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标题: 【讨论帖】个人的详细实验过程关于蛋白可溶表达与纯化 [打印本页]

作者: 箭头儿 时间: 2013-6-1 13:23 标题: 【讨论帖】个人的详细实验过程关于蛋白可溶表达与纯化

我是新手，但是做蛋白也2个月了，简单的说，从不懂到稍微懂，走了些弯路，鄙视那些不教人只说风凉话的，对于新人只有先获而后给，不叫不劳而获，不劳而获是连论坛都不上等着别人给你材料。
这次发下我这两个月的成果，给新人参考，也算是还丁香园给我的帮助（可以说，我学的都是论坛上朋友帮助的，现在还给论坛，也算是我自己的归纳了），我想我的文章新人肯定会有用。因为我以前想找类似的文章，可是没找到..

作者: 箭头儿 时间: 2013-6-1 13:24

一、证明目的蛋白有表达
1、挑取一单菌落接种于含氨苄(Amp，终浓度为100g/mL)的3mL液体LB培养基中37℃，250rpm培养过夜。
2、将过夜培养菌液以1:100转接于含上述抗生素的100mL液体LB中，37℃，250rpm，3.5h（大量培养至OD600＝0.6左右）。
3、取出1 mL菌液为未诱导的电泳对照，剩余培养液加入诱导物IPTG至终浓度为1 mmol/L，继续振荡培养4h。
4、以未诱导菌液与IPTG诱导后菌液作对比，SDS-PAGE检测。
结果如下：图1
1: pET-32aA3未诱导，2: pET-32aA3未诱导，3: pET-32aA3诱导后，4: pET-32aA3诱导后

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作者: 箭头儿 时间: 2013-6-1 13:24

二、表达的情况，是可溶还是沉淀
1、将上述的37℃诱导菌液离心（4℃，12000g，5min），弃上清（LB培养液），沉淀重悬于0.9% NaCl溶液洗菌。
2、将重悬于0.9% NaCl的菌体溶液离心（4℃，12000g，5min），弃上清（0.9% NaCl洗菌液），得菌体，称菌体重量，重悬于8mL PBS（pH 7.0）缓冲液，缓冲液用量根据50~100mg/mL的菌液终浓度。
3、超声破菌：冰浴条件下，超声波破碎大肠杆菌，超声设置如下
功率：400W，工作：15s，间隔：45s，全程时间：30min（30次左右）以菌液由白变透明，且不粘稠为依据（少量菌液用液氮反复冻融7次以上效果也不错，而且简单，但是DNA出来后会粘稠，可能加dna酶后会好些，那样好离心，我是用接近最高转速离心的（没加dan酶），不然分不开）
4、将超声波破碎的菌液离心（4℃，12000g，15min），分别收集上清和沉淀，各取1mL，加入1mL 2×上样缓冲液，沸水浴10min，SDS-PAGE检测。
结果如下：图2
1: pET-32aA3诱导上清，2: pET-32aA3诱导沉淀

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作者: 箭头儿 时间: 2013-6-1 13:25

三、探索可溶表达条件
有上述实验结果可知，目标蛋白在上清也有表达，即存在可溶性的表达，但是量很少，大部分也包涵体的形式存在（沉淀中），而包涵体的存在也证明了蛋白表达量很高，上清可溶蛋白的可操作性等因素都优于对包涵体蛋白的分离纯化，所以可通过探索可溶表达条件，最终来加大上清蛋白的含量，以利于下一步实验的进行。
影响包涵体形成的因素有很多，如诱导温度，诱导时间，IPTG浓度，摇床转速等等，所以设定在低IPTG浓度下（0.1 mmol/L），在不同温度，诱导时间下的表达对照：

1）37℃ 250rpm 5h
2）30℃ 180rpm 10h
3）23℃ 90rpm 30h
过程：挑取一单菌落接种于含氨苄(Amp，终浓度为100g/mL)的3mL液体LB培养基中37℃，250rpm培养过夜。将过夜培养菌液以1:100转接于含上述抗生素的50mL+50mL+60mL液体LB中，37℃，250rpm，3.5h（大量培养至OD600＝0.6左右）。从60mL培养液中取10mL作为未诱导对照，标记3个50mL LB培养菌液：1、37℃ 250rpm 5h 2、30℃ 180rpm 10h 3、23℃ 90rpm 30h
都分5次取样：
37℃ 每一小时取样一次（取10mL）编号为：371、372、373、374、375
30℃ 每二小时取样一次（取10mL）编号为：301、302、303、304、305
37℃ 每五小时取样一次（取10mL）编号为：231、232、233、234、235
诱导培养结束后，将上述样品分别破菌离心，得上清与沉淀，加2×上样缓冲液，沸水浴10min，SDS-PAGE检测。
SDS-PAGE检测：
1、37℃ M 1 2 3 4 5 五个样的上清和沉淀
2、30℃ M 1 2 3 4 5 五个样的上清和沉淀
3、23℃ M 1 2 3 4 5 五个样的上清和沉淀
4、以不同温度下的最优可溶表达做比较
结果如下：
图3图3：37℃条件下五个样的上清和沉淀

1: 371上清，2: 371沉淀，3: 372上清，4: 372沉淀，5: 373上清，6: 373沉淀，
7: 374上清，8: 374沉淀，9: 375上清，10: 375沉淀

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作者: 箭头儿 时间: 2013-6-1 13:25

图4图4：30℃条件下五个样的上清和沉淀

1: 301上清，2: 301沉淀，3: 302上清，4: 302沉淀，5: 303上清，6: 303沉淀，
7: 304上清，8: 304沉淀，9: 305上清，10: 305沉淀

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作者: 箭头儿 时间: 2013-6-1 13:26

图5图5：23℃条件下五个样的上清和沉淀

1: 231上清，2: 231沉淀，3: 232上清，4: 232沉淀，5: 233上清，6: 233沉淀，
7: 234上清，8: 234沉淀，9: 235上清，10: 235沉淀

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作者: 箭头儿 时间: 2013-6-1 13:26

图6图6:不同温度下的最优可溶表达

1: 234上清，2: 234沉淀，3: 303上清，4: 303沉淀，5: 373上清，6: 373沉淀，
由图5可知：23℃条件下，明显的提高了上清目的蛋白的含量，并且，存在可溶表达平衡，即20个小时后，蛋白表达将以包涵体的形式存在，即不论如何改变条件，可溶表达已经达到极限。所以无需探索更低温度等条件。(个人观点，不知道是否正确)

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作者: 箭头儿 时间: 2013-6-1 13:27

四、大量制备，表达与纯化
配置1L LB液体培养基，分装成100mL×10瓶，分瓶以利于大肠杆菌生长和后续操作。
诱导培养：挑取一单菌落接种于含氨苄(Amp，终浓度为100g/mL)的3mL×5管液体LB培养基中37℃，250rpm培养过夜。将过夜培养菌液以1:100转接于含上述抗生素的100mL×10瓶液体LB中，37℃，250rpm，3.5h（大量培养至OD600＝0.6左右）。取出1 mL菌液为未诱导的电泳对照，剩余培养液加入诱导物IPTG至终浓度为0.1 mmol/L，23℃，90rpm条件下，继续振荡培养20小时。
破菌收集上清：分别离心（4℃，12000g，5min）加8mL×10管 PBS（pH 7.0）缓冲液重悬后，冰浴条件下超声波破碎（400W，15s，45s，30min），分别离心（4℃，12000g，15min）收集上清（8mL左右×10管）。
稀释过滤上清：将8mL左右×10管菌液用 PBS（pH 7.0）缓冲液稀释为2倍，并过0.45纳米滤膜。取1mL留样。
过镍柱纯化：（8mL左右×10管×2倍=160mL，分2次过柱，每次80mL）
A、用缓冲液I （PBS pH 7.0缓冲液）平衡镍柱，5个床体积，流速为2mL/min。
B、将稀释过滤后的上清上样，流速为1mL/min。
C、用缓冲液I （PBS pH 7.0缓冲液）再洗5个床体积，流速为2mL/min。使目标蛋白充分挂柱。
D、用含50mM咪唑的缓冲液III，洗去杂蛋白，流速为2mL/min。并收集洗杂峰。
E、用含100mM咪唑的缓冲液III，进行洗脱，流速为1mL/min。并收集洗脱峰，收集洗脱液。
F、将收集的洗脱液用15mL超滤离心管分次超滤浓缩，收集各次浓缩液合并后再次超滤浓缩，分装成每管1.5mL，取1mL 4℃备用，其余-80℃保存。
G、各取1mL 过柱前、挂柱穿透、洗杂液、洗脱液加2×上样缓冲液，沸水浴10min，SDS-PAGE检测。
结果如下：图7蛋白质过Ni柱电泳图示

1: pET-32aA3诱导全菌，2: pET-32aA3诱导沉淀，3: pET-32aA3诱导上清，4: Ni柱穿透，
5: 50mM咪唑洗杂蛋白，6: Ni柱洗脱（纯化的蛋白），7: 超滤离心管浓缩的蛋白
全图：

1: pET-32a未诱导，2: pET-32a诱导，3: pET-32aA3未诱导4: pET-32aA3诱导，
5: pET-32aA3诱导沉淀，6: pET-32aA3诱导上清，7: Ni柱纯化的蛋白，8: Ni柱纯化的蛋白

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作者: 箭头儿 时间: 2013-6-1 13:27

五、Western Blot
（过程下次补上）

六、多克隆抗体的制备
纯化蛋白加等量的弗氏完全佐剂进行乳化使之形成油包水乳剂（我用枪吹了2个多小时），采用皮下、皮内和肌肉注射的方法进行第一次家兔免疫。再次免疫使用弗氏不完全佐剂乳化，最后一次静脉加强免疫时则不用佐剂。每次免疫抗原量为400 -500g/次（1mL左右），最后一次加强免疫7-10 d后采血。将所采血4℃凝结过夜，取血清(3000rpm 10~15min)，加入NaN3后于4℃保存（我是直接-80保存，什么都没加）。用琼脂双扩散的方法测定抗血清效价（还没做）
七、什么什么效价（还没做）
用琼脂双扩散的方法测定抗血清效价

作者: pencil菲 时间: 2013-6-1 13:27

WB我做了一次就成功了，步骤没电子版的，现在实验在多抗制备阶段，琼脂双扩散的方法测定抗血清效价还没研究，希望大家的帮助
感谢楼主等各位高手的帮助。。希望新手少走弯路

作者: 箭头儿 时间: 2013-6-1 13:28

图7中，穿透和50mM洗杂蛋白两条带，应该是没目的条带的，由于这次图用的是大量制备时收集的样，所以有条带，因为量一多，柱子挂的不是很好（穿透），稍微改变也能洗下些蛋白（洗杂），不过以前试验图倒是没条带。
标记补齐了，大家可以看看。Ni柱使用是我多次试验无意中发现的，50mM洗杂多洗几次，可以洗的挺干净的，100mM也足够完全洗脱了。超滤管给我很大的方便。能得到纯的蛋白和水，听说盐水超滤后就不咸了。

作者: 8princess8 时间: 2013-6-1 13:29

楼主在证明目的蛋白有表达中菌液怎样处理后做的SDS-PAGE呢？用蛋白裂解液行吗？

作者: 8princess8 时间: 2013-6-1 13:29

楼主的蛋白只过镍柱就纯化的那么好，真让人羡慕啊。离子层析、凝胶过滤层析都不需要吗？

作者: 箭头儿 时间: 2013-6-1 13:29

楼主在证明目的蛋白有表达中菌液怎样处理后做的SDS-PAGE呢？用蛋白裂解液行吗？

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诱导表达完毕后，取0.5-1ml菌液离心弃上清，沉淀加入200-400ul水混匀，取40ul样品加入到10ul 5*loading buffer中，沸水浴加热3-5min，取5-10ul上样SDS-PAGE。
过程中不用加任何蛋白裂解液，loading buffer起到相同作用。

作者: 箭头儿 时间: 2013-6-1 13:30

楼主的蛋白只过镍柱就纯化的那么好，真让人羡慕啊。离子层析、凝胶过滤层析都不需要吗？

============================================================================================

与蛋白种类，表达情况，胶种类，纯化参数，目标收率等等相关。
如果你不在乎纯化收率的话，把镍柱的条件细化等很精确，再采用分段收集多个样品的方法，一步镍柱也可以得到很纯的蛋白。

作者: ladyhuahua 时间: 2013-6-1 13:30

楼主你好，我最近也是刚刚在做蛋白纯化，可纯化了好几次都没有目的带（35KD），我用的是TOYOBO公司的蛋白纯化试剂盒，载体是pet32a，纯化后出现大约20KD 的带，请问这个带是组氨酸标签的带么？

作者: 箭头儿 时间: 2013-6-1 13:31

QUOTE:

原帖由 ladyhuahua 于 2013-6-1 13:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼主你好，我最近也是刚刚在做蛋白纯化，可纯化了好几次都没有目的带（35KD），我用的是TOYOBO公司的蛋白纯化试剂盒，载体是pet32a，纯化后出现大约20KD 的带，请问这个带是组氨酸标签的带么？ ...

条件不够，分析不详。
可能的原因：
1：PET32a表达的融合蛋白有可能断裂。
2：重组质粒构建不正确。
3：没有真正表达，20kd蛋白是杂带。

注：未插入目的基因的PET32a表达出的histag蛋白大约为22kd左右。
插入目的基因后表达的融合蛋白其histag融合段大约为14-17kd左右。

作者: lxh031 时间: 2013-6-1 13:31

楼主辛苦了。顺便问一下，你的融合蛋白用的是什么标签？HIS还是GST?或是其他什么？

作者: 箭头儿 时间: 2013-6-1 13:31

QUOTE:

原帖由 lxh031 于 2013-6-1 13:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼主辛苦了。顺便问一下，你的融合蛋白用的是什么标签？HIS还是GST?或是其他什么？

呵呵，看帖不认真。多处都写了PET32a，是histag。

作者: tie8 时间: 2013-6-1 13:32

我也是开始了三个月了，从最开始的迷茫到现在稍微懂一点经历了很多，很羡慕lz的钻研精神，我的蛋白每次用Ni柱纯化的效果每次都不一样，也还没弄清原因

作者: kuaizige 时间: 2013-6-1 13:32

辛苦了lz，谢谢分享。
不知道你在蛋白纯化出来后是如何定量的?

作者: abc816 时间: 2013-6-1 13:32

Amp，终浓度为100g/mL？

笔误了吧，ug/ml

作者: lagua123 时间: 2013-6-1 13:33

写的不错，要是能把前面如何构建质粒开始，就更完美了。
不知道楼主要纯化蛋白的目的是做什么

作者: misswu61 时间: 2013-6-1 13:33

23℃ 90rpm 30h

不知道LZ为什么选择90RPM，而不和上面的一样呢？

作者: 12xunmei 时间: 2013-6-1 13:34

非常感谢楼主，本人也是做纯化蛋白的菜鸟，在做了一个月仍无法有效增加蛋白可溶性后，看到了此贴，准备按照楼主的思路做一遍，希望成功，也会将过程结果拿来共享，谢谢

作者: ALALA 时间: 2013-6-1 13:34

楼主，你好！我也是一个新手，正在纯化蛋白，但是每次纯化后都有一条和目的蛋白稍小的杂带。
我使用的载体也是pET32a，但是我带有蛋白自己的终止密码子，请问是什么原因呢？
谢谢！

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