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标题: 【求助】为什么高分子量的蛋白用低浓度的分离胶... [打印本页]

作者: ssonglikihi 时间: 2013-5-17 10:32 标题: 【求助】为什么高分子量的蛋白用低浓度的分离胶...

我一直有个疑问，找了好多资料都没有找到明确的答案

为什么分子量高的蛋白用低浓度的分离胶，而分子量低的却用高浓度的分离胶，其机理是什么？

大孔胶和小孔胶的作用是什么？

其根本原理是什么？

谢谢！！！

作者: duoduo 时间: 2013-5-17 10:32

蛋白电泳成功的条件是蛋白通过凝胶孔径形成的分子筛作用和蛋白电荷的电场力作用，把我们想要的目的蛋白跑开。
就某一孔径而言，其最适合某一段分子量蛋白通过，再大分子量的蛋白通过就会有障碍，跑的慢，而小分子量蛋白跑的快，反之亦然。我们针对我们的目的蛋白选择合适的胶浓度，也就是选择了合适的孔径，这样目的蛋白就能以一定的速度刚好通过孔径，而大分子量的蛋白因孔径相对小而通过较慢，小分子量则快，这就把我们的目的蛋白分开

作者: ladyhuahua 时间: 2013-5-17 10:33

楼主所说的问题其实在很多生物化学类的技术书籍上都有相关的解释，这里我把我所了解的一些原理和楼主分享一下。
不连续电泳是指包含两种以上的缓冲溶液， pH 和凝胶孔径的电泳。因此制备凝胶时，需分别制备分离胶及浓缩胶，多用于分析浓度较稀的样品。这里我们用常用的聚丙烯酰胺凝胶电泳为例和楼主分析下大孔胶和小孔胶的作用。

不连续电泳之所以有很高的分辨率是因为有 3 种效应：即浓缩效应、电荷效荷和分子筛效应。

1. 浓缩效应：样品通过浓缩胶被浓缩成高浓度的样品薄层，甚至有的能浓缩几百倍。为什么样品会在浓缩胶中被压挤成层呢 ? 这是因为样品胶和浓缩胶是用 pH6.7 的 Tris – HCl 缓冲液制成；电泳时，由于 HCI 解离度大，几乎全部释放出 Cl – ；而在电泳槽中的 Tris –甘氨酸缓冲液是 pH8.3 ，因为甘氨酸的等电点为 6.0 ，在电泳过程中，它只有极少数分子解离成NH2CH2COO- 。一般酸性蛋白质在此 pH 值下也解离为带负电荷的离子，但其解离度比 HCl 小，比甘氨酸大。这 3 种离子带有同性电荷，在一定的电场作用下，它们的泳动率是不一样的，而且它们的有效泳动率快慢是按下列次序排列的，即： Cl – ＞蛋白质＞甘氨酸。电泳开始后，由于快离子的泳动率最大，在快离子后面就形成一个离子浓度低的区域，即低电导区。电导与电势梯度成反比，所以低电导区就产生了较高的电势梯度。这种高电势梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。因而在高电势梯度区和低电势梯度区之间形成一个迅速移动的界面（见附图）。由于样品中蛋白质的有效泳动率恰好介于快、慢离子之间，所以也就聚集在这个移动的界面附近，被浓缩成一狭小的样品薄层。

2. 电荷效应：蛋白质混合物在界面处被高度浓缩，堆积成层，形成一狭小的高浓度的蛋白质区带，但由于每种蛋白质分子所带的电荷不同，因而泳动率不同，各种蛋白质就以一定的顺序排列成一个一个的蛋白质区带。

3. 分子筛效应：当蛋白质通过浓缩胶进入分离胶时，由于 pH 和凝胶孔径突然改变（选择分离胶的 pH 为 8.9 ），使甘氨酸的解离度增大，因而它的有效泳动率也增加，此时甘氨酸很快就赶上并超过了蛋白质分子，这样高电势梯度不存在了，使蛋白质样品进入一个均一的电势梯度和 pH 条件的分离胶中。分离胶的孔径较小，相对分子质量或构型不同的蛋白质通过分离胶，所受摩擦力不同，受阻滞的程度不同，因此表现出不同的泳动率，即所谓的分子筛作用。即使净电荷相似，泳动率相等的蛋白质分子也会由于分子筛效应在分离胶中被分开。

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作者: ssonglikihi 时间: 2013-5-17 10:34

好象明白了,因为我以前一直理解是蛋白在胶的上面跑,其实不是,在因为梳子插出的孔哪个位置是没有和下面一样厚的胶的，加在哪里后，不会跑到表面来，只会有重力作用往下跑，通过的是下面没有梳子作用而有的一定厚度的胶通过的孔，是吧

谢谢你们两个，

不过哪个凝聚效果还是看不懂。有没有更好懂的？
谢谢！！

作者: duoduo 时间: 2013-5-17 10:34

是在电场力的作用下是蛋白由负极向正极跑，跑的过程中要通过凝胶形成的网状孔也就是形象的说成分子筛。

作者: duoduo 时间: 2013-5-17 10:35

告诉我你的邮箱，我给你发个pdf,,,原理奥讲的挺好的，至于操作步骤还要结合自己情况摸索

作者: abc816 时间: 2013-5-17 10:36

楼主所说的问题其实在很多生物化学类的技术书籍上都有相关的解释，这里我把我所了解的一些原理和楼主分享一下。
不连续电泳是指包含两种以上的缓冲溶液， pH 和凝胶孔径的电泳。因此制备凝胶时，需分别制备分离胶及浓缩胶，多用于分析浓度较稀的样品。这里我们用常用的聚丙烯酰胺凝胶电泳为例和楼主分析下大孔胶和小孔胶的作用。

不连续电泳之所以有很高的分辨率是因为有 3 种效应：即浓缩效应、电荷效荷和分子筛效应。

1. 浓缩效应：样品通过浓缩胶被浓缩成高浓度的样品薄层，甚至有的能浓缩几百倍。为什么样品会在浓缩胶中被压挤成层呢 ? 这是因为样品胶和浓缩胶是用 pH6.7 的 Tris – HCl 缓冲液制成；电泳时，由于 HCI 解离度大，几乎全部释放出 Cl – ；而在电泳槽中的 Tris –甘氨酸缓冲液是 pH8.3 ，因为甘氨酸的等电点为 6.0 ，在电泳过程中，它只有极少数分子解离成NH2CH2COO- 。一般酸性蛋白质在此 pH 值下也解离为带负电荷的离子，但其解离度比 HCl 小，比甘氨酸大。这 3 种离子带有同性电荷，在一定的电场作用下，它们的泳动率是不一样的，而且它们的有效泳动率快慢是按下列次序排列的，即： Cl – ＞蛋白质＞甘氨酸。电泳开始后，由于快离子的泳动率最大，在快离子后面就形成一个离子浓度低的区域，即低电导区。电导与电势梯度成反比，所以低电导区就产生了较高的电势梯度。这种高电势梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。因而在高电势梯度区和低电势梯度区之间形成一个迅速移动的界面（见附图）。由于样品中蛋白质的有效泳动率恰好介于快、慢离子之间，所以也就聚集在这个移动的界面附近，被浓缩成一狭小的样品薄层。

2. 电荷效应：蛋白质混合物在界面处被高度浓缩，堆积成层，形成一狭小的高浓度的蛋白质区带，但由于每种蛋白质分子所带的电荷不同，因而泳动率不同，各种蛋白质就以一定的顺序排列成一个一个的蛋白质区带。

3. 分子筛效应：当蛋白质通过浓缩胶进入分离胶时，由于 pH 和凝胶孔径突然改变（选择分离胶的 pH 为 8.9 ），使甘氨酸的解离度增大，因而它的有效泳动率也增加，此时甘氨酸很快就赶上并超过了蛋白质分子，这样高电势梯度不存在了，使蛋白质样品进入一个均一的电势梯度和 pH 条件的分离胶中。分离胶的孔径较小，相对分子质量或构型不同的蛋白质通过分离胶，所受摩擦力不同，受阻滞的程度不同，因此表现出不同的泳动率，即所谓的分子筛作用。即使净电荷相似，泳动率相等的蛋白质分子也会由于分子筛效应在分离胶中被分开。

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楼上这里讲得很清楚啊，受益了，以前想的很简单，以为就是电流及分子筛的作用，原来设计得如此巧妙。浓缩胶pH6.7 分离胶pH8.9 用Tris-HCl配浓缩胶，缓冲液用Gly来配置这些都是有讲究的啊。

作者: wmp1234 时间: 2013-5-17 10:37

分子量150-160KD，用多大的胶好呢？转膜的话有什么好的条件呢?
我在此向大家虚心请教a。

作者: wood533 时间: 2013-5-17 10:38

4%浓缩，8%分离，转膜没做过，不过估计300mA，2小时，你试试

作者: tangxin_80 时间: 2013-5-17 10:39

请问在2D-page中可以用积层胶吗？不是胶条就相当于积层胶吗？

作者: ending 时间: 2013-5-17 10:40

据我理解，1-DE中的胶条是等点聚焦的过程，是根据不同蛋白质等电点不同而将其分开的，和胶的孔径没关系吧

作者: tianmei001 时间: 2013-5-17 10:40

请问43kda的蛋白用多少的胶比较好啊？还有电泳和转膜的时间。谢谢。

作者: dongdongqiang 时间: 2013-5-17 10:41

43KD 的蛋白用10%的分离胶和4%的浓缩胶，70V电泳，转膜250mA 3小时。

作者: 966735obeng 时间: 2013-5-17 10:42

请问43kda的蛋白用多少的胶比较好啊？还有电泳和转膜的时间。谢谢。

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我以前做的是用12%的分离胶，5%的积层胶，120的Marker，湿转的话70V，55-60min就可以啦

作者: gogo 时间: 2013-5-17 10:43

蛋白分子量为45KDa，应该选用多大浓度的分离胶啊？还有，我的内参是GAPDH，杭州贤至的，分子量是37KDa，请问这个可以吗？谢谢了啊！ 0票

作者: uuooii 时间: 2013-5-17 10:43

原理大概看懂了但是多少kd用多少的胶还是木有什么概念啊

作者: NBA 时间: 2013-5-17 10:45

新手，看的有点晕啊，我要作的蛋白分子量216kd，用多少的胶比较好啊？还有电泳和转膜的时间？非常谢谢。都说这么大的不好做呀，我现在压力很大。

作者: bamboo16 时间: 2013-5-17 10:45

我要跑500KD蛋白，不知道有没有人做过大分子蛋白？用多大的分离胶跑得出来？我试过5%分离胶不行

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