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标题: 【求助】western背景高 [打印本页]

作者: zhihui小新 时间: 2013-6-4 11:46 标题: 【求助】western背景高

各位战友，

最近作western，背景非常高，改变了几个条件，还是不行。
请大家会诊一下。
另外，大家是否碰到过这样的问题？都是如何处理的？
我注意到本版关于背景深的问题有不少战友提出过疑问，希望有经验的战友能够献计献策，指出对可能的原因，提供自己试验中消除背景的具体方法。帮助大家共同进步。

[ 本帖最后由 zhihui小新于 2013-6-4 11:50 编辑 ]

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=16635

作者: zhihui小新 时间: 2013-6-4 11:51

上样蛋白量30 60 100 ug，4度封闭过夜（包括室温下2h＋过夜），一抗室温1h，二抗室温1h, ECL显色结果背景都很深，整个膜都很亮。而目的条带都相对很浅，曝光时间从几s到1min，目的条带都很细。
开始考虑是封闭不好的原因，过夜封闭＋室温2h还不行。
考虑上样量太高了，做了一次预试，发现上样量10ug，看不到目的条带；20ug稍微有点影子；感觉30ug还可以，不能再少了。
考虑缩短抗体孵育时间和浓度。一抗用的是1：1000（santa cruze抗体稀释范围的最大值）；二抗用的是1：10 000。
洗脱时间10min*3次，感觉洗的应该非常干净了。

下一步，我想继续稀释一抗和二抗，上样量保持30ug。
请教有经验战友，有什么建议？
谢谢

作者: wood533 时间: 2013-6-4 11:53

你的ECL工作液孵育完后有没有用吸水纸吸取多余的工作液？你的整个膜都很亮，怀疑是否发光底物液残留太多。
个人觉得你的封闭应该可以（我都用室温2小时），一抗可以试着降低浓度（但你的背景那么高，觉得跟一抗关系不大），二抗1：10000也可以了。漂洗液加Tween了吗？封闭液、稀释液都用含Tween的漂洗液配，有助于降低背景。

作者: zhihui小新 时间: 2013-6-4 11:54

如果洗干净了，ECL工作液是不会发光的。我的工作液不发光。
封闭液和稀释液都含有Tween。
今天又做了一次，明天发光，出了结果再向大家汇报。

作者: wood533 时间: 2013-6-4 11:55

当然不能洗掉ECL工作液啊，只是用吸水纸把多余的吸去。另外，加完HRP-二抗后还是尽量多漂洗，我一般洗4－5次。不过没遇到过你这样高的背景的情况。希望你能找到不一样的原因。

作者: redbutterfly 时间: 2013-6-4 11:59

图文并茂，个人觉得可以是一个值得探讨的问题！所以先给tony1982加了一分。
希望大家能积极参与讨论。

ECL工作液可以用定性滤纸或者吸水力比较强的纸巾完全吸干。

作者: zhihui小新 时间: 2013-6-4 12:03

ECL工作液体之所以发光，是因为二抗孵育后，没有洗干净，还有未结合的二抗与工作液反应显色。但是，如果洗的足够充分的话，工作液在暗室中是看不到的（没有颜色）。
我试过，当5min*3次洗脱时，ECL残留的工作液确实有荧光；但是，当我洗脱10min*3次时候，在暗室中ECL工作液就看不到光了。
请战友们继续讨论

作者: fsdd817 时间: 2013-6-4 12:03

肉眼与胶片。。。

不科学的问一下，是否有数据可以说明他们之间感光程度的差异。。。。google一下呵呵

作者: niangao1980 时间: 2013-6-4 12:05

你用的ECL底物是那个公司的？是GE还是Pierce？
个人认为你可以以30ug作为上样量，但是可继续提高一抗稀释比例（特别是如果你采用的是GE的ECL底物）1：3000，一抗牛奶4度过夜，二抗室温1h，依你的膜大小，考虑加ECL底物300ul-500ul

个人主要认为还是一抗稀释比过低

作者: 831226 时间: 2013-6-4 12:06

我们这里这段时间也出现了这种情况，我们用的一抗是杂交瘤上清，曝光出来也是背景很高，其它的和楼上说的基本相似。也很想搞清楚是什么回事。

作者: abc816 时间: 2013-6-4 12:06

封闭液里建议你家千分之1的吐温试试

作者: jujuba 时间: 2013-6-4 12:06

tween含量过低，封闭液还有tbst洗的时候tween的量不足，你是配成20%的tween然后作的么？我看到有人曾经每次做都吸取100%的纯tween，每次都吸不准，背景很高，再就是二抗浓度太高了也会有背景高的问题

作者: zhihui小新 时间: 2013-6-4 12:07

经过反复的摸索后，还是不行。我换了一个新的抗体，解决了。我觉得应该是原来那个抗体的问题。Santa的抗体有时候确实不好做。我买的时候，试剂公司的人就说了，Santa的抗体药看运气的，他们生产出来后不做检验，直接销售。不过，Santa的确实便宜啊。以前我们买的还可以，这次可能让我碰上了。
谢谢大家的关注和帮助。 ^_^

作者: pencil菲 时间: 2013-6-4 12:08

从图片上看,有类似气泡的区域,没有任何本底的反应.说明应该跟跟曝光的过程无关,排除ECL干扰.
同时泳道颜色均匀的略深,属于系统本底,应该于上样量没啥关系.着重看酶和抗体吧.个人不觉得会是吐温的问题.
抗体和酶重点怀疑,另外,我还会怀疑电泳液和转膜液,或者是转膜用的滤纸反复使用导致的交叉污染.
另外,显影液最好常换,夹子也要经常清洗.
我的经验是,把膜夹在自封袋中放在夹子里曝光,有助于本底降低.

作者: ROSE李 时间: 2013-6-4 12:08

单纯从图片上来看我觉得你可以从以下几个方面改进：
1 一抗是可以稍微在稀释，因为目的条带都是很清晰的，只是有背景而已。
2 我的经验是封闭用5%的脱脂奶粉，而一抗稀释用的是5%BSA的TBST，这样的一个好处是稀释的同时能够用BSA将奶粉没有封闭的位点封闭。
3 其实你肉眼都能看得清楚的荧光是比较强的，这样的话你曝光的时间一定要短，只要十多二十秒就可以，有时候甚至只要几秒就足够了。
4 第四张图片还是可以接受的，你可以再用同样的调件适当优化一下就应该可以做出比较漂亮的图片来的。
祝你好运了！

作者: wsll 时间: 2013-6-4 12:09

最近背景高的western好多呀. 呵呵. 包括我.

两点改进:

1. 牛奶可以用到20% (其实我用过30% , 疯了?, 没有, 我的膜现在就在30% 的牛奶里block着, 不信过来瞧瞧, 呵呵)

2. 继续棋盘式稀释一抗和二抗, 多少倍稀释其实无法与别人的参考, 因为大家条件都不甚相同, 最佳条件还得自己膜呀. 但,,,,, 稀释时要大胆一些, 不要2倍2倍的稀释, 可以以10倍为单位, 或以5倍为单位, 这样较快得到结果.

Good luck!. 一起努力.

作者: abc816 时间: 2013-6-4 12:09

santa的抗体还真叫人汗.......居然还能不检验就出厂，这不是明摆着有浪费大家精力和为数不多的经费的嫌疑嘛。话说，前几天师姐图便宜买了个抗体，单抗乖乖做出8个条带来，更让人郁闷的是想要的条带没有，竟是8条清清楚楚地非特异性条带，当时就让人晕倒了。
我要是做WB背景高，排除了抗体的问题以后，会考虑到封闭液的问题，我习惯用BSA。一般在摸条件的时候，我会做不同浓度的BSA和脱脂奶粉，就我的经验看，往往是BSA的效果好（难道是奶粉里的三氯氰胺在作怪？哈哈，玩笑话），所以现在摸条件我都懒得用奶粉（冒着被老板训斥的危险，呵呵）。封闭的浓度，还有封闭液的种类这些要去仔细的摸，有的抗体吐温加千分之一，有的加千分之五，有的用PBS有的用TBS，有的时候差别还挺大的，以前无聊的时候比较过。还有一个步骤可以降低背景，就是洗完一抗再加二抗之前，用封闭液再封闭10-20分钟，也许会有所改进。
做WB的兄弟姐妹们加油，明天偶要继续做WB

作者: #问号# 时间: 2013-6-4 12:09

检查下试剂看看。

作者: summerxx 时间: 2013-6-4 12:10

我弱弱地问一句,大家的一抗都不回收的吗?
或者,不用的一抗稀释液稀释的一抗,反复用没有问题吗?

作者: summerxx 时间: 2013-6-4 12:11

我上周的实验也出现了背景高的问题,

结果换了一只二抗就解决了问题.

个人觉得,二抗也应该纳入背景高的诱因之一.

作者: yychen 时间: 2013-6-4 12:11

通常要回收一抗吧，毕竟昂贵，用量大，一般稀释后一周内用两三次没问题，再长没试过，估计会变质？毕竟不是无菌条件阿

作者: dog002 时间: 2013-6-4 12:12

这样高而且均匀的背景肯定是二抗的问题，就好好多洗几遍再显色吧，跟稀释比例关系不大的

作者: fsdd817 时间: 2013-6-4 12:13

我们实验室多是用一抗稀释液稀释后，4度保存，一个月内反复使用三次都没有问题。

作者: 89tongzijun 时间: 2013-6-4 12:13

通常要回收一抗吧，毕竟昂贵，用量大，一般稀释后一周内用两三次没问题，再长没试过，估计会变质？毕竟不是无菌条件阿

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可以加叠氮钠防腐，我们实验室效价高的一抗可以用几个月

作者: qiangren789 时间: 2013-6-4 12:14

请问下上面提到的将ECL发光试剂用吸水纸吸干具体是怎么操作的呢？

吸干之后确定不会导致条带灰度下降或者别的什么不良后果嘛？

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