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标题: 【求助】谁能给讲讲封闭的原理？ [打印本页]

作者: bamboo16 时间: 2013-5-21 16:12 标题: 【求助】谁能给讲讲封闭的原理？

一直做western，可是不知道BSA具体封闭什么原理。BSA和脱脂奶粉封闭的时候，难道都是和非目的带结合？为什么不和要检测的目的带结合呢？怎么就不封闭目的蛋白呢？希望那个高手能帮我解答一下这个疑惑！

作者: xyw5 时间: 2013-5-21 16:14

你可以理解为NC膜或者PVDF膜上有很多洞洞，通过电转，胶上的蛋白被转移到了膜上，塞进了很多洞洞里面，但是你也知道，蛋白并不是连续的，有很多空隙，而且比如说样品孔之间也有空隙，这些洞洞并没有填进东西，而抗体也是蛋白，也会被吸附在空的洞里，这样，就会有很多非特异性的信号，但如果用富含蛋白的封闭液与膜作用，那所有的空洞都会被BSA或者酪蛋白填满，这样，抗体蛋白就不会被非特异性的吸附到膜上，而只会跟特异性蛋白结合

作者: am10 时间: 2013-5-21 16:19

楼上谈到“BSA和脱脂奶粉封闭”，我感觉是不是说法有错误啊，蛋白组学教材讲到---“由于抗磷酸氨基酸抗体可以与牛奶中的某些成分结合，所以不能使用常用的脱脂奶粉（blotto）作为封闭液”，“磷酸化蛋白质的Western blotting反应可以使用牛血清白蛋白BSA（组分V），或牛血清白蛋白与鸡卵白蛋白的混合物作为封闭液。”。

作者: birdfish 时间: 2013-5-21 16:33

BSA和脱脂奶粉都可以用作封闭的
一般来说，BSA成份单一，适用于大多数情况，但是价格相对昂贵，而且也据说封闭效果略不如脱脂奶粉
OVA价格就更加昂贵了
脱脂奶粉最大的优点是价钱便宜，所以是首选，但是由于成分相对复杂，所以适用范围要狭窄一些。磷酸化抗体也许会导致背景增加，此外，因为自身含有biotin,不能用于biotin标记的抗体系统。

作者: redbutterfly 时间: 2013-5-21 16:37

那如何解释组织免疫组化中用的BLOCKING呢

作者: PINK 时间: 2013-5-21 16:37

嗯这个是不是正解撒封闭的目的是保证蛋白条带的完整性吗？

作者: S6044 时间: 2013-5-21 16:38

你可以理解为NC膜或者PVDF膜上有很多洞洞，通过电转，胶上的蛋白被转移到了膜上，塞进了很多洞洞里面，但是你也知道，蛋白并不是连续的，有很多空隙，而且比如说样品孔之间也有空隙，这些洞洞并没有填进东西，而抗体也是蛋白，也会被吸附在空的洞里，这样，就会有很多非特异性的信号，但如果用富含蛋白的封闭液与膜作用，那所有的空洞都会被BSA或者酪蛋白填满，这样，抗体蛋白就不会被非特异性的吸附到膜上，而只会跟特异性蛋白结合

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2楼说的形象，让人一目了然。但个人认为并不全面，如果封闭仅仅是填补空隙的话，那封闭仅仅是起到降低背景的作用。如果是这样的话杂带的问题怎么解释呢？还有免疫组化的封闭是怎么个原理呢？个人觉得从抗原决定簇的角度来说可能会更好一点。抗体是识别抗原决定簇，然后与之结合，奶粉和BSA起封闭作用主要是通过蛋白起作用的，就是能够非特异性地将表面的抗原决定簇结合，这样特异性的抗体就不会跟这些非特异性的抗原决定簇结合，这样背景就会降低。可能有人会问，那目的蛋白为什么不能被封闭掉？因为抗体跟目的蛋白的结合是非常特异的，结合能力很强，封闭之后依然能够结合。当然如果封闭是太长，也能影响抗体的特异性结合，导致最后显影信号变弱，这就是有时候封闭时间长了信号变弱的原因。同样，通过延长封闭时间来去除非特性条带以及免疫组化中延长封闭时间降低背景都是这么个原理。
个人拙见，不知道说没说清楚，不对之处欢迎指正

作者: kswl870 时间: 2013-5-21 16:46

QUOTE:

原帖由 S6044 于 2013-5-21 16:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你可以理解为NC膜或者PVDF膜上有很多洞洞，通过电转，胶上的蛋白被转移到了膜上，塞进了很多洞洞里面，但是你也知道，蛋白并不是连续的，有很多空隙，而且比如说样品孔之间也有空隙，这些洞洞并没有填进东西，而抗体也是蛋白，也会被吸附 ...

其实现在有商业化western封闭专用的脱脂奶粉，这些奶粉都是蛋白激酶和蛋白磷酸酶失活的，所以做蛋白的磷酸化也是没有问题的。

作者: bamboo16 时间: 2013-5-21 16:47

我最初问得就是楼上战友回答的这个问题，我一直觉得block是要把除了目的蛋白以外的蛋白都给封闭掉，没有想过还有膜上的空隙这个问题，这样看来楼上两位的综合起来应该是比较全面。

作者: tuuu2 时间: 2013-5-21 16:48

本人再抛出一个吸附-洗脱假说，来解释封闭不仅可以降低背景，而且可以使杂带信号变弱的原因，大家看看如何。
Western Blott用的膜和蛋白质纯化用的柱类似，都是对蛋白进行了吸附，包括胶电转到膜上的蛋白以及封闭所用的奶粉和BSA等都是对膜的一种吸附。这种吸附作用的机理是包括疏水作用、静电、范德华力等等的综合作用，都是非特异性的。
本人认为，封闭时的封闭蛋白不仅是吸附到膜上的空白位置，而且还会和膜上已有的蛋白（目标蛋白和杂蛋白）产生竞争性的洗脱作用，而不是和膜上的蛋白产生结合作用。即不是用封闭液封闭杂蛋白的非特异性的抗原决定簇（用抗原决定簇这个词不是很妥当，但好理解一些），而是将杂蛋白从膜上部分洗脱下来，从而减轻了非特异性的条带信号。这种洗脱也会对目标蛋白产生作用，同样减轻其条带信号。
楼上的这句话：“当然如果封闭是太长，也能影响抗体的特异性结合，导致最后显影信号变弱，这就是有时候封闭时间长了信号变弱的原因”不能用结合来解释，但用洗脱就比较好理解。抗体与目标抗原的亲和结合常数远远高于这个楼上06战友假说的非特异性结合，即使封闭液中的蛋白可能有与目标蛋白的非特异性结合，在抗体孵育过程中也会完全被替代，而不会影响到最后的显影信号。
用吸附-洗脱假说来看封闭的操作，就能明白为什么封闭液的组成、浓度、时间等等要素的对WB的影响。封闭液中要有可以和膜产生非特异性吸附的分子量适中的蛋白，太大了可能对邻近的目标蛋白产生位置阻碍，太小了容易从膜上的孔洞里脱落。封闭液的pH，盐，表面活性剂等一方面影响封闭液中的蛋白与膜的结合吸附，另一方面还会对膜上的已有的蛋白产生不同洗脱作用，这也是WB中选用不同封闭液的原因，即为了尽可能多的洗脱杂蛋白，尽量减少对目标蛋白的洗脱作用。封闭液的浓度越高，封闭时间越长，对膜上孔洞的覆盖越好，由于竞争性的作用，对杂蛋白的洗脱也越好，但对目标蛋白的洗脱也越强。也就是说在相同曝光条件下背景更干净，杂带更淡，但目标条带也更淡。

作者: owanaka 时间: 2013-5-21 17:19

我在用密理博的PVDF膜的时候，它的说明书上说把膜直接放入甲醛中十秒中，然后拿出来晾干，就起到了封闭的作用，可以直接加入一抗孵育了，这又是什么原理呢？

作者: ending 时间: 2013-5-21 17:19

没想到平常做的这么一个小操作,还有这么多的原理.有兴趣的童学甚至可以做成一个小课题.

作者: Ao7 时间: 2013-5-21 17:20

我在用密理博的PVDF膜的时候，它的说明书上说把膜直接放入甲醛中十秒中，然后拿出来晾干，就起到了封闭的作用，可以直接加入一抗孵育了，这又是什么原理呢？

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这个是化学法封闭，就是让甲醛和PVDF膜表面的微结构反应或者结合，使之失去结合蛋白的疏水力或者空间结构域

但是根据实际使用情况来看，我们公司每天近百次WB的实验证明，还是用奶粉封闭的效果最好，不过奶粉要挑牌子的，不是所有牌子的奶粉都适宜来封闭

作者: Ao7 时间: 2013-5-21 17:21

至于奶粉封闭的效果为什么比BSA好，我是这样理解的

1，奶粉蛋白种类比BSA多，而WB膜也好，ELISA板也好，表面的微结构都不是那么均匀的，相对而言，不同分子量蛋白种类多的奶粉（BSA只是一种蛋白），封闭起来更全面

2，至于奶粉里的蛋白会不会和膜上已有的蛋白结合，这个要分3种情况（现实中确实也这样复杂）

a,部分奶粉蛋白和“目标蛋白”及“其他转上去的杂蛋白”都结合，但是这种结合是非特异性的，这种情况下，相应的特异性一抗是能竞争过“奶粉蛋白”与“目的蛋白”的结合，同时一抗与“部分奶粉蛋白”+“转上去的其他杂蛋白”的结合体不会有更强的特异性竞争，所以对杂带的封闭有效，杂带不会消失。

b，部分奶粉蛋白和膜和板的空白位置结合，不与“目标蛋白”结合，但是与“转上去的其他杂蛋白”结合，这样也能去掉杂带

c，部分奶粉蛋白只和膜和板的空白位置结合，不与“目标蛋白”及“其他转上去的杂蛋白”结合，这样杂带也依然存在

不知道我这样说，是否好理解

作者: jkobn 时间: 2013-5-21 17:22

好贴子，总结一下，大家继续讨论。

1、封闭液中的蛋白可以与膜上的空白位置结合。

2、封闭液中的蛋白与膜上的蛋白是一种吸附覆盖作用，无选择性。

3、封闭液中的蛋白与膜上的蛋白是一种吸附覆盖作用，但根据所用封闭蛋白的不同有选择性。

4、封闭液中的蛋白与膜上的蛋白是一种竞争性洗脱作用，无选择性。

5、封闭可以用化学方法，如甲醛封闭PVDF膜。

作者: fei1226com 时间: 2013-5-21 17:23

楼上说的都很精彩，借你们的文字和理论，我也自己总结一下，对错与否，恳请赐教。

1、转膜后蛋白以机械填补（堆积）和吸附的方式结合于膜上，这种结合是很牢固的。
2、封闭液中的蛋白可以与膜上的空白位置结合，同样以机械填补（堆积）和吸附覆盖的方式结合在膜上，因为有“填补”和“覆盖”蛋白结合位点以避免一抗的非特异结合，所以有“封闭”的说法。同样这两种作用使封闭液中的蛋白能够很牢固的结合在空白位置上。
3、同时，封闭液中的蛋白与膜上的蛋白（抗原决定簇）进行非特异性结合，说明与目的蛋白也是有结合的。但这种结合强度不强，起码比1或2的结合方式要弱得多。
4、不排除“封闭液中的蛋白与膜上的蛋白存在一种竞争性洗脱作用，无选择性”。但应该说这种竞争是很微弱的，因为原来在膜上的蛋白和膜结合得很牢固，这种洗脱作用不至于对膜上蛋白的数量造成实质性影响。
5、一抗和目的蛋白的结合是特异性结合，这种结合力比较强。
6、结合能力比较：1＞2≥5＞3
7、理由：
a、抗体洗脱液可以洗脱抗体，却不能洗脱膜上的蛋白，故2≥5。（另外，洗涤剂如免疫组化的PBS或wetern的TBST无法洗脱2和5、3这三种结合，只是洗去未结合一抗。因为在加二抗前有洗涤，如果能洗脱的话，二抗就会取代被洗掉的蛋白而与膜或其他蛋白产生非特异结合。所以，在封闭后也可洗涤也可不洗涤，但不洗会保险一点，因为在都封闭的情况下，一抗终究会取代封闭液中的蛋白。）
b、1和2有着相同的结合方式，但1的机械填补是在电场的作用下完成的，综合起来认为1＞2。
c、一抗和目的蛋白的结合是特异性的，这种结合在封闭后进行就存在这一抗和封闭液中蛋白对目的蛋白的竞争，但这种竞争很不平衡，因为特异性结合比非特异性结合牢固得多（5＞3），也就是说一抗最终肯定取代封闭液中的蛋白结合在目的蛋白上；但毕竟是存在着竞争，所以一抗的取代不是完全绝对的，还受封闭液的浓度等因素的影响，因此，封闭液的不同会影响一抗和目的蛋白的结合率，也就解释了封闭时间长短，浓度会影响目的条带的现象。虽然这种影响很微弱。
8、最后，结合的强弱都是相对的，非特异条带的出现首要考虑一抗的特异性，其他只是辅助因素，只有衡量利弊，才能有合适的实验方案。

作者: koook5695 时间: 2013-5-21 17:24

转自 pierce western blot（节选1）

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作者: koook5695 时间: 2013-5-21 17:24

转自 pierce western blot（节选2）

图片附件: 67045167.snap.jpg (2013-5-21 17:24, 60.66 KB) / 该附件被下载次数 10
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16373

作者: hold住 时间: 2013-5-21 17:34

什么牌子的奶粉封闭效果好？我用的最最普通的完达山脱脂奶粉，超市买的，效果感觉也不错啊～

作者: jkobn 时间: 2013-5-21 17:35

我们实验室用安怡的脱脂奶粉。
通常当我们要做检测，需要灵敏的时候用 BSA
当我们需要漂亮结果时用脱脂奶粉

作者: eric930 时间: 2013-5-21 17:35

Millipore 蛋白质印迹手册（节选）

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16374

作者: kuohao17 时间: 2013-5-21 17:36

楼上说的形象，让人一目了然。但个人认为并不全面，如果封闭仅仅是填补空隙的话，那封闭仅仅是起到降低背景的作用。如果是这样的话杂带的问题怎么解释呢？还有免疫组化的封闭是怎么个原理呢？个人觉得从抗原决定簇的角度来说可能会更好一点。抗体是识别抗原决定簇，然后与之结合，奶粉和BSA起封闭作用主要是通过蛋白起作用的，就是能够非特异性地将表面的抗原决定簇结合，这样特异性的抗体就不会跟这些非特异性的抗原决定簇结合，这样背景就会降低。可能有人会问，那目的蛋白为什么不能被封闭掉？因为抗体跟目的蛋白的结合是非常特异的，结合能力很强，封闭之后依然能够结合。当然如果封闭是太长，也能影响抗体的特异性结合，导致最后显影信号变弱，这就是有时候封闭时间长了信号变弱的原因。同样，通过延长封闭时间来去除非特性条带以及免疫组化中延长封闭时间降低背景都是这么个原理。
个人拙见，不知道说没说清楚，不对之处欢迎指正

我有个疑问，既然抗体的结合是特异性的，其与目的蛋白的结合是非常特异且结合能力很强，其辨识目的蛋白的能力应该很强，那特异性的抗体怎么会与非特异性的抗原决定簇结合？

作者: vera+ 时间: 2013-5-21 17:38

这里有2种情况
1，IgG本身也是一种蛋白质，是蛋白质就有疏水作用或者亲水基团，这样和别的物质就会发生一定牢固程度的结合，当然这种结合总是强不过特意性的“抗原--抗体”结合。

2，相似表位的问题（半特异结合），一个表位一般是有4-6个氨基酸组成的，一个抗原或者说一个蛋白质本身可以组合出很多种表位（包括线形和空间两种表位）。当你的抗体的特异性不是非常好（识别的表位属于一些类似蛋白的同源性或者保守区），或者一些蛋白有3-4个氨基酸序列和你抗体所识别的表位序列相似时（转膜的蛋白种类越多，发生这种"撞衫"情况的几率也越高），抗体也是有一定的亲和性。这个时候就是考验一个抗体表位特异性的时候了，高质量的单抗，这方面应该是尽量避免发生的，所以做QC的时候需要用全细胞裂解液作为转膜的蛋白，来测试细胞中是否有杂蛋白能“非特异”或者“半特异”结合。

作者: vera+ 时间: 2013-5-21 17:40

继续讨论。两个问题：

1、封闭液可用Tween 20等非离子型表面活性剂来降低背景和非特异性条带的原因？
看了很多关于WB封闭的资料，均提到了上述现象。除了可能的抗原修复，膜的疏水性吸附封闭，会不会还有竞争性洗脱膜上蛋白的作用呢？

楼上阐述了封闭对膜上的蛋白是一种非特异性的吸附覆盖，从而影响背景和非特异性条带的结果。Tween20这种小分子也能有效吸附覆盖吗？

2、关于免疫组化使用封闭液
战友在前面提到过免疫组化的例子，我没有做过免疫组化，刚好看看了解一下。发现一个和本帖相关的问题，正好大家讨论。

免疫组化中使用的封闭液与WB有些差别，常常使用的是动物血清为封闭成分及抗体稀释液。这里面的原理除了可能的楼上战友所认为的非特异性吸附覆盖作用外，至少还有一种可能性，那就是特异性的结合。

动物的正常血清中往往也含有一些微量的“特异性抗体”，与我们的一抗或二抗特异性相同。这一点至少我在一种小鼠单抗纯化和一种羊血清多抗纯化过程中得到验证。

通俗的讲，正常的动物血清实际上也有一点儿“不正常”。

用这种有一点儿“不正常”的血清作为封闭或抗体稀释液，就完全是有点特异性的竞争结合了。结果就是整个的降低了检测信号值，非特异条带没有了。

说到这儿，不禁对这些封闭的手段怀疑。不是说怀疑它的效果，而是试验的真实性。我们实验的目的就是为了一张好看漂亮的图吗？

为了这个好看的图，为了可以发表文章，就用一些实验手段，想方法来消除这些事实上应该存在的条带，使得试验结果向我们想要的方向进行？

非特异性条带实际上是抗体特异性不够或抗原决定族接近的真实反映。

作者: caihong 时间: 2013-5-21 17:41

你可以理解为NC膜或者PVDF膜上有很多洞洞，通过电转，胶上的蛋白被转移到了膜上，塞进了很多洞洞里面，但是你也知道，蛋白并不是连续的，有很多空隙，而且比如说样品孔之间也有空隙，这些洞洞并没有填进东西，而抗体也是蛋白，也会被吸附在空的洞里，这样，就会有很多非特异性的信号，但如果用富含蛋白的封闭液与膜作用，那所有的空洞都会被BSA或者酪蛋白填满，这样，抗体蛋白就不会被非特异性的吸附到膜上，而只会跟特异性蛋白结合

说的真好,赞一个!

作者: 831226 时间: 2013-5-21 17:44

各位的建议也可以解释为什么要用封闭液来稀释抗体了。

作者: 66小飞侠 时间: 2013-5-21 17:45

关于Tween-20降低背景及杂带：
我认为作为表面活性剂的Tween20有很强的对非特异性吸附的洗脱作用，这一点从丽春红染膜后洗脱可以看出来，用蒸馏水洗丽春红染后的膜效果很差，红色褪去较慢，但加了Tween20的TBS能很轻易的洗掉丽春红，红色很快就漂洗掉了。
同样，一抗稀释液中的Tween20可以将一些非特异性吸附的抗体-蛋白复合物中的抗体洗掉，但相对于特异性吸附的抗体抗原复合物作用就小了很多，以此就降低了一些背景和杂带。
封闭液中Tween20同样可以降低蛋白间的疏水作用，个人认为Tween20洗脱非特异性结合是有的，但不是“竞争性洗脱”而是利用其表面活性作用直接的将非特异性结合“拆散”，减少封闭液中的蛋白与膜上蛋白的结合，可以避免封闭过度引起信号降低，相对背景杂带就少喽。
个人愚见，期待更好的解释。

作者: utt0989 时间: 2013-5-21 17:45

学习了，不知道ELISA中封闭时间过长会不会也导致阳性OD降低？

作者: qiangren789 时间: 2013-5-21 17:45

给大家讲一个故事：

有一面墙，墙上布满胶水，胶水很黏。
有一个人，开着一辆车，从垃圾回收站把一堆废铜烂铁拉到墙边，并粘在上边。
有一群孩子很顽皮，把好多的破烂东西往墙上粘，有塑料、木头，甚至少量铁屑，最后都粘满了。
车主想看看自己捡到的东西里有多少铁。
他用水龙头往下冲，结果只冲下少量泥土。
他想了个好办法，将一些彩色的磁石粉撒到了墙上，然后又用水冲
他看到了那些彩色的东西在一个地方闪闪发光，很特异

首先，nc膜靠疏水性结合蛋白，力量大；pvdf膜也靠疏水性但它还带正电荷，所以和带sds的蛋白正好结合，力量更大。大家所说的堵上窟窿虽然很形象，但是实质上不是靠窟窿，而是靠蛋白与膜的结合力，电转只是将蛋白送过去，是一辆车，而不是把蛋白订到膜上的锤子。

所以无论是电转上去的蛋白条带，还是滴加上去的封闭液，作用力相差不大，封闭后的结果就是膜上布满蛋白！而且结合力都很强！

有少量的封闭剂会和我们的目的蛋白发生一些作用力，有可能堵住抗原决定簇，但这种力量很小，所以我们用低浓度tween20去洗，其实tween洗的就是他们！如果你用tween80去洗，结果几乎就是一张新膜

一抗也是蛋白，但来晚了，膜上没有位子了，只有一些蛋白上有它的抗原决定簇可以结合，所以它就被特异了！一些不太合适的决定簇也可能被结合，但又可以用tween20了

就这样，一抗特异了

作者: loli 时间: 2013-5-21 17:46

我看了大家的分析真的很精彩，我当实例，大家结合给分析下吧也许其他人理解的更快些。我前天做了个条带，转膜完成用脱脂牛奶4°C封闭6个小时，一抗是1：500 4°C脱脂牛奶封闭过夜，二抗1:5000脱脂牛奶室温封闭2小时.曝光后结果如下：请大家给分析分析

图片附件: 28390791.jpg (2013-5-21 17:46, 14.7 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16375

作者: moonlight45 时间: 2013-5-21 17:47

但个人认为并不全面，如果封闭仅仅是填补空隙的话，那封闭仅仅是起到降低背景的作用。如果是这样的话杂带的问题怎么解释呢？还有免疫组化的封闭是怎么个原理呢？个人觉得从抗原决定簇的角度来说可能会更好一点。抗体是识别抗原决定簇，然后与之结合，奶粉和BSA起封闭作用主要是通过蛋白起作用的，就是能够非特异性地将表面的抗原决定簇结合，这样特异性的抗体就不会跟这些非特异性的抗原决定簇结合，这样背景就会降低。可能有人会问，那目的蛋白为什么不能被封闭掉？因为抗体跟目的蛋白的结合是非常特异的，结合能力很强，封闭之后依然能够结合。当然如果封闭是太长，也能影响抗体的特异性结合，导致最后显影信号变弱，这就是有时候封闭时间长了信号变弱的原因。同样，通过延长封闭时间来去除非特性条带以及免疫组化中延长封闭时间降低背景都是这么个原理。
个人拙见，不知道说没说清楚，不对之处欢迎指正

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说的很好，只是有疑问，中间有句“目的蛋白的结合是非常特异的，结合能力很强，封闭之后依然能够结合”，请问：
如果封闭蛋白与非特异性位点结合，也可以与特异性位点结合。那么特异性位点结合后，特异性位点就没有位点或空间与特异性抗体蛋白结合了。抗体与目的蛋白结合力再强，又如何结合呢？？？已经没有了位点和空间，如何结合？？难道会像磁铁一样有穿透性吗？？不会吧……

还是不明白封闭的道理……请继续解释！！

作者: qumm1985 时间: 2013-5-21 17:47

QUOTE:

原帖由 moonlight45 于 2013-5-21 17:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
但个人认为并不全面，如果封闭仅仅是填补空隙的话，那封闭仅仅是起到降低背景的作用。如果是这样的话杂带的问题怎么解释呢？还有免疫组化的封闭是怎么个原理呢？个人觉得从抗原决定簇的角度来说可能会更好一点。抗体是识别抗 ...

哈哈，竞争性结合！！！把封闭蛋白推开，自己坐上去！！！

作者: moonlight45 时间: 2013-5-21 17:48

QUOTE:

原帖由 qumm1985 于 2013-5-21 17:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

哈哈，竞争性结合！！！把封闭蛋白推开，自己坐上去！！！

请问：“把封闭蛋白推开，自己坐上去！！！”，如何推开？？？与目的蛋白结合的力量？？中间隔着封闭蛋白，抗体能不能找到目的蛋白还是个问题吧？那又是如何推开的呢？？

作者: birdfish 时间: 2013-5-21 17:49

最近用0.2孔径的膜，对封闭有一些体会，和大家交流一下。millipore 0.2的膜吸附蛋白能力很强，如果常规方法封闭，NC膜封闭一个小时就可以，而0.2的膜如果按这个条件，背景很高，几乎完全盖住目的条带。但有一些表达量不高，分子量较小的蛋白用0.2的膜还是必需的。我改进条件，4度封闭过夜，然后洗脱时间延长，效果就改善了。

如前面战友所说，封闭降低背景，应该是因为封闭液与膜上能非特异性吸附蛋白的位点结合，非特异性吸附蛋白的位点结合掉以后，当一抗或二抗（蛋白）加入时，不会再与膜非特异性结合了。（这种结合可以是疏水作用，离子键，共价键等）

至于非特异性条带，封闭条件优化一下应该能降低或去除。但我觉得没有太大必要去除。因为抗体特异性不一定很强。再者有很多未知的蛋白与蛋白相互作用，蛋白跟蛋白之间的相互作用，也能发生在非目的蛋白与抗体之间。只用我们所要的目的蛋白变化明显就足够了。

作者: fox_79 时间: 2013-5-21 17:49

不用那么麻烦奶粉用小牛初乳就可以我做过脑脊液与神经脱髓鞘的研究，那些单一抗体比如IgG寡克隆就是很好的例子，如果在转膜是把气泡赶走就可以

作者: ukonptp 时间: 2013-5-21 17:50

封闭的目的---阻滞膜对抗体的非特异性吸附

作者: bohe221 时间: 2013-5-21 17:50

不过呢，如果一抗是羊源的抗体，一定要用BSA，否则，奶粉中的很多成分可以被羊源抗体识别，只能得到黑膜。

作者: xue258 时间: 2013-5-21 17:51

不过呢，如果一抗是羊源的抗体，一定要用BSA，否则，奶粉中的很多成分可以被羊源抗体识别，只能得到黑膜。

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我用的就是牛奶，没有你说的现象。

作者: 脱水萝卜 时间: 2013-5-21 17:51

既然这样，无果我不封闭，直接加一抗会是什么结果？TBS配置后有两年了，一直在4度置放，会对western结果有影响吗？

作者: 68943512yao 时间: 2013-5-21 17:51

本人一直WB，交流下！
1、奶粉（封闭液）中的蛋白填塞入膜孔道，封闭膜上无蛋白转移区，这样一抗孵育时起到减轻背景作用；
2、奶粉与抗原结合只是非特异性结合膜表面抗原，在一抗孵育情况下大部分可以竞争性的与抗原结合，而此时的一抗和奶粉对杂带的作用均为非特异性的作用~ 所以奶粉封闭后可以减少杂带的显色；封闭时间长条带变弱，此时可以延长漂洗和一抗孵育的时间。
3、预实验时多做几次，摸索好自己的条件~ 因为各个阶段的时间都不是唯一的~

作者: nn255 时间: 2013-5-21 17:52

学习了，收益非浅，感谢各位大侠

奶粉你们浓度都怎么掌握呢，多少奶粉加多少水

作者: ROSE李 时间: 2013-5-21 17:52

既然这样，无果我不封闭，直接加一抗会是什么结果？TBS配置后有两年了，一直在4度置放，会对western结果有影响吗？

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建议不要使用了。我们最初做wb时用的就是在4度保藏了2年的TBS，结果封闭效果很差。后来从新配了，背景变得很好。

作者: 9900 时间: 2013-5-21 17:53

转自The ELISA Guidebook (2nd edition).pdf 第123页 John R. Crowther

作者: 9900 时间: 2013-5-21 17:54

相信参与讨论的各位战友都有受益匪浅的感觉，我觉得这种讨论的形式真的不错。

比书本上的资料来得生动，因为我们自己都做过相关的工作，有实践的体会；又比单纯的试验细节讨论更高一些，因为我们在根据实践总结一些共性的东西。

在思考中我们回顾了自己的实验；在讨论中我们了解了更多的不同面；在总结中我们获得了真实性的技术。

作者: xue258 时间: 2013-5-21 17:54

请问：“把封闭蛋白推开，自己坐上去！！！”，如何推开？？？与目的蛋白结合的力量？？中间隔着封闭蛋白，抗体能不能找到目的蛋白还是个问题吧？那又是如何推开的呢？？

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哈哈，推开只是一种比喻，至于具体如何推开就和抗体和目的蛋白的相互作用强度有关了，比如氢键，共价键，范德华力，还有空间位阻等等。这里的推开用取代或许更准确一点。而能不能找到目的蛋白，这就是一个碰撞几率的问题，按理说，这个几率在这些实验上不成问题才对。这个问题看来是很细化。

作者: vcve 时间: 2013-5-21 17:55

精彩!封闭蛋白与以结合到膜上的蛋白作用方式两种观点都有道理,我个人觉得两种作用方式在同时起作用.但个人觉得封闭蛋白对目的蛋白两种作用方式很微弱,试想如果作用一般的话,那么有的蛋白就有可能做不成WB,因为蛋白的多样性的存在会使这两种作用方式占主导地位;不管是那种方式占主导地位,最终的结果就是抗体结合不了目的蛋白.至于封闭时间过长会产生信号减弱的现象,本人认为蛋白之间洗脱和吸附多是需要时间的,相互作用弱的就更依赖时间了.(对吸附作用来江,也许很可能时间长了会产生不可逆影响;对洗脱也是如此).总之,我个人认为:1、封闭液中的蛋白与膜上的空白位置结合占主导地位；2、封闭液中的蛋白与膜上的蛋白的洗脱和吸附作用在相对短的时间内很微弱，但也很重要。

作者: hold住 时间: 2013-5-21 17:56

在不断的思考过程当中，觉得无论

封闭（膜与封闭蛋白或非蛋白）、

特异性的抗体结合（抗原抗体，一抗二抗）、

非特异性的蛋白相互作用（杂带与封闭蛋白，杂带与一抗二抗，封闭蛋白与一抗二抗）、

洗脱液中各种成分的作用（如Tween）

都可以用化学反应中的动态平衡来比喻。

影响WB结果的就是这些反应的化学反应平衡常数，参与反应的物质，以及化学动力学中达到反应平衡所需的反应时间。平衡常数决定了这些相互作用的强度，而动力学决定了能否到达平衡的时间作用。

从理论上来讲，WB体系中的吸附和洗脱都是存在的，无非就是参与反应的强弱而已。可能平衡常数和动力学决定了某些反应在实践中难以察觉。

想到一点说一点，不知不觉向化工方面靠了，见笑。

大家继续讨论，加票加分，呵呵。

作者: greenbee 时间: 2013-5-21 17:57

有人注意过膜上面蛋白量的问题么？
如果是洗脱，则膜上蛋白要脱
如覆盖屏蔽杂带是否较易理解

作者: duoduo 时间: 2013-5-21 17:57

封闭膜上的-OH, =O, -NH, -NO2,-COOH,-SH, -SO, 等很多基团。甚至就是-C-C-, -C-H, 免得结合一抗二抗。亲水，疏水，氢键，范德华力，离子键，…

…各种作用都有；所以教科书不详细列举了。

脱脂奶粉中蛋白大小都有，所以封闭彻底；其中最多的还是BSA吧。拿别的蛋白封闭也行，但是贵。

作者: hustwb 时间: 2013-5-21 17:58

你可以理解为NC膜或者PVDF膜上有很多洞洞，通过电转，胶上的蛋白被转移到了膜上，塞进了很多洞洞里面，但是你也知道，蛋白并不是连续的，有很多空隙，而且比如说样品孔之间也有空隙，这些洞洞并没有填进东西，而抗体也是蛋白，也会被吸附在空的洞里，这样，就会有很多非特异性的信号，但如果用富含蛋白的封闭液与膜作用，那所有的空洞都会被BSA或者酪蛋白填满，这样，抗体蛋白就不会被非特异性的吸附到膜上，而只会跟特异性蛋白结合

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说句实话，我以前一直是这么理解的，我觉得也不尽然就是这么回事。因为封闭不好的话，常常出现的情况是杂带显色，而不是没有蛋白条带的空白膜上显色！我现在倒更倾向于认为封闭可能是利用蛋白质之间的非特异性的相互作用（次级键的作用）而将能潜在结合抗体的部位占据。如果有人可以做一个极端的实验，利用BSA的抗体做Western，看看封闭以后是不是整个膜都显色可能会有一个比较直观的结果，呵呵。

作者: junhun 时间: 2013-5-21 17:58

不过呢，如果一抗是羊源的抗体，一定要用BSA，否则，奶粉中的很多成分可以被羊源抗体识别，只能得到黑膜。

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我买的BSA是TAKARA的0.3%的，配封闭液时应该怎么稀释？

作者: langlang 时间: 2013-5-21 17:59

弱弱地问一句：为什么封闭完了后还要洗脱呢？

作者: kuohao17 时间: 2013-5-21 18:00

关于Tween-20降低背景及杂带：
我认为作为表面活性剂的Tween20有很强的对非特异性吸附的洗脱作用，这一点从丽春红染膜后洗脱可以看出来，用蒸馏水洗丽春红染后的膜效果很差，红色褪去较慢，但加了Tween20的TBS能很轻易的洗掉丽春红，红色很快就漂洗掉了。
同样，一抗稀释液中的Tween20可以将一些非特异性吸附的抗体-蛋白复合物中的抗体洗掉，但相对于特异性吸附的抗体抗原复合物作用就小了很多，以此就降低了一些背景和杂带。
封闭液中Tween20同样可以降低蛋白间的疏水作用，个人认为Tween20洗脱非特异性结合是有的，但不是“竞争性洗脱”而是利用其表面活性作用直接的将非特异性结合“拆散”，减少封闭液中的蛋白与膜上蛋白的结合，可以避免封闭过度引起信号降低，相对背景杂带就少喽。
个人愚见，期待更好的解释。

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说法没错但是关于丽春红的那一段不对。丽春红在低pH时带电荷，可以结合到多肽上显色。水洗脱色很慢，但是用偏碱性的缓冲液清洗时丽春红被中和，电荷消失，容易被洗掉，和Tween没有关系

作者: chenshuanhe 时间: 2013-5-21 18:00

所以无论是电转上去的蛋白条带，还是滴加上去的封闭液，作用力相差不大，封闭后的结果就是膜上布满蛋白！而且结合力都很强！有少量的封闭剂会和我们的目的蛋白发生一些作用力，有可能堵住抗原决定簇，但这种力量很小，所以我们用低浓度tween20去洗，其实tween洗的就是他们我最近实验背景很深是否和封闭有关系……………………

作者: chenshuanhe 时间: 2013-5-21 18:00

10X的TBS ,配好有半年了最近做实验背景很深，是否TBS有问题？最好背景深的原因一般有哪些…………求解

作者: duoduo 时间: 2013-5-21 18:01

蛋白从胶上转移到膜上之后，通过skykiller所说的疏水作用、静电、范德华力等非共价键、共价键及离子键与膜结合，不同的膜结合方式也不一样。NC膜是是通过非共价键结合；重氮化膜通过共价键结合；阳离子膜是通过离子键结合；PVDF膜是用来吸附从各种凝胶中转印的蛋白质的最佳用膜，呈均一控制的孔结构，具有极强的吸附生物分子的能力。如skykiller说的，封闭液的成分、浓度、pH值、盐浓度、表面活性剂及封闭时间等要素对WB的结果都有很大影响。但是skykiller所提出的吸附-洗脱假说并不适合用来解释封闭作用。封闭，顾名思义，就等于是在表面铺一层物质，来阻断那些非特异性的结合，而并不是一个洗脱的过程。免疫组化的封闭其原理是一样的，如果封闭是一个洗脱的过程的话，那免疫组化是几个微米的组织切片，那么厚的蛋白层，怎么可能洗脱掉？怎么可能降低背景呢？洗脱只能说是在孵育完抗体之后用PBS-T/TBS-T洗，将非特异性结合的抗体洗脱下来的过程。“由于竞争性的作用，对杂蛋白的洗脱也越好，但对目标蛋白的洗脱也越强。也就是说在相同曝光条件下背景更干净，杂带更淡，但目标条带也更淡。”这句话确实也能解释封闭时间长，信号减弱的问题，但我觉得这并不是其真正原因。封闭时间对于结合在膜上的蛋白的量是没有什么实质性的影响，在强酸、强碱、变性剂等等情况下才能把蛋白洗脱下来。想想看，就算是在用stripping buffer stripping之后，蛋白都能很好的结合在膜上，更何况是封闭液了。上面说提到pH值是指封闭液的pH值，并不是转膜缓冲液的pH，转膜缓冲液pH值对蛋白结合到膜上影响很大，而PBS-T/TBS-T的pH对封闭效果及一抗结合效果影响很大。

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而对于楼上所说的“由于竞争性的作用，对杂蛋白的洗脱也越好，但对目标蛋白的洗脱也越强。也就是说在相同曝光条件下背景更干净，杂带更淡，但目标条带也更淡。” 如果说封闭时间过长，导致目标蛋白洗脱越强的话，那么striping后对同一张膜经行再次分析是不是一般会有足够大的影响导致striping没有结果？而事实上，striping还是被很多实验者应用。如果目标蛋白被洗脱了，这个striping的方法我觉得是不是就没有存在的必要了呢？
我是菜鸟一只，刚刚接触WB，做了4次。拙见请拍砖！嘎嘎~

作者: duoduo 时间: 2013-5-21 18:03

我看了大家的分析真的很精彩，我当实例，大家结合给分析下吧也许其他人理解的更快些。我前天做了个条带，转膜完成用脱脂牛奶4°C封闭6个小时，一抗是1：500 4°C脱脂牛奶封闭过夜，二抗1:5000脱脂牛奶室温封闭2小时.曝光后结果如下：请大家给分析分析

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兄弟啊，我做了2次WB了，第一次就和你这个一样。也是4°封闭6h，一抗4°过夜，二抗我是75min。然后显色就是你这样。然后第二次，我封闭了3小时，一抗稀释液中的牛奶提高了0.4%，二抗提高了0.25%，结果显色出现白板板，；连actin都没有出来。很郁闷啊！不知道您是否有解决您出现的问题？求教啊！感谢！

作者: IAM007 时间: 2013-5-21 18:03

兄弟啊，我做了2次WB了，第一次就和你这个一样。也是4°封闭6h，一抗4°过夜，二抗我是75min。然后显色就是你这样。然后第二次，我封闭了3小时，一抗稀释液中的牛奶提高了0.4%，二抗提高了0.25%，结果显色出现白板板，；连actin都没有出来。很郁闷啊！不知道您是否有解决您出现的问题？求教啊！感谢！

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是不是封闭时间太长了？考虑下室温1h(拙见）

作者: duoduo 时间: 2013-5-21 18:04

是不是封闭时间太长了？考虑下室温1h(拙见）

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哈哈，我今天做了一次出来了，还是4度封闭6H，只是稀释用的牛奶倍数降了。还是谢谢你的意见，我会试试的，今天的背景有点儿高。
多谢你的回复啊！
祝：顺利！

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