标题:
【求助】western blot的分离胶不凝
[打印本页]
作者:
98776langtao
时间:
2013-5-24 17:12
标题:
【求助】western blot的分离胶不凝
这一段时间做的western blot的分离胶总是不怎么凝,就是留在离心管(配胶的容器)里的胶不凝,或者只凝的很少,板里的胶用水封后能出现分界线,所以总体上还是能用。但是同样配的浓缩胶离心管里的就能够凝好。
自己分析了一下原因,可能是tris-hcl(室温存放)放的太久了,但是不知道他能不能影响胶。还有可能是屋里温度比较低不容易凝。还是丙烯酰胺(4度冰箱里避光存放)有了问题?
不知道大家遇到过这种情况么?
作者:
lxh031
时间:
2013-5-24 17:13
楼主先考查一下是不是温度的问题,方法很简单,再配胶的时候打空调到20度以上,这时候胶凝的就很快了。
TRIS-HCL保存的条件就是室温,没问题的。
凝固主要和AP与TEMED有关,如果丙烯酰胺没问题的话,试着增大一点TEMED的量,稍微多加50%,效果很明显。
作者:
98776langtao
时间:
2013-5-24 17:14
楼主先考查一下是不是温度的问题,方法很简单,再配胶的时候打空调到20度以上,这时候胶凝的就很快了。
TRIS-HCL保存的条件就是室温,没问题的。
凝固主要和AP与TEMED有关,如果丙烯酰胺没问题的话,试着增大一点TEMED的量,稍微多加50%,效果很明显。
==========================================================================================================
恩,可能和温度有关,但是有又发现了新的问题就是我配了一管胶,然后过了大概四十分钟之后胶凝了,但是胶上面浮了很多水,我问同学他们说一般胶都是刚好凝的没有很多水系出来,请问这样是怎么回事呢?是和丙烯酰胺有关么?我们的丙烯酰胺用的是百分之三十,4度避光保存。
还想请问一下temed是该4度还是常温呢?
作者:
49888
时间:
2013-5-24 17:14
增大TEMED的同时一定要加大10%AP的量,10%AP一定是TEMED的是10倍,否则还是不凝
作者:
98776langtao
时间:
2013-5-24 17:14
增大TEMED的同时一定要加大10%AP的量,10%AP一定是TEMED的是10倍,否则还是不凝
====================================
AP是用的25微升,temed是5微升,加的少么?
作者:
ending
时间:
2013-5-24 17:39
你AP加少了,我的配方里面TEMED为5uL的话,AP在分离胶和浓缩胶里分别为75uL和50uL,所以凝的慢啦。TEMED可以室温保存的,楼主先看看试剂标签上的说明,RT就是可以放在室温啦。
水什么的无所谓啦,只要你按配方加试剂,没问题的。但是强烈怀疑楼主的配方不对,你贴出来看看。
作者:
98776langtao
时间:
2013-5-24 17:40
QUOTE:
原帖由
ending
于 2013-5-24 17:39 发表
bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '
%s
')
你AP加少了,我的配方里面TEMED为5uL的话,AP在分离胶和浓缩胶里分别为75uL和50uL,所以凝的慢啦。TEMED可以室温保存的,楼主先看看试剂标签上的说明,RT就是可以放在室温啦。
水什么的无所谓啦,只要你按配方加试剂,没问题的。 ...
可是以前也是一直按配方配的,也没什么问题,配方
百分之10的分离胶10ml的话
水 4.05ml
百分之30的丙烯 3.3ml
tris-hcl8.8 2.5ml
百分之10的sds 100ul
AP 50ul
TEMED 10ul
你们的配方是怎么样的呢?
水的量多少都没问题么?
tris-hcl的ph不好有关系么?
作者:
ending
时间:
2013-5-24 17:40
服务楼主,把自己的配方贴一下
10%分离胶,5%浓缩胶
分离胶
浓缩胶
水
3.0mL
2.85mL
30%丙烯酰胺
2.475mL
0.85mL
买
1.5M Tris(ph8.8)
1.85mL
买
0.5M Tris(ph6.8)
0.85mL
买
10% SDS
75μL
50μL
自制
10% APS
75μL
50μL
临用现配
TEMED
5μL
5μL
买
这是配两块胶的配方,很明显,楼主你的AP加少了,所以胶凝的慢。自己按照比例换算一下吧。还有一点,AP很容易失效的,所以我都是临用现配,失效的话就凝不了啦。
Tris最好买试剂公司的预混液,很方便,自己配的Ph不准。
作者:
kuohao17
时间:
2013-5-24 17:41
AP是用的25微升,temed是5微升,加的少么?
===============================================================
这是几块胶的量?这种天我们一般一块胶5~6微升TEMED 10%AP是TEMED的10倍
另外 板里的胶确实比烧杯的凝得快
作者:
kuohao17
时间:
2013-5-24 17:41
这是几块胶的量?这种天我们一般一块胶5~6微升TEMED 10%AP是TEMED的10倍
另外 板里的胶确实比烧杯的凝得快
=====================================
一块分离胶的,一共5ml,我试着多加点AP吧~
欢迎光临 分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)
Powered by Discuz! 5.5.0