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标题: 【求助】纯化his-tag蛋白的镍柱可以永久性再生吗 [打印本页]

作者: 小游abc 时间: 2013-6-8 16:23 标题: 【求助】纯化his-tag蛋白的镍柱可以永久性再生吗

纯化his-tag蛋白的镍柱可以永久性再生吗？如果不能够，大概能够用多少次呢？

几丁质层析柱大家都是用5次就重新换填料吗？

作者: tie8 时间: 2013-6-8 16:23

任何纯化填料都不可能永久再生。使用次数与柱的种类、你的样品原料性质、再生方法、操作细节习惯以及纯化的要求相关，没有确定的说法。但可以肯定的是，IDA类型的镍柱（如Chelating Sepharose FF）是比较耐用的，注意再生操作的话用个100-200次没有问题。NTA类型的镍柱在使用还原剂的条件下，镍脱落较多，再生后不能达到初始效果，使用次数要少很多很多。

作者: 49888 时间: 2013-6-8 16:24

现在的Ni-NTA柱子都很便宜，不用太在意的。

作者: 9900 时间: 2013-6-8 16:26

NTA螯合四价，IDA螯合三价，NTA的稳定性要更好一些吧。

作者: 04906 时间: 2013-6-8 16:28

现在的Ni-NTA柱子都很便宜，不用太在意的。

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是的，现在的柱子都不贵。要拿到好的结果，完全不用太在意。

作者: 04906 时间: 2013-6-8 16:29

NTA螯合四价，IDA螯合三价，NTA的稳定性要更好一些吧。

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IDA不能用还原剂，NTA可以用还原剂，我说的是在用还原剂条件下的NTA和不用还原剂的IDA比较。IDA可以很方便的脱镍再生，NTA不可以。NTA脱镍后再挂镍就不耐还原剂了，NTA生产商是怎么做到挂镍后耐还原剂的，没人说。我们的版助是做填料的大师，如果不是涉及到商业秘密他早就告诉大家了。

作者: 小游abc 时间: 2013-6-8 16:29

填料很贵啊。几丁质珠填料(279元/10ml)只能够提5次蛋白；而25ml NI-NTA都在2600元以上。

作者: remenb 时间: 2013-6-8 16:30

NTA的可以照分子克隆上的去再生，效果挺好，当然肯定不会是永久性的，不过这样可以用不少次，当然得到好的实验结果更重要，改换新的就换新的。

作者: summerxx 时间: 2013-6-8 16:30

填料很贵啊。几丁质珠填料(279元/10ml)只能够提5次蛋白；而25ml NI-NTA都在2600元以上。

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Ni-NTA的柱子GE的预装柱HisTrap FF 1 mlX5也就$130，我一年多用了两个，效果还非常好的。

Chitin的填料没用过。

作者: 131415 时间: 2013-6-8 16:31

IDA不能用还原剂，NTA可以用还原剂，我说的是在用还原剂条件下的NTA和不用还原剂的IDA比较。IDA可以很方便的脱镍再生，NTA不可以。NTA脱镍后再挂镍就不耐还原剂了，NTA生产商是怎么做到挂镍后耐还原剂的，没人说。我们的版助是做填料的大师，如果不是涉及到商业秘密他早就告诉大家了。

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请问如果两者都是在不用还原剂的条件下哪个更稳定呢？谢谢

作者: zhezhe 时间: 2013-6-8 16:31

请问如果两者都是在不用还原剂的条件下哪个更稳定呢？谢谢

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毫无疑问，无论是理论上还是实践上，在鳌合镍方面都是NTA比IDA稳定。而且很多时候NTA纯化的效果都比IDA要好一些。

但是如果都不用还原剂的话，我肯定是选择IDA，而不是NTA。

原因有三个方面
1、价格，相差有3-4倍吧。
2、再生性能，IDA柱反复再生个几百次都没问题。
3、载量，可能有成倍的差异。

作者: 9900 时间: 2013-6-8 16:32

IDA柱耐还原剂及特异性完全可换成钴离子改善,这时候多大浓度的还原剂都不成问题.

作者: 小游abc 时间: 2013-6-8 16:33

呵呵，楼上大师出手了。

钴离子我试过一次，但是完全不成功。我把我的程序讲一讲，还请韦兄指点。

1、填料chelating Sepharose FF， GE，国产16/20柱，20ml装胶量，多次使用过旧胶，20%乙醇保存，AKTA explorer 100。
2、水洗：去离子水洗大于5个柱体积
3、脱镍：50mM EDTA.2Na水溶液，至柱完全变白，电导和pH稳定
4、水洗：去离子水洗至电导近为0ms/cn，pH稳定
5、再生：0.5N NaOH洗柱至紫外280、260均回归基线
6、水洗：去离子水洗至电导近为0ms/cn，pH基本在中性偏碱
7、挂钴离子：100mM CoCl2水溶液，大于5个柱体积
8、水洗：去离子水洗至电导近为0ms/cn，pH基本在5-6
9、平衡：pH8.0,20mMPB,0.5NNaCl,40mM咪唑至柱完全变颜色，紫外280小峰过，电导和pH与bypass缓冲液完全相同
10、还原：新配制1mM DTT加平衡缓冲液，溶液一进入柱中，填料立即变色，流出液有钴离子沉淀及深色
11、拆柱，烧杯倒出填料，加20乙醇，4度放置，大约有4-5个月了，还是深深的钴离子沉淀颜色

这个程序基本是按说明书做的，只是常用的硫酸镍改成了氯化钴，再就是加了DTT。
不知道问题出在哪儿，请韦兄指点一下，为什么我用钴离子也是不耐还原剂的？

作者: star#room 时间: 2013-6-8 16:33

我也不是大师,钴离子我记得用的是硫酸钴,是粉色的,理论上钴离子已经是最低价,不会被还原的,我记得曾经用巯基乙醇和半胱氨酸试过,当时没怎么调pH,你可用巯基乙醇试试,此外pH调到7点多试试.此外所用填料是我们自己的镍琼脂糖凝胶,进口的我没试过.可参考下面的文件,说明书上写30mM巯基乙醇内没问题,大多样品浓度用5mM左右应该足够,毕竟蛋白浓度没那么高,不需要太大浓度的还原剂.

理论上来说镍柱如果合成的对,那配基是不会脱落的,镍离子就可以反复固定,其实填料有时配基脱落是填料本身设计时化学键不牢固造成的,这样通常按说明书做可延长寿命,另外主要是杂质包裹导致失效,可再生能恢复,还有一种情况是填料本身如琼脂糖凝胶分解或断裂导致失效.的确IDA三百次左右是完全没问题的,但是需要有效清洗.而特异性可通过洗脱和改变吸附条件一样能达到NTA的效果,此外NTA理论上也不会不能反复用,只是再生没解决好而已.通常情况下个人觉得IDA已经足够,如果需要特异性好点,那就牺牲载量,这样作用力弱,对一些本身作用力弱的蛋白可能会挂不上.所以可把IDA上挂钴离子,这样作用力弱了,背景会更干净,但是载量是肯定会下降的.

作者: utt0989 时间: 2013-6-8 16:34

硫酸钴还是CoCl2，我买过，很容易潮解和“冒烟”

至今被我冷落在哪个不知名的实验台柜子的底层了

作者: 小游abc 时间: 2013-6-8 16:34

但从产品说明上看clontech的介质也是NTA类型的，与这里讨论的IDA耐还原剂问题有差别。是否IDA挂上Co离子就可以耐还原剂仍然是个谜。我做失败了，chromatography做成功过，唉，不知我的程序错在哪儿。

作者: 小游abc 时间: 2013-6-8 16:34

上面一个图是clontech的，下面一个图是qiagen的Ni-NTA，配基作用相同。

作者: bluelake 时间: 2013-6-8 16:35

clontech的介质不是NTA类型的，是CM-ASP类型的。和NTA一样都是螯合四价的。CM-ASP比NTA具有更好的特异性，基本没有非特异性的吸附。
最近，clontech还推出了IDA的树脂。结合能力达到惊人的60mg/ml，名字就叫作His60 Ni Superflow。
其实，clontech的介质要比NTA便宜15%左右！
大家不妨关注一下。
cuturl('http://www.clontech.com/products/detail.asp?product_family_id=1424&product_group_id=1459&product_id=212698')

作者: memory 时间: 2013-6-8 16:35

QUOTE:

原帖由 bluelake 于 2013-6-8 16:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

clontech的介质不是NTA类型的，是CM-ASP类型的。和NTA一样都是螯合四价的。CM-ASP比NTA具有更好的特异性，基本没有非特异性的吸附。
最近，clontech还推出了IDA的树脂。结合能力达到惊人的60mg/ml，名字就叫作His60 Ni Supe ...

个人觉得都是四价螯合,所以CM-ASP类型和NTA没本质区别.而60mg/ml这不难达到,只是个别蛋白或动态吸附载量.有时间我再做钴离子的试试,详细情况到时候告诉大家,CM-ASP类型的不是很难合成.钴离子的理论上在IDA上应该也不容易被还原,至少我做的是这样.

作者: 小游abc 时间: 2013-6-8 16:36

QUOTE:

多谢指点。当时比较了一下两者鳌合镍的方式，都是三个羧基一个N原子，就认为是相同的，鲁莽了。二者在其中一个羧基的位置上有差异。

但这些都不能解释IDA与还原剂是否兼容的问题。

作者: zwsyrt 时间: 2013-6-8 16:36

关于还原剂是否兼容的问题，我的观点：
1.钴和镍肯定会被还原的，或多或少，还要看还原剂的类型和浓度。
2.做一次纯化，发现介质没有变色就断定兼容是不科学的。怎么得有浓度的梯度试验，再加上时间的试验吧。
3.能纯化出来就可以了吧，一定要争出是否兼容没啥意义。退一步讲，介质被还原了，但是蛋白已经纯化出来了，那目的不也达到了吗。

作为抛砖引玉吧。

作者: idoww 时间: 2013-6-8 16:37

非特异性吸附的多少，一方面取决于填料本身，第二方面更重要的是纯化的方法，很多时候想在binding中加还原剂，也是希望能将一些2硫键打开，减少非特异性吸附，我们最近在试验对比一些IDA和NTA填料，在非特异性方面IDA做的也完全可以象NTA一样，而载量上NTA就输的多了。我个人觉得还原剂，能不加，还是尽量不加。

作者: rxcc33 时间: 2013-6-8 16:37

还原剂DTT是可以还原镍和钴离子的，会将镍还原为棕色，钴还原为蓝色。

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