分析测试百科

标题: 【讨论帖】抗菌肽的大规模生产 [打印本页]

作者: memory 时间: 2013-5-23 14:05 标题: 【讨论帖】抗菌肽的大规模生产

老板想把抗菌肽能大量生产，我们实验室曾经做过真核，表达不怎么稳定而且纯化方面遇到很多麻烦。然后我在用原核，选用的是融合表达。融合表达一方面不经济，另一方面在切割和下游纯化方面也遇到很多困难。单独表达又对宿主有影响，不知各位高人有什么好的建议？

作者: Ao7 时间: 2013-5-23 14:06

建议你选择原核的融合表达体系，我做过，抗菌肽产量很高，主要是设计选择好的切割和纯化体系，单独表达几乎是不可能的，就算是western blotting也检测不到单体表达的，基本认为无表达，你的抗菌肽是多大？我最小做过3.5KD的，可以成功酶切得到单体，并纯化。正准备发文。估计做产业化的话，要选择一个便宜好用的切割酶很重要，

作者: Ao7 时间: 2013-5-23 14:06

我做过抗菌肽的原核融合表达体系，很好作，不过就是要选择一个便宜高效的酶切体系，纯化也不难，最小做过3.5KD的抗菌蛋白。真核表达量本身就是一个很大的障碍，根本不能和原核相比的

作者: 49888 时间: 2013-5-23 14:06

大规模生产恐怕难度大，我倒是觉得酵母表达会更好些，用融合表达的话，酶切是一个很大的问题，成本也会大幅升高，另外，酶切后的纯化呢？如何解决？再有，蛋白酶切一般不彻底，会不会影响活性？
酵母是真核细胞，表达有先天的优势，不利之处在于大多数表达量超低，另外，抗菌肽一般是小肽，电泳验证也比较困难，还有降解的问题，所以，我认为大规模生产，需要解决很多问题，如果真的都能克服了，那可的确是一个很大的突破了，我也希望能看到这样的突破

作者: flower-201 时间: 2013-5-23 14:07

我现在做毕赤酵母表达，进入表达阶段了，今天第一天诱导。
我想三天时再留样，对不同时间样品处理，有什么好方法和注意事项吗？
因为我想三天的样一起跑page

作者: wsll 时间: 2013-5-23 14:07

相对楼上建议要做的是
1，测量菌体的湿重，以更好的了解菌体生长规律。
2，开始时最好每24小时取样一次，从24小时开始，直到144小时，如果是胞内表达，离心后要及时制备样品，不能及时做-70度冰箱保存，对于分泌型表达，上清夜要放于-70度冰箱保存，最好进行浓缩。跑SDS-PAGE胶时如果培养基中加有磷酸缓冲液，最好进行脱盐处理。
3，毕赤酵母表达蛋白因为本身有蛋白酶，所以容易出现降解现象，最好有相应的抗体进行检测。

作者: flower-201 时间: 2013-5-23 14:08

蛋白如何浓缩？
我每次只有1ML样

作者: zzzz 时间: 2013-5-23 14:08

相对楼上建议要做的是
1，测量菌体的湿重，以更好的了解菌体生长规律。
2，开始时最好每24小时取样一次，从24小时开始，直到144小时，如果是胞内表达，离心后要及时制备样品，不能及时做-70度冰箱保存，对于分泌型表达，上清夜要放于-70度冰箱保存，最好进行浓缩。跑SDS-PAGE胶时如果培养基中加有磷酸缓冲液，最好进行脱盐处理。
3，毕赤酵母表达蛋白因为本身有蛋白酶，所以容易出现降解现象，最好有相应的抗体进行检测。

======================================================================================================

磷酸缓冲液会影响PAGE电泳么？我曾经直接跑过，感觉条带还行，但我并不确定PBS是否对电泳有没有影响，希望有战友能帮忙解答一下。

作者: viviwang1987 时间: 2013-5-23 14:08

1ml样好办阿。
可以透析除盐后冷冻干燥，然后用适量的溶液溶解就好了。
注意：
1 要选好透析带：分子量范围应该在你的蛋白分子量3倍以上；
2 透析至少四小时以上，透析带外用双蒸水（体积越大越好），中间至少换三次。这一步是为了除盐，如果盐浓度过高，冻干过程中容易引起蛋白变性。

作者: wsll 时间: 2013-5-23 14:09

抗菌肽除了电泳检测表达以外，还有什么其他方法呢？
如果用抗体的话，应该如何选择呢？

作者: 二子 时间: 2013-5-23 14:09

十个氨基酸的能表达吗

作者: kulee 时间: 2013-5-23 14:10

关于磷酸缓冲液是否会影响PAGE电泳的问题，我个人实验体会认为应该进行脱盐处理的。
据我得实验（抗菌肽表达)来看，浓缩后（从50ml到500ul）磷酸盐缓冲液的确是影响了PAGE胶的效果，脱盐处理后条带清晰。
但我不确认是否所有毕赤酵母表达产物都需要脱盐。请各位战友仅做参考

作者: memory 时间: 2013-5-23 14:10

看来原核和真核都各有优缺点，原核我作过，融合蛋白表达量挺好的，但经过切割，纯化加上抗菌肽易被降解的缘故，基本上纯品就很少了。所以个人觉得融合表达还不是最好的选择，至于酵母我没作过，不知作过的同行，酵母表达量有多高,在纯化方面是否顺利？
也不知市场上用于临床上抗菌肽有哪些?又是如何生产的？

作者: 12xunmei 时间: 2013-5-23 14:10

检测抗菌肽抗体的制备，可以选择抗菌肽上的部分氨基酸序列进行人工合成，然后免疫小鼠获取相应的抗多肽的抗体，然后进行检测．需要的话还可以进行相应单克隆细胞的制备，获得大量的抗多肽的单克隆抗体，不仅可以用于检测，还可以与beads耦联后亲和纯化抗菌肽，解决抗菌肽的纯化检测问题．
不过这可是一大手笔！

作者: lgm 时间: 2013-5-23 14:11

建议选择原核串联表达，连接的位点可以选择比较便宜的酶切割位点或酸切割位点，当然这些要考虑你的蛋白序列。
理由一:可以很好解决分子小的问题，以及小分子带来的检测问题
理由二：可以解决酶切成本问题，相对与融合表达来说。
理由三：可以避免真核表达带来的纯化问题，酵母表达这些物质的话，除色素是一个非常麻烦的事。
请LZ考虑，具体文献可以搜索。

作者: nikonun 时间: 2013-5-23 14:11

我的课题也是抗菌肽的表达，不过用的是酵母
请问各位前辈，酿酒酵母能表达等电点为12左右的抗菌肽吗？碱性会不会太强呢？产量又如何呢？

作者: bamboo16 时间: 2013-5-23 14:12

您好，我现在也要做抗菌肽的表达，但是我选择的抗菌肽只有43个氨基酸，在酵母中表达的话，表达量很成问题。
请问，你们表达的都是多大的？

作者: memory 时间: 2013-5-23 14:12

相关疾病：
超敏反应
抗菌肽会产生抗体，会引起过敏反应。没有任何应用前途。相当于给动物打疫苗。怎么做新型抗菌剂去杀菌了。

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)