa,41kDa
WB用膜类型、孔径：PVDF
转膜方式（恒压、恒流）：恒压
转膜时间：70v120min，180min，5-6h
转膜设备:伯乐湿转

图片（可选）：
建议改进方向（可选）：40kDa一下，70v 60-90min足够，40-70kDa 90-120min即可。
70-120kDa 70v120-180min足够，120-180kDa 180-240min，180kDa以上建议6h

作者: u234 时间: 2013-5-16 16:59

蛋白来源：卵巢癌细胞膜蛋白
蛋白名称（可保密）：
蛋白分子量：53KD
WB用膜类型、孔径：PVDF膜 0.45um
转膜方式（恒压、恒流）：恒压
转膜时间：80V 100min
转膜设备: 湿转 Bio-Rad

图片（可选）：
建议改进方向（可选）：
蛋白来源卵巢癌膜蛋白
蛋白名称（可保密）：磷酸化VEGFR
蛋白分子量：230
WB用膜类型、孔径：PVDF膜 0.45um
转膜方式（恒压、恒流）：恒压
转膜时间：80V 120min
转膜设备:湿转 Bio-Rad

图片（可选）：
建议改进方向（可选）：

作者: abc816 时间: 2013-5-16 17:00

蛋白来源：人宫颈癌HELA细胞总蛋白
蛋白名称（可保密）：β-actin
蛋白分子量：42
WB用膜类型、孔径：PVDF膜 0.45um
转膜方式（恒压、恒流）：恒压
转膜时间：50 4h
转膜设备:湿转 Bio-Rad

图片（可选）：
建议改进方向（可选）：

图片附件: 52304592.jpg (2013-5-16 17:00, 10.66 KB) / 该附件被下载次数 17
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16280

作者: PCR 时间: 2013-5-16 17:00

我看各位转膜都用了好长的时间，invitrogen的iBlot把转膜时间大大的缩短了（7到10分钟），就是有点贵啊。本实验室也在研制快速转膜的仪器，现在40-100KD的蛋白7到10分钟也可以转过去，不过现在实验条件还在优化，明年初应该就可以上市了，希望可以帮助各位缩短实验的时间！

作者: orangecake 时间: 2013-5-16 17:01

蛋白来源：脑组织
蛋白名称（可保密）：
蛋白分子量：16KD、27KD、32KD、42KD
WB用膜类型、孔径：PVDF 0.22um
转膜方式（恒压、恒流）：半干转恒流 1mA/cm2或2mA/cm2
转膜时间：不定
转膜设备: 北京六一仪器

图片（可选）：
建议改进方向（可选）：
我共做了六个蛋白，所以总在想节约时间的方式。
在预试时我会观察电压数与转膜效率的关系，所以我不会按时间来定何时转完，而是按电压来定。通过染胶来确定电压数与转移蛋白分子量上限的关系。这样有的5分钟就转完了，不用多浪费时间。并且六一的半干转膜仪随着使用次数的增多，效率也会下降，所以时间和转膜效率（尤其是使用后期）的关系并不稳定，单纯依靠时间有时会有问题。

作者: wu11998866 时间: 2013-5-16 17:01

蛋白来源：CHO cell
蛋白名称（可保密）：酶原
蛋白分子量：40KD
WB用膜类型、孔径：0.22的PVDF膜（Biorad）
转膜方式（恒压）：100V，湿转，转膜时间: 60min。
设备：Tanon（上海天能）
建议：
1. 转膜液现用现配，用完倒掉。
2. 转膜时间，电压可以适当调整。分子量大或者小一些的蛋白，采用此条件一样转膜效率很高。

作者: wood533 时间: 2013-5-16 17:02

蛋白来源：Hepg2
蛋白名称（可保密）：EGFR
蛋白分子量：170kd
WB用膜类型、孔径：pvdf 0.45
转膜方式（恒压、恒流）：24V
转膜时间：2个半小时
转膜设备:伯乐半干转

图片（可选）：
建议改进方向（可选）：半干转转大分子量没有湿转好，200KD以上的还是建议湿转

作者: ukonptp 时间: 2013-5-16 17:02

蛋白来源：肝癌细胞
蛋白名称：HIF-1α
蛋白分子量：120kD
WB用膜类型、孔径：NC膜
转膜方式（恒压）：80伏，湿转，转膜时间: 150分钟
设备：“Bio-Rad mini”
建议：湿转，转膜液特别重要，否则会导致电压或者电流不稳影响转膜条带。转膜均现配先用，不重复利用。转膜时间一般是150分钟，80伏恒压。经李春红染色，靠近蛋白胶的一侧膜上蛋白染色深，膜另外一面染色浅，说明蛋白未转过。该湿转条件自己做过的蛋白分子量范围;170-36kD。

作者: flower-201 时间: 2013-5-16 17:03

蛋白来源：心肌细胞总和膜
蛋白名称（可保密）：
蛋白分子量：128KD，100，60，55，43KD
WB用膜类型、孔径：NC膜 0.2um
转膜方式（恒压、恒流）：恒压
转膜时间：70V 200min
转膜设备: 湿转 Bio-Rad
建议：转膜液最好现配现现用，或配成母液，最好不重复使用，70V电压下，电流约154mA。甲醇可以加到150ml。对大分子量如200KD转膜时间延长6-8h。

作者: fsdd817 时间: 2013-5-16 17:04

蛋白来源：肺脏
蛋白名称（可保密）：ICAM-1
蛋白分子量：85~110KD
WB用膜类型、孔径：0.22NC
转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒流 300mA
转膜时间：120min
设备名字 Bio-Rad mini
一抗用的santa cruz 1mL包装的。比例调整到1：800做出很好的条带。
效价会一直降低的。去年做的这个指标，今年夏天做就不行了。

作者: 131415 时间: 2013-5-16 17:05

蛋白来源：成纤维细胞
蛋白名称（可保密）：
蛋白分子量：16KDa
WB用膜类型、孔径：0.2um PVDF膜
转膜方式（恒压、恒流）：0.2A恒流
转膜时间：65 min
转膜设备: 湿转 Bio-Rad

蛋白来源：成纤维细胞
蛋白名称（可保密）：
蛋白分子量：28KDa
WB用膜类型、孔径：0.2umPVDF膜
转膜方式（恒压、恒流）：0.25A恒流
转膜时间：60 min
转膜设备: 湿转 Bio-Rad

作者: mamamiya 时间: 2013-5-16 17:05

蛋白来源：人肿瘤细胞
蛋白名称（可保密）：保密
蛋白分子量：80KD
WB用膜类型、孔径：0.45um PVDF膜
转膜方式（恒压、恒流）：半干转移系统恒流，勿超过0.85 mA/cm*2，同时转多张膜电流需累加（串联）
转膜时间：60-90min
设备：Bio-Rad

其实有些东西并不是非常严格的，要转移的目的蛋白分子量小，那么转移的时间就短一些，反之，则长一点；蛋白量充足，可以多转一会，蛋白量较少，则要少转一下，免得蛋白穿膜而过到了滤纸上而前功尽弃。

作者: guagua 时间: 2013-5-16 17:05

蛋白来源：人和鼠肝癌细胞总蛋白、胞浆、胞核蛋白
蛋白名称（可保密）：***
蛋白分子量：17--116kd
WB用膜类型、孔径：PVDF膜 0.45um
转膜方式（恒压、恒流）：恒流 200mA
转膜时间：3h
转膜设备:湿转北京六一 24D mini

作者: fox_79 时间: 2013-5-16 17:06

蛋白来源：CO COS7 293T
蛋白名称（可保密）：保密
蛋白分子量：80 72 56 52 48 25 18KD
WB用膜类型、孔径：0.45um PVDF膜
转膜方式（恒压、恒流）：湿转 90V 电流约为230--280mA之间。两张膜串联叠加。
转膜时间：40min
设备：Bio-Rad 法码西亚

我们的转膜液都是新配的，不重复使用。
15%甲醇。如果蛋白比较大的话，可以加大甲醇浓度，提高电压，或者延长时间。

ps：实验室有人用80V也做过，结果很好。感觉转膜应该是比较好成功的。
有师姐做5KD大小的蛋白，都是半干转过夜，好像是 <5V 3mA 3W左右。结果也很漂亮。

作者: 969 时间: 2013-5-16 17:06

蛋白来源：人肿瘤细胞
蛋白名称（可保密）：磷酸化蛋白
蛋白分子量：30-60KDa
WB用膜类型、孔径：pall NC膜 0.45um
转膜方式（恒压、恒流）：恒流 0.85-1mA/平方厘米膜
转膜时间：60-90 min
转膜设备: 北京六一半干转

建议：转膜缓冲液用新鲜配制的，可先配成2倍的母液，转膜液的多少会影响电转的效率，一般将吸水纸润湿即可，不要和膜一起浸泡，这样效果很好。

作者: am10 时间: 2013-5-16 17:07

蛋白来源：人肝癌肿瘤细胞
蛋白名称（可保密）：notch
蛋白分子量：60-120KDa
WB用膜类型、孔径：pall NC膜 0.45um
转膜方式（恒压、恒流）：恒流 0.3A
转膜时间：-20度冰柜120min
转膜设备: 湿转 Bio-Rad

建议：转膜缓冲液用新鲜配制的，可先配成10倍或5倍的母液，保持低温是转膜效果的一个保证，这样效果很好。

作者: PINK 时间: 2013-5-16 17:07

相关疾病：
神经胶质瘤
蛋白来源：胶质瘤细胞总蛋白和核蛋白
蛋白名称（可保密）：
蛋白分子量：18KDa 、36KDa、55KDa、98KDa
WB用膜类型、孔径：NC膜 PALL
转膜方式（恒压、恒流）：0.35 恒流
转膜时间：60 min
转膜设备: 湿转 Bio-Rad mini

转缓液的配制有点讲究。如果蛋白大于一百多，一般加入SDS，时间延长结果会更好些.
由于，目前试验的蛋白就都不大，所以，我们都采用不加SDS的转缓液，跑出来的条带也很整齐、干净。

作者: vcve 时间: 2013-5-16 17:08

蛋白来源大肠癌205
蛋白名称（可保密）：保密
蛋白分子量：92kd,43kd
WB用膜类型、孔径：0.45pvdf
转膜方式（恒压、恒流）：恒压
转膜时间：90min
转膜设备:湿转,天能

图片（可选）：
建议改进方向（可选）：
转膜缓冲液用新鲜配制

作者: summerxx 时间: 2013-5-16 17:08

蛋白来源：大鼠脑组织
蛋白名称（可保密）：BDNF（28KDa）、Bactin（42KDa）、LaminB（72KDa），以及磷酸化蛋白（保密 43 KDa）
WB用膜类型、孔径：PVDF（0.45）膜
转膜方式（恒压、恒流）：300mA 恒流
转膜时间：60 min
转膜设备: 湿转 Bio-Rad Mini
转膜缓冲液：25％甲醛觉得这个浓度的甲醛可以有效降低电转的热量，而且使膜对蛋白的吸附效果较好，Marker转到膜上很鲜艳。用立春红染色效果也很好。
附图：LaminB

图片附件: 85889085.snap.jpg (2013-5-16 17:09, 8.81 KB) / 该附件被下载次数 26
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16281

作者: sunnyB 时间: 2013-5-16 17:09

蛋白来源：表达产物
蛋白名称（可保密）：
蛋白分子量：29KDa
WB用膜类型、孔径：PVDF
转膜方式（恒压、恒流）：0.3 A 恒流
转膜时间：80 min
转膜设备: 湿转 Bio-Rad

作者: owanaka 时间: 2013-5-16 17:09

蛋白来源：cell lysate, culture medium
蛋白名称（可保密）：
蛋白分子量：15-50 kD
WB用膜类型、孔径：NC, PVDF, 0.45 um
转膜方式（恒压、恒流）：恒压, semi-dry
转膜时间：about 2h is ok if the protein is small and the voltage can keep 100 V, if not increase to 3-4h.
转膜设备: Bio-Rad

作者: zsxan1990 时间: 2013-5-16 17:10

蛋白来源：肺脏、肝脏等
蛋白名称（可保密）：actin
蛋白分子量：43kD
WB用膜类型、孔径：NC膜PALL 0.22um
转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒流 200mA
转膜时间：45~60min
设备名字 Bio-Rad mini
用的santa cruz 分装和整装的都可以。效价一般1：1000-1：3000左右，可稳定较长一段时间。

作者: any333 时间: 2013-5-16 17:10

蛋白来源肺脏
蛋白名称（可保密）：保密
蛋白分子量：19kd,35kd
WB用膜类型、孔径：0.2pvdf
转膜方式（恒压、恒流）：恒流250
转膜时间：150min
转膜设备:湿转 Bio-Rad mini

作者: wanglaoshi 时间: 2013-5-16 17:13

蛋白来源:大鼠血管
蛋白名称（可保密）：保密
蛋白分子量：140kd
WB用膜类型、孔径：0.45pvdf
转膜方式（恒压、恒流）：恒流，200ma
转膜时间：210min
转膜设备:湿转,北京六一

图片（可选）：
建议改进方向（可选）：

作者: bring 时间: 2013-5-16 17:14

蛋白来源：心肌
蛋白名称（可保密）：
蛋白分子量：90kDa，70kDa,12.6kDa
WB用膜类型、孔径：NC
转膜方式（恒压、恒流）：恒压
转膜时间：70v 240min，120min，60min
转膜设备:伯乐湿转

作者: one 时间: 2013-5-16 17:14

蛋白来源：脑
蛋白名称（可保密）：保密
蛋白分子量：16KD 60KD
WB用膜类型、孔径：16的用0.22的PVDF，60的用0.45的NC
转膜方式（恒压、恒流）:20V
转膜时间：16的30min，60的90min
转膜设备:Bio-Rad 半干

建议：好像很不容易转过

作者: jujuba 时间: 2013-5-16 17:17

转膜不是WB的关键吧，条件很宽，做过280KD-15KD多种蛋白，湿转转膜从50V，60V,80V过夜，80V3h，100V2h,120V1.5h，290mA1h等都试过，效果都可以。转膜液浓度高点低点也能转好。保证低温就行。

作者: lxh031 时间: 2013-5-16 17:17

蛋白来源：子宫内膜癌组织
蛋白名称（可保密）：
蛋白分子量：156.8
WB用膜类型、孔径：NC膜
转膜方式（恒压、恒流）：恒流400mA
转膜时间：90 min
转膜设备: 湿转 Bio-Rad

作者: www.1 时间: 2013-5-16 17:17

感觉大家的转膜时间普遍偏长，以下是我的：

蛋白来源：真核表达
蛋白名称（可保密）：（多种，30个以上）
蛋白分子量：40-200kD
WB用膜类型、孔径：PVDF
转膜方式（恒压、恒流）：恒压100V（电流在280mA至350mA之间）
转膜时间：60min（M<100kD）,60-100min (100kD<M<200kD)
转膜设备: 湿转

作者: bamboo16 时间: 2013-5-16 17:19

蛋白来源：大鼠肾脏
蛋白名称（可保密）：保密
蛋白分子量：130kD
WB用膜类型、孔径：0.45NC膜 PALL
转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒流 350mA 转膜时间：120min
设备名字 Bio-Rad mini
一抗用的sigma 羊抗大鼠，0.2mL包装的，打折后价格3000多，有些贵哦。
比例调整到1：1500左右条带可，用BSA封闭。但是背景稍高。

作者: dog002 时间: 2013-5-16 17:19

蛋白来源：脑组织
蛋白名称（可保密）：
蛋白分子量：38KDa
WB用膜类型、孔径：PVDF膜，
转膜方式（恒压、恒流）：80v恒压
转膜时间：180min
转膜设备: 湿转 Bio-Rad mini

图片附件: 82112195.jpg (2013-5-16 17:19, 3.48 KB) / 该附件被下载次数 30
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16282

作者: IAM007 时间: 2013-5-16 17:20

蛋白来源：真核表达
蛋白名称（可保密）：
蛋白分子量：约35kD（双亚基）
WB用膜类型、孔径：0.22 um PVDF
转膜方式（恒压、恒流）：恒流200mA
转膜时间：60min
转膜设备: 湿转Bio-rad,天能，六一

转膜时间其实不需要那么长的，转膜没转上一般原因不在这里，可能是转膜液的原因：有些蛋白SDS可能影响其与膜的结合，还原型电泳因巯基乙醇的原因也可能导致后面的抗体不结合（这是我最近的经验教训），还有一抗的选择很重要，一定要选识别线性表位的抗体，才能用于做WB

作者: sunnyB 时间: 2013-5-16 17:20

蛋白来源：细菌蛋白
蛋白名称（可保密）：全部的可溶性蛋白
蛋白分子量：11-170KD
WB用膜类型、孔径：0.45 NC
转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒流300mA
转膜时间：80min

作者: birdfish 时间: 2013-5-16 17:21

蛋白来源：骨肉瘤细胞
蛋白名称（可保密）：
蛋白分子量： 72kDa
WB用膜类型、孔径： PVDF膜(0.45um)
转膜方式（恒压、恒流）：半干转恒流200mA
转膜时间： 20-30min
转膜设备: Bio-Rad 型号忘了，就是有4个插孔的电泳仪

图片（可选）：
建议改进方向（可选）：低温很重要，新鲜的电转液也很重要。

作者: memory 时间: 2013-5-16 17:21

相关疾病：
骨肉瘤
蛋白来源：骨肉瘤CELL LINE
蛋白名称（可保密）：Beta actin
蛋白分子量：42kDa
WB用膜类型、孔径：Nitrocellulose Membrane 0.2um Pore Size (Invitrogen)
转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压22v
转膜时间：90 min
转膜设备: X-cell Sure Lock Mini-cell (Invitrogen)

图片（可选）：
建议改进方向（可选）：转膜过程冰水浴，保持低温,Transfer Buffer重复使用。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16283

作者: junjie05 时间: 2013-5-16 17:22

蛋白来源：肾瘤细胞
蛋白分子量：39kDa
WB用膜类型、孔径：Nitrocellulose Membrane 0.2um Pore Size (Invitrogen)
转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压100v
转膜时间：50 min

作者: abc816 时间: 2013-5-16 17:22

蛋白来源：MCF7
蛋白名称（可保密）：
蛋白分子量：70kDa
WB用膜类型、孔径：PVDF膜（GE）
转膜方式（恒压、恒流）：湿转 100伏
转膜时间：60 min
转膜设备: 伯乐小转膜仪

作者: cj_mondy 时间: 2013-5-16 17:23

蛋白来源：pichia 分泌表达
蛋白名称（可保密）：细胞因子等
蛋白分子量：17到30kDa
WB用膜类型、孔径：millipore PVDF 0.45um
转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压：100V
转膜时间：60min

这个条件除了100KDa的预染maker转的不好，剩下的条带都非常清晰。正向前面ycwzq说的，感觉时间不是很重要，只要蛋白别太小或太大，在一个比较宽的时间和电压范围都能转上。当然这些还有一个重要的影响因素就是所用的蛋白转印缓冲液.
所以建议把自己用的转印缓冲液的配方也贴上，便于分析交流.
我先说我的吧，是大师兄师姐的配方，我用了感觉还不错，但是100KDa以上的转的不好。
蛋白转印缓冲液pH8.2:Tris碱1.93g，甘氨酸9g，甲醇200ml，加水定容至1000ml

作者: mimili_901 时间: 2013-5-16 17:23

蛋白来源：大鼠坐骨神经
蛋白名称（可保密）：
蛋白分子量： 30kDa
WB用膜类型、孔径： PVDF膜(0.2um)
转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒流300mA
转膜时间： 45min
转膜设备: Bio-Rad

图片（可选）：
建议改进方向（可选）：

作者: plaa 时间: 2013-5-16 17:24

蛋白来源：小鼠胚胎成纤维
蛋白名称（可保密）：
蛋白分子量：36KDa、55KDa
WB用膜类型、孔径：PVDF膜 0.45
转膜方式（恒压、恒流）：0.3A 恒流
转膜时间：60 min
转膜设备: 湿转 Bio-Rad mini

垫子变薄时，可用三层纤维垫，也没问题。

作者: finger 时间: 2013-5-16 17:24

看到大家的这些贡献还是很受用的，小分子量的蛋白可能相对比较好转一些，大分子量的稍困难，希望大家能多提供一些大分子量蛋白的转膜条件，谢谢！

蛋白来源：小鼠前列腺癌细胞
蛋白名称（可保密）：P53 P21 RAD51 GAPDH
蛋白分子量：53KDa、21KDa、37KDa、36KDa
WB用膜类型、孔径：PVDF膜 0.45
转膜方式（恒压、恒流）：恒压110v
转膜时间：60 min
转膜设备: 湿转 Bio-Rad mini

作者: vivian4123 时间: 2013-5-16 17:24

蛋白来源：HEK293总蛋白
蛋白名称（可保密）：***
蛋白分子量：~200KD
WB用膜类型、孔径：PVDF膜 0.2um (用甲醇预先处理)
转膜方式（恒压、恒流）：恒压 25V
转膜时间：过夜 (~16-20hours)
转膜设备:biorad mini

作者: vivian4123 时间: 2013-5-16 17:25

蛋白来源：人前列腺癌细胞
蛋白名称（可保密）：***
蛋白分子量：~40KD
WB 用膜类型、孔径：PVDF膜 0.45um (用甲醇预先处理)
转膜方式（恒压、恒流）：恒压 20V, 限制最高电流0.3A
转膜时间：过夜 (~16-20hours)
转膜设备:biorad semi-dry

作者: mamamiya 时间: 2013-5-16 17:25

版主，您好，我提个小的建议，是不是将转膜液的配制（如甲醇的比例和是否加SDS以及多大质量浓度）稍提一下会更好啊，因为我觉得其实转膜液的成份还是比较重要的。

作者: KGZ564 时间: 2013-5-16 17:26

对这个方向不大熟悉，但我想应该包括下列几个方面，请战友们费心了，谢谢。

蛋白来源：
蛋白名称（可保密）：
蛋白分子量：
WB用膜类型、孔径：
转膜方式（恒压、恒流）：
转膜时间：
转膜设备:
转膜液的配制：（如甲醇的比例和是否加SDS以及多大质量浓度等）

图片（可选）：
建议改进方向（可选）：

作者: kuaizige 时间: 2013-5-16 17:27

蛋白来源：组织
蛋白名称（可保密）
蛋白分子量：42KDa
WB用膜类型、孔径：PVDF膜（0.22）
转膜方式（恒压、恒流）：350mA 恒流
转膜时间：60-90 min
转膜设备: 湿转 Bio-Rad

作者: langlang 时间: 2013-5-16 17:27

顶一下。

我的目的蛋白是 55kd

1.5mA/cm? 1.5h

出现丢带

作者: pencil菲 时间: 2013-5-16 17:28

蛋白来源：E.Coli BL21
蛋白名称（可保密）：
蛋白分子量：4kd
WB用膜类型、孔径：PVDF 0.22um
转膜方式（恒压、恒流）：恒压15v
转膜时间：O/N
转膜设备: Bio-Rad Mini 湿转
转膜液的配制：for 1 L transfer buffer: 200ml Methanol,14.4g Glycine, 3.03g Trizma-base

用了Trcine-gel SDS Page，效果不错

作者: mickeylin 时间: 2013-5-16 17:28

蛋白来源：肾脏
蛋白名称（可保密）：
蛋白分子量：23kd
WB用膜类型、孔径：PVDF 0.45um
转膜方式（恒压、恒流）：恒压20v
转膜时间：35mins
转膜设备: Bio-Rad 半干

作者: PCR 时间: 2013-5-16 17:29

蛋白来源：来自MDCK增殖的流感病毒裂解物
蛋白名称（可保密）：PB1
蛋白分子量： 96kd （注意，10% SDS-PAGE，冰上电泳。用预染marker观察100kd的条带跑到胶的正中间位置时，才开始转膜，否则转膜效率降低）
WB用膜类型、孔径： NC膜， 0.45
转膜方式（恒压、恒流）：恒压，100V
转膜时间： 2 hours
转膜设备: BIO-rad 转膜设备。其间，准备一个冰盒，将电泳槽半埋到冰里。
转膜液的配制：（如甲醇的比例和是否加SDS以及多大质量浓度等）： 2.9g甘氨酸，5.8gtris,0.37gSDS，200ml甲醇

WB做不好的童鞋，可以参考此文： cuturl('http://www.360doc.com/content/11/0623/19/5430276_129105136.shtml')

作者: xue258 时间: 2013-5-16 17:30

蛋白来源： RAW
蛋白名称（可保密）：
蛋白分子量：235kd
WB用膜类型、孔径： NC膜， 0.45
转膜方式（恒压、恒流）：恒压，100V-110V
转膜时间： 30min-1.5h
转膜设备: Bio-Rad mini box, cold room
转膜液的配制：

【5x Running Buffer】

2 L

5 L

Tris

30 g

75 g

Glycine

144 g

360 g

SDS

10 g

25 g

作者: xue258 时间: 2013-5-16 17:30

For 1000mL 1x Running Buffer: Add200mL 5x Running Buffer into 800mL DDW.

【10x Transfer Buffer】

1 L

2 L

5 L

Tris

30 g

60 g

150 g

Glycine

144 g

288 g

720 g
Add 200mL methanol/1000mL 1x Transfer Buffer before use (use H2O at 4°C);
Add 0.2% SDS (20mL of 10% SDS/1000mL 1x Transfer Buffer) for larger Proteins over 120kD.
For 2000mL 1x Transfer Buffer: 1400mL DDW + 400 mL Methanol + 200mL 10x Transfer Stock.

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作者: vera+ 时间: 2013-5-16 17:32

蛋白来源：肾脏
蛋白名称（可保密）：
蛋白分子量：9kd
WB用膜类型、孔径：PVDF 0.22um
转膜方式（恒压、恒流）：恒压20v
转膜时间：30mins
转膜设备: Bio-Rad 半干

作者: okhaha 时间: 2013-5-16 17:35

蛋白来源：软骨细胞
蛋白名称（可保密）：b-actin
蛋白分子量： 43kd
WB用膜类型、孔径： PVDF膜， 0.45
转膜方式（恒压、恒流）：湿转，恒流，350mA
转膜时间： 85mins
转膜设备: BIO-rad 转膜设备。其间，准备一个冰盒，将电泳槽半埋到冰里。
转膜液的配制：（2.92g甘氨酸，5.8gtris,0.375gSDS，200ml甲醇，用双蒸水定容到1L）

作者: bohe221 时间: 2013-5-16 17:36

蛋白来源：宫颈癌细胞
蛋白名称：保密
蛋白分子量：60kD
WB用膜类型、孔径：PVDF膜 0.45uM
转膜方式（恒压、恒流）：恒流，按膜的面积来算电流，标准大小的膜-60mA/张
（8.2cm x 6.0cm)
转膜时间：2h
转膜设备:Biorad semi-dry
转膜液的配制：Boston Bioproduct Transfer buffer
+10-20% 甲醇

建议改进方向：
做半干转的时候，三明治上面再压一张滤纸，可以保证压紧，转膜效率稳定。用这个条件做过不少不同分子量的蛋白，最小从15kD，到最大235kD，都可以得到稳定结果。转膜液只用一次，不重复使用。

作者: mickeylin 时间: 2013-5-16 17:36

蛋白来源：家牛肝细胞
蛋白名称（可保密）：保密
蛋白分子量：30kDa
WB用膜类型、孔径：NC, 6x8cm, 0.45um
转膜设备: Invitrogen 湿转，外层冰水浴冷却
转膜方式（恒压、恒流）：恒流170mA
转膜时间：根据胶的厚度而定，每0.5mm转30min, 1.5mm的超厚预制胶转1.5-2hr
转膜液的配制：10mM碳酸氢钠，3mM碳酸钠，20%甲醇
建议改进方向：已考染的胶脱色后可以用此法转膜，条带稍淡但不影响结果

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作者: Ao7 时间: 2013-5-16 17:37

蛋白来源：组织
蛋白名称（可保密）
蛋白分子量：170KDa
WB用膜类型、孔径：PVDF膜（0.45）
转膜方式（恒压、恒流）：300mA 恒流
转膜时间：170 min
转膜设备: 湿转 Bio-Rad

作者: KGZ564 时间: 2013-5-16 17:38

蛋白来源：E.Coli BL21
蛋白名称（可保密）：
蛋白分子量：4kd
WB用膜类型、孔径：PVDF 0.22um
转膜方式（恒压、恒流）：恒压15v
转膜时间：O/N
转膜设备: Bio-Rad Mini 湿转
转膜液的配制：for 1 L transfer buffer: 200ml Methanol,14.4g Glycine, 3.03g Trizma-base

以上“转膜时间：O/N”是什么意思啊？

作者: popo520 时间: 2013-5-16 17:38

蛋白来源：细胞裂解液蛋白名称（可保密）：A蛋白分子量：38KuWB用膜类型、孔径：4.5的PVDF膜转膜方式（恒压、恒流）：湿转；恒流200mA转膜时间：1h转膜设备:伯乐转膜液的配制：完全按照宝生物材料配方配置！注意PVDF膜使用前用甲醇激活！
图片我就不送上了！大概就是这个条件

作者: moonlight45 时间: 2013-5-16 17:38

蛋白来源：HepG2细胞
蛋白名称（可保密）：Akt及P-Akt
蛋白分子量：55KDa/56KD
WB用膜类型、孔径：PVDF膜 0.45孔径
转膜方式（恒压、恒流）：100V 恒压
转膜时间：75 min
转膜设备: 湿转 Bio-Rad
图片：

图片附件: 88019118.snap.jpg (2013-5-16 17:39, 35.12 KB) / 该附件被下载次数 23
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