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标题: 【求助】上清有少量表达，包涵体大量表达.... [打印本页]

作者: 摆渡客 时间: 2013-6-3 16:33 标题: 【求助】上清有少量表达，包涵体大量表达....

最近在做GST融合蛋白表达。先考虑的是可溶表达，跑SDS_PAGE,考马斯亮蓝染色后看不出来，做了WB，发现有目的蛋白表达。又跑了沉淀，目的条带很明显。也就是说，目的蛋白大量表达在包涵体里面，上清里的很少。之后做了很多的优化，包括调整IPTG的量，改变诱导温度和时间（但是没有低温摇床，诱导温度最低只能是室温），改变加诱导剂前菌体OD，目的就是想提高上清蛋白的表达量，但是效果不明显 --------考虑到GST蛋白变性复性的复杂，很纠结，不知道该怎么做----各位大虾遇到这种上清有表达，包涵体也有表达的情况是怎么做的？？？？现在真是纠结的很！还望各位不吝赐教！小女子谢过了！

作者: fei1226com 时间: 2013-6-3 16:35

那就先纯化上清看看,能得到就不做复性,如果不能避免再做.

作者: zhezhe 时间: 2013-6-3 16:35

换载体, 宿主，Tag试试看。

作者: 摆渡客 时间: 2013-6-3 16:41

那就先纯化上清看看,能得到就不做复性,如果不能避免再做.

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我纯化了两次上清，结果都不好。我怀疑是不是我的纯化技术不好？打算再做一次。（不好意思我老是对自己的实验结果没信心，老想重复）
另外，楼主觉得我大量诱导菌体后纯化上清得到目的蛋白的可能性大吗？
谢谢斑竹！

作者: 摆渡客 时间: 2013-6-3 16:41

换载体, 宿主，Tag试试看。

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我也想换载体试试，比如pet载体，但是考虑到GST表达系统表达得到可溶蛋白的可能性更大，而且T7启动子的强度好像比tac启动子高，所以觉得可行性不大----

作者: ladyhuahua 时间: 2013-6-3 16:43

if you just want to get the antibody, you do not need refold.

作者: mickeylin 时间: 2013-6-3 16:43

知音啊，我都停留在这个上面一个月了。我做了不同温度及不同浓度IPTG诱导，但将上清过柱纯化后，SDS-PAGE，染色后只见白板。而沉淀却有较浓的条带。现在正在考虑是否进行包涵体复性呢。
楼主继续加油！

作者: 摆渡客 时间: 2013-6-3 16:45

你想想办法看能不能低温表达吧，不如接摇床试一试
还有就是可以换下菌株，如origami
实在不行的话，复性也不就不需要带GST了，融合GST就是为了可溶表达，既然不行的话，就不带GST，复性更好进行些，可以考虑带His-tag，柱上复性。

作者: memory 时间: 2013-6-3 16:45

个人感觉，如果使用GST的融合蛋白诱导后大量出现于包涵体中，再去摸索减少包涵体的条件不太现实了，我曾经遇到过这样的问题，最后尝试过无数种组合（低温诱导，IPTG浓度梯度，加入蔗糖促进分子伴侣蛋白表达等）后，只能硬着头皮去摸索包涵体的变性复性，做出来才发现其实直接搞定包涵体才是最快捷的方法，但是很多人在遇到包涵体的第一反应却是怎么避免它的出现。

作者: qiangren789 时间: 2013-6-3 16:45

可以换个菌株试试。或者不加IPTG，做个自诱导表达看看。

作者: 摆渡客 时间: 2013-6-3 16:46

你想想办法看能不能低温表达吧，不如接摇床试一试
还有就是可以换下菌株，如origami
实在不行的话，复性也不就不需要带GST了，融合GST就是为了可溶表达，既然不行的话，就不带GST，复性更好进行些，可以考虑带His-tag，柱上复性。

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谢谢你！
请问你说的不带GST是什么意思？换载体吗？我知道带His-tag可以柱上复性，但是貌似也存在很多问题---纠结------

作者: 摆渡客 时间: 2013-6-3 16:47

个人感觉，如果使用GST的融合蛋白诱导后大量出现于包涵体中，再去摸索减少包涵体的条件不太现实了，我曾经遇到过这样的问题，最后尝试过无数种组合（低温诱导，IPTG浓度梯度，加入蔗糖促进分子伴侣蛋白表达等）后，只能硬着头皮去摸索包涵体的变性复性，做出来才发现其实直接搞定包涵体才是最快捷的方法，但是很多人在遇到包涵体的第一反应却是怎么避免它的出现。

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我师姐也说再去摸索条件不现实，但是，就像你说的，我的第一反应也是怎么避免它出现怎么提高上清的表达量。一个是因为GST变性复性后GST本身的空间结构不能保证，也就是可能挂不住，就算GST挂住，后面的蛋白空间结构也不敢肯定。另一个原因是，没有做过包涵体变性复性，总觉得很复杂，心里很胆怯---鄙视一下自己---

作者: memory 时间: 2013-6-3 16:48

我师姐也说再去摸索条件不现实，但是，就像你说的，我的第一反应也是怎么避免它出现怎么提高上清的表达量。一个是因为GST变性复性后GST本身的空间结构不能保证，也就是可能挂不住，就算GST挂住，后面的蛋白空间结构也不敢肯定。另一个原因是，没有做过包涵体变性复性，总觉得很复杂，心里很胆怯---鄙视一下自己---

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大部分人都很担心变性复性后会导致蛋白的空间结构破坏从而导致活性下降甚至没有，其实真是情况并不是我们假想的这样，在合适的条件下绝大部分重组蛋白在先变性后复性后活性的损失是可以忽略不计的。最近刚好在写毕业论文，就直接把我自己用过的变性复性protocol贴出来，欢迎大家讨论。

包涵体的溶解和复性
1、PBS buffer洗涤诱导后菌体，重悬菌体，超声波破碎。
２、４℃，１2０００rpm离心１０分钟，弃上清。
３、用1.5ml Lysis buffer+1%Triton X-100洗涤沉淀，冰上放置10min后12000rpm离心10min去上清。
４、往沉淀中加1.5ml Lysis buffer+0.3%ＳＫＬ（十二烷基肌氨酸钠），洗涤沉淀，使其缓慢溶解，室温静置３０分钟至２小时。
５、４℃，１2０００rpm离心１０分钟，取上清置于透析袋中。
６、依透析袋体积加入若干Refolding buffer稀释上清，４℃透析复性24-48h后取10μl跑胶检测，剩下的样品-２０℃长期保存备用。
7、复性好的重组蛋白过GST树脂纯化即可。

Refolding buffer（TGE buffer）配方（1L）：
Tris-HCL 50mM
EDTA 0.5mM
NaCl 50mM
甘油　　 5%
DTT 0.1mM

说明下：该protocol对应50ml菌液诱导产生的蛋白，所以如果你是1L这样大量诱导的情况，请在包涵体溶解后适当稀释后再入透析袋中透析复性。当然这个条件需要你稍微摸索下，也许不需要稀释即可直接透析。

作者: gemei0115 时间: 2013-6-3 16:49

我曾经有用过十二烷基肌氨酸钠来洗涤包涵体，但是发现目的蛋白也给洗掉以部分，而且发现包涵体后面形状和开始的不一样，所以我认为最好不加这个，我用过很多种复性缓冲液做过比较，发现20mM Tris和20mM Tris 0.2M Arginine pH10.5这两个缓冲液合适很多包涵体复性，有兴趣的不妨试试。最终是将pH10.5用6M HCl调到pH8.0 慢慢的调下来。

作者: memory 时间: 2013-6-3 16:50

我曾经有用过十二烷基肌氨酸钠来洗涤包涵体，但是发现目的蛋白也给洗掉以部分，而且发现包涵体后面形状和开始的不一样，所以我认为最好不加这个，我用过很多种复性缓冲液做过比较，发现20mM Tris和20mM Tris 0.2M Arginine pH10.5这两个缓冲液合适很多包涵体复性，有兴趣的不妨试试。最终是将pH10.5用6M HCl调到pH8.0 慢慢的调下来。

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有两个问题请教下：
1、能详细描述下你用SKL洗涤包涵体后，你说的这种形状的差异是什么吗？是指蛋白少了一部分吗？
2、你说的这个缓冲液里面没有含甘油，最后复性出来蛋白的活性还很高吗？我想请问下你说这个缓冲液适合很多包涵体，你试过多少个蛋白的复性，能将这些蛋白的序列都列出来吗？我还想知道这个复性缓冲液的原始文献出处。谢谢！

作者: ending 时间: 2013-6-3 16:51

能换的条件楼上的说的很全了，俺做了近两年的诱导表达了，最麻烦的一个差不多弄了近一年。你的上清中有表达就能够搞定，实在不行就多摇菌了，大量诱导表达，1L菌的最佳产量大约有10mg了。建议你看看冷泉港的【分子克隆】（下册），细细品，很有收获的~~不妨把里面的原始文章找出来看看，年代有些久了~~最好别变性复性了，最终产量还得看运气，有没活性还说不定~~

作者: 摆渡客 时间: 2013-6-3 16:51

能换的条件楼上的说的很全了，俺做了近两年的诱导表达了，最麻烦的一个差不多弄了近一年。你的上清中有表达就能够搞定，实在不行就多摇菌了，大量诱导表达，1L菌的最佳产量大约有10mg了。建议你看看冷泉港的【分子克隆】（下册），细细品，很有收获的~~不妨把里面的原始文章找出来看看，年代有些久了~~最好别变性复性了，最终产量还得看运气，有没活性还说不定~~

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多摇菌这个方法也试过了，过柱子挂不住。据说GS4B柱子的产量不会因为你多加蛋白而提高，可能是蛋白结构造成的----现在已经在做变性复性了，痛苦-----

作者: ending 时间: 2013-6-3 16:52

多摇菌这个方法也试过了，过柱子挂不住。据说GS4B柱子的产量不会因为你多加蛋白而提高，可能是蛋白结构造成的----现在已经在做变性复性了，痛苦-----

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不改变菌种的情况下，温度和诱导物浓度是调节包涵体量的关键因素，试试~~

作者: tangxin_80 时间: 2013-6-3 16:55

在诱导前加点氯霉素进去,减小表达是否有效??

作者: 摆渡客 时间: 2013-6-3 16:56

不改变菌种的情况下，温度和诱导物浓度是调节包涵体量的关键因素，试试~~

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诱导物浓度改变试过了温度就差16度诱导没有试------

作者: 摆渡客 时间: 2013-6-3 16:56

我曾经有用过十二烷基肌氨酸钠来洗涤包涵体，但是发现目的蛋白也给洗掉以部分，而且发现包涵体后面形状和开始的不一样，所以我认为最好不加这个，我用过很多种复性缓冲液做过比较，发现20mM Tris和20mM Tris 0.2M Arginine pH10.5这两个缓冲液合适很多包涵体复性，有兴趣的不妨试试。最终是将pH10.5用6M HCl调到pH8.0 慢慢的调下来。

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谢谢你。你能把你的复性过程说的详细一点吗？你是同时用了20mM Tris和20mM Tris 0.2M Arginine pH10.5这两种缓冲液？为什么要pH10.5？而且后面还要调到8.0？是按你的目的蛋白的等电点来的吗？

作者: mickeylin 时间: 2013-6-3 16:57

我用的是pet，也是这样，上清的目的蛋白非常少，也用低浓度IPTG，23度诱导了，还是不行，郁闷的要死~~~~~

作者: windy+++ 时间: 2013-6-3 17:00

我尝试了16度，IPTG0.1mm诱导，每3小时取表达产物，然后运用溶菌酶，反复冻融最后超声破菌，SDS-PAGE考染和WESTERN-BLOT后，菌发现上清一点没有目的产物，全部在沉淀里。反复试了几次后，结果一样。所以，我认为，如果是一些很顽固的包涵体，做任何诱导条件的调整都是无益的，唯一解决的办法就是换载体。

作者: avi317 时间: 2013-6-3 17:00

个人觉得，首先看您蛋白是属于哪一类的，所有人报道都是包涵体表达的，而且您做的也基本上是包涵体，那就没有太多的必要去优化条件了；
如果有人报道可以从上清上得到的话，但他得到的数据，获得的量很低的话，个人建议，也不要从上清获得了。他们都是过好多柱子，亲和，离子交换等，从好大的体积里才得到那么一点；个人觉得这个比较费劲，特别是对于蛋白纯化不是很熟练的；
如果上清有个20%的话，个人觉得你可以再优化条件试试，温度比较重要，还有可以尝试下自诱导培养基，要么用乳糖（0.05%）代替IPTG！
祝好运！

作者: 摆渡客 时间: 2013-6-3 17:01

我尝试了16度，IPTG0.1mm诱导，每3小时取表达产物，然后运用溶菌酶，反复冻融最后超声破菌，SDS-PAGE考染和WESTERN-BLOT后，菌发现上清一点没有目的产物，全部在沉淀里。反复试了几次后，结果一样。所以，我认为，如果是一些很顽固的包涵体，做任何诱导条件的调整都是无益的，唯一解决的办法就是换载体。

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现在换了没？

作者: xyw5 时间: 2013-6-3 17:01

我用的是pet，也是这样，上清的目的蛋白非常少，也用低浓度IPTG，23度诱导了，还是不行，郁闷的要死~~~~~

版主啊，我之前的蛋白实在是上清表达太少了，过akta，总峰过后就基本保持基线平了，什么峰也没有，我都要疯了~~~
所以我决定就用包涵体变性复性测酶活了，但是师兄说这样测得的酶活会活性打折，很容易没有活性，是这样么？
另外，如果变性后的蛋白过柱会不会堵柱子呢，我的是1ml的镍柱，不能自己填材料的，如果用滤膜抽滤会不会防止堵呢，那么用0.22的还是0.4的滤膜呢？我只有0.4的，但是听说要用0.22的
多谢版主不吝赐教啊~~~！！！

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过akta，总峰过后就基本保持基线平了，什么峰也没有
这句话看不懂。你应该给出详细的纯化流程。缓冲液的成分等等。点击参考我的签名档提有关纯化问题。
如果肯定上清中有目标蛋白，Ni柱纯化上清是值得尝试的。

包涵体变复性后酶活性如何很难讲，但绝非很容易没有活性。除非你的酶高级结构很复杂。我认为你可以尝试。

变性后溶解的蛋白要离心、过滤、最好再超声后上柱，防止堵塞。0.22的滤膜一般滤不动的，我们通常就是用双层滤纸过滤，它的效果和0.8滤膜差不多。如果能用0.45滤膜过滤一下，更好。你的柱很小，样品量也不多，可以用0.45滤膜。

作者: xyw5 时间: 2013-6-3 17:02

那我再说明的详细点，希望版主在帮我看看啊，附件中是我的SDS-PAGE，最左边的marker，从上往下第3个是43KD，第4个是31KD，从左往右第一泳道为上清样品，第二泳道为沉淀样品，第三泳道为培养基加入3价铁的上清样品，第四道为培养基加入3价铁的沉淀样品（因为该蛋白是螯合fe的金属蛋白，只是试试，看有和变化），明显看出，目的蛋白在沉淀大量表达。

图片附件: 37929007.jpg (2013-6-3 17:02, 35.64 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16621

作者: xyw5 时间: 2013-6-3 17:04

这样的上清蛋白的量同学说太少了，所以很不好过出AKTA

作者: xyw5 时间: 2013-6-3 17:04

我的binging buffer是
10mM Na2HPO4
10mM NaH2PO4
500mM Nacl
30mM Imidazole
ph=7.4

elution buffer
10mM Na2HPO4
10mM NaH2PO4
500mM Nacl
500mM Imidazole
ph=7.4

作者: ukonptp 时间: 2013-6-3 17:05

遇到同样的问题，不过我用的pQE30载体，可以换pet载体试试吗？求解求解，谢谢大家！

作者: abc816 时间: 2013-6-3 17:06

求救蛋白复性！我的蛋白是个膜蛋白，在原核里换了两三个载体，两三个宿主菌，最后换成了一个带GST签的，宿主菌换成origami,结果还是是包涵体，只是感觉包涵体量比较很大，但上清还是没有。其他表达的及个包涵体没带签，考虑纯化问题，现在准备用带GST签这包涵体复性，有人做过GST包涵体复性么，望不吝赐教，小女子做生化很菜，谢谢大虾们了哈。

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