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标题: 【求助】可不可以分次孵育不同的一抗？还有好多个问题。 [打印本页]

作者: zhezhe 时间: 2013-6-5 15:31 标题: 【求助】可不可以分次孵育不同的一抗？还有好多个问题。

Q1可不可以分次孵育不同的一抗？
Q2抗体能不能分装？因为我怕多次冻融抗体失活，但是我老板说量太少了不要分装。那分不分好呢？
Q3加了一抗的牛奶能冰冻保存吗？我想配制好之后分装一半冰冻保存，等第二个星期用。可以吗？
Q4PVDF膜能用铅笔划吗？在对胶的背面，因为样本量不够，要剪开条带测试
Q5测磷酸化蛋白要注意什么

谢谢各位大侠！

作者: yonger 时间: 2013-6-5 15:31

1. 一般是先测一种蛋白，然后洗掉膜上的抗体然后重新上另一种一抗。也有人会把两种一抗混合在一起孵育，我试过效果还可以但是这样抗体没办法回收
2. 一般都是分装的，不过如果量很小而且所有实验都在3个月内完成的话不分装直接放4C也可以
3. 牛奶建议不要冻，一抗怕染菌的话加一点叠氮钠可以放很久（二抗万万不能加）
4. 没有经验，希望其他人说明
5. 不要用奶粉封闭，里面自带大量磷酸化蛋白

作者: zhezhe 时间: 2013-6-5 15:32

Q1可不可以分次孵育不同的一抗？Q2抗体能不能分装？因为我怕多次冻融抗体失活，但是我老板说量太少了不 ...

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Q1的意思是先用种一抗孵育tbst洗三次再用另一种一抗孵育一次。
Q5 我是一直做不出磷酸化的蛋白，加了抑制剂，连总蛋白也没了，好怪。

作者: zhezhe 时间: 2013-6-5 15:32

1. 一般是先测一种蛋白，然后洗掉膜上的抗体然后重新上另一种一抗。也有人会把两种一抗混合在一起孵育，我试过效果还可以但是这样抗体没办法回收
2. 一般都是分装的，不过如果量很小而且所有实验都在3个月内完成的话不分装直接放4C也可以
3. 牛奶建议不要冻，一抗怕染菌的话加一点叠氮钠可以放很久（二抗万万不能加）
4. 没有经验，希望其他人说明
5. 不要用奶粉封闭，里面自带大量磷酸化蛋白

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谢谢前辈。
请问叠氮钠需要加多少量呢？
另外请问前辈，不用奶粉封闭是不是直接加用TBST的一抗孵育？不需要先牛奶封闭1小时+一抗孵育过夜？因为我的一抗是用加在5%脱脂奶里面的。

哇！谢谢前辈！
我用的是pierce 的Restore Western Blot Stripping Buffer。

Wash blot to remove chemiluminescent substrate
Incubate blot in Restore Western Blot Stripping Buffer for 5 to 15 minutes at room temperature
(or incubate at 37°C for high-affinity antibodies)
Remove blot and wash in Wash Buffer
Block membrane
Test for sufficient removal of antibodies
Perform next immunoblot experiment

and stripping的效果非常不稳定，试过三次，都是十分钟，室温，第一次洗到一抗再也孵不上，第二次刚刚好，第三次洗不够。晕死了。我是这样做测试的洗完之后显色液/二抗-显色液/一抗-二抗-显色液，分别看二抗、一抗、抗原的情况。第一次是摇床，第二第三次是刷羊肉一样洗。

[ 本帖最后由 zhezhe 于 2013-6-5 15:34 编辑 ]

作者: luoliqiong 时间: 2013-6-5 15:33

谢谢前辈。
请问叠氮钠需要加多少量呢？
另外请问前辈，不用奶粉封闭是不是直接加用TBST的一抗孵育？不需要先牛奶封闭1小时+一抗孵育过夜？因为我的一抗是用加在5%脱脂奶里面的。

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叠氮钠一般加0.02%就可以了，一抗有叠氮钠的情况下洗膜时间要加倍，防止残留的NaN3导致二抗失活
奶粉里有磷酸化蛋白（主要是磷酸酪氨酸）和磷酸酶, 前者会提高背景，后者会减弱原本的信号，所以不要用
可以试试5%BSA封闭1小时后用TBST冲一下，加一抗过夜

作者: luoliqiong 时间: 2013-6-5 15:33

Q1的意思是先用种一抗孵育tbst洗三次再用另一种一抗孵育一次。
Q5 我是一直做不出磷酸化的蛋白，加了抑制剂，连总蛋白也没了，好怪。

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没有这样做过，因为抗体/封闭之间是一个竞争的关系，时间长了估计原本的信号也没了。一般为了求快也就是剪膜或者两种一抗同时孵育。最稳妥的方式还是Strip后重新上一抗

作者: luoliqiong 时间: 2013-6-5 15:34

QUOTE:

原帖由 luoliqiong 于 2013-6-5 15:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
Q1的意思是先用种一抗孵育tbst洗三次再用另一种一抗孵育一次。
Q5 我是一直做不出磷酸化的蛋白，加了抑制剂，连总蛋白也没了，好怪。

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pierce的3432洗脱液？你看看MSDS就知道成分是酸性甘氨酸+TCEP，洗不干净是正常的。大部份文献里做wb用的洗脱液是2% SDS，55度孵育。可以洗得很干净但是抗原损失较多

我常用的的PVDF抗体洗脱液配方是
6M 盐酸胍
0.2% tween20
50mM tris ph 7.5
用之前加硫代乙醇到100mM，室温摇床洗15分钟。洗的时候膜会变透明。TBST洗三次到没有硫磺味道为止就可以了

作者: zhezhe 时间: 2013-6-5 15:35

QUOTE:

原帖由 luoliqiong 于 2013-6-5 15:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

pierce的3432洗脱液？你看看MSDS就知道成分是酸性甘氨酸+TCEP，洗不干净是正常的。大部份文献里做wb用的洗脱液是2% SDS，55度孵育。可以洗得很干净但是抗原损失较多

我常用的的PVDF抗体洗脱液配方是
6M 盐酸胍
0.2% twee ...

用之前加硫代乙醇到100mM？不明白。另外，需要针对不同抗体调整洗脱时间和温度吗？

作者: luoliqiong 时间: 2013-6-5 15:37

QUOTE:

原帖由 zhezhe 于 2013-6-5 15:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

用之前加硫代乙醇到100mM？不明白。另外，需要针对不同抗体调整洗脱时间和温度吗？

就是巯基乙醇，原液一般是13M。因为需要避光保存而且容易挥发所以洗膜之前加在洗脱液里就好了

推荐室温操作，如果信号很强可以稍微延长一些时间

作者: zhezhe 时间: 2013-6-5 15:49

QUOTE:

原帖由 luoliqiong 于 2013-6-5 15:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

就是巯基乙醇，原液一般是13M。因为需要避光保存而且容易挥发所以洗膜之前加在洗脱液里就好了

推荐室温操作，如果信号很强可以稍微延长一些时间 ...

我用的是pierce的21059的洗脱液，成分查不到。
按前辈的配方就是下面这样配成100ml？
95.53*6/10=57.318g 盐酸胍
200ul tween-20
121.14*50/1000=6.057g Tris
62.13/13*0.1=0.247m l硫代乙醇

现在我改用5%BSA+TBST的blocking buffer和一抗，pH值应该在10.0左右。
那我想问洗脱液需要pH7.5吗？因为我看别人的pH有很多种。

作者: luoliqiong 时间: 2013-6-5 15:51

现在我改用5%BSA+TBST的blocking buffer和一抗，pH值应该在10.0左右。
那我想问洗脱液需要pH7.5吗？因为我看别人的pH有很多种。

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中性比较好，pH太高或者太低可能损伤抗原

作者: zhezhe 时间: 2013-6-5 15:52

QUOTE:

原帖由 luoliqiong 于 2013-6-5 15:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
现在我改用5%BSA+TBST的blocking buffer和一抗，pH值应该在10.0左右。
那我想问洗脱液需要pH7.5吗？因为我看别人的pH有很多种。

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中性比较好，pH太高或者太低可能损伤抗原 ...

请教大虾，不知道为什么我的蛋白样本lyn在没加酶抑制剂的时候可以显示出来，但是加了酶抑制剂之后却没有了，而内参beta-actin却可以显示出来。
因为我老板说可以不加酶抑制剂，他买酶抑制只是备用。因为我用的loading buffer能裂解细胞，不用ripa，裂解细胞之后直接就加热了。

提蛋白如果是直接加loading buffer煮沸提取，则不能测蛋白的浓度，无法较好地定量。
其实裂解之后不是加热变性了么？酶活性还有吗？
因为用的是不同批次的细胞，beta-actin密度都差不多，能显示出来的第一次lyn的量也是挺多的，跟beta-actin差不多。所以就想不明白了，因为同一批wb，也就是第二次，其他像是syk、shp、CD32b这样的蛋白也是一丁点都没有，都是用说明书上说的用BSA新配的一抗和封闭液。

作者: ROSE李 时间: 2013-6-5 15:52

貌似没有人回答问题4...
那我来回答吧。
如果，你的眼神够好，铅笔磨的够细，你甚至可以在膜上画画...
不要画到蛋白条带上即可，对实验无影响。
另：请在封闭之前，即转膜完后“作画”。

作者: luoliqiong 时间: 2013-6-5 15:53

QUOTE:

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请教大虾，不知道为什么我的蛋白样本lyn在没加酶抑制剂的时候可以显示出来，但是加了酶抑制剂之后却没有了，而内参beta-actin却可以显示出来。
因为我老板说可以不加酶抑制剂，他买酶抑制只是备用。因为我用的loading buff ...

你用的是什么酶抑制剂？一般来说肯定是要加的，因为细胞加到上样缓冲里加热到蛋白酶彻底失活中间怎么也要几分钟时间，某些丰度不高的蛋白可能直接就没了

还有要注意的是样品不能太复杂，否则大小类似的蛋白会相互干扰，加大上样量也没用。裂解不充分的话和DNA结合的蛋白被核酸包被，也容易出现异常。建议你用ripa裂解后超声或者反复抽吸，感觉样品不是很粘稠后高速离心15min取上清跑胶。

作者: zhezhe 时间: 2013-6-5 15:54

貌似没有人回答问题4...
那我来回答吧。
如果，你的眼神够好，铅笔磨的够细，你甚至可以在膜上画画...
不要画到蛋白条带上即可，对实验无影响。
另：请在封闭之前，即转膜完后“作画”。

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答案是性的..........但是那个PVDF膜有点厚度，铅笔画下去之后就凹下去了，其实我是想把条带从中间分开的，而不是条带间

作者: zhezhe 时间: 2013-6-5 15:54

你用的是什么酶抑制剂？一般来说肯定是要加的，因为细胞加到上样缓冲里加热到蛋白酶彻底失活中间怎么也要几分钟时间，某些丰度不高的蛋白可能直接就没了

还有要注意的是样品不能太复杂，否则大小类似的蛋白会相互干扰，加大上样量也没用。裂解不充分的话和DNA结合的蛋白被核酸包被，也容易出现异常。建议你用ripa裂解后超声或者反复抽吸，感觉样品不是很粘稠后高速离心15min取上清跑胶。

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用的是calbiochem的，
磷酸酶抑制剂是#524625：咪唑200mM，氟化钠100mM，钼酸钠115mM，钒酸钠100mM，酒石酸钠400mM，稀释100倍用。
蛋白酶抑制剂是#539134：AEBSF，Aprotinin，bestatin，E64，leupeptin，pepstatinA，

RIPA是thermo的#89900 1X的，还没用，之前一直使用CST的blue loading buffer碎细胞，稀释到1X来碎细胞。

CellSignaling T的 blue loading buffer
3X Blue Loading Buffer Pack: 187.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 at 25?C), 6% (w/v) SDS, 30% glycerol and 0.03% (w/v) bromophenol blue. (Store at room temperature.)

30X Reducing Agent: 1.25 M dithiothreitol (DTT) (Store at -20?C.)

因为之前觉得温度高了些没什么的，也觉得保持低温挺难。
没有4度吊篮离心机，只有1.5mlEP的4°离心机。-70°冰箱的雪花，用来不知道能不能用一下。
按理说应该是细胞裂解之后才要保持低温的吧？请教您有什么好方法呢？

因为做的是人的B细胞，样本量很少，能有个5*10^6算不错了。每次离心之后大概都会（回流）留下180ul的液体在15ml离心管底，不一定有沉淀，但是那一丁点液体的细胞非常多，就是离心离不下去，我想直接加PPI/PI和10X的RIPA进去，然后放到制冰机/-20度冰箱里面裂解10min，不知道行不行。但是10X的RIPA，我没有。有些试剂也没有。

目标蛋白本事一个是BCR在膜上，之前的blue loading buffer好像还可以，量还挺丰富的，也就这样吧可能是SDS厉害。
两个是蛋白的激酶。
一个是蛋白磷酸酶，就怕这个会被酶抑制剂搞坏了。

作者: luoliqiong 时间: 2013-6-5 15:55

用的是calbiochem的，
磷酸酶抑制剂是#524625：咪唑200mM，氟化钠100mM，钼酸钠115mM，钒酸钠100mM，酒石酸钠400mM，稀释100倍用。
蛋白酶抑制剂是#539134：AEBSF，Aprotinin，bestatin，E64，leupeptin，pepstatinA，

RIPA是thermo的#89900 1X的，还没用，之前一直使用CST的blue loading buffer碎细胞，稀释到1X来碎细胞。

CellSignaling T的 blue loading buffer
3X Blue Loading Buffer Pack: 187.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 at 25?C), 6% (w/v) SDS, 30% glycerol and 0.03% (w/v) bromophenol blue. (Store at room temperature.)

30X Reducing Agent: 1.25 M dithiothreitol (DTT) (Store at -20?C.)

因为之前觉得温度高了些没什么的，也觉得保持低温挺难。
没有4度吊篮离心机，只有1.5mlEP的4°离心机。-70°冰箱的雪花，用来不知道能不能用一下。
按理说应该是细胞裂解之后才要保持低温的吧？请教您有什么好方法呢？

因为做的是人的B细胞，样本量很少，能有个5*10^6算不错了。每次离心之后大概都会（回流）留下180ul的液体在15ml离心管底，不一定有沉淀，但是那一丁点液体的细胞非常多，就是离心离不下去，我想直接加PPI/PI和10X的RIPA进去，然后放到制冰机/-20度冰箱里面裂解10min，不知道行不行。但是10X的RIPA，我没有。有些试剂也没有。

目标蛋白本事一个是BCR在膜上，之前的blue loading buffer好像还可以，量还挺丰富的，也就这样吧可能是SDS厉害。
两个是蛋白的激酶。
一个是蛋白磷酸酶，就怕这个会被酶抑制剂搞坏了。

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http://www.cellsignal.com/products/9803.html
看上面那个CST的操作手册

如果是贴壁细胞的话一般是直接加1xRIPA然后刮取，非贴壁细胞则是离心后每10^7个细胞加400ul裂解液。
细胞太少的话15ml离心确实很难沉下去，可以考虑多装几个1.5ml小管

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