分析测试百科

标题: 【求助】为什么marker只跑出三条带？ [打印本页]

作者: pulala 时间: 2013-6-1 15:34 标题: 【求助】为什么marker只跑出三条带？

我用的是上海生化所的低分子量标准蛋白，Bio-Rad电泳系统，电压150V，指示剂到达距底部约1cm处终止电泳，但是marker的六条带只显出了三条，在指示剂处颜色较浓，是否可能是较低分子量蛋白的条带呢？电泳的电压是否过高？浓缩胶和分离胶的电压是不是分别设定会好一些？
谢谢。

作者: 小游abc 时间: 2013-6-1 15:35

你的胶浓度是多大，marker只显出三条带也太少了，如果不是上样量不足的话就是蛋白降解了。样品过浓缩胶的时候电压小一点，然后再调大，这样得到的条带更漂亮。

作者: dog002 时间: 2013-6-1 15:35

提高分离胶的浓度，marker可以显示出更多的条带。浓缩胶和分离胶的电压最好分开，浓缩胶得电压小一点，浓缩胶得电压大一些。

作者: uuooii 时间: 2013-6-1 15:36

我的浓缩胶和分离胶的电压分别为100V、120V，除了蛋白降解外，可能原因是：跑的时间太久，低分子的蛋白Marker跑丢了；染色时间太久，你过夜了吗？时间太长可能会造成蛋白条带弥散，你脱色后的背景是不是很高；浓缩胶不要太短。
仅供参考！

作者: pulala 时间: 2013-6-1 15:36

分离胶的浓度是10％，待测蛋白质的分子量为45kd和55kd。染色没有过夜，脱色后的背景并不高，电泳时间40分钟。我打算明天把电压调小再试试。谢谢大家的参考

作者: 8s5g 时间: 2013-6-1 15:37

分离胶聚合时间不够。我也遇过此问题

作者: xyw5 时间: 2013-6-1 15:37

我用的多肽marker也是只显示3条带。6kb下的两条没了，增大marker加样量也不幸。

作者: loli 时间: 2013-6-1 15:38

我谈一下我的看法的经验:

我曾经用过并且一直在用上海生化所的低分子量标准蛋白，我用的10%分离胶，多数跑出来的MARKER是5个（实际是6个），只有一两次是3个，我用的是定电流24mA或32mA，后来分析了一下原因，其它都很正常，唯一可能就是分离胶的浓度低，不能使低分子量的蛋白质跑出来。我就用12.5%的分离胶，电流还是24mA或32mA，堆积胶的电流是分离胶电流的一半。以后跑出来的胶都很好，MARKER也正常为6条带。
你的情况与电压有关，但不是太大，你应关注的是分离胶的浓度，建议你试一下12.5%的分离胶或更高浓度一点的分离胶！

另外，你最好附图就更明晰一点！

作者: wu11998866 时间: 2013-6-1 15:38

我觉的以上各位说的都有道理，我补充一点，你还要检查一下你的上样缓冲液和染液，因为上海生化所的低分子量标准蛋白各带的浓度不是一样的，有的浓度低，如果染液时间长的话可能就染色不出来了。

作者: zsxan1990 时间: 2013-6-1 15:40

我也遇到类似情况，后来发现与试剂有关，用进口的吧。

作者: yes4 时间: 2013-6-1 15:40

倒是想请问以下，该上海生化所的低分子量蛋白试剂剂盒中是哪6种蛋白？dothing 兄的“6KB”是？似乎BIO-RAD等的“LOW”分子蛋白标准盒最小的也是10以上，若下面还有二个蛋白，哪是什么？若6KD以下还有二种蛋白，10%的胶浓度低了。linca 兄若是要看45-55KD的样本蛋白，14~90+或~200左右的那套正适合。
另用新购买的、加够量也应考虑。

作者: 8princess8 时间: 2013-6-1 15:41

是不是和上样量有关啊？

作者: 6327555 时间: 2013-6-1 15:41

分离胶12%就会出现6条带，10%就只会有3条带。我遇到过这种情况。

作者: 9900 时间: 2013-6-1 15:42

我也用上海生化所低分子量marker，根据目的蛋白分子量选择8％的分离胶，每次都只有3条带，电泳电压为浓缩胶55v，分离胶80v，一直不知何故，今天受益匪浅，看能不能纠正过来。

作者: pulala 时间: 2013-6-1 15:43

多谢各位战友的指点，我把胶的浓度调整到了12%，六条带都跑出来了，很漂亮，谢谢了。

作者: 8princess8 时间: 2013-6-1 15:52

请问你所用的上海生化所的低分子量标准蛋白最低是多大分子量的？我也想用用试试。

作者: 68943512yao 时间: 2013-6-1 15:53

各位战友，我用5%积层胶、12%分离胶跑SDS-PAGE电泳，在胶前缘跑出两条带，一条应该是前沿指示剂的带，另一条与之平行，不清楚是什么带，请指教!

作者: damingxia0904 时间: 2013-6-1 15:53

加些BSA吧，看看多大！！

作者: lxh031 时间: 2013-6-1 15:54

这是个基本知识：

丙烯酰胺在凝胶中的百分比(%) 分离胶的分辨范围(kDa)
15 15-45
12.5 15-60
10 18-75
7.5 30-120
5 60-212

参考蛋白质技术手册（汪家政）

作者: 49888 时间: 2013-6-1 15:54

除了蛋白降解外，可能原因是：跑的时间太久，低分子的蛋白Marker跑丢了；
　
我有一点不明白，linca战友不是指出其在指示剂到达距底部约1cm处终止电泳，那又怎么会跑过了呢？

作者: huifeng0516 时间: 2013-6-1 15:55

我的实验条件和楼主基本相同，我的胶是12％，但是每次只有三条带，不知什么原因，结果有一天一看日期，唉，已经过期两年了，难怪啊。哈哈。

作者: vera+ 时间: 2013-6-1 15:55

我也曾经碰到同样的问题，郁闷了好长一段时间，最后换amersham就好了！

作者: am10 时间: 2013-6-1 15:56

我遇到过和你一样的问题，蛋白标准品也是买自中科院上海生化研究所，我们的电泳系统也是Biol-Rad的。我把标准品的浓度增大了一倍，结果原先没有跑出的高分子量和低分子量蛋白条带都跑出来的，我用的电压是60伏。

作者: bs4665 时间: 2013-6-1 15:56

我们开始做western跑胶时也是Marker跑不全，7条带一般只有5条带，但后来一次偶然的机会发现，跑胶时间短些，溴芬兰大约只跑了整个胶长度的2分之1时考马斯亮兰染色出现了清晰的7条带，所以认为太小的marker条带跑久了就不见了（原因未知）！不能说是小条带跑的超过了溴芬兰，因为7条带都在溴芬兰后面，真是怪，不过实践出真知！你们也试试看！

作者: vera+ 时间: 2013-6-1 15:56

直觉告诉我ZJhan的经验对大家有很大的应用价值，大家可以按其所述试试。因为我用的多肽分子量marker低于6kb的3条带全不见了，但是这些带不会全跑到溴芬兰之前。也是莫名其妙消失了，不过我一直没办法解决。但是我因为跑得是Tricine－SDS－PAGE，时间特别长，要3－5h，所以为我觉得ZJhan的方法可能会解决我的问题。

作者: yjf1026 时间: 2013-6-1 15:58

我们也遇到过这种情况，marker只有3条带，跟别的实验室用的条件和试剂都一样，把别人的marker拿来跑也只出3条带，后来找到原因了，是胶的浓度配稀了，我相信这是主要原因，提高胶的浓度，我想一定会出的。

作者: DONT 时间: 2013-6-1 15:59

我用8%的分离胶跑PARP的活化形式（89 kD）和PARP的酶原（116 kD）,marker只有6条带（正常有10条带），我用的是fermentas 的预染marker 0671，那我是否也可以用12%的胶试试吧？

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)