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标题: 【求助】动物组织蛋白提取方法 [打印本页]

作者: linlinstar 时间: 2013-6-8 09:02 标题: 【求助】动物组织蛋白提取方法

我是个初学者，准备开始提蛋白了，查了一些资料，但心里实在忐忑不安，没有把握。以下是我的裂解液配方及操作步骤，不知妥否，请各位大侠点评，以便改进。
裂解液配方：
尿素：8M
CHAPS:4%
DTT:65mM(现加）
PMSF:1mM(现加）
MiliQ 水
操作步骤：
取300mg样品在液氮环境下研磨，加入1ml裂解液混匀，室温静置1小时，15000g离心1小时，取上清测定蛋白质浓度。
（实验还没开始做，有几个疑问：裂解液中没有IPG buffer可以么？样品与裂解液的比例合适么？这个配方和处理对于肝脏和肌肉组织都适用么？这样提取的蛋白质大概有多大浓度？）
谢谢！

顶啊！

作者: kulee 时间: 2013-6-8 09:03

裂解液中没有IPG buffer可以么？
（可以的，最后上胶条的时候可以再加）
不过，我觉得液氮研磨以后，最好是粗离心一下，把一些结缔组织给离心掉（150g既可）然后再加裂解液。裂解液加1ML应该没什么问题，主要取决你以后蛋白的浓度。用这个方法最好经丙酮沉淀一次比较好）

作者: abc816 时间: 2013-6-8 09:03

把室温1h静置改成匀浆速度快些，对蛋白也有好处。

我们都是这么做的，效果还行。

作者: qhyu 时间: 2013-6-8 09:03

我是个初学者，准备开始提蛋白了，查了一些资料，但心里实在忐忑不安，没有把握。以下是我的裂解液配方及操作步骤，不知妥否，请各位大侠点评，以便改进。
（实验还没开始做，有几个疑问：裂解液中没有IPG buffer可以么？样品与裂解液的比例合适么？这个配方和处理对于肝脏和肌肉组织都适用么？这样提取的蛋白质大概有多大浓度？）

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具体的裂解条件还需要您自己去摸索
在裂解液中加IPG buffer有两个作用:1,增强蛋白质的溶解性2,可以结合核酸,在沉淀的时候予以除去。建议最好加，浓度从0.5-2%不等（这取决于您样品蛋白质的难溶程度）

作者: bring 时间: 2013-6-8 09:04

冷冻桥隧

作者: bring 时间: 2013-6-8 09:06

相关疾病：
动脉粥样硬化
刚才搞错了
组织中脂蛋白测定

从组织中提取载脂蛋白和脂蛋白可采用冰组织培养液或磷酸缓冲液盐水灌注整体动物, 可避免组织被血浆蛋白质或血浆脂蛋白污染。将一根导管插入已麻醉的动物心脏左心室, 切断下腔静脉, 用培养液充分灌注动物(小鼠至少用250ml)至流出液中已无血液。当血液被清除后, 肝脏变化较亮的颜色。灌注后组织提取方法依所需要的是完整脂蛋白或是载脂蛋白而定。

一、完整脂蛋白提取

必须十分小心, 以确保脂蛋白不变性或结构不改变。脂蛋白是从组织中过滤入冰冻的提取缓冲液中, 缓冲液(2.05%Tris-HCl、0.88%NaCl、0.05%EDTA, pH7.4)含有蛋白酶抑制剂而不含去垢剂。该方法可用来从正常的和再生的神经组织是或从动脉粥样硬化斑块中提取完整的脂蛋白。先将组织切成小碎片, 然后用含蛋白酶抑制剂的缓冲液(10-20ml/每克组织)进行孵育, 缓冲液中加有防腐剂(每100ml中含0.13克E-氨基已酸、2mg 氯霉素、0.2mg leupeptin、0.01ml aproteinin、2.4mg胰肽酶A、50000单位青霉素G和5mg硫酸链霉素)。获得最多提取物的时间是由经验决定的。用固体KBr使溶液密度提高至1.21g/ml, 以使脂蛋白浓缩, 然后超速离心使脂蛋白分离。

二、载脂蛋白的提取

在有去垢剂存在下, 使组织成为匀浆, 以获取细胞内和细胞间的载脂蛋白。如果提取物直接用凝胶进行分离和Western印迹分析, 则可用SDS-PAGE样本工作缓冲液进行灌注后, 并使动物组织匀浆, 然后低速离心, 分析上层清液中的载脂蛋白。但是, 在分析前常常使用免疫沉淀的方法, 使待测蛋白质沉淀。这时, 可用含去垢剂的缓冲液(50mM Tris-HCl, pH8.5, 120mM NaCl和0.5%Noneidet-P40)进行组织匀浆(10ml/每克组织), 离心100000g, 用免疫沉淀法使上层清液中的载脂蛋白沉淀。从组织中提取的脂蛋白和载脂蛋白需要进一步进行分离和分析, 可采用超速离心、层析、电泳等方法, 这与分离和分析血浆中的脂蛋白和载脂蛋白基本相同, 可参考本书前面的有关介绍。转发：cuturl('http://www.chinalipid.com/measure/45.htm')

作者: JK.jon 时间: 2013-6-8 09:07

建议最好加完裂解液后再用超声波破碎，我做肝脏蛋白提取时一般采取400W工作10秒，间歇10秒，次数15次，一次结束后大约30分钟再重复上述步骤一次（因为不同的样品用一根超声柱子，可能会导致污染，所以一定要用双蒸水冲洗干净，再用70%乙醇洗一下，再用水洗一次），另外样品超声时要置于冰浴中，以免产热

作者: u234 时间: 2013-6-8 09:07

我也是一名初学者，我将要做的是大鼠脑膜蛋白的抽提。我拿到的裂解液的配方如下:
1% SDS
40 mM Tris
65 mM DTT(现加）
ddH2O
而且在匀浆后，似乎还需要加入50ug/ml RNase和200ug/ml DNase,在4℃ 放置15min;15000离心1h.取上清。
我想请诸位高手指点一下，上面的配方和步骤中有无欠妥之处。谢谢！

作者: DDD 时间: 2013-6-8 09:09

我也是一名初学者，我将要做的是大鼠脑膜蛋白的抽提。我拿到的裂解液的配方如下:
1% SDS
40 mM Tris
65 mM DTT(现加）
ddH2O
而且在匀浆后，似乎还需要加入50ug/ml RNase和200ug/ml DNase,在4℃ 放置15min;15000离心1h.取上清。
我想请诸位高手指点一下，上面的配方和步骤中有无欠妥之处。谢谢！

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你的配方较适合水溶性蛋白的提取。8M尿素的加入能使膜蛋白更多地溶解，现在很多文献提倡用7M尿素，2M硫脲提取膜蛋白。另外CHAPS、TritonX100、NP40等去垢剂的使用是否也要考虑？
还有提取蛋白以后的下一步将做什么也很重要，如果是做IEF则最好不要用SDS，这会影响等电点，如果还要做DIGE的话，在标记荧光以前不能加DTT，标好后可以加。

作者: sunnyB 时间: 2013-6-8 09:10

建议最好加完裂解液后再用超声波破碎，我做肝脏蛋白提取时一般采取400W工作10秒，间歇10秒，次数15次，一次结束后大约30分钟再重复上述步骤一次（因为不同的样品用一根超声柱子，可能会导致污染，所以一定要用双蒸水冲洗干净，再用70%乙醇洗一下，再用水洗一次），另外样品超声时要置于冰浴中，以免产热

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请问一下你的肝脏蛋白的详细提取步骤，我现在也在做肝脏2d，效果不是很好。

作者: DDD 时间: 2013-6-8 09:10

请问一下你的肝脏蛋白的详细提取步骤，我现在也在做肝脏2d，效果不是很好。

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我做的是大鼠的肝脏
1 断头处死大鼠，（尽量让血液流掉多些），取5克肝脏，冰生理盐水洗2 次
2 将肝脏用剪刀煎碎，倒入MSHE（0.22M甘露醇，0.07M蔗糖，0.5Mmegta，0.1%BSA,2Mm Hepes/KOH PH7.4），用玻璃匀浆器匀浆（冰上进行）后，加入3倍体积的Lysis buffer(30mM Tris,7M Urea,2M Thiourea,4%CHAPS(W/V),PH8.5)裂解2小时
3 期间超声裂解2次，每次工作10秒，间歇10秒，工作次数15次（冰浴）
4 12000rpm，4度，离心30分钟取上清

这个是我们实验室的提取方法，你们具体条件需要根据自己实验室情况再摸索，希望对你有帮助。

作者: gemei0115 时间: 2013-6-8 09:11

我做的是大鼠的肝脏
1 断头处死大鼠，（尽量让血液流掉多些），取5克肝脏，冰生理盐水洗2 次
2 将肝脏用剪刀煎碎，倒入MSHE（0.22M甘露醇，0.07M蔗糖，0.5Mmegta，0.1%BSA,2Mm Hepes/KOH PH7.4），用玻璃匀浆器匀浆（冰上进行）后，加入3倍体积的Lysis buffer(30mM Tris,7M Urea,2M Thiourea,4%CHAPS(W/V),PH8.5)裂解2小时
3 期间超声裂解2次，每次工作10秒，间歇10秒，工作次数15次（冰浴）
4 12000rpm，4度，离心30分钟取上清

这个是我们实验室的提取方法，你们具体条件需要根据自己实验室情况再摸索，希望对你有帮助。

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请问一下MSHE中的megta、hepes是什么东西？匀浆加MSHE有什么作用？

作者: DDD 时间: 2013-6-8 09:13

请问一下MSHE中的megta、hepes是什么东西？匀浆加MSHE有什么作用？

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哦，不好意思，是0.5mM EGTA，金属酶抑制剂，HEPES是一种缓冲剂。MSHE实际上是一种缓冲介质，有人用TRIS-HCL，PH7.4缓冲液也可以

作者: ending 时间: 2013-6-8 09:15

请问一下MSHE中的megta、hepes是什么东西？匀浆加MSHE有什么作用？

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请问加BSA有什么用？不会增加要提取蛋白的杂质量吗？另外组织重量和裂解液之间的比例大概是多少比较好？

作者: wmp1234 时间: 2013-6-8 09:15

我提的也是肝脏组织蛋白，不过提出来的蛋白中混有太多血液，怎么处理呢？谢谢

作者: 2541 时间: 2013-6-8 09:15

用PBS洗几次

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