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标题: 【求助】2xSDS上样缓冲液的配方 [打印本页]

作者: vvmmoy 时间: 2013-5-30 16:30 标题: 【求助】2xSDS上样缓冲液的配方

本人开始做WB，急求2xSDS上样缓冲液的配方，谢谢！

作者: memory 时间: 2013-5-30 16:30

2xSDS凝胶加样缓冲液:
100mmol/L Tris—HCl(pH6.8)
200mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)
4% SDS(电泳级)
0.2% 溴酚蓝
20% 甘油
不含有二硫苏糖醇(DTT)的2XSDS凝胶加样缓冲液可保存于室温,临用前须从lmol/L二硫苏糖醇储存液现用现加于上述缓冲液中。

作者: vvmmoy 时间: 2013-5-30 16:31

这个配方我有,为什么不是质量或体积?

作者: jujuba 时间: 2013-5-30 16:31

我给你一个配方：2xSDS凝胶加样缓冲液
1.０mol/L Tris—HCl(pH6.8)　１.２５ml
beta巯基乙醇０.５ml
１０% SDS(电泳级)　３.０ml
溴酚蓝　１.０mg
１００% 甘油　１.０ml
分装后负２０度　保存．这个配方我们一直用，挺好的．祝你实验顺利．

作者: vvmmoy 时间: 2013-5-30 16:33

谢谢大家！可惜我的Tris—HCl(pH6.8)　是0.5mol/L的，且手头只有DTT，没有beta巯基乙醇，原先我用的配方是：还原型5XSDS上样缓冲液 0.5 mol/L Tris·HCl（pH6.8） 2.5ml
二硫叔糖醇（DTT，MW154.5） 0.39g
SDS 0.5g
溴酚蓝 0.025
甘油 2.5ml------想知道是否可以用蒸馏水稀释成2xSDS凝胶加样缓冲液？

作者: mamamiya 时间: 2013-5-30 16:33

2x sample buffer: 120mM Tris-HCl, pH 6.8
20% Glycerol
4% SDS
0.02% Bromphenol Blue
临用前加入DTT

作者: remenb 时间: 2013-5-30 16:34

谢谢大家！可惜我的Tris—HCl(pH6.8)　是0.5mol/L的，且手头只有DTT，没有beta巯基乙醇，原先我用的配方是：还原型5XSDS上样缓冲液 0.5 mol/L Tris·HCl（pH6.8） 2.5ml
二硫叔糖醇（DTT，MW154.5） 0.39g
SDS 0.5g
溴酚蓝 0.025
甘油 2.5ml------想知道是否可以用蒸馏水稀释成2xSDS凝胶加样缓冲液？

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Loading Buffer的最终使用浓度是：
2% SDS
60 mmol/L Tris-Cl（pH 6.8）
10% 甘油
0.01% 溴酚兰
100 mmol/L DTT（贮存液-20度保存，临用前加入）

所谓2X，5X或者6X的Loading Buffer，其实就是上述成分的浓缩液。楼主可以对比一下kuang贴的2X配方，刚好就是所有成分的浓度乘以2。有些配方的Tris终浓度是50 mmol/L，有些配方的溴酚兰可能加得比较多，有些6X配方甘油没有60%这么多，这些都无所谓，不影响实验结果。只要保证SDS终浓度是2%，DTT终浓度是100 mmol/L，Tris的pH值是6.8就可以了。

另外，DTT和巯基乙醇的作用是一样的，二者加其一即可。DTT比巯基乙醇贵，效果也比巯基乙醇好。

至于楼主的配方可不可以稀释，相信看了上面的自己都知道了吧？

作者: pencil菲 时间: 2013-5-30 16:35

我想求5xSDS上样缓冲液的配方：
我看楼主给的5xSDS上样缓冲液的配方，稀释后也达不到favoritevirus给的1x时要求的浓度。只有SDS达到了要求，时2%。但是，DTT的浓度好像达不到呀！因为着急用，借楼主的宝地一用，请高手帮忙，在这里向大家道谢了，非常感激。

作者: greenbee 时间: 2013-5-30 16:37

我用5xSDS(不含DTT)加10xDTT的共300/7ul加到100ul的样品中，这样对吗？

作者: 9900 时间: 2013-5-30 16:37

100mmol/L Tris.Hcl(6.8), 200mmlol/L DTT, 4%SDS(电泳级）0.2%溴酚蓝， 20%甘油溶解于水中。

作者: am10 时间: 2013-5-30 16:38

2xSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液
终浓度
1mol/L Tris-Cl（pH 6.8） 0.5ml 100mmol/l
10%SDS 2ml 4%
甘油 1ml 20%
溴酚兰 0.1g 0.2%
DTT现用现加，因为不含DTT的缓冲液可以室温保存，用时加1mol/lDTT,体积为总体积的1/10,也可以加终浓度10%的巯基乙醇，最好现用现加

作者: standbyme 时间: 2013-5-30 16:42

很有帮助的帖子！也想搭车请教几个问题
1、组织提蛋白后什么时候加2*SDS上样缓冲？匀浆时，离心前，还是煮沸变性前？与裂解液或所提上清液等体积加入就能达到所需终浓度吗？
2、如果要测蛋白浓度，该什么时候测？加缓冲液前还是后？变性前还是变性后？
3、所测每个样本浓度有差异，点样前可以用上样缓冲液稀释到浓度一致吗？这样每个样本中的缓冲液终浓度不同对试验结果有什么影响？
还望高手赐教，谢谢！

作者: xue258 时间: 2013-5-30 16:43

很有帮助的帖子！也想搭车请教几个问题
1、组织提蛋白后什么时候加2*SDS上样缓冲？匀浆时，离心前，还是煮沸变性前？与裂解液或所提上清液等体积加入就能达到所需终浓度吗？
2、如果要测蛋白浓度，该什么时候测？加缓冲液前还是后？变性前还是变性后？
3、所测每个样本浓度有差异，点样前可以用上样缓冲液稀释到浓度一致吗？这样每个样本中的缓冲液终浓度不同对试验结果有什么影响？
还望高手赐教，谢谢！

解答：1、煮沸变性之前加上样缓冲液；如果是2x的缓冲液，是加入与上样样品等体积的缓冲液。
2、测蛋白浓度应该是在蛋白提取之后，每次电泳之前，按照所测蛋白的量确定各样品的稀释倍数。稀释好后，再加入缓冲液，煮沸变性。
3、如各样品浓度有差异，应该用蛋白裂解液或生理盐水等能够溶解蛋白的溶液来稀释。

作者: mimili_901 时间: 2013-5-30 16:43

我做的是细胞的一直用的是2xsds配方：共（10ml）

tric-hcl（6.8） 2ml

甘油 2ml

20％的sds 2ml

2-巯基乙醇（dtt或者msp） 1ml

双蒸水 2.5ml
0.1％溴酚蓝 0.5ml

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