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标题: 【求助】loading buffer [打印本页]

作者: 月牙牙 时间: 2013-6-4 16:58 标题: 【求助】loading buffer

western blot ：目的蛋白分子量120（胞内域）和300（膜蛋白），表达量少，请问裂解培养的细胞可以直接用1*蛋白loading buffer裂解细胞提取蛋白吗，之后的蛋白浓度测定可以直接用紫外分光光度法测吗？这种方法提取蛋白与RIPA裂解液相比有什么优缺点吗？新手求助，如果能有具体的操作步骤更好了，先谢过了。

作者: NBA 时间: 2013-6-4 16:59

满意答案
1.请问裂解培养的细胞可以直接用1*蛋白loading buffer裂解细胞提取蛋白吗
——Loading buffer中含有还原剂，可以还原二硫键使得蛋白变性成为亚基，另外可与蛋白结合使之沉于孔底，易于电泳。另外，其中有变性剂，可以使蛋白变性后不沉淀。

2.之后的蛋白浓度测定可以直接用紫外分光光度法测吗？
——如果要测浓度，一般都是在加入loading buffer 之前先用其它裂解液裂解和测浓度，然后再加X＊loading buffer 变性（X为1~6多见，应根据所测蛋白浓度情况选择，否则可能导致后面电泳上样体积数过大或过小。我们实验室常用3、4、5＊的），混匀，然后90-100℃蒸煮彻底变性。然后再上样电泳、电转.......。直接加了loading buffer 以后的裂解液不能用分光光度计测浓度了。
至于测蛋白浓度的方法很多，我们在实验室那会常用的是马斯亮兰法（Bradford法），提供PPT参考，见附件。还有一些其他的测蛋白浓度的方法，如BCA法等，你可再查查差别和各自优缺点。

3.这种方法提取蛋白与RIPA裂解液相比有什么优缺点吗？
——没有听说用蛋白上样buffer去裂解蛋白的。你根据实验和指标需要，如欲做的是总蛋白、核蛋白或者膜蛋白等选取不同类型和强弱度的RIPA。

作者: 月牙牙 时间: 2013-6-4 17:01

A general protocol for sample preparation is described below.

Treat cells by adding fresh media containing regulator for desired time.
Aspirate media from cultures; wash cells with 1X PBS; aspirate.
Lyse cells by adding 1X SDS sample buffer (100 μl per well of 6-well plate or 500 μl per plate of 10 cm diameter plate). Immediately scrape the cells off the plate and transfer the extract to a microcentrifuge tube. Keep on ice.
Sonicate for 10–15 seconds for complete cell lysis and to shear DNA (to reduce sample viscosity).
Heat a 20 μl sample to 95–100°C for 5 minutes; cool on ice.
Microcentrifuge for 5 minutes.
Load 20 μl onto SDS-PAGE gel (10 cm x 10 cm). NOTE: CST recommends loading prestained molecular weight markers (#7720, 10 μl/lane) to verify electrotransfer and biotinylated protein ladder (#7727, 10 μl/lane) to determine molecular weights.
Electrotransfer to nitrocellulose or PVDF membrane.

这是在CST公司网页上的protocol其中一部分，其中裂解细胞就用1X SDS sample buffer ，我应该没看错吧，这是蛋白loading buffer吧，难道没有人知道吗，但是没有测浓度，不知道怎么蛋白定量，不知道有没人这样做啊，第4步可以省去吗

作者: 月牙牙 时间: 2013-6-4 17:04

因为买他们个抗体，所以想按他们的步骤做，不知道可不可以，有需要调整的吗

作者: JK.jon 时间: 2013-6-4 17:05

以前看到过直接用loading buffer直接裂解细胞的，但是在那之前也多次用RIPA裂解测浓度后摸清条件（比如细胞密度、随后loading buffer用量）再进行的，而且直接裂解时因为DNA链还是比较长的，所以裂解完收集的样品会很粘稠，可以超声一下，意见仅供参考！

作者: ukonptp 时间: 2013-6-4 17:05

不知道你所说的1*蛋白loading buffer裂解细胞的配方是怎么样的，我原来就用过自己配的1*loading buffer裂解细胞，裂解完后很粘稠，然后就直接变性再测浓度，仅供参考，

作者: 月牙牙 时间: 2013-6-4 17:06

谢谢你可以直接测蛋白浓度吗，这样准吗，很粘稠需要特殊处理吗，我的1*蛋白loading buffer，就是买来的loading buffer

作者: 月牙牙 时间: 2013-6-4 17:07

煮完会不会就不粘稠了啊，是用紫外分光测的浓度吗，请赐教啊

作者: am10 时间: 2013-6-4 17:08

我就是1Xloading buffer裂解的，裂解完是粘稠，冰上放置15分钟，然后煮了，离心，很好

作者: 月牙牙 时间: 2013-6-4 17:13

那您怎么进行蛋白定量啊，能否告知啊

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-6-4 17:14

根本不需要定量，你只要确保分细胞的时候，每个dish细胞密度等同就OK了。

作者: applebook=213 时间: 2013-6-4 17:14

那您怎么进行蛋白定量啊，能否告知啊

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考马斯亮蓝法，或者BCA法

作者: lgm 时间: 2013-6-4 17:15

根本不需要定量，你只要确保分细胞的时候，每个dish细胞密度等同就OK了。

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刚铺板的时候是同等细胞密度分的。但是要经过实验处理，比如转染，所以最终的细胞密度可能不一样，这样就可能不是等质量上样了。变性之后还能用BCA测浓度吗？

作者: redbutterfly 时间: 2013-6-4 17:15

可以用考马斯亮蓝法测蛋白量

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