分析测试百科

标题: 【求助】如何去掉蛋白提取中的脂肪？ [打印本页]

作者: zhihui小新 时间: 2013-5-27 18:00 标题: 【求助】如何去掉蛋白提取中的脂肪？

提取蛋白已经有一段时间。现在换了组织标本，用的脂肪肝细胞。在蛋白提取过程，最后离心部分，发现出现三层：底层-细胞碎片，中层-蛋白，上层-脂肪。用枪头吸蛋白层时，脂肪总是会粘在枪头并跟蛋白层液体一起吸进去。不知道，园内是否有人能够解决这个问题。

作者: tangxin_80 时间: 2013-5-27 18:00

方法一，离心除去底层-细胞碎片，然后作硫沉，离心弃上清（脂肪也会在里面）。沉淀溶解后就是要的蛋白质。
要是样品量过小或者蛋白质没有办法作硫沉，那就用方法二。
方法二，找一个干净的玻璃丝棉或者滤纸将上清过滤，这样就可以除去里面的脂肪了。

作者: wsll 时间: 2013-5-27 18:01

用0.22um滤膜离心五分钟脂肪就被滤掉了很干净

作者: zhihui小新 时间: 2013-5-27 18:01

方法一，离心除去底层-细胞碎片，然后作硫沉，离心弃上清（脂肪也会在里面）。沉淀溶解后就是要的蛋白质。
要是样品量过小或者蛋白质没有办法作硫沉，那就用方法二。
方法二，找一个干净的玻璃丝棉或者滤纸将上清过滤，这样就可以除去里面的脂肪了。

============================================================

样品量确实是很少只有300ul，这样也能用方法二吗？能用的话，能不能具体点说。

作者: zhihui小新 时间: 2013-5-27 18:02

用0.22um滤膜离心五分钟脂肪就被滤掉了很干净

===================================================

你说的滤膜，可以放到1ml的EP管里离心吗？怎么操作，能否详细点

作者: tangxin_80 时间: 2013-5-27 18:03

方法二，找一个干净的玻璃丝棉或者滤纸将上清过滤，这样就可以除去里面的脂肪了。
具体方法：
找一个 1ml 枪头，再找一团棉花（要是灭菌的就直接用，要是没灭菌的就先用75%洗一洗，然后用提取蛋白的buffer浸泡）。
将棉花塞在1ml枪头中，再用buffer预洗一下。然后将提取的蛋白质脂肪混合物加入枪头中，让混合物自然流出就行了，下面用EP管接着，最好EP管放入冰中，防止蛋白分解。
备注：1. 棉花的量要注意，不能太多。太多了流速比较慢，可能会堵死的。量也不要太少，防止棉花掉下来或者脂肪漏出来。
2.注意棉花要提前处理好，不要混入新的杂质或者其他蛋白分解酶什么的。
最后：以上意见参考一下，这个没有标准操作，是我自己想得，但我认为可行性很高，只要能达到我们试验的目的就行了。你也想想，总有办法的。
其实用0.22um 或者0.45 um的膜过滤可很好，但是你的样太少了。

作者: jkobn 时间: 2013-5-27 18:24

你说的滤膜，可以放到1ml的EP管里离心吗？怎么操作，能否详细点

===================================

呵呵说的不准确是离心过滤管

工作体积500μl，离心管规格2.0ml 直接离心即可

图片附件: 33924029.jpg (2013-5-27 18:24, 21.7 KB) / 该附件被下载次数 10
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16508

作者: sr9971 时间: 2013-5-28 13:15

这个帖子太好了

我因为要提取胸腺组织中的蛋白，也出现了很多脂肪组织，愁的不行！！

非常感谢SUNNYXIA,JEROMECUI等的热心回答，也感谢LILYMILLIE的问题

不知道楼主现在实验成功了否？也提供一些经验以作参考啊，哈哈

还有点细节想问下大侠：

JER提到的离心过滤管是否是将超声粉碎好后的组织直接放入过滤管中离心？还是将第一次离心好后的上清放入过滤管中离心？离心时间为5min，那么

转速为多少？多次离心会不会使蛋白含量下降？

SUN提到的小棉花团，大概体积是多少呢？

呵呵，不好意思，非常感谢！

作者: sr9971 时间: 2013-5-28 13:16

SUN还提到“其实用0.22um 或者0.45 um的膜过滤可很好”。

是不是就用过滤无菌溶液时用的针头过滤器来过滤即可？

作者: kuaizige 时间: 2013-5-28 13:16

我也在做脂肪细胞，遇到同样的问题。

LILYMILLIE 和弓长张的实验有结果了吗？用的离心过滤管还是针头过滤器？

谢谢！期待中......

作者: #问号# 时间: 2013-5-28 13:17

很好的帖子啊！

同问，我需要提取的组织中含有很多脂肪组织，匀浆前也剔除不掉，很是发愁。

前面大侠们的实验有结果了吗？能否提供点经验哈，先都谢啦！

和弓长张同问“离心过滤管是否是将超声粉碎好后的组织直接放入过滤管中离心？还是将第一次离心好后的上清放入过滤管中离心？离心时间为5min，那

么转速为多少？多次离心会不会使蛋白含量下降？”。

另外，过滤管是0.22um 还是0.45 um的呢？

先多谢啦！

作者: am10 时间: 2013-5-28 13:17

抗体纯化技术（英文版）上有讲如何去除脂类，以前照着做过效果不错，因在外出差，没有办法查找资料在确认，谁有时间可以确认下具体的操作方法

这里大体讲下方法，谁查到文献或者实验确认后可以再告知下：

先在蛋白溶液中加入一定浓度的氯化镁或者氯化钙，搅拌一段时间以后，缓慢加入一定量的硫酸葡聚糖，这时脂类会沉淀下来，最后离心去沉淀，多余

氯化镁，氯化钙，硫酸葡聚糖可以用透析的方法去除，操作相对简单的。具体的浓度记不清楚了

作者: jkobn 时间: 2013-5-28 13:18

请问脂肪组织如何提蛋白？需要注意哪些呢？如何去除脂肪呢？

作者: rxcc33 时间: 2013-5-28 13:19

很好的帖子啊！

同问，我需要提取的组织中含有很多脂肪组织，匀浆前也剔除不掉，很是发愁。

前面大侠们的实验有结果了吗？能否提供点经验哈，先都谢啦！

和弓长张同问“离心过滤管是否是将超声粉碎好后的组织直接放入过滤管中离心？还是将第一次离心好后的上清放入过滤管中离心？离心时间为5min，那么转速为多少？多次离心会不会使蛋白含量下降？”。

另外，过滤管是0.22um 还是0.45 um的呢？

先多谢啦！

====================================================

离心过滤管使用：

样品蛋白加入抽提液后放入离心机离心去沉淀留上清

如果还有脂肪等杂质将上清液加入离心过滤管中 12000rpm 5min

这时得到的滤液就是蛋白液了损耗很小

如果在滤膜上还有残余的上清液请延长时间或更换离心过滤管的滤膜

多次离心蛋白基本没啥损失但注意控制温度

我用的是0.22的 0.45没用过

作者: zhihui小新 时间: 2013-5-28 13:20

我也在做脂肪细胞，遇到同样的问题。

LILYMILLIE 和弓长张的实验有结果了吗？用的离心过滤管还是针头过滤器？

谢谢！期待中......

==================================================================================

呵呵不好意思，才看到你的关注。我用了过滤管，效果很好，外形有点类似小型质粒提取的吸附管。4摄氏度离心

作者: yueban-1147 时间: 2013-5-28 13:20

用硫酸铵沉淀法去除脂类，沉淀下来的蛋白用透析法除掉硫酸铵即可

作者: luoliqiong 时间: 2013-5-28 13:21

呵呵不好意思，才看到你的关注。我用了过滤管，效果很好，外形有点类似小型质粒提取的吸附管。4摄氏度离心

======================================================

请问下过滤管是不是一般试剂公司就可以买到？你是用0.22的过滤管吗？

作者: ququer787 时间: 2013-5-28 13:22

我也在做脂肪组织的蛋白提取。我用1ml的一次性注射器插到蛋白液体层吸取。也比较方便。还有就是我问下，组织在液氮中研磨，裂解液也是加在液氮里头吗？我试过，但是立刻就形成了冰。

作者: moonlight45 时间: 2013-5-28 13:22

提蛋白一般在冰上操作即可。

离心管法不错，简单易行。Corning公司有。

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)