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标题: 【求助】heLa细胞mTOR 分子的western blot [打印本页]

作者: dream2013 时间: 2013-5-28 13:41 标题: 【求助】heLa细胞mTOR 分子的western blot

想检测hela细胞中mTOR 分子的表达和磷酸化情况，western blo实验做了3次，可是都没有目的条带，很是着急，还请各位帮我分析下啊～～
磷酸化的mTOR或许不好检测，可是我的mTOR的条带也没有，感觉就是很奇怪了。一抗说明书上显示mTOR 235KD, phospho－mTOR 289KD（说明书中phospho－mTOR是293细胞的，289kd，mTOR是大鼠肝脏中的，235kd，热心的iris_palm版主回帖说这个可能是由于组织特异性）

下面是我实验的具体步骤与试剂，各位大侠帮我分析下啊，不胜感激

1.mTOR的一抗是abcam公司的，phospho-mTOR的一抗是cell signaling公司的，二抗是荧光二抗。
2.实验步骤：
1） sample buffer 在60mm皿中裂解细胞，刮板将细胞刮下，吸到1.5ml EP
管，用1ml注射器枕头抽吸细胞，破碎DNA，沸水浴5min。－20度冰箱保存。
2) 电泳浓缩胶4％，分离胶6％。先是50V跑过浓缩胶，130V电泳3h。上样量是200ug。
3）转膜 pvdf膜，100V，3.5h。
4）5％脱脂奶粉封闭2h。
5) 一抗用脱脂奶粉1：1000稀释4度过夜。PBST洗膜，3次每次5min
6）二抗脱脂奶粉1：5000稀释，室温1h。洗膜，4次，每次5min。

补充一下：
1.本人用的试剂药品荧光二抗之类的应该没有问题，前些天成功地检测到了AKT和phospho－AKT。

2.转膜时marker最大 175kd的，可以转过去的。

3.蛋白胶跑过了，考马斯亮蓝染过，有条带的。至于蛋白上样量，因为觉得这个蛋白的含量可能比较低，所以多加了些。我的蛋白浓度是用nanodrop的仪器测的，当然可能蛋白浓度不是很准，所以就有意多加了些。

4.阳性的话我也考虑过。mTOR的抗体是abcam公司的，推荐
rat liver lysate 做阳性对照，可是这个我没有，phospho－mTOR的抗体是cell
signaling 公司的，它的图是用293细胞饥饿16h做的，其中一张图是染的mTOR。我们实验室不做大鼠，所以我用293细胞，不加血清的DMEM培养基处理16h做的阳性对照，也是没有条带。不知这算不算是阳性对照呢？？

5.其实也是看到一篇文章中用过这两个抗体才订的。那篇文章结果还可以的，是我们老板一年前在的实验室发的，所以方法什么的应该也没有太大关系，可是我做的就是没有条带，很是郁闷……

还有我想请教一下
1.转膜完了，胶用考马斯亮蓝染色，不管做哪个蛋白好像总是marker转的最彻底，这是什么原因呢？？

2.关于蛋白样本的反复使用问题我一直在想蛋白样品煮沸之后－20度保存的时候会不会也会使某些蛋白降解啊？？即使分装开了，每次拿一管出来用，那剩余的样本即使没有反复冻融会不会也有可能降解掉？？

再另：我们实验室几个月前有人买了santa cruze的抗体，wb做了好多次都没有条带，后来向一篇文章的作者要了他们自己做的抗体就染出条带了。联系代理公司又给他们换了一支新的抗体。我的抗体是不是会有问题啊？？担心，大把的时间浪费在上面的>_<

附件照片是我的结果

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作者: dream2013 时间: 2013-5-28 13:41

补充一下，本人用的试剂药品之类的应该没有问题，前些天成功地检测到了AKT和phospho－AKT。

作者: 箭头儿 时间: 2013-5-28 13:42

你这个蛋白好大哦，能转上吗？用立春红染染看，用个大分子量的预染marker做个对照。我记得超过120kd的，转膜是需要特殊条件是吧？我也没做过这么大的，只是随便说说，呵呵

作者: dream2013 时间: 2013-5-28 13:42

转膜时marker最大 175kd的，可以转过去的。

作者: bgf5 时间: 2013-5-28 13:43

转膜时间还可以加大，这样的时间对于289KD还少了些，
为什么磷酸化与非磷酸化的分子量相差这么大呢？绝对不可能, 应该是因为不同公司买的抗体原因，说明书上标的不一样，
还有你蛋白的上样量？200ug，太多了吧，你先跑个胶，考染下，看看有没有条带

作者: dream2013 时间: 2013-5-28 13:43

QUOTE:

原帖由 bgf5 于 2013-5-28 13:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

转膜时间还可以加大，这样的时间对于289KD还少了些，
为什么磷酸化与非磷酸化的分子量相差这么大呢？绝对不可能, 应该是因为不同公司买的抗体原因，说明书上标的不一样，
还有你蛋白的上样量？200ug，太多了吧，你先跑个胶，考染下， ...

多谢！胶跑过了，考马斯亮蓝染过，有条带的。至于蛋白上样量，因为觉得这个蛋白的含量可能比较低，所以多加了些。我的蛋白浓度是用nanodrop的仪器测的，当然可能蛋白浓度不是很准，所以就有意多加了些。
还有我想请教一下，转膜完了，胶用考马斯亮蓝染色，不管做哪个蛋白好像总是marker转的最彻底，这是什么原因呢？？

作者: bgf5 时间: 2013-5-28 13:43

我觉得应该加个阳性对照组织，否则你不知道问题会出在哪里，
我也做过大分子蛋白，一个220KD的，不同批次的细胞结果很不一样，
因为我做的是原代分离的细胞，用传1-3代的，
但是传代次数不同的细胞表达220KD目的蛋白不一样，有时候能在220KD出现很明显的条带，有时候220KD条带干脆没有，只有低分子量处的条带（因为我用SC的抗体）。
为了避免每次条件不一样而导致的不能重复，我干脆把几个批次细胞提的蛋白在同一块胶上跑，结果就是验证了我的想法。

所以强烈建议你加个阳性对照。

作者: dream2013 时间: 2013-5-28 13:44

阳性的话我也考虑过这个问题。mTOR的抗体是abcam公司的，推荐
rat liver lysate 做阳性对照，可是这个我没有，phospho－mTOR的抗体是cell
signaling 公司的，它的图是用293细胞饥饿16h做的，其中一张图是染的mTOR。我们实验室不做大鼠，所以我用293细胞，不加血清的DMEM培养基处理16h做的阳性对照，也是没有条带。不知这算不算是阳性对照呢？？

另：说明书中phospho－mTOR是293细胞的，289kd，mTOR是大鼠肝脏中的，235kd，这个有没有可能呢？？

再另：你刚才说不同批次的细胞蛋白提取物跑一块胶做wb，我一直在想蛋白样品煮沸之后－20度保存的时候会不会也会使某些蛋白降解啊？？即使分装开了，每次拿一管出来用，那剩余的样本即使没有反复冻融会不会也有可能降解掉？？

十分感谢！！

作者: bgf5 时间: 2013-5-28 13:44

相关疾病：
头痛
WB学问大着呢，我也正头疼阿，
我还做一个200KD的，用SC的抗体，结果出了60KD的条带，干干净净一条，
而且因子刺激后10min，表达骤然增高，重复三四次，都是这样啊，200KD却没有条带，找到抗体具体信息，查了蛋白库，没有收获，SC承诺给我相同蛋白的另外一个抗体，现在还没来，我们这实验条件不行，我也不能接着往下做，只能停了，再找找资料，

我看了下你的蛋白，应该分子量是大的289KD，大鼠肝组织中235KD，可能是组织特异表达吧，你多看看别人的文献，CST上面是说用293做的，最好让CST给你个阳性对照，我见了细胞株就讨厌的要死，
还有你旁边没有人杀老鼠么？问同学要一个肝组织蛋白阿，看看235KD有没有条嗲？
荧光二抗有没有问题？

作者: dream2013 时间: 2013-5-28 13:46

QUOTE:

原帖由 bgf5 于 2013-5-28 13:44 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

相关疾病：
头痛
WB学问大着呢，我也正头疼阿，
我还做一个200KD的，用SC的抗体，结果出了60KD的条带，干干净净一条，
而且因子刺激后10min，表达骤然增高，重复三四次，都是这样啊，200KD却没有条带，找到抗体具体信息，查了蛋白库，没有收获，S ...

荧光二抗应该还好，前些天刚染过AKT.
其实也是看到一篇文章中用过这两个抗体才订的。那篇文章结果还可以的，是我们老板一年前在的实验室发的，所以方法什么的应该也没有太大关系，可是我做的就是没有条带，很是郁闷……
另：我们实验室几个月前有人买了santa cruze的抗体，wb做了好多次都没有条带，后来向一篇文章的作者要了他们自己做的抗体就染出条带了。联系代理公司又给他们换了一支新的抗体。我的抗体是不是会有问题啊？？担心，大把的时间浪费在上面的>_<

作者: duoduo 时间: 2013-5-28 13:48

bgf5说的没错，你的转膜时间可能偏短，或者仪器的问题（其实很多国产仪器的内核，它的绕线不精细，所以在相同条件下，它可能出问题；但是对一般的蛋白没影响，因为时间短，而且比较好转膜，对大蛋白的转膜效率就不同了）；所以干脆点，你就是延长转膜时间，再不行60v转膜过夜。另外，转膜液中一定要含SDS，但含量不超过0.1%；延长转膜时间的话，你可以考虑在一半的时候，更换新鲜的转膜液；转膜过程要时刻注意不能温度过高（手摸上去有点温就表明开始过热了），一定要加冰槽，并且及时更换；要设置最高电流。
至于235和289的问题，其实如果你搞清楚了，这种WB图片是如何定义分子量大小的就不奇怪，经常会出现同个蛋白分子量不同，那是因为蛋白分析软件做不到那么精确，只是相对值。何况mTOR那么大，差一点点其实表观分子量计算出来差很多。如果是个小蛋白，也许就只是差个1-2KDa。你认为能够准确定义一个蛋白的大小吗！？（针对这种SDS-PAGE的表观分子量而言）要准确定义大小只有质谱，而且那不是表观分子量。

你最好要个质粒，过表达做阳性con，但是对于这么大的蛋白，提质粒很困难
除了之外，查查文献看看有没有做mTOR表达调控的，但是我觉得估计也不是条可行的路线。那个刺激它活性升高的，你看清楚了，是EGF刺激的结果；没有EGF，你有没有bFGF，TGFa等等吧，要不看看H2O2、UV能不能激活，这些能刺激AKT，但是对下游mTOR我不是特别清楚
PS：cell signalling虽然主要做磷酸化抗体，但是它的品质并不能体现它的“专业”精神；所以。。。不好说呀。

作者: zsxan1990 时间: 2013-5-28 13:48

直接作下游靶蛋白PHOSPH P70S6K, 4E-BP1

作者: dream2013 时间: 2013-5-28 13:49

QUOTE:

原帖由 duoduo 于 2013-5-28 13:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
bgf5说的没错，你的转膜时间可能偏短，或者仪器的问题（其实很多国产仪器的内核，它的绕线不精细，所以在相同条件下，它可能出问题；但是对一般的蛋白没影响，因为时间短，而且比较好转膜，对大蛋白的转膜效率就不同了）；所以干脆点，你就是延 ...

非常感谢您的热心。
1.对于装置问题，我们实验室用的是BIO-RAD公司的进口装置。转膜我们是用下图中的装置，用海绵、滤纸，把胶膜做成三层夹心，放在黑白的那个夹子里面，然后在小型电泳槽中，湿法转膜。

2.对于转膜液，我们的配方是：1L转膜液中，Tris 3.03g，Glycine 14.4g，甲醇 150ml（查资料说甲醇可是膜变性带正电，有利于和蛋白的结合，所以我这次实验稍微多加了些，170ml）。您说到的SDS不知在转膜过程中具体作用什么呢？？可否再解释详细些呢？？

3.转膜时，我们把上面的装置放在冰浴里转膜。我们是恒压转膜。您说的60v转膜过夜，还要设置最大电流，这个具体要怎么操作呢？？最大电流要多少呢？？我初做WB，好多不是很明白，麻烦您再解释下，好吗？？^_^

4.我前些天已经确定了AKT的激活，现在想检测下其下游的mTOR是否也被激活。如果mTOR有条带，而phospho－mTRO没有条带那说明我的设想可能是不正确的。所以我现在是想把mTOR先作出来。

问题比较多，还希望您能帮忙解答。还有版上的达人们，如果有什么建议，还望不吝赐教啊～～

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作者: dream2013 时间: 2013-5-28 13:49

直接作下游靶蛋白PHOSPH P70S6K, 4E-BP1

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抗体要好多米啊

作者: u234 时间: 2013-5-28 13:50

转膜液的甲醇加太多了！甲醇可以使胶固定，但会导致凝胶的孔径缩小，这样你大分子的蛋白就很可能转不过去。你说的“甲醇可是膜变性带正电”，就指用甲醇预处理PVDF膜时的作用，不是在转膜液的作用。
SDS可以用你的大分子蛋白增加电荷，使你的蛋白容易转过去。
个人觉得你的问题关键是转膜。可以摸索一下条件，比如增加转膜时间。

作者: dream2013 时间: 2013-5-28 13:51

QUOTE:

原帖由 u234 于 2013-5-28 13:50 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

转膜液的甲醇加太多了！甲醇可以使胶固定，但会导致凝胶的孔径缩小，这样你大分子的蛋白就很可能转不过去。你说的“甲醇可是膜变性带正电”，就指用甲醇预处理PVDF膜时的作用，不是在转膜液的作用。
SDS可以用你的大分子蛋白 ...

这样啊～～谢拉。可是我查了一下，好像有人转膜时甲醇浓度20％的，而且我的175kd的marker蛋白转过去了啊…………。
我也觉得转膜是关键，很有可能我的目的蛋白没有转过去。转膜后我胶考马斯亮蓝染色之后看胶上蛋白剩余，好像大分子量蛋白和小分子量蛋白的颜色深浅差不多哎

作者: dream2013 时间: 2013-5-28 13:51

转膜液的甲醇加太多了！甲醇可以使胶固定，但会导致凝胶的孔径缩小，这样你大分子的蛋白就很可能转不过去。你说的“甲醇可是膜变性带正电”，就指用甲醇预处理PVDF膜时的作用，不是在转膜液的作用。
SDS可以用你的大分子蛋白增加电荷，使你的蛋白容易转过去。
个人觉得你的问题关键是转膜。可以摸索一下条件，比如增加转膜时间。

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这样啊～～谢拉。可是我查了一下，好像有人转膜时甲醇浓度20％的，而且我的175kd的marker蛋白转过去了啊…………。
我也觉得转膜是关键，很有可能我的目的蛋白没有转过去。转膜后我胶考马斯亮蓝染色之后看胶上蛋白剩余，好像大分子量蛋白和小分子量蛋白的颜色深浅差不多哎

作者: duoduo 时间: 2013-5-28 13:52

转膜时甲醇浓度20％比较适用于200KD以下，建议使用10%

作者: lgm 时间: 2013-5-28 13:52

你好,我们实验室也是做的MTOR信号pathway.
mtor 和pmtor用的都是cellsigning 公司的.
效果还不错.
可能每个实验室的步骤不一样.依据我们的实验条件给你些建议.
1 转膜 300mA 恒流转,2.30小时,湿转
2 封闭 3%BSA
3 一抗和二抗均用3%BSA稀释(对于磷酸化抗体,尽量不用牛奶)
对于磷酸化的抗体,建议1:500,4度过夜(最好)
转膜液的问题,应该不会太大,应该是问题是处在一二抗上了,你也可以做S6K,我们用的也是cellsignal的,他家的磷酸化抗体还是不错的.
阳性对照的问题,建议你可以用3T3L1,这个细胞正常条件下有MTOR的表达,也可以用insulin刺激30分,收样品,可以看到激活的mTOR.
祝你好运!

作者: bring 时间: 2013-5-28 13:52

呵呵，60v恒压是没必要设置最大电流的，因为根本跑不到那么高的温度。
littlesmile专门做这个蛋白，应该给的条件可行，建议试试；她说得很正确的地方在于，转膜对于大分子量蛋白是重要，但WB最核心的技术在转膜之后，其实更多时候出问题不是在转膜这一步，而论坛上太多人把焦点集中在转膜上，造成了一种舆论的偏差。
我在一个帖子上说过：一个抗体一个脾气，抗体的使用才是艺术。

PS：SDS对大蛋白转膜很重要，前段时间一个250KDa的大蛋白，俺一直搞不定，但拿过来的抗体在美国那边用得好好的；后来发现是俺偷懒用了semi-dry buff.，对小蛋白semi-dry buff.也可以用，但对大蛋白不行，后来补加SDS就正常了。

作者: 梦幻苹果 时间: 2013-5-28 13:53

非常感谢您的热心。
1.对于装置问题，我们实验室用的是BIO-RAD公司的进口装置。转膜我们是用下图中的装置，用海绵、滤纸，把胶膜做成三层夹心，放在黑白的那个夹子里面，然后在小型电泳槽中，湿法转膜。

2.对于转膜液，我们的配方是：1L转膜液中，Tris 3.03g，Glycine 14.4g，甲醇 150ml（查资料说甲醇可是膜变性带正电，有利于和蛋白的结合，所以我这次实验稍微多加了些，170ml）。您说到的SDS不知在转膜过程中具体作用什么呢？？可否再解释详细些呢？？

3.转膜时，我们把上面的装置放在冰浴里转膜。我们是恒压转膜。您说的60v转膜过夜，还要设置最大电流，这个具体要怎么操作呢？？最大电流要多少呢？？我初做WB，好多不是很明白，麻烦您再解释下，好吗？？^_^

4.我前些天已经确定了AKT的激活，现在想检测下其下游的mTOR是否也被激活。如果mTOR有条带，而phospho－mTRO没有条带那说明我的设想可能是不正确的。所以我现在是想把mTOR先作出来。

问题比较多，还希望您能帮忙解答。还有版上的达人们，如果有什么建议，还望不吝赐教啊～～

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SDS增加蛋白的水溶性，促进蛋白在电转液中泳动。若不加SDS，蛋白会沉淀在胶上，但SDS过多会影响蛋白与膜的吸附。甲醇能使SDS与蛋白分离，甲醇浓度越高SDS与蛋白分离越快，但是甲醇浓度过高对蛋白会有固定作用，不利于蛋白从胶里跑出来。对于PVDF膜，一般来说甲醇的浓度在10%-20%都可以，对于>80kDa的蛋白用5%的甲醇，20-80kDa用10%，小分子蛋白用20%

作者: dream2013 时间: 2013-5-28 13:54

SDS增加蛋白的水溶性，促进蛋白在电转液中泳动。若不加SDS，蛋白会沉淀在胶上，但SDS过多会影响蛋白与膜的吸附。甲醇能使SDS与蛋白分离，甲醇浓度越高SDS与蛋白分离越快，但是甲醇浓度过高对蛋白会有固定作用，不利于蛋白从胶里跑出来。对于PVDF膜，一般来说甲醇的浓度在10%-20%都可以，对于>80kDa的蛋白用5%的甲醇，20-80kDa用10%，小分子蛋白用20%

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谢谢呵呵解释的好专业。
最近在想TBS 和PBS 的问题，也搜索了下园子里的帖子，不过大家说法不一。想请教下您觉得这两种缓冲液在WB时效果有什么不同吗？？有什么情况只能用PBS或是TBS吗？？
还有，有人说在封闭的时候不要TWEEN-20，一抗二抗和洗膜时再加TWEEN－20，我们是封闭时有T的，这个会有什么大的影响吗？？

作者: cocacola 时间: 2013-5-28 13:54

SDS增加蛋白的水溶性，促进蛋白在电转液中泳动。若不加SDS，蛋白会沉淀在胶上，但SDS过多会影响蛋白与膜的吸附。甲醇能使SDS与蛋白分离，甲醇浓度越高SDS与蛋白分离越快，但是甲醇浓度过高对蛋白会有固定作用，不利于蛋白从胶里跑出来。对于PVDF膜，一般来说甲醇的浓度在10%-20%都可以，对于>80kDa的蛋白用5%的甲醇，20-80kDa用10%，小分子蛋白用20%

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说法不准确，太绝对化。我们的marker在半干转的时候经常过头（就是颜料都跑到滤纸上了），我不懂你说的那些专业的东西，但是我当初猜测甲醇挥发快（久置的buff.可能甲醇挥发掉了转膜过头了），所以提高甲醇的浓度至25%，并没有发现影响转膜，颜料确实截留更多（转膜过头的较少）Marker更清晰了，呵呵。用你说的理论可以恰当的解释这一现象。
但是我必须指出，你后面的说法太绝对了，我们主要研究的蛋白复合体的组分从100KDa到20KDa都有，25%的甲醇没有任何影响

封闭液内不能加Tween-20纯粹胡扯蛋。我们的抗体稀释液就是封闭液，没有另加过啥咚咚，除了一抗加NaN3抑菌；Tween-20是用于消除背景的（非特异结合），用PBS不好，不好，即使用PBS最好还要补Tween-20。免疫荧光就是这么干的呀

作者: tuuu2 时间: 2013-5-28 13:55

我用过cell signal techonolgy公司的mTOR抗体，非常好。估计还是你的抗体问题。至于磷酸化要看情况。ser2448很多情况下还是容易活化。ser2481相对难活化一些。

你可以买CST公司的mTOR Pathway Antibody Sampler Kit #9964，非常合适，含有5种抗体，每种都能工作。
cuturl('http://www.cellsignal.com/products/9964.html')
Kit Includes Quantity Applications Reactivity MW (kDa) Source
Phospho-mTOR (Ser2448) Antibody # 2971 40 microliters W H M R Mk 289 Rabbit
Phospho-mTOR (Ser2481) Antibody # 2974 40 microliters W H M R Mk 289 Rabbit
mTOR (7C10) Rabbit mAb # 2983 40 microliters W IHC-P F H M R Mk 289 Rabbit
Raptor (24C12) Rabbit mAb # 2280 40 microliters W IP H M R Mk 150 Rabbit
Rictor (53A2) Rabbit mAb # 2114 40 microliters W H M R Mk 200 Rabbit
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody # 7074 100 microliters Goat

作者: tuuu2 时间: 2013-5-28 13:56

个人做WB 成功的关键主要有两个：1是好的抗体，2 是样品提取成功。其他次要。

”最近在想TBS 和PBS 的问题，也搜索了下园子里的帖子，不过大家说法不一。想请教下您觉得这两种缓冲液在WB时效果有什么不同吗？？有什么情况只能用PBS或是TBS吗？？
--没有本质差别。

还有，有人说在封闭的时候不要TWEEN-20，一抗二抗和洗膜时再加TWEEN－20，我们是封闭时有T的，这个会有什么大的影响吗？？ “
--没有本质差别。

另外搞不清楚为啥用荧光二抗，赶时髦？换一个普通2抗试。

CELL SIGNAL TECHONOLOGY的抗体多是推荐4度过夜。我配抗体喜欢用BSA配，因为要回收，保存时间长。封闭用牛乃，便宜。从不加防腐剂，对身体不好，污染环境。

作者: dream2013 时间: 2013-5-28 13:56

说法不准确，太绝对化。我们的marker在半干转的时候经常过头（就是颜料都跑到滤纸上了），我不懂你说的那些专业的东西，但是我当初猜测甲醇挥发快（久置的buff.可能甲醇挥发掉了转膜过头了），所以提高甲醇的浓度至25%，并没有发现影响转膜，颜料确实截留更多（转膜过头的较少）Marker更清晰了，呵呵。用你说的理论可以恰当的解释这一现象。
但是我必须指出，你后面的说法太绝对了，我们主要研究的蛋白复合体的组分从100KDa到20KDa都有，25%的甲醇没有任何影响

封闭液内不能加Tween-20纯粹胡扯蛋。我们的抗体稀释液就是封闭液，没有另加过啥咚咚，除了一抗加NaN3抑菌；Tween-20是用于消除背景的（非特异结合），用PBS不好，不好，即使用PBS最好还要补Tween-20。免疫荧光就是这么干的呀

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呵呵昨天又做一次western，转膜时加了0.1%SDS，其他条件不变，还是没有条带。请教了下其他人，说可能我电泳蛋白没有跑开。我是用的6％的分离胶，130v电泳3h，bio－lab的marker 10ul，可是跑到后来marker的条带完全看不到了，所以也不能判断电泳的情况，3h的时候就停止了。想问下，如果我的目的蛋白没有很好的和其他蛋白分离，有没有可能wesern检测不到条带？？谢谢

作者: kuohao17 时间: 2013-5-28 13:57

想问下，如果我的目的蛋白没有很好的和其他蛋白分离，有没有可能wesern检测不到条带？？谢谢

是的，我也是做ｍＴＯＲ，也是没有结果，但是对于你的问题，我还是能回答，那就是＂ｙｅｓ＂．就像***抓小偷（目标蛋白）一样，你想想，小偷老是混到人群中，***（一抗）怎么抓得到呢？

作者: 831226 时间: 2013-5-28 13:57

我也做mTOR，还没做出来。不过我觉得你是不是买个预染的大marker。我的最大的是220kDa，据说还有250的。因为172kDa的会跑丢，越大的分子跑的越慢。我100V4h，160V1h。丽春红都染出条带，但是发光没发出来。准备再做！

作者: glass 时间: 2013-5-28 13:57

1. 200ug protein is too much to seperate
2. 2h's blocking is too long, try 1h
3. try nitrocellulose membrane if i were you
4. don't forget to add protease and phosphatase inhibitor
5. try high concentration of primary antibody. We bought several antibodies from AbCam, sometimes Ab works when reaches to 1:100- 1:200 dilution.

Good luck

作者: ffooll 时间: 2013-5-28 13:58

把这个帖子顶起来，看看还有没有高人光顾

我今天用DAB染色，上样量１５０ｕｇ的泳道隐隐约约出现了一条条带，提样品用了鸡尾酒，立春红染的也发现了条带（在２００ｋｄａ　ｍａｒｋｅｒ上方一点点），其他上样量比较少的泳道没有看见条带

打算１００ｖ　－２０度转膜过夜，一抗１：５００　三七度　摇床过夜，看看出不出条带

作者: qhyu 时间: 2013-5-28 13:59

1、楼主用荧光抗体（700nm or 800nm），是不是用Odyssey近红外的机器扫描的？如果是，抗体封闭液不能加Tween-20! 这种机器的说明书中要求就是在封闭时不能加Tween,否则会增高很大的背景。

2、Odyssey有专门的blocking buffer，效果比BSA和牛奶好，1h即可

3、转膜3.5小时应该是够了。。。甲醇降低了也没用的话就要考虑其他因素吧

阳性对照你找个大鼠的liver做一下啊，很容易的事情啊

作者: IAM007 时间: 2013-5-28 14:00

总蛋白和磷酸化都做出来了，

总蛋白的预实验

图片附件: 71196836.snap.jpg (2013-5-28 14:00, 7.47 KB) / 该附件被下载次数 9
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16523

作者: IAM007 时间: 2013-5-28 14:00

这一张是磷酸位点的p-mTOR（Ser2448),用的都是CST的抗体，#2971和#2983.反应条件：3.5%的积层胶，8%的分离胶。所用的是5%脱脂奶粉配的封闭及孵抗体液。
1）电泳恒压60V 30min,120V 90min.
2）电转恒流：300mA,尽量保持电压在100V以上。但有时候不到100也可以出结果。我用的Marker最大是170KD,所以切胶的时候估计一下，除尽积层胶和分离胶上面1-2mm的胶，然后切到170KD的位置。
3）封闭1h,室温。
4）一抗4度过夜，按照说明的1：1000的抗体。
5）二抗室温1h.

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作者: www.1 时间: 2013-5-28 14:01

我也做过，条带是出来了。但是磷酸化的水平没有变化，没意义！
注意转膜一定要湿转

作者: star#room 时间: 2013-5-28 14:01

这楼很有帮助！

还想请教一个问题，文献报道说mTOR是大部分分布在细胞膜上的蛋白，那么在样品制备的过程中，是否需要单纯提取膜蛋白呢？

我现在是提总蛋白，SH细胞，300ul RIPA/10cm dish，冰上裂解30min后14000g，10min。

不知道这样可不可以？

最后结果在250kD下方出现了清晰条带…………位置不对…………

恳请高手给予建议~~！谢谢！

作者: star#room 时间: 2013-5-28 14:01

补充一点，我用的是CST p-mTOR(Ser2448)的抗体

转膜是250mA, 6h, 其他都是按照抗体说明书来的

作者: DNA 时间: 2013-5-28 14:02

请问，做mtor和p-mtor 所用的阳性对照细胞用什么比较好呢？都是3T3L1吗？十分感谢啊！！

作者: yychen 时间: 2013-5-28 14:02

这一张是磷酸位点的p-mTOR（Ser2448),用的都是CST的抗体，#2971和#2983.反应条件：3.5%的积层胶，8%的分离胶。所用的是5%脱脂奶粉配的封闭及孵抗体液。
1）电泳恒压60V 30min,120V 90min.
2）电转恒流：300mA,尽量保持电压在100V以上。但有时候不到100也可以出结果。我用的Marker最大是170KD,所以切胶的时候估计一下，除尽积层胶和分离胶上面1-2mm的胶，然后切到170KD的位置。
3）封闭1h,室温。
4）一抗4度过夜，按照说明的1：1000的抗体。
5）二抗室温1h.

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请问楼主转膜多少时间？你电泳时间这么短，蛋白能跑开吗，用哪套设备跑的呢

作者: avi317 时间: 2013-5-28 14:03

把这个帖子顶起来，看看还有没有高人光顾

我今天用DAB染色，上样量１５０ｕｇ的泳道隐隐约约出现了一条条带，提样品用了鸡尾酒，立春红染的也发现了条带（在２００ｋｄａ　ｍａｒｋｅｒ上方一点点），其他上样量比较少的泳道没有看见条带

打算１００ｖ　－２０度转膜过夜，一抗１：５００　三七度　摇床过夜，看看出不出条带

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－２０度转膜过夜，这个非常创意啊，请教应该怎样操作呢？

作者: kuohao17 时间: 2013-5-28 14:04

mtor与p-mtor很好做

作者: nut6694 时间: 2013-5-28 14:04

想检测hela细胞中mTOR 分子的表达和磷酸化情况，western blo实验做了3次，可是都没有目的条带，很是着急，还请各位帮我分析下啊～～
磷酸化的mTOR或许不好检测，可是我的mTOR的条带也没有，感觉就是很奇怪了。一抗说明书上显示mTOR 235KD, phospho－mTOR 289KD（说明书中phospho－mTOR是293细胞的，289kd，mTOR是大鼠肝脏中的，235kd，热心的iris_palm版主回帖说这个可能是由于组织特异性）

下面是我实验的具体步骤与试剂，各位大侠帮我分析下啊，不胜感激

1.mTOR的一抗是abcam公司的，phospho-mTOR的一抗是cell signaling公司的，二抗是荧光二抗。
2.实验步骤：
1） sample buffer 在60mm皿中裂解细胞，刮板将细胞刮下，吸到1.5ml EP
管，用1ml注射器枕头抽吸细胞，破碎DNA，沸水浴5min。－20度冰箱保存。
2) 电泳浓缩胶4％，分离胶6％。先是50V跑过浓缩胶，130V电泳3h。上样量是200ug。
3）转膜 pvdf膜，100V，3.5h。
4）5％脱脂奶粉封闭2h。
5) 一抗用脱脂奶粉1：1000稀释4度过夜。PBST洗膜，3次每次5min
6）二抗脱脂奶粉1：5000稀释，室温1h。洗膜，4次，每次5min。

补充一下：
1.本人用的试剂药品荧光二抗之类的应该没有问题，前些天成功地检测到了AKT和phospho－AKT。

2.转膜时marker最大 175kd的，可以转过去的。

3.蛋白胶跑过了，考马斯亮蓝染过，有条带的。至于蛋白上样量，因为觉得这个蛋白的含量可能比较低，所以多加了些。我的蛋白浓度是用nanodrop的仪器测的，当然可能蛋白浓度不是很准，所以就有意多加了些。

4.阳性的话我也考虑过。mTOR的抗体是abcam公司的，推荐
rat liver lysate 做阳性对照，可是这个我没有，phospho－mTOR的抗体是cell
signaling 公司的，它的图是用293细胞饥饿16h做的，其中一张图是染的mTOR。我们实验室不做大鼠，所以我用293细胞，不加血清的DMEM培养基处理16h做的阳性对照，也是没有条带。不知这算不算是阳性对照呢？？

5.其实也是看到一篇文章中用过这两个抗体才订的。那篇文章结果还可以的，是我们老板一年前在的实验室发的，所以方法什么的应该也没有太大关系，可是我做的就是没有条带，很是郁闷……

还有我想请教一下
1.转膜完了，胶用考马斯亮蓝染色，不管做哪个蛋白好像总是marker转的最彻底，这是什么原因呢？？

2.关于蛋白样本的反复使用问题我一直在想蛋白样品煮沸之后－20度保存的时候会不会也会使某些蛋白降解啊？？即使分装开了，每次拿一管出来用，那剩余的样本即使没有反复冻融会不会也有可能降解掉？？

再另：我们实验室几个月前有人买了santa cruze的抗体，wb做了好多次都没有条带，后来向一篇文章的作者要了他们自己做的抗体就染出条带了。联系代理公司又给他们换了一支新的抗体。我的抗体是不是会有问题啊？？担心，大把的时间浪费在上面的>_<

附件照片是我的结果

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您好，我最近也要做mtor的wb，请问你那里最后有什么心得吗？压缩胶和分离胶您最后配的是百分之几的浓度呢？谢谢！

作者: 再回首tv 时间: 2013-5-28 14:05

mTOR 我曾做过，一次就搞定了。
你没有阳性对照（你说的那都不是），所以潜在问题比较多。
几个重要的步骤需要关注：1，跑胶，时间不要过长。 2，转膜。你转膜时间显然不够，使劲转吧。 3，抗体浓度，再提升一倍。 4，曝光，使劲曝。

至于蛋白是280还是230KD, 这个时候来纠结这个问题显然没有意义，因为1，你还没做出来呢。2，即使你做出来了，你也分不开。

另外，不妨把pAKT的结果说下，方便分析。
另另外，可以WB下pS6作为一个不算对照的对照。
最后，最好上个图。

作者: 再回首tv 时间: 2013-5-28 14:05

把同一张胶上的其他曝光结果（比如actin等）一起拿出来看看，对比下基本就可以推测出原因了。

作者: qiangren789 时间: 2013-5-28 14:06

mTOR 我曾做过，一次就搞定了。
你没有阳性对照（你说的那都不是），所以潜在问题比较多。
几个重要的步骤需要关注：1，跑胶，时间不要过长。 2，转膜。你转膜时间显然不够，使劲转吧。 3，抗体浓度，再提升一倍。 4，曝光，使劲曝。

至于蛋白是280还是230KD, 这个时候来纠结这个问题显然没有意义，因为1，你还没做出来呢。2，即使你做出来了，你也分不开。

另外，不妨把pAKT的结果说下，方便分析。
另另外，可以WB下pS6作为一个不算对照的对照。
最后，最好上个图。

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请问你的转膜条件是多少呢？？

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