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标题: 【求助】GST融合蛋白纯化 [打印本页]

作者: 人小鬼大 时间: 2013-6-3 17:09 标题: 【求助】GST融合蛋白纯化

大家好，我最近纯化GST融合蛋白，可纯化后融合蛋白很少，杂蛋白却很浓，详见下图。使用的树脂是Pierce Glutathione Agarose，纯化方法是batch method 。采用超声破菌，超声裂解液是50mM Tris, 150mM NaCl, pH 8.0，同时含有1%甘油、0.1%Triton X-100、1mM DTT和1mM PMSF，超声参数是功率500W，超声2S、间歇2S，循环100次，其中超声破碎仪最大功率为1000W。请高手帮忙分析原因，在下感激不尽！

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作者: 98776langtao 时间: 2013-6-3 17:10

1.对比L和FT，你的蛋白应该挂柱成功了，建议跑个Beads看看是不是没洗脱下来。
2.你标记的杂蛋白从分子量看像GST，貌似有GST tag掉落的现象

作者: DNA 时间: 2013-6-3 17:10

树脂已经再生了，只能下次做纯化时留些跑电泳看看。如果是GST标签掉落，是融合蛋白降解所致吗，有什么方法可以避免吗？

作者: zhenxin 时间: 2013-6-3 17:10

会不会是大部分只表达了GST标签后就终止了呢？你的目的蛋白有无什么难表达的序列或是稀有密码子过多？

作者: 人小鬼大 时间: 2013-6-3 17:11

会不会是大部分只表达了GST标签后就终止了呢？你的目的蛋白有无什么难表达的序列或是稀有密码子过多？

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编码序列中有稀有密码子，用的表达菌就是Rosetta

作者: 987789 时间: 2013-6-3 17:12

编码序列中有稀有密码子，用的表达菌就是Rosetta

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Rosetta也不是万能的，我遇到过一些蛋白稀有密码子过多，连Rosetta也无法表达。

作者: 人小鬼大 时间: 2013-6-3 17:13

诱导后在融合蛋白处相对于诱导前多出一条带，另外我做western blot 也证实确有融合蛋白表达，所以应该不是蛋白不表达。我现在的问题是为什么洗脱后杂蛋白比融合蛋白还浓，另外杂蛋白看上去也像GST标签，不知是如何脱落的？

作者: langlang 时间: 2013-6-3 17:13

诱导后在融合蛋白处相对于诱导前多出一条带，另外我做western blot 也证实确有融合蛋白表达，所以应该不是蛋白不表达。我现在的问题是为什么洗脱后杂蛋白比融合蛋白还浓，另外杂蛋白看上去也像GST标签，不知是如何脱落的？

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降解了，破菌时加5mM EDTA应该有改善。

大肠杆菌里金属蛋白酶较多，PMSF没用的

作者: PINK 时间: 2013-6-3 17:14

降解了，破菌时加5mM EDTA应该有改善。

大肠杆菌里金属蛋白酶较多，PMSF没用的

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你的意思是在在超声液里加EDTA?

作者: avi317 时间: 2013-6-3 17:14

你的意思是在在超声液里加EDTA?

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如果过镍柱的话不能加EDTA, 柱子会直接脱镍失效

这也是GST, MBP之类层析的优点

作者: IAM007 时间: 2013-6-3 17:15

GST标签蛋白大概27kD左右，你可以用GST的抗体做一下 western blot鉴别一下再到是不是GST标签，如果是就说明是在表达或者破菌过程出现降解。可以在破军的时候就加入EDTA，看是否是在破菌以后降解。

作者: yjf1026 时间: 2013-6-3 17:15

个人觉得你可以改善的地方：
诱导时的温度可以降低到15度；过夜诱导；
菌的重悬液可以不加tritonX100；
破碎的功率可以降低到300W，超声4S、间歇8S，循环100次；
祝好运！

作者: sunnyB 时间: 2013-6-3 17:16

1.你的蛋白在上清中表达情况看不太清，但GST空标签表达也很好，纯化时也吸附。如果你目的蛋白在上清表达很好，过柱流出也很少，但解离很少，可能目的蛋白已经沉淀在柱子上。按我的经验看，你的蛋白在上清中表达量不高。
2.应该是你的GST融合蛋白比较大，GST标签暴露不好。
3.你的破碎的时候换PBS缓冲液 PH7.4或是Tris 不加150mM氯化钠。
4.对于空标签的去除你可以考虑用其他的离子色谱法，如DEAE。

作者: PCR 时间: 2013-6-3 17:16

楼上的你好：请问换PBS缓冲液 PH7.4或是Tris 不加150mM氯化钠，为什么呢？PH或氯化钠能使其断裂吗？

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