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标题: 【讨论帖】蛋白研究技术答疑专贴 [打印本页]

作者: NBA 时间: 2013-5-21 18:18 标题: 【讨论帖】蛋白研究技术答疑专贴

蛋白质是生命活动最终的控制者和执行者。在分子生物学研究中，往往会陷入一种尴尬局面：DNA编码了RNA，RNA也翻译成了蛋白，但却无法解释蛋白何时、如何、以及为什么被激活，从而承担相应的工作，使生物体表现相应的机能。在蛋白质水平对生物学过程进行研究势在必行。然而，蛋白种类繁多、各有特点，而且难以合成、纯化和保持稳定性，这些瓶颈，制约着蛋白相关研究的开展。

虽然对蛋白质进行研究难度大，但人们攻克难关的决心从未改变。从经典的Western Blot，免疫组化，酵母双杂交，双向电泳技术到现在最热门的蛋白芯片，生物质谱等，对蛋白质表达差异、相互作用、功能以及修饰等各方面进行不断深入的探索。如何很好地利用这些通用的工具，最好地服务于自己的个性化研究，是每个科研工作者最关心的问题。

作者: memory 时间: 2013-5-21 18:19

我现在做的是关于蛋白修饰和相互作用方面的，我想问一下有没有软件可以预测某一种蛋白质的修饰及相互作用蛋白呢？谢谢

作者: yes4 时间: 2013-5-21 18:19

现在很多实验室开始用 genome-wide siRNA screening 掘金了，但就是成本太高。
请问一下目前有没有其他的 High throughput screening 技术用于蛋白质功能的研究？

作者: zhezhe 时间: 2013-5-21 18:19

蛋白质电泳之后银染，有些地方说由于上样缓冲液里含有巯基乙醇，会在55或67KDa处出现两条平行的条带，那这个量有没有一个大概的范围？如果目的蛋白是微量的，而且分子量也恰好处于55-72KDa之间，那还有什么敏感的染色方法，如果用银染，那该如何避开这个干扰？DTT是否也会出现这种现象？原理又是什么？谢谢

作者: dongdongqiang 时间: 2013-5-21 18:20

您好，版主。我现在做唾液淀粉酶糖基化与非糖基化，以WB分离二者。
大致条件如下：
1、电泳：浓缩胶60V、10min左右，分离胶100V、60min左右；
2、转膜：湿转，100mA、2.5h；
3、封闭：5%BSA+TBST(tween-20浓度0.058%)，室温下、床2h；
4、一抗与二抗按说明书稀释。稀释液与清洗液与封闭液配方一样，均为1.33%BSA+TBST(tween-20浓度为0.025%)；
5、ECL发光法。
结果如图，您能不能给分析下，我个人感觉电泳后的环节出问题。上样量足够、电泳分离得蛮好。谢谢噢。

作者: bring 时间: 2013-5-22 12:38

我们现在做的是脂肪组织的WB，有一个解决不了的问题是：测完浓度后（BCA法），按照计算出来的上样量，电泳后显影出来的内参都是有差异的，自己分析了一下，可能是抽提的蛋白中还是有脂类，影响了浓度测量的准确性。
想请教一下，对于脂肪组织的WB，有没有什么好的方法，以确保内参的一致性。
谢谢。

作者: NBA 时间: 2013-5-22 12:39

QUOTE:

原帖由 memory 于 2013-5-21 18:19 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我现在做的是关于蛋白修饰和相互作用方面的，我想问一下有没有软件可以预测某一种蛋白质的修饰及相互作用蛋白呢？谢谢

关于蛋白质相互作用方面的软件有很多，比如cuturl('http://www.bio-soft.net/protein.html') 就有很多关于这方面的介绍，在很多论坛上也有，幸运的话可能淘到一些**的软件。个人认为最好的方式还是通过查找文献来获得蛋白相互作用的证据，因为一些物种整个的相互作用网络已经构建好了并发表在相关的杂志上（比如人，拟南芥，水稻等），很多都有酵母双杂的证据，结果更可靠。另外，像CO-IP, ITC，BIFC等都是研究蛋白相互作用的常用方法了。
蛋白修饰方面的软件我就不大清楚了，目前来说，质谱和制作相关的抗体来研究可能是主要的手段了，像short-gun 蛋白组学以及质谱测序等研究方案，和抗体芯片研究磷酸化等信号通路方面等在蛋白修饰方面都是很好的研究手段。

作者: NBA 时间: 2013-5-22 12:39

QUOTE:

原帖由 yes4 于 2013-5-21 18:19 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

现在很多实验室开始用 genome-wide siRNA screening 掘金了，但就是成本太高。
请问一下目前有没有其他的 High throughput screening 技术用于蛋白质功能的研究？ ...

在蛋白水平能跟genome-wide siRNA screening相类似的方法可能就是化学遗传学(chemical genetics)方法了。它利用化学工具来研究生物体系的一种新兴手段, 它不仅可以在不同时间, 以不同剂量,和进行可逆操作, 为功能基因组研究提供一个检测特定基因或蛋白质功能的手段, 同时, 它也可以在以下两个重要方面促进新药开发: 一方面是鉴定出在某种疾病形成过程中起重要作用的基因或蛋白质, 从而为新药筛选提供靶点; 另外一方面是发现特异性作用于某个基因或蛋白质的小分子化合物, 从而为新药开发提供先导化合物。化学遗传学的研究策略： 1.正向的化学遗传学采用各种小分子化合物处理细胞, 诱导细胞出现表型变异, 然后经过筛选, 寻找小分子作用的靶标。 2.反向的化学遗传学是从基因或蛋白质与小分子化合物的相互作用来研究基因或蛋白质对表型的影响, 从而确定这些生物大分子的功能。进行化学遗传学研究的关键之一是要有大量的可供筛选的不同结构的化合物。新兴的组合化学是化学遗传学获得大量小分子化合物的核心技术。它的原理是, 在同一个化学反应体系中加入不同的结构单元, 利用这些结构单元的排列组合, 就能够系统地合成大量的化合物。此外, 现代化学多样性合成技术的改进和发展, 也为化学遗传学奠定了良好的基础。
　　化学遗传学在功能基因组学研究中的应用：
　　1.寻找酶的抑制剂
　　2.寻找酶的作用底
　　3.研究细胞内信号转导
　　4.研究基因转录

作者: ukonptp 时间: 2013-5-22 12:40

QUOTE:

蛋白质相互作用的预测针对不同物种模式生物有许多预测方法，总结网站详见：cuturl('http://www.geneinfinity.org/sp/sp_proteininteraction.html#ppidb')

蛋白质修饰的预测针对不同的修饰方法也有许多预测网站，总结详见：
cuturl('http://www.cbs.dtu.dk/researchgroups/PTM.php')

作者: NBA 时间: 2013-5-22 12:40

蛋白质电泳之后银染，有些地方说由于上样缓冲液里含有巯基乙醇，会在55或67KDa处出现两条平行的条带，那这个量有没有一个大概的范围？如果目的蛋白是微量的，而且分子量也恰好处于55-72KDa之间，那还有什么敏感的染色方法，如果用银染，那该如何避开这个干扰？DTT是否也会出现这种现象？原理又是什么？谢谢

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建议先将电泳后的胶用固定液固定1h 以上，然后用水洗N次后，再进行银染，效果可能更好。另外，银染方法有多种，对不同蛋白有不同的染色效果。

作者: NBA 时间: 2013-5-22 12:41

QUOTE:

原帖由 bring 于 2013-5-22 12:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我们现在做的是脂肪组织的WB，有一个解决不了的问题是：测完浓度后（BCA法），按照计算出来的上样量，电泳后显影出来的内参都是有差异的，自己分析了一下，可能是抽提的蛋白中还是有脂类，影响了浓度测量的准确性。
想请教一下，对于脂 ...

如果想除去脂类，可以尝试“丙酮沉淀”处理一下样品。

作者: NBA 时间: 2013-5-22 12:42

您好，版主。我现在做唾液淀粉酶糖基化与非糖基化，以WB分离二者。
大致条件如下：
1、电泳：浓缩胶60V、10min左右，分离胶100V、60min左右；
2、转膜：湿转，100mA、2.5h；
3、封闭：5%BSA+TBST(tween-20浓度0.058%)，室温下、床2h；
4、一抗与二抗按说明书稀释。稀释液与清洗液与封闭液配方一样，均为1.33%BSA+TBST(tween-20浓度为0.025%)；
5、ECL发光法。
结果如图，您能不能给分析下，我个人感觉电泳后的环节出问题。上样量足够、电泳分离得蛮好。谢谢噢。

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从图上结果来看，个人感觉除背景有些深和主带有些虚外，其他都还可以。背景深可能是因为一抗孵育完以后洗膜不彻底，主带虚的话可以尝试适当增加一抗孵育时间。如果目的蛋白的分子量过大不建议使用高电流转膜。个人意见，仅供参考。

作者: nn255 时间: 2013-5-22 12:42

你好，请问用组蛋白试剂盒测试组蛋白乙酰化程度，每个样本至少需要抽取多少的血呢？这些血能不能分离单个核细胞后-80°C保存，以后再批量提取组蛋白呢？

作者: greenbee 时间: 2013-5-22 12:42

如果想除去脂类，可以尝试“丙酮沉淀”处理一下样品。

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想就“丙酮沉淀”请教一个问题：有人用丙酮浓缩蛋白质，但又说浓度过低的时候不能用这种方法，因此就有疑问：既然要浓缩，那就是浓度比较低，如果浓度过低不能选择丙酮沉淀，那大概这个度该是多少？或者根本就没这种限制？谢谢

作者: NBA 时间: 2013-5-22 12:43

想就“丙酮沉淀”请教一个问题：有人用丙酮浓缩蛋白质，但又说浓度过低的时候不能用这种方法，因此就有疑问：既然要浓缩，那就是浓度比较低，如果浓度过低不能选择丙酮沉淀，那大概这个度该是多少？或者根本就没这种限制？谢谢

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关于这个浓度的话，最好在1mg/ml以上。

作者: guagua 时间: 2013-5-22 12:43

如果想除去脂类，可以尝试“丙酮沉淀”处理一下样品。

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您好，请问您那儿有“丙酮沉淀”的相关知识和操作吗？

作者: DNA 时间: 2013-5-22 12:44

蛋白质芯片技术的应该越来越广，其中抗体芯片更为成熟，请问目前市面上的抗体芯片有多少种？应用最成熟的是那些？谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-5-22 12:44

蛋白质芯片技术的应该越来越广，其中抗体芯片更为成熟，请问目前市面上的抗体芯片有多少种？应用最成熟的是那些？谢谢！

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抗体芯片根据片基不同分为平面微阵列芯片和悬浮液体芯片，平面微阵列芯片代表品牌有Raybiotech、Full moon等，悬浮液体芯片的代表产品有Bio-rad的Bio-plex悬浮芯片系统。

作者: NBA 时间: 2013-5-22 12:51

您好，请问您那儿有“丙酮沉淀”的相关知识和操作吗？

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1 样品中加入5倍样品体积的丙酮(-20度预冷后)，-20度过夜；
2 5000g，4度，离心10分钟；弃上清，待样品中丙酮挥发完后加入裂解液溶解。
个人的小小经验，希望对您有帮助！

作者: fox_79 时间: 2013-5-22 12:52

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原帖由 NBA 于 2013-5-22 12:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
您好，请问您那儿有“丙酮沉淀”的相关知识和操作吗？

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1 样品中加入5倍样品体积的丙酮(-20度预冷后)，-20度过夜；
2 5000g，4度，离心10分钟；弃上清，待样品中丙酮 ...

在加入丙酮之后是不是就应该把脂肪组织剪碎？用不用超声裂解？还是用破碎仪破碎？
另外，5000 g相当于多少的rpm？我们用的是Eppendoff 5810R的低温离心机。
再次感谢。

作者: viviwang1987 时间: 2013-5-22 12:52

您好，版主。我现在做唾液淀粉酶糖基化与非糖基化，以WB分离二者。
大致条件如下：
1、电泳：浓缩胶60V、10min左右，分离胶100V、60min左右；
2、转膜：湿转，100mA、2.5h；
3、封闭：5%BSA+TBST(tween-20浓度0.058%)，室温下、床2h；
4、一抗与二抗按说明书稀释。稀释液与清洗液与封闭液配方一样，均为1.33%BSA+TBST(tween-20浓度为0.025%)；
5、ECL发光法。
结果如图，您能不能给分析下，我个人感觉电泳后的环节出问题。上样量足够、电泳分离得蛮好。谢谢噢。

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"从图上结果来看，个人感觉除背景有些深和主带有些虚外，其他都还可以。背景深可能是因为一抗孵育完以后洗膜不彻底，主带虚的话可以尝试适当增加一抗孵育时间。如果目的蛋白的分子量过大不建议使用高电流转膜。个人意见，仅供参考。"

谢谢版主的建议。我做的目的蛋白分子量分别是57kD和62kD,个人严重怀疑在转膜环节出问题，电转液配置没问题、新鲜，以前用您讲的湿转、低电流100mA、2h，PVDF膜是0.2um，做了DAB结果还不错。那现在准备转膜做回以前的条件，就是低电流100mA、2h，不过想换个0.45um的PVDF膜。那现在请教您，这个膜的选择应该没问题吧？我选择孔径大的膜会不会有渔网拦不住沙子的顾虑？hope 4 ur reply！

作者: www.1 时间: 2013-5-22 12:54

您好，请问您那儿有“丙酮沉淀”的相关知识和操作吗？

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个人认为：您可以去查找一些文献，有关丙酮沉淀法提取蛋白的相关文章有很多，里面有介绍的，做2D电泳很多都是用这种方法的。

作者: huifeng0516 时间: 2013-5-22 12:55

个人认为：您可以去查找一些文献，有关丙酮沉淀法提取蛋白的相关文章有很多，里面有介绍的，做2D电泳很多都是用这种方法的。
谢谢您。

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很不好意思，我只是做脂肪组织的普通WB，感觉浓度测的不准、导致内参都不一致，请问您有什么意见和指导。

作者: bring 时间: 2013-5-22 12:55

蛋白类药物的空间构象与其生物活性是密切相关的，请问在制药时，都是有哪些方法来测定不同批次的药品间空间结构的变化？

作者: NBA 时间: 2013-5-22 14:41

谢谢您，再请问，在加入丙酮之后是不是就应该把脂肪组织剪碎？用不用超声裂解？还是用破碎仪破碎？
另外，5000 g相当于多少的rpm？我们用的是Eppendoff 5810R的低温离心机。
再次感谢。

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脂类组织我没提取过，丙酮沉淀应该是用裂解液溶解后的样品，因为丙酮沉淀后样品不易溶解。离心机的g和rpm的换算跟转子的半径有关，Eppendoff 5810R的低温离心机直接按“rpm/rcf"就可以转换了

作者: NBA 时间: 2013-5-22 19:51

为什么在ELISA封闭时有人用BSA，有人用脱脂奶粉？用BAS和脱脂奶粉有什么不同？两者是否用相同的浓度？

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脱脂奶粉: 5%, clean backgroud, but disguises some antigens
BSA: 3%, good signal strength

作者: douding66 时间: 2013-5-22 19:52

老师您好，我想请教您一下，最近想做细胞转染，但是用公司提出的小提中量试剂盒提出的质粒都在100多微克每毫升，这样做转染的话要加很多的液体，这样会不会把整个体系都稀释了，这样低的浓度是不是不适用于细胞转染，怎么才能提高质粒的浓度呢，我已经重新转化过了，还是很低。

作者: NBA 时间: 2013-5-22 19:53

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原帖由 douding66 于 2013-5-22 19:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
老师您好，我想请教您一下，最近想做细胞转染，但是用公司提出的小提中量试剂盒提出的质粒都在100多微克每毫升，这样做转染的话要加很多的液体，这样会不会把整个体系都稀释了，这样低的浓度是不是不适用于细胞转染，怎么才能提高 ...

您好，从我们的经验看，提高质粒浓度可用以下两种方式：1.您可以用冻干机对保存质粒的原液进行浓缩，通过挥发掉多余的水分来起到浓缩效果。2.您也可以用多抽提几管质粒然后合并它们，再加入乙醇将质粒沉淀出来，离心获得沉淀，并彻底晾干（将乙醇完全挥发掉），然后重新加入DNA溶解液体（水，TE等）。

作者: abc816 时间: 2013-5-22 19:53

蛋白类药物的空间构象与其生物活性是密切相关的，请问在制药时，都是有哪些方法来测定不同批次的药品间空间结构的变化？

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简单的办法是采用圆二色谱扫描。

终极解决方案是进行X-ray晶体衍射。小肽类可以用核磁共振。

作者: jujuba 时间: 2013-5-22 19:54

学习中，请问：我目前在进行蛋白磷酸化研究，在无特异性磷酸化抗体时，可选择通用型磷酸化抗体，我想请问免疫沉淀后用磷酸化抗体western与构建标签融合蛋白再进行免疫沉淀western有何区别？谢谢！

作者: H2O 时间: 2013-5-22 19:54

您好！我想请教您关于检测蛋白质的乙酰化和甲基化的具体方法，看了文献感觉它的意思是先用一个乙酰化抗体把蛋白质沉淀下来再用该蛋白的抗体对沉淀下来的蛋白进行western检测，但是具体操作还是不懂
谢谢！

作者: H2O 时间: 2013-5-22 19:55

用western blot技术对creb总水平和磷酸化水平检测是否一定要提取核蛋白来进行western blot呢？普通方法提取总蛋白进行检测会对结果有影响吗？

作者: NBA 时间: 2013-5-22 19:55

"从图上结果来看，个人感觉除背景有些深和主带有些虚外，其他都还可以。背景深可能是因为一抗孵育完以后洗膜不彻底，主带虚的话可以尝试适当增加一抗孵育时间。如果目的蛋白的分子量过大不建议使用高电流转膜。个人意见，仅供参考。"

谢谢版主的建议。我做的目的蛋白分子量分别是57kD和62kD,个人严重怀疑在转膜环节出问题，电转液配置没问题、新鲜，以前用您讲的湿转、低电流100mA、2h，PVDF膜是0.2um，做了DAB结果还不错。那现在准备转膜做回以前的条件，就是低电流100mA、2h，不过想换个0.45um的PVDF膜。那现在请教您，这个膜的选择应该没问题吧？我选择孔径大的膜会不会有渔网拦不住沙子的顾虑？hope 4 ur reply！

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蛋白分子量分别是57kD和62kD 用 0.45um的膜没有问题，不必担心。为保险起见，低电流转膜时间最好延长点好，我个人的习惯是10v 过夜转。

作者: NBA 时间: 2013-5-22 19:56

用western blot技术对creb总水平和磷酸化水平检测是否一定要提取核蛋白来进行western blot呢？普通方法提取总蛋白进行检测会对结果有影响吗？

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提取方法应该是根据您的实验目的来确定的，比如说您的目的蛋白非常少，或者是WB杂出来的杂带很多，或者其他原因，那提取核蛋白就比提取总蛋白要好。

作者: NBA 时间: 2013-5-22 19:57

您好！我想请教您关于检测蛋白质的乙酰化和甲基化的具体方法，看了文献感觉它的意思是先用一个乙酰化抗体把蛋白质沉淀下来再用该蛋白的抗体对沉淀下来的蛋白进行western检测，但是具体操作还是不懂
谢谢！

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您找些IP/Co-IP 方面的protocol 或者试剂盒的说明书看下就明白了

作者: NBA 时间: 2013-5-22 19:57

学习中，请问：我目前在进行蛋白磷酸化研究，在无特异性磷酸化抗体时，可选择通用型磷酸化抗体，我想请问免疫沉淀后用磷酸化抗体western与构建标签融合蛋白再进行免疫沉淀western有何区别？谢谢！

最大区别可能就是构建标签融合蛋白需要遗传转化，专一性更好

作者: greenbee 时间: 2013-5-22 19:58

"从图上结果来看，个人感觉除背景有些深和主带有些虚外，其他都还可以。背景深可能是因为一抗孵育完以后洗膜不彻底，主带虚的话可以尝试适当增加一抗孵育时间。如果目的蛋白的分子量过大不建议使用高电流转膜。个人意见，仅供参考。"

谢谢版主的建议。我做的目的蛋白分子量分别是57kD和62kD,个人严重怀疑在转膜环节出问题，电转液配置没问题、新鲜，以前用您讲的湿转、低电流100mA、2h，PVDF膜是0.2um，做了DAB结果还不错。那现在准备转膜做回以前的条件，就是低电流100mA、2h，不过想换个0.45um的PVDF膜。那现在请教您，这个膜的选择应该没问题吧？我选择孔径大的膜会不会有渔网拦不住沙子的顾虑？hope 4 ur reply！

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蛋白分子量分别是57kD和62kD 用 0.45um的膜没有问题，不必担心。为保险起见，低电流转膜时间最好延长点好，我个人的习惯是10v 过夜转。

再次感谢版主建议！^_^

作者: tudou85 时间: 2013-5-22 19:58

您好，版主。我现在做唾液淀粉酶糖基化与非糖基化，以WB分离二者，一个56kD，一个62kD；膜是0.45的PVDF膜。再次请教您下转膜的方法，您上次推荐的是湿转、10V过夜转，那请问这个过夜有没有个时间范围？再一个，我之前以100mA、2.5h，有没有可能转过头（marker很淡、胶考R250染未见残余）？dying 4 ur immediate reply！！

作者: ququer787 时间: 2013-5-22 19:59

您好！我想请问我研究的对象标本现在只有半年到一年甚至更长的石蜡块标本，能够进行western blot实验吗？

作者: NBA 时间: 2013-5-22 19:59

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原帖由 ququer787 于 2013-5-22 19:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

您好！我想请问我研究的对象标本现在只有半年到一年甚至更长的石蜡块标本，能够进行western blot实验吗？

一般石蜡块标本建议做免疫组化或者免疫荧光，如果实在要做western blot可以尝试，但是做出来的结果肯定是没有新鲜样品理想。

作者: 3648755 时间: 2013-5-22 20:00

刚开始做蛋白，我想请教一个基础的问题，望帮助解答。
现在基因的表达一般是表达一个开放阅读框，但是对于一些蛋白表达一个完整的开放阅读框往往没有太大的必要，例如：表达一种蛋白做基因亚单位疫苗，仅仅表达具有免疫原性的一段基因会不会更好些？还有就是用原核表达的蛋白，基因太长表达的蛋白太大容易生成包涵体。因此，优化表达一段基因是非常有必要的。但是如何优化表达？小弟才疏学浅，还请赐教！

作者: 3648755 时间: 2013-5-22 20:00

补充一下：基因的密码子容易优化，但是基因的长度如何优化？

作者: plaa 时间: 2013-5-22 20:00

您好！
我在Western blot实验过程中发现某蛋白X在细胞内和细胞外蛋白的分子量不一致，细胞内有两条蛋白带，而分泌到细胞外后则只有一条蛋白带。
现在推测：
（1）X蛋白在向细胞外分泌过程中发生了蛋白质翻译后的去修饰，比如磷酸化和乙酰化。
（2）X蛋白在向细胞外分泌过程中蛋白质发生了发生了截断。
那么通过什么手段可以知道蛋白条带1和蛋白条带2之间的变化：蛋白序列变化、蛋白修饰变化。

作者: NBA 时间: 2013-5-22 20:01

您好，版主。我现在做唾液淀粉酶糖基化与非糖基化，以WB分离二者，一个56kD，一个62kD；膜是0.45的PVDF膜。再次请教您下转膜的方法，您上次推荐的是湿转、10V过夜转，那请问这个过夜有没有个时间范围？再一个，我之前以100mA、2.5h，有没有可能转过头（marker很淡、胶考R250染未见残余）？dying 4 ur immediate reply！！！

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时间范围 8h~14h左右吧，不过以100mA、2.5h，不大可能转过头，但是您说的 “marker很淡、胶考R250染未见残余” 这种情况很难解释了

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-22 20:01

您好！我想请教您关于检测蛋白质的乙酰化和甲基化的具体方法，看了文献感觉它的意思是先用一个乙酰化抗体把蛋白质沉淀下来再用该蛋白的抗体对沉淀下来的蛋白进行western检测，但是具体操作还是不懂
谢谢！

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1、用乙酰化抗体进行沉淀的话相当于是一个用抗体对相应抗原的富集过程
2、沉淀的产物用来进行WB检测
3、具体的操作第一步要了解IP的过程，第二步是做WB检测
搜一些关于IP的protocol吧

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-22 20:02

您好！
我在Western blot实验过程中发现某蛋白X在细胞内和细胞外蛋白的分子量不一致，细胞内有两条蛋白带，而分泌到细胞外后则只有一条蛋白带。
现在推测：
（1）X蛋白在向细胞外分泌过程中发生了蛋白质翻译后的去修饰，比如磷酸化和乙酰化。
（2）X蛋白在向细胞外分泌过程中蛋白质发生了发生了截断。
那么通过什么手段可以知道蛋白条带1和蛋白条带2之间的变化：蛋白序列变化、蛋白修饰变化。

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这个蛋白存在修饰情况吗？

作者: www.1 时间: 2013-5-22 20:02

这个蛋白存在修饰情况吗？

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有文献报道，此蛋白存在乙酰化修饰，而且位点不止一个。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-22 20:03

QUOTE:

原帖由 www.1 于 2013-5-22 20:02 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
这个蛋白存在修饰情况吗？

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有文献报道，此蛋白存在乙酰化修饰，而且位点不止一个。

如果存在修饰的情况
是会出现不同的分子量
如果可能的话
你可以选择这个蛋白的乙酰化抗体进行检测试试

作者: fox_79 时间: 2013-5-22 20:04

我还想请教一个问题，做western blot时要切多宽的胶才能保证把目的条带切到呢？我检测一个90kd的蛋白，在marker70稍稍下面一点切胶，曝光后还是有好几个样品的条带被切掉了，从没切掉的条带看也是在紧紧挨着70kd边缘，这是怎么回事呢？如何避免这种情况发生？

作者: fox_79 时间: 2013-5-22 20:04

还有不知道有没有哪位前辈做过IGF2这个蛋白的western blot？它只有7.5kd，摸了几次条件，都没有把它跑出来

作者: c86v 时间: 2013-5-22 20:05

我做western抽提T细胞的蛋白的时候做page看了一下条带特别少，可是别人提的就很多，这是为什么呢，方法都一样啊，请教一下附图第一道是maker 第二道我的T细胞蛋白后三道别人的癌细胞蛋白，以前没提过T细胞的蛋白不知道T细胞表达的蛋白有多少种，应该不止这几条吧

作者: xiaoxiaoniao 时间: 2013-5-22 20:05

请问目的蛋白和内参蛋白分子量接近，相差10kd左右，该怎么区分呢？谢谢

作者: kulee 时间: 2013-5-22 20:06

您好，我做的重组蛋白连的是HIS-tag。蛋白在18度的时候有微量的能在上清中表达，但大部分还是在沉淀中。但是自爱测活性时，上清中的蛋白液没有生物活性。请问这是什么原因造成的。当时测序了，序列是完全正确的，表达出的蛋白大小也差不多对。

作者: kulee 时间: 2013-5-22 20:07

我还想请教一个问题，做western blot时要切多宽的胶才能保证把目的条带切到呢？我检测一个90kd的蛋白，在marker70稍稍下面一点切胶，曝光后还是有好几个样品的条带被切掉了，从没切掉的条带看也是在紧紧挨着70kd边缘，这是怎么回事呢？如何避免这种情况发生？

第一次做WB时，可以把膜稍微剪的大点。因为第一次做，不能确定蛋白在哪些分子量范围内显现。如果是比目的蛋白分子量小的，可能是目的蛋白的降解。

作者: kulee 时间: 2013-5-22 20:08

您好，我做的重组蛋白连的是HIS-tag。蛋白在18度的时候有微量的能在上清中表达，但大部分还是在沉淀中。测上清中蛋白酶的活性时，上清中的蛋白没有生物活性。请问这是什么原因造成的。当时测序了，序列是完全正确的，表达出的蛋白大小也差不多对。谢谢

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你好，如果蛋白丰度低的话很容易失活的，温度影响很大的！

作者: xingyi08 时间: 2013-5-22 20:09

你好，如果蛋白丰度低的话很容易失活的，温度影响很大的！

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但是这个蛋白在包涵体里面表达量还是挺高的。
另外有文献报道这个蛋白的反应温度是40-50摄氏度，所以我觉得不应该是温度使酶失活的。哎，不知道是什么原因导致蛋白失活。
我也尝试过将包涵体复性，但是摸了好多条件，还是没有活性。
不知道大家做蛋白复性都有什么好的方法？

作者: sunshine039 时间: 2013-5-22 20:09

老师您好，我请教一个蛋白复性的问题。我手头一个动物细胞表达的重组蛋白，含有二硫键，复性前单体占40%左右，采用稀释法加入氧化还原对GSH/GSSG复性，复性后单体达到80%，但是一经过浓缩透析，就又发生聚合了，单体只有40-50%，请教一下老师为什么单体又会降低？是因为氧化还原对被透析掉的原因吗？复性后蛋白质会不稳定吗？谢谢老师

作者: IAM007 时间: 2013-5-22 20:10

最近在做CO-IP，用的是皮尔斯的试剂盒，想证明蛋白A和蛋白B结合，用抗体A（目的蛋白分子量48KD）拖（4度摇晃过夜），加蛋白A/G珠子，洗脱后煮5分种变性，上样跑WESTERN，用得抗体B（目的蛋白分子量子19KD）孵育膜，化学发光得出条带如下，请问：左侧为分子Marker，中间粗条带（43-55KD）处是否为 IgG重链？下面20KD处条带是否为轻链？我想要的阳性条带在哪儿？谢谢各位了，给兄弟指条明路。

作者: bling 时间: 2013-5-22 20:10

你好，我想请问下我做蛋白表达时为什么诱导时间超过2小时，表达量就很少？还有我用Rosetta菌株表达，这种菌怎么很难裂解，超声、酶解、冻溶都试了，跑的PAGE胶一点条带都没有？

作者: applebook=213 时间: 2013-5-22 20:11

但是这个蛋白在包涵体里面表达量还是挺高的。
另外有文献报道这个蛋白的反应温度是40-50摄氏度，所以我觉得不应该是温度使酶失活的。哎，不知道是什么原因导致蛋白失活。
我也尝试过将包涵体复性，但是摸了好多条件，还是没有活性。
不知道大家做蛋白复性都有什么好的方法？

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我觉得首先你得再把上清和包涵体同时上样检测，弄清楚这个蛋白是确定在包涵体里高表达；至于蛋白复性我建议你去看一下文献报道，我们实验室用的是8M Urea 和巯基乙醇处理蛋白，这个有很多说明的。

作者: NBA 时间: 2013-5-22 20:13

请问目的蛋白和内参蛋白分子量接近，相差10kd左右，该怎么区分呢？谢谢

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建议最好换内参。如果不换可以洗膜后孵育目的蛋白一抗。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-22 20:13

你好，我想请问下我做蛋白表达时为什么诱导时间超过2小时，表达量就很少？还有我用Rosetta菌株表达，这种菌怎么很难裂解，超声、酶解、冻溶都试了，跑的PAGE胶一点条带都没有？

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不知道你这个时间设置了几个段，是前后蛋白表达量相差很大吗？另外Rosetta菌株诱导可能会产生一些毒蛋白的，个人建议不用这种，如果其他菌株不行那没办法。你可以不经过裂解直接上样看看条带怎么样！

作者: NBA 时间: 2013-5-22 20:14

还有不知道有没有哪位前辈做过IGF2这个蛋白的western blot？它只有7.5kd，摸了几次条件，都没有把它跑出来

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分子量这么小的蛋白的确很不好做，首先您需要确定一下您的目的蛋白能在胶上跑出来，而没有跑出去。另外膜的孔径建议用小一点的，PVDF膜0.2的可以试一下。还有您需要确定下您的一抗有没有问题。

作者: www.1 时间: 2013-5-22 20:14

WB之前，有没有简单些的蛋白浓度测定方法，怎样判断蛋白已经降解。

作者: finger 时间: 2013-5-22 20:15

我认为利用红外对蛋白质的研究是很有意义的

作者: ROSE李 时间: 2013-5-22 20:15

版主，您好！再次请教您下。我做两个目的蛋白，一个56kD、一个62kD，现在想把二者分得更开点，请您看图（电泳60V跑完全程，5%浓缩胶、10%分离胶）。那请教您，应该是在电泳环节做改动，那如何做呢？或者有什么其他地方改动的？非常感谢您！also dying 4 ur immediate reply

图片附件: 13087925.jpg (2013-5-22 20:15, 14.11 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16393

作者: any333 时间: 2013-5-22 20:16

我觉得首先你得再把上清和包涵体同时上样检测，弄清楚这个蛋白是确定在包涵体里高表达；至于蛋白复性我建议你去看一下文献报道，我们实验室用的是8M Urea 和巯基乙醇处理蛋白，这个有很多说明的。

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这个蛋白在18度的时候在上清中只有微量的表达，在37度时，上清中几乎看不到（用考染的方法）。我看了很多关于蛋白复性的方法，溶解沉淀我用的是8M尿素的50mMTRIS-HCL ph7.5 溶的。溶解效果挺好，现在的问题是，蛋白复性后，还是没活性

作者: lixi559 时间: 2013-5-22 20:16

老师您好，我想请教您一下，最近想做细胞转染，但是用公司提出的小提中量试剂盒提出的质粒都在100多微克每毫升，这样做转染的话要加很多的液体，这样会不会把整个体系都稀释了，这样低的浓度是不是不适用于细胞转染，怎么才能提高质粒的浓度呢，我已经重新转化过了，还是很低。

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转染时的质粒浓度最好是1ug/uL. 你可以用大提试剂盒。

作者: damingxia0904 时间: 2013-5-22 20:17

WB之前，有没有简单些的蛋白浓度测定方法，怎样判断蛋白已经降解。

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BCA法测蛋白浓度的，半个小时差不多。

作者: damingxia0904 时间: 2013-5-22 20:17

这个蛋白在18度的时候在上清中只有微量的表达，在37度时，上清中几乎看不到（用考染的方法）。我看了很多关于蛋白复性的方法，溶解沉淀我用的是8M尿素的50mMTRIS-HCL ph7.5 溶的。溶解效果挺好，现在的问题是，蛋白复性后，还是没活性

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我觉得你的蛋白可能存在一些修饰，所以才会出现这种情景。

作者: NBA 时间: 2013-5-22 20:18

版主，您好！再次请教您下。我做两个目的蛋白，一个56kD、一个62kD，现在想把二者分得更开点，请您看图（电泳60V跑完全程，5%浓缩胶、10%分离胶）。那请教您，应该是在电泳环节做改动，那如何做呢？或者有什么其他地方改动的？非常感谢您！also dying 4 ur immediate reply

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分离胶做成梯度胶（7~12%）就可以了

作者: NBA 时间: 2013-5-22 20:18

WB之前，有没有简单些的蛋白浓度测定方法，怎样判断蛋白已经降解。

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如果蛋白降解，SDS电泳一般会出现条带模糊

作者: NBA 时间: 2013-5-22 20:19

我做western抽提T细胞的蛋白的时候做page看了一下条带特别少，可是别人提的就很多，这是为什么呢，方法都一样啊，请教一下附图第一道是maker 第二道我的T细胞蛋白后三道别人的癌细胞蛋白，以前没提过T细胞的蛋白不知道T细胞表达的蛋白有多少种，应该不止这几条吧

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从图上看，怀疑样品中盐浓度有点高，不知电泳过程是否也有问题？

作者: 969 时间: 2013-5-22 20:19

版主，您好！再次请教您下。我做两个目的蛋白，一个56kD、一个62kD，现在想把二者分得更开点，请您看图（电泳60V跑完全程，5%浓缩胶、10%分离胶）。那请教您，应该是在电泳环节做改动，那如何做呢？或者有什么其他地方改动的？非常感谢您！also dying 4 ur immediate reply

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分离胶做成梯度胶（7~12%）就可以了

非常感谢版主您！

作者: eric930 时间: 2013-5-22 20:20

我现在做的是关于蛋白修饰和相互作用方面的，我想问一下有没有软件可以预测某一种蛋白质的修饰及相互作用蛋白呢？谢谢

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有的比如cuturl('http://string-db.org/') 和 cuturl('http://expasy.org/')还有好像瑞士一个网站都可以不过忘记了

作者: eric930 时间: 2013-5-22 20:20

这个蛋白在18度的时候在上清中只有微量的表达，在37度时，上清中几乎看不到（用考染的方法）。我看了很多关于蛋白复性的方法，溶解沉淀我用的是8M尿素的50mMTRIS-HCL ph7.5 溶的。溶解效果挺好，现在的问题是，蛋白复性后，还是没活性

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复性后蛋白的活性会有非常大的损失没有活性也是正常的；关键还是要在复性的时候逐步降低尿素的浓度

作者: bs4665 时间: 2013-5-22 20:20

版主好：我个人认为蛋白实验关键还在蛋白的提取上，至少蛋白提取量的多少起决定作用！请问我们怎么确保蛋白提取效率呢？即便测定了蛋白的浓度，可是又怎么说明我的提取是好坏呢？比如E.coli全蛋白的提取（取20ML的对数期E.coli混悬液，OD600+0.9；这时候我的20ML的混悬液应该提出多少的蛋白才算合格呢？），

作者: NBA 时间: 2013-5-22 20:21

刚开始做蛋白，我想请教一个基础的问题，望帮助解答。
现在基因的表达一般是表达一个开放阅读框，但是对于一些蛋白表达一个完整的开放阅读框往往没有太大的必要，例如：表达一种蛋白做基因亚单位疫苗，仅仅表达具有免疫原性的一段基因会不会更好些？还有就是用原核表达的蛋白，基因太长表达的蛋白太大容易生成包涵体。因此，优化表达一段基因是非常有必要的。但是如何优化表达？小弟才疏学浅，还请赐教！

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对，蛋白表达很多时候是没有必要表达一个完整的ORF的，只需要表达出目标蛋白某些功能基团就可以。但是某些时候，一个表达不完整的蛋白其空间结构的改变可能会影响其活性。针对您的问题，个人认为，可能需要构造含有不同基因长度的载体分别进行表达，然后利用特定抗原检测其活性，确定一个最优方案。

作者: NBA 时间: 2013-5-22 20:21

版主好：我个人认为蛋白实验关键还在蛋白的提取上，至少蛋白提取量的多少起决定作用！请问我们怎么确保蛋白提取效率呢？即便测定了蛋白的浓度，可是又怎么说明我的提取是好坏呢？比如E.coli全蛋白的提取（取20ML的对数期E.coli混悬液，OD600+0.9；这时候我的20ML的混悬液应该提出多少的蛋白才算合格呢？），

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“蛋白实验关键还在蛋白的提取” 我非常赞成，但是 “蛋白提取量的多少起决定作用” 我不敢苟同了，个人认为用最简单的办法将目的蛋白提取出来才是上策，将所有的成分提取出来也只是增加了样品分析的复杂程度，所以提取多少并不能说明好坏。一般来说，用常用的提取液提取，不必太担心蛋白的提取效率。如果您想知道菌液中蛋白提取的准确效率，建议做个“凯氏定氮实验”进行计算。

作者: rxcc33 时间: 2013-5-22 20:22

从图上看，怀疑样品中盐浓度有点高，不知电泳过程是否也有问题？

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细胞提出来后是用0.01m的PBS洗的，然后低速离心，弃上清，加的细胞裂解液，您说的盐浓度时PBS么？电泳过程应该没问题，实验室都是用这个方法，而且右边3个条带都是好的，感觉就像裂解不充分似的

作者: 阿凡提 时间: 2013-5-22 20:22

版主好：我现在做的是蛋白的降解实验（细菌中）。是不是有方法在培养基中加入某种抗生素使蛋白量维持恒定，然后再逐步观察其降解的情况。或者看到类似方法的文献，可不可以提供一些参考，谢谢啦，版主辛苦了。

作者: newway 时间: 2013-5-22 20:23

请问版主：我做iTRAQ，我用什么样的指标确定酶解的效率和标记的效率？或者说应该用什么样的质谱结果来确定我的酶解和标记是合格的呢？

作者: tie8 时间: 2013-5-22 20:23

我觉得你的蛋白可能存在一些修饰，所以才会出现这种情景。

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请问后续的实验应该怎样设计啊？

作者: any333 时间: 2013-5-22 20:24

请问版主：我做iTRAQ，我用什么样的指标确定酶解的效率和标记的效率？或者说应该用什么样的质谱结果来确定我的酶解和标记是合格的呢？

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酶解及标记效率没有统一的指标判定，一般我们做完酶解，标记之前会进行一次质谱分析的预实验，根据质谱数据（basepeak图、鉴定蛋白数量等）判定酶解效率，并通过样品标记后质谱得到的定量蛋白数量判定标记的效率。

作者: owanaka 时间: 2013-5-22 20:24

老师您好，我想问一下用质谱检测蛋白质时，基质效应很大，空白中总是有很多干扰，怎么解决这类问题呢？

作者: PCR 时间: 2013-5-22 20:24

您好，请问变性后的蛋白在-20°可以存放多久？做WB的时候荧光特别容易淬灭是什么情况？

作者: hot_hot_hot 时间: 2013-5-22 20:25

楼主，我一直有一个疑问，请教您一下。在提取蛋白的过程中，虽然低温和偏碱性的裂解液可以很大程度上抑制蛋白酶的活性，但不同组织的蛋白“结实”程度却有很大差别。有一些蛋白，比如左心室组织，即使不加蛋白酶抑制剂，组织量很多，慢慢悠悠整上大半天，提的蛋白也很好；但是另一些组织，比如血管组织，即使加了cocktail，很小心的提，蛋白降解的也会很厉害，丽春红染膜都能看出条带模糊。有时候即使不同组织一起提，所有条件相同，提出来的结果也不同。您认为如何在提取蛋白时，保护这些脆弱组织呢？

作者: veiwu 时间: 2013-5-22 20:25

你好：
有一种蛋白质，通过软件预测这种蛋白可能是有毒性的，那么它是否具备用原核表达制备单抗的可能？还有就是已知一种蛋白利用免疫共沉淀拉蛋白的时候是否会由于选取的宿主细胞的不同而得到不同的蛋白条带？如果已知一种新蛋白该从那些方面去寻找与该蛋白相互作用的宿主蛋白？一些蛋白的氨基酸位点发生变化对病毒的致病力方面有显著增强作用，那么在蛋白相互作用上是否会有不同的结果呢？

作者: u76mp 时间: 2013-5-22 20:25

我的蛋白上样量是70ug时对照组和实验组区别不明显，那如果我把上样量加大到100ug或者更大的话，对照组和实验组的区别会变明显吗？非常感谢！

作者: NBA 时间: 2013-5-22 20:26

您好，请问变性后的蛋白在-20°可以存放多久？做WB的时候荧光特别容易淬灭是什么情况？

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加甘油了么？一般长时间保存最好-70°较好。荧光淬灭快比较可能与您的试剂盒有关，选个好点的试剂盒试下

作者: NBA 时间: 2013-5-22 20:26

楼主，我一直有一个疑问，请教您一下。在提取蛋白的过程中，虽然低温和偏碱性的裂解液可以很大程度上抑制蛋白酶的活性，但不同组织的蛋白“结实”程度却有很大差别。有一些蛋白，比如左心室组织，即使不加蛋白酶抑制剂，组织量很多，慢慢悠悠整上大半天，提的蛋白也很好；但是另一些组织，比如血管组织，即使加了cocktail，很小心的提，蛋白降解的也会很厉害，丽春红染膜都能看出条带模糊。有时候即使不同组织一起提，所有条件相同，提出来的结果也不同。您认为如何在提取蛋白时，保护这些脆弱组织呢？

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低温

作者: NBA 时间: 2013-5-22 20:28

我的蛋白上样量是70ug时对照组和实验组区别不明显，那如果我把上样量加大到100ug或者更大的话，对照组和实验组的区别会变明显吗？非常感谢！

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您将对照组样品做个上样量梯度吧，这样您就可以决定上多大的量能够有很好的区分效果

作者: abc816 时间: 2013-5-22 20:28

加甘油了么？一般长时间保存最好-70°较好。荧光淬灭快比较可能与您的试剂盒有关，选个好点的试剂盒试下

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没有，用的是5*的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，平时一般都放-20°
发光试剂盒用的是皮尔斯的超敏试剂盒，不过今天把压片版里的保鲜膜换成新的，淬灭现象没有了。

作者: any333 时间: 2013-5-22 20:29

老师您好，我想问一下用质谱检测蛋白质时，基质效应很大，空白中总是有很多干扰，怎么解决这类问题呢？

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基质效应有样品中内源性成分和样品前处理过程中引入的外源性成分。内源性组分包括无机盐、有机盐、或者各种有机化合物（糖类、胺类、尿素、类脂类）和分析目标物的同类物及其代谢物。外源性组分包括处理样品的塑料管中残留的聚合物、离子对试剂、有机酸、缓冲液、SPE柱材料等。所以可以从内源性和外源性两个方向找原因，样品处理过程、流动相的配制、上样管、是否柱子上有污染残留，有时候实验室空气质量也会造成。

作者: duoduo 时间: 2013-5-22 20:51

中科新生命和欧易都是很垃圾，技术很不咋地的公司，也好意思来搞什么蛋白技术答疑，真是不怕贻笑大方

作者: NBA 时间: 2013-5-22 20:51

QUOTE:

原帖由 duoduo 于 2013-5-22 20:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

中科新生命和欧易都是很垃圾，技术很不咋地的公司，也好意思来搞什么蛋白技术答疑，真是不怕贻笑大方

您好！上海欧易从成立之初到现在已经经历了8个年头，实验室也是开放的，一切大家可以眼见为实。而上海中科新生命是一家以中国科学院为依托的公司，技术上肯定是毋庸置疑的。开这个答疑专帖目的就是希望给大家提供一个交流平台，看我们怎样去改进发展能够更好地帮助到别人，不断地为客户更好地解决问题正是我们科研服务行业的生命线。

作者: NBA 时间: 2013-5-22 20:52

你好：
有一种蛋白质，通过软件预测这种蛋白可能是有毒性的，那么它是否具备用原核表达制备单抗的可能？还有就是已知一种蛋白利用免疫共沉淀拉蛋白的时候是否会由于选取的宿主细胞的不同而得到不同的蛋白条带？如果已知一种新蛋白该从那些方面去寻找与该蛋白相互作用的宿主蛋白？一些蛋白的氨基酸位点发生变化对病毒的致病力方面有显著增强作用，那么在蛋白相互作用上是否会有不同的结果呢？

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1. 如果蛋白对于宿主微量致死毒性，那就不能够利用该宿主进行单抗制备；建议更换宿主菌；
如果蛋白对于宿主为累积致死毒性，并且宿主耐受量相对较高，利用该宿主菌进行单抗制备是可行的，只不过可能产量较低。
2. 如果目标蛋白与宿主蛋白不存在融合表达，那选用不同的宿主对于目标蛋白条带应该没有影响。
3. 如果做蛋白相互作用的话，目前最普遍的方法就是酵母双杂。
4. 病毒致病力的增强，表明氨基酸的改变使得具有新结构蛋白的病毒与宿主蛋白结合更稳定或更容易通过蛋白通道侵入宿主细胞，因此推断新蛋白在蛋白相互作用上应该具有不同的表现。

作者: youyou99 时间: 2013-5-22 20:52

您好，我在pubmed里面搜索蛋白质序列的时候，为什么同一个物种的同一个蛋白有那么多序列，如人类的SOCS1，该选用哪一种呢？

作者: NBA 时间: 2013-5-22 20:53

QUOTE:

原帖由 youyou99 于 2013-5-22 20:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

您好，我在pubmed里面搜索蛋白质序列的时候，为什么同一个物种的同一个蛋白有那么多序列，如人类的SOCS1，该选用哪一种呢？

您好，您在pubmed或者Genebank数据库中以SOCS1为关键词搜索时，会出现许多条都标注为SOCS1的序列，这是因为这些序列来自不同的研究所产生的结果。比如，有些SOCS1序列显示的是在2005提交的，另有一些SOCS1序列是在2010年提交，还有一些SOCS1序列是在2012年提交到数据库中去的，从这里你就可以看出，不同的研究团队独自进行了有关SOCS1的研究并获得了相应的序列，虽然这些序列是同一物种的同一个基因，但来自不同的个体。从您的研究出发，您可以选择一条SOCS1，产生这个SOCS1的实验或研究（这个信息可以通过打开这条序列记录，并从title中找到相关的文章）和您的研究最类似。如果您只是想拿到序列信息，那么假如数据库中收录的SOCS1序列都一样，选其中一条即可；假如有存在氨基酸位点不同的情况，则需要您把相关文章看一下然后根据自己的研究才能确定选哪一条。

作者: KGZ564 时间: 2013-5-22 20:53

请问哪些蛋白质用于临床治疗？进行ELISA时的标志物有哪些？具体制作方法?

作者: yueban-1147 时间: 2013-5-22 20:53

您好，我想把蛋白提纯。
我是通过：1、高盐3.4M NaCl 里加各种蛋白酶抑制剂处理；2、2M Urea 溶解蛋白离心得上清蛋白溶液。
但问题随之而来，此上清液里含大量的 NaCl 和 Urea，这些都是小分子的杂质，有文献上写的是用生物半透膜（透析袋）的方法去除，具体：1、透析袋外是0.5% 氯仿透析一次；2、透析袋外TBS 透析3次。
我要的蛋白主要是一型胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白
NaCl 分子量是 58.44 ；Urea 分子量是 60.05 ；氯仿分子量是119.39 ；TBS中的Tris base分子量是121.14 ；KCl 分子量是74.55。
Oso-T8340 透析袋MD34 ( 3500 ) 5米/卷美国联合碳化 Oso-T8260 透析袋MD25 ( 7000 ) 5米/卷美国联合碳化 Ojk-T8330 透析袋MD34 ( 7000 ) 5米/卷美国联合碳化 ojk-47780 透析袋MD10(8000-14000) 5米/卷美国联合碳化 Oso-T8280 透析袋MD25(8000-14000) 5米/卷美国联合碳化 Oso-T8300 透析袋MD34(8000-14000) 5米/卷美国联合碳化 Oso-T8310 透析袋MD44(8000-14000) 5米/卷美国联合碳化 ojk-47781 透析袋MD55(8000-14000) 5米/卷美国联合碳化 Ojk-T8320 透析袋MD77(8000-14000) 5米/卷美国联合碳化

这几种透析袋我分别选哪几种？透析这种方法可靠吗？我主要想把里面的盐分去掉。

作者: nn255 时间: 2013-5-22 20:54

你好，我目前在做Cell Sulface Purification。因为是用磁珠和蛋白结合，我想请问的是，我在加入磁珠之前需要和western一样的蛋白定量么？或者是只需要在全蛋白原液中留出一部分跑western做对照就可以了呢？在提取细胞膜蛋白的时候有没有什么需要注意的事项、

作者: standbyme 时间: 2013-5-22 20:54

我做双向电泳，还是菜鸟，您能给我一些建议和文献吗？
十分感谢

作者: rxcc33 时间: 2013-5-22 20:55

脱脂奶粉: 5%, clean backgroud, but disguises some antigens
BSA: 3%, good signal strength

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我们用的脱脂奶粉：7%，感觉脱脂奶粉比BSA的降背景能力强点。

作者: tie8 时间: 2013-5-22 20:55

我在包涵体复性遇到困难，我的蛋白单体约17kd，包含9个cys，活性状态形成4对二硫键。在选择透析复性时，透析过程会出现沉淀，透析过程结束离心活抽滤后的溶液SDS-PAGE没有目的条带。请大家帮忙指导。

作者: bs4665 时间: 2013-5-22 20:55

我在包涵体复性遇到困难，我的蛋白单体约17kd，包含9个cys，活性状态形成4对二硫键。在选择透析复性时，透析过程会出现沉淀，透析过程结束离心活抽滤后的溶液SDS-PAGE没有目的条带。请大家帮忙指导。

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建议用GSH/GSSG氧化还原系统，透析多做几个梯度，让错配的二硫键有机会重新组合

作者: summerxx 时间: 2013-5-22 20:56

建议用GSH/GSSG氧化还原系统，透析多做几个梯度，让错配的二硫键有机会重新组合

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我用的透析液分别为：
透析液1，25mM Tris ，200mM NaCl ，5M尿素，1mM EDTA , 5mM DTT ;
透析液2，同，50mM NaCl ，4M尿素，1mM EDTA , 0.2mM GSSG, 2mM GSH；
透析液3，同，20mM NaCl ，2M尿素，1mM EDTA , 0.5mM GSSG, 1mM GSH；
透析液4，同，10mM NaCl ，1M尿素，1mM EDTA , 1 mM GSSG, 1mM GSH , 甘油 5%， 5mM DTT；
透析液5，同，10mM NaCl ，0.5M尿素，1mM EDTA , 1mM GSSG, 1mM GSH , 甘油 5% ，5mM DTT ；
透析液6，同，10mM NaCl ，1mM EDTA , 甘油5% ，5mM DTT；
透析液7，同，10mM NaCl 。
ph=9
请问这个透析液有问题么？我们实验室都用这个配方呀，在5，6还加Gly呢。不知道是哪里除了问题。还有就是我一直不明白为什么在透析液4，5，6为甚还要加DTT呢？

作者: bs4665 时间: 2013-5-22 20:56

QUOTE:

原帖由 summerxx 于 2013-5-22 20:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
建议用GSH/GSSG氧化还原系统，透析多做几个梯度，让错配的二硫键有机会重新组合

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我用的透析液分别为：
...

我也没看懂，这个配方前面三个梯度GSSH的含量逐渐增加是对的，问题是加了DTT, GSSG也都还原了。我觉得可能是笔误。不过9个cys的蛋白复性难度确实很大，有条件的话可以考虑在大肠杆菌的间质里表达。

一般复性在生理盐浓度进行（150mM）, 太低的话容易吸附损失。如果要防止复性过程中聚合, L-Arg比Gol效果好一些，此外根据蛋白本身的性质，BSA, 聚乙二醇，蔗糖，甘露醇之类的中性分子都有可能帮助复性。

作者: summerxx 时间: 2013-5-22 20:57

我想进行改进如下：
NaCl 浓度为150mM 不变，在5,6加上L-Arg
再透析一次试试吧。。

作者: bs4665 时间: 2013-5-22 20:57

QUOTE:

原帖由 summerxx 于 2013-5-22 20:57 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我想进行改进如下：
NaCl 浓度为150mM 不变，在5,6加上L-Arg
再透析一次试试吧。。

有机会找到原作者问问这DTT是怎么回事吧，一套流程抄来抄去完全走样的事情也不少

作者: am10 时间: 2013-5-22 20:58

请问：在肝病蛋白研究技术中，有多少种蛋白芯片啊？

作者: vvmmoy 时间: 2013-5-22 20:58

还有不知道有没有哪位前辈做过IGF2这个蛋白的western blot？它只有7.5kd，摸了几次条件，都没有把它跑出来

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低分子量蛋白需要用Tricine-SDS-PAGE。

作者: vvmmoy 时间: 2013-5-22 20:59

请问目的蛋白和内参蛋白分子量接近，相差10kd左右，该怎么区分呢？谢谢

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换一个内参蛋白，使其分子量差别更大。不然条带会很接近的。

作者: cocacola 时间: 2013-5-22 20:59

我想做一下组蛋白乙酰化方面的，实验技术现在有些什么呢？CHIP？

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